端粒酶抑制剂范文

端粒酶抑制剂范文（精选7篇）

端粒酶抑制剂 第1篇

1 材料与方法

1.1 材料

25只Balb/c-nu裸鼠、1只SGC-7901荷瘤Balb/c-nu裸鼠购自中国医学科学院上海生物研究所,大蒜素注射液购于连云港市医药有限公司,产地为上海禾丰制药有限公司。人端粒酶酶联免疫分析试剂盒购于武汉博瑞达生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌动物模型的建立:

用颈椎脱臼法处死荷瘤鼠,把肿瘤组织坏死部分去除,并去除肿瘤组织的表面包膜。用眼科剪把肿瘤组织剪成1mm3大小的组织块,20号穿刺针塞入肿瘤组织,取裸鼠的腋下为接种部位,约14d后,肿瘤生长到0.7cm大小后,用药前用游标卡尺测量肿瘤的大小并随机分成5组:N组为PBS处理组,P组为氟尿嘧啶组,L组为低剂量大蒜素组,M组为中剂量大蒜素组,H组为高剂量大蒜素组。大蒜素、氟尿嘧啶隔日应用1次,共处理4次,观察荷瘤鼠的生长状态,并在最后一次用药后2d用颈椎脱臼法处死荷瘤鼠,取出肿瘤组织,应用电子天平称重,留取标本称重约100mg,用液氮迅速冷冻保存备用,进行端粒酶活性的检测。余标本放液氮灌中备用。

1.2.2 端粒酶的活性检测:

从液氮灌中迅速取出标本,迅速复温。切割标本后,称取重量约100mg。加入2ml PBS,pH7.4,用超声波匀浆器对组织进行均浆,为防止温度过高破坏蛋白,采用冰浴均浆。超低温离心机离心 20min左右(2 000~3 000r/min)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。按照端粒酶活性检测试剂盒的说明书按步骤行端粒酶活性的检测。最后置于酶标仪上读取OD值,根据标准品的OD值应用Curve Expert1.3绘制出剂量浓度曲线,然后根据检测样品的OD值计算出检测样品的端粒酶蛋白浓度。

1.3 统计学分析

实验数据均采用SPSS17.0统计软件进行分析,不同组的端粒酶的活性比较采用单因素的方差分析。

2 结果

2.1 肿瘤体积的动态变化和生长曲线

药物处理后每2天用游标卡尺(精度为0.01mm)测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b),按公式(V=ab2/2)计算肿瘤体积,统计得出各组肿瘤平均体积,绘制出生长曲线。从第14天开始用药物处理,可以看出未用药物处理组即N组的肿瘤持续处于生长状态,应用5-氟尿嘧啶处理组即P组的荷瘤鼠在第16天后即出现了肿瘤的缩小,而大蒜素不同组要在18d以后才出现肿瘤的缩小,说明大蒜素对肿瘤的抑制作用较5-氟尿嘧啶慢,见图1。

2.2 端粒酶活性检测

按照说明书进行端粒酶活性检测,在酶标仪中得到端粒酶的OD值,根据标准品的OD值应用Curve Expert1.3绘制出剂量浓度曲线,然后根据检测样品的OD值计算出检测样品的端粒酶蛋白浓度。结果见表1。与N组相比,H组端粒酶蛋白浓度较低,且差异有统计学意义(P=0.000)。

注:#P=0.000。

3 讨论

大蒜(Allium sativum)是百合科植物蒜的地下鳞茎,含有多种成分:含硫化合物(蒜氨酸、蒜油、蒜素、阿霍烯等)、微量元素(高含量的锗、硒、磷、镁等)、氨基酸(高含量的半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸等)、维生素(主要为维生素C、维生素B和维生素A),使大蒜具有广泛的药理作用[6,7]。大蒜素(allⅡnase)是含硫化合物蒜氨酸在酶的作用下形成,目前已经能够合成,具有大蒜特有的辛辣味,不完全溶于乙醇,是蒜中有效成分的精华。大蒜素化学结构式为CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH-CH2,分子式为C6H10S3,化学名为二烯丙基三硫化物[7],大蒜素为一单体化合物,具有多种治疗作用且不良反应小的特点。本研究发现氟尿嘧啶在抑制肿瘤生长的同时对荷瘤鼠表现为一定的毒性作用,表现为活动度下降、恶液质、肿瘤体积缩小出现的时间早;而大蒜素在抑制荷瘤鼠的肿瘤生长的同时并不影响其生活状态,但大蒜素抑制肿瘤生长出现的时间相比要比氟尿嘧啶出现的时间晚。随着剂量的增加,肿瘤的生长越慢,说明大蒜素据有抑制肿瘤生长的作用且随剂量的增加而增强。

在20世纪30年代 Barbara Mcclintock就观察到染色体的末端结构在避免染色体之间的融合中起了重要的作用,猜测它有保护染色体的作用[8],20世纪70年代把这一结构命名为端粒。1985年Blackburn实验室发现了具有合成端粒功能的端粒酶[9]。端粒酶能够使端粒的长度维持一定的长度,从而使细胞得以永生化,逃过死亡,成为具有无限增殖能力的细胞—肿瘤细胞。抑制了端粒酶的活性就有可能使肿瘤细胞在有限的分裂次数后进入死亡或停止复制。因此靶向端粒酶治疗成为一种抗肿瘤治疗的手段[10]。笔者的研究发现大蒜素具有体内抑制端粒酶活性作用,高、中、低不同浓度大蒜素的端粒酶浓度分别为10.25ng/ml、13.25ng/ml、 15.64ng/ml,高剂量组与N组相比端粒酶的活性抑制作用更强,差异具有统计学意义。提示大蒜素的体内抑制端粒酶活性有剂量依赖性,剂量越大端粒酶活性抑制作用越强。大蒜素的抑制肿瘤作用有多重机制,如直接杀死肿瘤细胞,阻滞细胞周期、诱导凋亡、影响细胞信号传导系统等[11]。本研究发现大蒜素抑制肿瘤细胞生长同时抑制端粒酶活性,因此不难推测大蒜素抑制端粒酶的活性是其体内抗肿瘤生长的机制之一。

总之,大蒜素能够抑制荷瘤鼠肿瘤组织的生长,同时具有体内抑制端粒酶活性的作用。大蒜素有可能成为有希望的中药端粒酶活性抑制剂,为胃癌的治疗带来新思路。

摘要：目的:探讨大蒜素对裸鼠胃癌移植瘤生长和端粒酶的活性抑制作用。方法:将SGC-7901胃癌移植瘤裸鼠随机分5组,N组为PBS处理组,P组为氟尿嘧啶组(250mg/L),L组为低剂量大蒜素组(600mg/L),M组为中剂量大蒜素组(800mg/L),H组为高剂量大蒜素(1 000mg/L)。观察荷瘤鼠的生长状态,量取肿瘤的大小绘制肿瘤的生长曲线,应用人端粒酶酶联免疫法测定端粒酶的活性。结果:与N组相比,大蒜素和氟尿嘧啶均对荷瘤鼠的肿瘤有抑制作用,各组对端粒酶活性均有抑制作用,大蒜素剂量越大抑制作用越强,H组与N组相比端粒酶的活性抑制作用有统计学意义(P=0.000)。结论:大蒜素对胃癌裸鼠移植瘤和端粒酶活性有抑制作用。

端粒酶抑制剂 第2篇

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，病死率居恶性肿瘤第一位，目前肺癌的治疗模式是多学科的综合治疗，靶向治疗在肺癌的治疗中具有重要的地位。端粒酶在肺癌组织中高表达，而在大多数正常组织中几乎不表达，使其成为治疗肺癌的重要靶点之一。笔者前期的研究[1]证实，端粒酶RNA的反义寡核苷酸能够抑制裸鼠移植瘤的生长，现进一步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

流式细胞仪，裸鼠移植瘤组织（共18块，正义寡核苷酸组、反义寡核苷酸组及生理盐水对照组各6块，每块重量约30 mg，均来自笔者前期实验），胰酶、EDTA购自Promaga公司，碘化丙啶、RNase（核酸酶）购自Sigama公司，70%乙醇、PBS缓冲液为国产试剂。

1.2 方法

将取到的标本除去血管和脂肪，用眼科剪刀剪成糊状，转入离心管内用PBS洗2遍，1 000 r/min,5min/次；每个标本中加入0.02%EDTA溶液5 m L，室温下作用30 min，离心，弃上清；再加入0.25%胰酶和0.02%EDTA溶液各10mL,37℃恒温水浴中消化30 min，间断震荡3～5次；终止消化，用200目尼龙网过滤一次，收集过滤液；400目尼龙网再过滤一次，收集过滤液并离心，1 000 r/min、离心5 min，再以PBS洗涤细胞沉淀2～3遍，500～800 r/min、离心5 min，弃上清液；向细胞沉淀内加入PBS 0.2 m L，充分吹打混匀；另取1支15 m L的离心管，放入5 m L、4℃的70%乙醇，然后用吸管吸取细胞悬液迅速吹入乙醇中，置4℃冰箱中固定24 h以上；将标本离心后弃去乙醇，用PBS洗涤2～3遍，离心，弃去上清液；标本中加入50 mg/L的RNase,37℃作用30 min；加入1 m L PI(50 mg/L）染液，4℃避光30 min；上机检测[2]。

1.3 统计学处理

实验数据以均数±标准差（±s）表示，计量资料采用统计软件SPSS11.0中t检验和F检验处理，检验水准为α=0.05。

2 结果

注：1)ASODN组与SODN组比较；2)SODN组与NS组比较;3)ASODN组与NS组比较

流式细胞仪作出细胞DNA含量直方图，见图1～3，计算机软件自动拟合出凋亡指数（%），ASODN组的凋亡指数显著大于SODN组和NS组的凋亡指数，SODN组和NS组间无明显差别，见附表。

3 讨论

癌症的发生是多途径、多步骤的过程，不仅与癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活导致细胞增殖过度而分化不足有关，还与细胞凋亡不足有关，诱导细胞凋亡已成为治疗癌症的策略之一。

端粒酶在大多数肿瘤组织中被激活，而在大多数正常组织中无活性，使它有可能成为治疗肿瘤的靶点。笔者前期的研究[3]显示，反义寡核苷酸组端粒酶活性的OD值低于正义寡核苷酸组和生理盐水对照组，提示端粒酶RNA的反义寡核苷酸能够抑制端粒酶活性。本实验则显示，反义寡核苷酸组的凋亡指数高于正义寡核苷酸组和生理盐水对照组，其差异具有显著性，提示端粒酶RNA的反义寡核苷酸可能是通过抑制端粒酶活性后诱导癌细胞发生了凋亡，从而抑制了裸鼠体内移植瘤的生长，这与XU[4]、LIU[5]的研究结果相似。

有证据表明，端粒酶的激活与细胞对凋亡的抵抗增强有关[6,7,8]。BERMUDEZ[9]的研究显示，端粒酶的激活能够抑制caspase3、caspase8、caspase9的活性，下调促凋亡蛋白t-BID、BAD、BAX的表达，上调抗凋亡线粒体蛋白bcl-2的表达，从而抑制caspase介导的细胞凋亡。ASFOUR[10]的研究则显示，端粒酶的活性与细胞凋亡呈负相关。近年来，大量的研究证明抑制端粒酶活性可导致细胞凋亡。SHAMMS[11]的研究显示，针对端粒酶RNA的反义寡核苷酸GRN163L能够抑制骨髓细胞的端粒酶活性，并引起细胞凋亡。CHOI[12]的研究证明抑制U937细胞的端粒酶活性可引起细胞凋亡，可能与上调促凋亡蛋白BAX表达，下调抗凋亡蛋白bcl-2、bcl XL的表达有关，抑制端粒酶活性在这一过程中起了关键作用。PARK[13]的研究也显示，抑制端粒酶的活性后可导致U937细胞生长抑制及凋亡，可能与bcl-2家族的表达调控、caspase的激活以及抗凋亡蛋白表达下调有关。

总之，本研究证实抑制端粒酶活性可导致裸鼠抑制瘤组织中癌细胞发生凋亡，为以端粒酶为靶点治疗肺癌提供了依据，但具体过程尚需进一步研究，如检测治疗前后端粒的长度、检测肿瘤组织中凋亡蛋白的表达情况等。

端粒、端粒酶与血管老化的关系 第3篇

关键词：血管老化,端粒,端粒酶,衰老

随着人口老龄化的加速发展, 有关增龄在心血管疾病发生发展中的作用逐渐被引起重视。血管老化作为一种退行性疾病, 是人体衰老的关键始发因素, 主要表现为内皮细胞和平滑肌细胞的衰老。根据其发病原因的不同, 可以分为主要是由增龄导致的生理性老化和由多种血管疾病促发引起的病理性老化。在细胞衰老领域, 端粒学说一直广受关注。端粒作为染色体末端的一段重复序列, 会随着细胞的有丝分裂而逐渐缩短, 从而引发了细胞衰老, 端粒酶的出现则能特定的延长端粒的长度, 进而提示在血管细胞衰老进程中端粒和端粒酶起着关键的作用。

1 血管老化的概述

血管是由内膜、中层和外膜所组成, 构成内膜和中层的主要细胞是血管内皮细胞和平滑肌细胞, 它们是防御各种应激因子的第一道防线, 外膜主要由成纤维细胞构成。血管老化是血管发生的一种缓慢的退行性变化, 其病理改变主要涉及血管内皮细胞衰老和功能障碍, 平滑肌细胞的衰老、迁移和增殖, 以及细胞外基质成分的改变和病理产物沉积。根据发病原因不同, 可分为主要由增龄导致的生理性老化和由多种血管疾病促发引起的病理性老化。生理性血管老化表现为随着增龄而出现血管长度和横断面的直径增长, 即血管扩张和屈曲, 与此同时, 血管壁发生了质的变化;病理性血管老化是由高血压病、高脂血症、冠心病以及糖尿病等疾病引起的, 它们共同表现为血管僵硬度增加, 动脉弹性和顺应性下降, 动脉供血减少, 进而引起机体功能降低。

2 端粒、端粒酶的结构及其功能

2.1 结构

端粒是真核细胞的染色体的末端结构, 被形象地比喻为细胞内染色体末端的“保护帽”, 它由重复的DNA序列和端粒结合蛋白组成, 是细胞必需的组分。端粒DNA序列既有高度的保守性, 又有种属特异性, 但每种生物都有其特定的序列和平均长度, 如四膜虫重复序列为GGGGTT, 草履虫为TTGGGG, 人类和哺乳动物为TTAGGG[1]。端粒结合蛋白是由称为shelterin的六个蛋白的复合体组成, 该复合体由TRF1、TRF2、TIN2、Rap1、TPP1、POT1组成, 其中TRF1、TRF2直接识别单链和双链TTAGGG端粒重复序列, 并通过TIN2、Rap1、TPP1、POT1相互联系。Shelterin complex能够维持“T-环”结构的稳定性, “T-环”结构即3′末端突出的单链折叠并侵入端粒的双螺旋结构形成的;这个“T-环”有利于端粒在染色体末端形成帽子结构[2], 该复合体不仅可以阻止染色体末端DNA损伤反应的激活, 而且可以调节染色体末端端粒酶活性。依据结合特性端粒结合蛋白分为两大类[3]:1双链TBPs (double-strand TBPs) , 它在端粒长度的维持中具有重要作用, 而且对端粒具有保护和调节功能[4];2单链TBPs (single-strand TBPs) , 对于染色体末端的“戴帽”, 以及端粒酶活性的调节具有重要作用[5]。

端粒的结构决定了端粒具有许多重要的功能:1保护染色体末端, 防止遗传信息丢失。端粒DNA如帽子一般保护染色体末端免于被化学修饰或被核酶降解, 从而防止染色体在复制过程中发生丢失或形成不稳定结构[6,7]。此外端粒的存在能使得DNA复制从端粒开始, 避免染色体遗传信息的丢失。2决定细胞寿命。正常体细胞端粒的长度是有限度的, 随着年龄的增长和细胞分裂次数的增多, 端粒会逐渐缩短, 一般丢失速度为 (50~200) bp/次[8], 当端粒缩短至一定程度, 细胞停止分裂, 进入静止状态, 故有人称端粒为正常细胞的分裂钟 (mistosis clock) , 因而端粒的长度也就决定了细胞的寿命[9]。3端粒位置效应, 这是由于端粒序列改变了染色体的结构, 使得接近端粒处的染色体区域形成异染色质, 而且这一区域位于核膜附近, 离体条件下不易被DNaseⅠ接近, 活体内不易受到DNA修饰酶的作用。由于聚合酶和转录因子不容易接近, 抑制了附近基因的表达, 这种现象称为端粒的位置效应[10]。

2.2 功能

端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白酶复合体, 具有逆转录酶活性, 它通过引物特异识别位点, 以自身RNA为模板, 在染色体末端合成端粒DNA, 使端粒得以延长。人类端粒酶主要由RNA成分 (hTR) 、端粒酶相关蛋白1 (hTEP1) 和催化亚单位 (hTERT) 三部分组成。hTR长约5 6 0 nt, 其中有1 1个碱基 (5-CUAACCCUAA-3) 与人类端粒序列5-TTAGGG-3互补[11], 与此区互补的反义寡核苷酸能抑制端粒酶活性, 而这段RNA的突变会导致端粒酶活性的改变[12]。hTEP1的mRNA表达并不限于有端粒酶活性的组织和细胞系, 各组织的水平差异与端粒酶的活性无关, 因此, 端粒酶活性表达并不是由TEP1决定的[13,14], 但hTERT则是端粒酶活性所必需的。对端粒酶活性的表达, hTR和hTERT两种组分缺一不可, 但它们的表达调控是分离的。因为hTR在人的组织细胞中广泛表达, 是一个普遍现象, 端粒酶活性没有平行关系;而hTERT只在有端粒酶活性的细胞中 (如生殖细胞、各种具有分裂增殖能力的细胞和绝大多数肿瘤细胞) 表达, 其表达与端粒酶活性呈正相关[15]。

端粒酶作为一种特殊的DNA聚合酶, 有着非常重要的生物学功能[16], 不仅使细胞分裂过程中缩短的端粒长度得到补偿, 维持端粒的长度, 还能够参与组织分化、细胞因子、胞浆Ca2+水平的调节, 并在一定程度上保护了线粒体, 此外, 端粒酶还参与细胞凋亡级联反应核信号的发放和细胞周期与细胞增殖的调控[17]。

3 端粒、端粒酶与血管老化的研究

生命机体由细胞构成, 生命机体的衰老是从细胞衰老开始的。胡章雪[18]认为端粒参与血管老化的机制, 主要是通过细胞衰老的途径发挥作用的。细胞衰老主要表现为端粒酶的活性明显下降, 端粒功能发生异常 (包括端粒DNA受损、端粒结构发生异常变化、端粒明显缩短) 和细胞停止生长。内皮细胞和平滑肌细胞作为血管细胞的主要成分参与了血管老化的发生, 内皮细胞和平滑肌细胞的衰老与端粒、端粒酶有关, 即端粒的缩短、损伤, 端粒酶活性的下降会导致相关血管内皮细胞和平滑肌细胞的衰老, 并且通过其衰老与心血管疾病的发生存在互为因果的关系。Minamino等[19]通过破坏端粒结构完整性诱导人主动脉内皮细胞衰老, 首先发现在人类动脉粥样硬化区域有典型的衰老细胞特征, 并发现抑制端粒酶可诱导内皮细胞衰老, 而促进端粒酶表达可抑制内皮细胞衰老, 延长细胞的生长周期。体外细胞实验表明端粒酶活性在血管平滑肌细胞增殖调控中发挥着至关重要的作用, 过表达hTERT可以延长血管平滑肌细胞寿命[20]。另一方面, 杨淑均等[21]也指出端粒的过度损耗导致血管内皮细胞、内皮祖细胞以及平滑肌细胞衰老和功能障碍, 进而参与动脉粥样硬化病理演进, 最终引发冠心病、脑卒中等。黄华等[22]指出早期端粒酶活性增强及端粒长度增加导致内膜血管平滑肌增生是高血压早期血管重塑的表现。可见端粒和端粒酶的生物学功能发生异常是导致细胞衰老, 以及血管老化的关键因素。

与此同时, 在研究有关端粒酶的端粒外作用机制的同时, 也发现端粒酶与氧化应激关系密切。氧化应激引起端粒损伤的重要表现之一是可改变端粒的长度, 使细胞端粒缩短, 进而加速细胞衰老[23]。而通过检测端粒DNA限制性酶切片段 (telomerase restriction fragment, TRF) 的长度, 并结合荧光原位杂交实验, 发现培养在高氧化应激环境下的内皮细胞, 其端粒缩短的速度加快[24]。实验发现40%的高压氧下细胞传代次数降低, 端粒缩短速率增大, 细胞出现衰老特征, 端粒DNA上单链断裂积累。由此推测端粒缩短的主要原因在于衰老过程中或氧胁迫下端粒DNA单链断裂增多, 使端粒末端单链片段在DNA复制时丢失[25]。此外, 端粒酶转基因鼠表现出明显的抗氧化应激能力, 其干细胞的增殖分化能力也提高, 而端粒酶基因敲除鼠则表现出较低的抗氧化应激能力, 并对化疗药物敏感[26,27]。端粒酶还与线粒体关系密切, 但在氧化应激状态下, 端粒酶线粒体定位的确切生理功能还需进一步探讨。Haendeler等[28]研究发现TERT进入线粒体后定位在线粒体基质, 结合mtDNA编码区ND1和ND2区, 并认为TERT的线粒体定位全面提高了呼吸链的活性, 可以抵抗氧化应激诱导的损伤。Ahmed等[29]发现在TERT过表达的细胞中, mtDNA被保护, 线粒体膜电位升高, 线粒体超氧化产物和细胞过氧化水平降低, 这些表明TERT表达下降能够导致端粒缩短和细胞衰老, 使端粒酶活性下降, 相反则能提高线粒体功能和减少不良反应, 使线粒体处于一个温和应激状态。

4 有关端粒、端粒酶与中医研究的现状

张先平等[30]实验表明, 当归多糖 (ASP) 能够拮抗X线诱导的造血干细胞 (HSC) 衰老, 其作用机制可能与增加端粒长度及端粒酶活性、下调P53蛋白表达有关。周玥等[31]研究发现, 人参皂苷Rg1可能通过激活端粒酶活性和减少端粒长度缩短发挥延缓和治疗造血干细胞 (HSC) 衰老的作用。张洪泉等[32]研究发现, 肉苁蓉多糖 (PCD) 能拮抗自由基损伤, 增强衰老小鼠心和脑组织端粒酶活性和机体免疫功能, 对D-半乳糖所致的衰老有一定的改善作用。马丽杰等[33]实验发现, 锁阳多糖 (CSP) 组可以通过抑制D-半乳糖衰老小鼠血细胞和脑细胞染色体末端端粒长度的缩短, 延缓组织细胞的衰老进程。杨靖等[34]通过研究发现, 四君子汤能拮抗自由基损伤, 减少D-gal衰老模型小鼠心、肝、脑组织丙二醛 (MDA) 含量, 并能提高心、脑组织端粒酶活性, 但对肝组织端粒酶活性无影响[34]。目前在中医药领域缺乏有关端粒、端粒酶和血管老化的直接研究, 有必要进行加强以阐明其中的关系。

5 结语

血管老化作为一种缓慢的进行性疾病和老龄化社会亟待解决的问题, 值得大家广泛关注。端粒长度的缩短引发了衰老, 而端粒酶的存在能够通过延缓细胞衰老, 提高细胞抗氧化应激水平来延缓衰老, 进而可能延缓血管老化, 但是仍然存在一些问题。第一, 有研究表明端粒长度可能和海拔有关, 影响衰老和血管老化[35], 如何用药物代替海拔对端粒长度的影响而延缓血管老化值得进一步的研究。第二, 如何控制端粒酶的过度表达是一个有待解决的问题。端粒酶一方面可以维持端粒的长度, 有效延缓衰老, 同时也会增加细胞癌变的机会, 这其中的临界点需要解决。第三, 正常情况下端粒长度随着细胞分裂不断缩短, 缩短到一定的程度会引发衰老, 但是没有确切的长度标准。

哺乳动物端粒酶活性研究进展 第4篇

1 端粒、端粒酶的结构和功能

1.1 端粒的结构和功能

1.1.1 端粒的结构

端粒是真核生物染色体的物理末端, 端粒复合物是一段高度有序的分子, 其富含G碱基的3′末端在多种端粒结合蛋白的参与下, 侵入端粒DNA双链之间, 形成一个特殊的T-loop结构, 对染色体3′末端起保护作用[1]。

端粒长度具有物种特异性, 不同品系端粒长度具有高度多态性[6,7]。J.Graakjaer等[8]在对人类同卵双生胎儿的研究中发现, 端粒长度在很大程度上由遗传决定;另外, S.Bekaert等[9]的研究发现, 端粒不仅在同源染色体间存在着长度多态性, 在姊妹染色单体之间这种多态性也普遍存在, 这就在一定程度上解释了为什么Southern Blots中端粒信号条带会呈现出宽泛、模糊的现象。

1.1.2 端粒的功能

端粒DNA序列不含功能基因, 但是端粒在进化和序列上的高度保守性及结构的特殊性决定了端粒具有特殊的生物学功能。端粒主要功能概括如下:1) 对染色体的保护作用。端粒像帽子一样在真核生物染色体末端起保护作用, 从而使真核生物染色体末端不致被化学修饰或被核酶降解。2) 对染色体的固定作用。染色体末端位于细胞核边缘, 端粒DNA和核基质中的蛋白相互作用, 以TTAGGG结构附着于细胞核基质, 对保护基因组的一致性起着关键作用[10]。3) 大大减少了染色体复制时的末端丢失。在细胞的分裂活动中, 染色体末端的丢失普遍存在, 端粒的存在起到了缓冲保护的作用, 从而防止染色体在复制过程中发生丢失或形成不稳定结构。4) 细胞的“分裂时钟”。端粒的缩短伴随着细胞分裂而发生[11], 故有此种说法。

1.2 端粒酶的结构与功能

1985年, C.W.Greider等[12]在四膜虫细胞抽提物中首次发现端粒末端转移酶 (端粒酶) , 随后人们对端粒酶的结构和功能进行了深入研究。

1.2.1 端粒酶的结构

端粒酶是一种核糖核蛋白, 由三部分组成:端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR 或hTRC) 模板、端粒酶相关蛋白 (hTPI) 和端粒酶逆转录酶 (hTERT) 。

端粒酶RNA在端粒酶的合成中发挥搬运功能, 并在维持端粒动态平衡中起着重要作用[13]。在不同物种中, 端粒酶RNA序列保守性较差, 但它们都含有一段与该物种约1.5个端粒重复序列互补的序列, 称为模板区域, 如人的端粒重复序列为TTAGGG, 其hTR模板区域序列为AAUCCCAAU[14]。

端粒酶逆转录酶属于反转录酶, 它的表达水平高低决定端粒酶活性, 因而它被认为是调节端粒酶活性的重要限速步骤之一[15]。端粒酶逆转录酶在进化上相对保守, 几乎所有物种均含有6个逆转录酶元件和1个端粒酶特异性元件[16]。有活性的端粒酶除了包含核心蛋白TR和TERT外, 还包括一些端粒酶相关蛋白。这些蛋白对端粒酶发挥正常功能起着非常重要的作用。例如, 角化不良蛋白 (dyskerin/GAR1) 、蛋白激酶C抑制剂 (Stau) 、核糖体蛋白 (L22) 是与hTR结合相关的蛋白, 而热休克蛋白 (HSP90) 和端粒酶结合蛋白 (p23) 是与hTERT结合相关的蛋白[17]。

1.2.2 端粒酶的功能

端粒酶对细胞的增殖具有重要作用, 它以自身RNA为模板, 逆转录合成端粒DNA并加到染色体末端, 在DNA复制过程中, 有活性的端粒酶可以把丢失的端粒补偿回来, 而没有端粒酶活性的细胞随着分裂的进行, 其端粒不断变短, 严重的端粒变短可导致细胞死亡[18]。

另外, 端粒酶逆转录酶具有3′-5′核酸裂解酶活性, 能够识别断裂染色体的末端, 并重新将端粒重复序列加到断裂末端, 从而保护染色体的完整性[19]。此外, 人们还发现端粒酶在DNA修复、干细胞功能以及基因表达调控方面具有着重要作用[20,21,22]。

1.3 早期胚胎中的端粒和端粒酶

在哺乳动物中, 早期腔前卵母细胞和排卵前卵母细胞具有较高的端粒酶活性, 卵母细胞成熟后端粒酶活性大大降低, 而受精后端粒酶活性显著升高, 4-细胞胚胎期可检测到活性非常高的端粒酶, 这些时期与早期胚胎发育其他时期端粒酶活性呈现较大差异[23]。目前, 学者普遍认为之所以出现这种差异, 原因在于在早期胚胎发育过程中母源端粒酶蛋白逐渐降解, 而胚源基因转录启动后, 新端粒酶蛋白逐渐合成, 胚胎继续发育。因此, 端粒酶的活性直接影响了早期胚胎的发育和细胞分化[24]。

对正常胚胎、IVF胚胎和体细胞核移植胚胎各阶段端粒长度的研究表明, 代与代之间端粒的长度重编程对胚胎正常发育至关重要;另外, 在胚胎发育过程中, 桑葚胚胚泡的转型伴随着端粒长度的重新设定;同时, 在不同种类胚胎发育过程中均存在这一现象。而在端粒长度重新设定这一过程中, 端粒酶起着重要作用, 一旦缺少端粒酶, 该过程就不能发生[25]。

2 端粒酶活性的检测方法

2.1 端粒重复扩增法 (TRAP, telomeric repeat amplification protocol)

端粒酶活性的测定对研究体细胞克隆重组胚内端粒重编程机制有着的重要意义。1994年, N.W.Kim等[13]成功建立了高灵敏度检测端粒酶活性的方法端粒重复扩增法。其原理是反应体系中存在着端粒酶底物寡聚核苷酸 (telomerase substrate oligonucleotide, TS) , 往此体系中加入的细胞裂解液如果有端粒酶活性, 便可在TS的3′末端合成并添加端粒重复序列 (GGTTAG) ;随后, 以TS和反转录引物 (reverse primers, RP) 作为反应引物, 将此延长的产物进行PCR扩增, 便可获得一系列长度逐渐增加的片段产物 (起始为50 bp, 每次端粒延长反应增加6 bp) ;反应体系中端粒酶活性越强, 获得的PCR产物的量越多;最后便可进行端粒酶活性定量分析。

这种方法易出假阴性结果, 但具有灵敏度强、特异性高, 所需标本量少、同位素少, 污染小, 方便、易行等优点。目前, 人们多将其应用于医学领域疾病检测, 1999年至2004年, 国内学者应用TRAP法, 对白血病、高血压、鼻咽癌等一系列疾病的临床诊断、治疗及疗效观察等进行了研究, 取得了显著效果。因此, TRAP法检测端粒酶活性对某些疾病的防治具有重要意义[26,27]。

2.2 TRAP-实时定量荧光PCR法

TRAP-实时定量PCR技术具有10倍敏感于常规TRAP法的特性, 是指作为端粒酶的底物, 端粒的单核苷酸引物持续增加产生6 bp差异的核苷酸重复序列片段, 扩增后的产物在逆向引物和端粒单核苷酸引物的共同作用下进行特异性扩增。同时, 采用可以和双链DNA的任一小沟结合的非特异性荧光标记SYBR Green绿色荧光染料作为DNA结合染料, 与双链DNA结合, 使其发出荧光信号以检测并观察。

此种方法使用循环阈值表示每个循环的荧光强度所确定的扩增产物的产量, 避免了假阳性的干扰, 具有性能稳定、操作便捷、敏感高效、重复性强、定量准确等优点, 目前亦主要应用于医学领域疾病检测[28]。

2.3 原位端粒重复片段扩增法和免疫组织化学法原位杂交法

1997年, K.Ohyashiki等[29]将TRAP法与原位PCR相结合, 建立了原位端粒重复片段扩增法和免疫组织化学法原位杂交法。

原位端粒重复片段扩增法将hTERT mRNA与标记探针进行原位杂交并进行PCR扩增, 从而检测端粒酶活性。免疫组织化学法使用hTERT蛋白抗体检测细胞中hTERT的含量, 从而推测与hTERT相关的端粒酶活性。这两种方法都属间接检测法, 操作简便, 并能检测出单个细胞的端粒酶活性, 可用于回顾性研究。

2.4 TRAP-ELISA法

1996年, 宝灵曼公司 (现为罗氏公司) 向市场推出了一款用于半定量测定端粒酶活性的试剂盒。其基本原理是 将TS引物 5′端标以生物素进行端粒酶延伸反应, 再进行PCR扩增, 之后加入地高辛标记的可与扩增产物的重复片段结合的探针。在该检测反应中, PCR产物通过生物素标记的引物固定到亲和素包被的微孔板上, 而探针上的地高辛与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体相结合, 最后经过过氧化物酶分解底物形成一种有色的反应物, 并用酶标仪进行测定。

该方法检测灵敏度高, 同放射性同位素TRAP测定相当, 极大地简化了 PCR产物检测操作步骤, 并且操作简便, 目前已广泛应用于各大医院、研究机构, 是作为端粒酶检测的常用方法。

2.5 RT-PCR法

RT-PCR法是采用反转录PCR法检测hTERT mRNA含量, 从而检测与hTERT mRNA相关的端粒酶酶活性。这种方法的特点是较TRAP法检测端粒酶酶活性更加简便、灵敏, 亦为半定量法。此法也常用于临床上对癌症的诊断。

3 结语

端粒酶抑制剂 第5篇

1 干细胞与肿瘤细胞

干细胞是指一种低分化或未分化的,具有多向分化潜能并可以自我复制在人体内少量存在细胞,在体内存在的形式与位置多种多样,以胃部干细胞为例。胃干细胞是存在于胃组织中的成体干细胞,其位于胃底腺颈部与峡部。关于其起源主要认同Peanse等,认为胃道内分泌干细胞来源于神经嵴的神经内分泌干细胞,上皮细胞的更新来自多功能干细胞[1]。

肿瘤细胞可分为良性与恶性。与良性肿瘤细胞相比,恶性肿瘤具有大量的正常与非正常的有丝分裂,生长方式也以一种浸润性的生长,其分级与分化呈反比。恶性肿瘤同样具有低分化,无限增殖,可转移的特点,其对某些环境的变化同干细胞一样敏感。这点已在Fisher和Fisher(1967)所建立的休眠实验模型中得到了初步的验证[2]。并且,20世纪70年代Barry Pierce利用某些物质作用于肿瘤细胞而改变其生物学特征。而恶性肿瘤细胞的转移也可以在受精卵在子宫着床,即子宫内膜遭到进攻性滋养层细胞侵袭的过程,和来源于骨髓的组织定向干细胞(tissue committed stem cells,TCSC)在组织受到损伤时所进行的锚定修复[3]。而且干细胞与肿瘤干细胞还有共同的细胞信号转导通路,如:CDC2、EGFR、Notch等[4,5]。

2 肿瘤也许可以被视为由肿瘤干细胞增殖分化而成的对身体有害的组织或器官

肿瘤可被视为器官,或者说是多种奢侈基因不受机体控制而随意表达的结果,现今比较公认的癌的发生是多步骤过程,分为始发突变、促癌、演进和恶变。Loeb曾以DNA本身在胞液中不稳定可能为内源性癌发生的基础为依据[6]。如果以高频脱嘌呤为例而言,在嘌呤脱去后,被DNA修复酶修复,一个缺嘌呤位点可有该酶产生,该酶可以识别一个改变了的碱基或加合物,并将它们从DNA链中除去,便会产生裂隙,而此时DNA-poly(DNA聚合酶)会较有自由度的选择以任意dNTP结合于该位点,使错误被保留下来,此时便形成了“源肿瘤干细胞”,这时再以促癌剂的作用下形成早期良性肿瘤细胞,继而再在某些环境因子的作用下向恶性演进。

众所周知,肿瘤细胞在遗传学上是不稳定的,这种较正常干细胞的突变很有可能发生在顺势作用元件上。

3 端粒酶的活性与肿瘤细胞

端粒酶(telomerase)活性的增高在大多数肿瘤细胞中都有发现。端粒酶是一种具有逆转录活性的DNA聚合酶,使端粒DNA在复制过程中得到延长,1997年人类端粒酶被克隆成功并鉴定了有三部分组成:人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)、人端粒酶协同蛋白1(human telomerase associated protein 1,hTpl)和端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,Htrt)[7]。

研究发现,随着细胞的分裂,端粒会逐渐变短,当缩短到一定程度时,就会涉及在生命体起着关键作用的DNA,即不能再维持DNA的稳定性与完整性,细胞将衰老死亡,这就是端粒钟学说。故端粒酶在看衰老中发挥了重要作用,这已经在抗癌动物模型中得到了证实[8]。

可以推测正常干细胞在某些情况下,完成了向肿瘤干细胞的转变,又在一些致癌因子的作用下发生了演进与恶变,导致正常的抑制端粒酶活性的物质被抑制,从而使其产生肿瘤细胞最大的特点——永生,继而无限增殖。

注:箭头代表变化方向

但是这种由正常细胞分泌的可抑制端粒酶活性的物质却由于化学物质变化太多和到现在为止还很难弄清的级联反应而变得难以分离,究竟是单纯一种物质,还是多重产物共同作用,目前还没有定论。但物质X如果具有普通生物学共性的话,是否可以用以下方法加以缩小范围呢?这里只提供一个设想。

将正常的、高分化的细胞在含14N的培养液中培养2～3代,之后分离一部分,加入同样有14N标记的端粒酶,如果不可以使细胞产生反应,可以考虑显微注射的方法,再将细胞转入15N的培养液中,如果正常细胞中有可以产生抑制物的基因,此时便会被激活,产生大量含15N的蛋白,检测,与未注入端粒酶的细胞产物对比放射性物质峰值,从而达到减少靶物质范围的目的。而且,近期研究还发现端粒酶还可以除核外的别的细胞器发挥作用,如促进DNA修复,改变基因表达,改善线粒体功能等[9]。越来越多的证据显示,如果可以控制端粒酶,那么攻破癌细胞的永生便不是梦想。

4 肿瘤干细胞学说对于临床的启示

目前一旦癌细胞出现进行性转移,就不能将它们以手术或射线的方式清除,只能用细胞毒素药物进行治疗,但这种无特异性的治疗方式最大的目的不是治愈患者而是减轻症状,如胰腺癌的治愈率仅为百分之五,肿瘤干细胞学说认为,肿瘤干细胞是演进与转移的源头[10]。也就是说只有完全清楚肿瘤干细胞才是治愈癌症的关键。

手术切除对于癌症治疗的不确定性在于无法证明肿瘤干细胞是否完全清除与进行手术时是否有肿瘤干细胞正在休眠,临床上休眠的恶性肿瘤细胞并不少见。这些处于G0期的细胞在一定正性调节下(如损伤后的机体的正常修复,自身对端粒酶活性抑制的解除)便会恶变,而处于G0期的它们在术后所马上采用的如5-FU等抗癌药物治疗过程中也可以逃过一劫。

如果以干细胞所具有的生物学特性或细胞转导通路为靶点的话,的确可以减少对大部分细胞的伤害,但其中不免会对大量正常干细胞也产生巨大伤害。近几年来美国Calando制药公司所研发的IT-101这一纳米药物应用肿瘤生长的特点即当肿瘤生长至一定厚度(约3 mm)时,就需要有新的通道为其输送营养,也就是要催生大量畸形血管,而这些血管上会出现很多大小不一的裂缝,而纳米载体便会利用物理屏障较为特异性的在癌组织释放药物,如果可以将根据肿瘤干细胞特征所研发的新药与这种纳米载体结合起来的话,再应用于临床,也许会有一些令人振奋的效果。

总之,特异性治疗就是不断的寻找特异蛋白与靶点的过程,随着研究的深入特异性治疗肿瘤细胞一定会在不远的将来实现。

参考文献

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[9]Ahmed S,Passos JF,Birket MJ.Telomerase doesn't counteract telomere shortening but protects mitochondrial function under oxidative stress.Cell Sci,2008,17:562.

端粒酶抑制剂 第6篇

1 材料与方法

1.1 一般资料

Hela细胞, 中国医科大学实验中心二部冻存。

试剂:γ-氨基丁酸、胎牛血清, RPMI-1640、青霉素、庆大霉素、Hepes、胰蛋白酶、D-hanks粉、Triton、DTT和AEBSF (华美公司) 、PCR试剂盒 (日本Takara公司) 、pBR322DNA/HaeⅢMarkers均购于华美生物工程公司T s引物5′-G C G G A T C C C G G G T G T G G T G-3′与C x引物5′-C A C A C A C C C A C A C C A C-3′均由大连宝生物公司合成;其它常规试剂均为国产分析纯。

仪器:Eppendorf微离心机, Sorvall高速离心机 (德国) , HRSP0520型PCR扩增仪 (Hybaid.美国) , DYY-1电泳仪, ELX-800酶标仪 (Bio-TEC, 美国) , Chemi Imager 5500自动电泳凝胶成像及分析系统 (UVP, GDS, 美国) 。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及细胞记数

常规细胞培养, 用含10%胎牛血清, 37℃, 5%CO2, 饱和湿度培养、传代并细胞记数, 当细胞位于对数生长期时, 用胰蛋白酶消化后收集细胞, 调节细胞悬液为5105/mL, 接种与48孔板和96孔板中。

1.2.2 不同浓度的γ-氨基丁酸分别处理Hela细胞不同时间

将γ-氨基丁酸制成1μmol/L, 10μmol/L, 100μmol/L, 1mmol/L, 10mmol/L, 100mmol/L不同浓度, 调节pH=7.4, 高压灭菌后加入到48孔板和96孔板中, 计时8h, 24h, 48h, 72h后收集细胞。96孔板中的细胞用于检测细胞活力, 48孔板中的细胞用于检测端粒酶活性的变化。

1.2.3 Hela细胞端粒酶的制备

收集48孔板细胞, 按每1105个细胞加入20μL裂解液裂解细胞, 40℃30min, 得到端粒酶提取液。

1.2.4 蛋白含量测定Folin酚法测定端粒酶提取液蛋白质含量。

1.2.5 端粒重复扩增法 (TRAP) 结合电泳及银染法测定端粒酶

活性: (1) 端粒重复序列扩增:48μL反应体系包含10PCR缓冲液5μL, dNTP混合物4μL, Taq DNA聚合酶 (2U) , Ts引物2μL, 端粒酶提取液 (根据Folin酚法测得蛋白质浓度计算加液量) , ddH2O补足到48μL, 混匀后于30℃保温10min合成端粒酶延伸产物后加入Cx引物2μL, 94℃30s。然后进行25次循环扩增。 (2) PCR产物纯化:酚、氯仿:异戊醇法。后加入2.5倍体积99.5%乙醇, -20℃放置30min, 15000r/min离心30min;留沉淀, 加入10μL ddH2O及2μL电泳示踪液备用。 (3) 电泳:取上述提纯物5μL加入1μL 6loading dye, 12.5%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离, 200v, 1.5h。 (4) 硝酸银染色:取下凝胶, 置10%冰乙酸, 40℃固定25min;去离子水漂洗3次, 共计10min;置0.2%硝酸银染液中, 40℃染色15min;再用去离子水漂洗3次, 共计1min;用含0.02%甲醛和0.28mol/L碳酸钠显影液显影, 直至产物信号足够强而背景不至于过高为止。 (5) 结果分析:用自动电泳凝胶成像分析仪进行扫描。并用生物电泳分析仪将端粒酶电泳结果用AAB软件测定各泳道端粒酶电泳梯度条带的总密度值 (A值) , 以GABA处理前的Hela细胞端粒酶活性定为1, 其它待测标本的端粒酶活性相对强度=待测标本A值/未处理的Hela细胞A值。

2 结果

2.1 1mmol/L GABA对Hela细胞端粒酶活性的下调作用

于作用8h时即可检测到Hela细胞端粒酶活性有所下降 (相对强度0.92) , 作用48h时端粒酶活性与对照组相比约下降了18% (相对强度0.87) , 随后端粒酶活性只有轻微的改变, 但均低于对照组 (图1) 。各作用时间端粒酶活性平均灰度值分别为116 (8h) , 117 (24h) , 110 (48h) , 115 (72h) , 126 (对照组) 。

2.2 不同浓度GABA对Hela细胞端粒酶活性的下调作用

不同浓度GABA作用于Hela细胞48h, 其端粒酶活性有不同程度的下降, 但以1mmol/L时为最低 (相对强度0.87) , 各浓度端粒酶活性平均灰度值分别为118 (1μmmol/L) , 119 (10μmmol/L) , 120 (0.1mmmol/L) , 110 (1 mmmol/L) , 121 (10 mmmol/L) , 120 (0.1mmol/L) , 124 (对照组) (图2) 。

3 讨论

端粒酶是一种逆转录酶, 能以自身RNA成分为模板, 催化合成端粒DNA, 添加 (TTAGGG) n序列到染色体末端, 由此延长和维持端粒长度不变。在多数正常人类体细胞中端粒酶活性的表达很低或不表达, 但是90%以上的恶性肿瘤细胞和体外永生化细胞表达端粒酶活性[2]。因此, 抑制端粒酶活性就为抗肿瘤治疗提供了新策略。Hela细胞 (人宫颈癌细胞) 作为一种恶性肿瘤细胞, 其端粒酶被激活从而维持端粒长度阻止细胞死亡, 所以Hela细胞常作为研究端粒酶的常用细胞, 而端粒酶活性也作为衡量某些肿瘤恶性程度的一个指标。然而, 目前人们对端粒酶活性的调控机制尚不十分清楚。

本研究将γ-氨基丁酸 (GABA) 作用于Hela细胞, 观察到端粒酶活性下调。不同浓度的GABA作用48h时, 端粒酶活性有不同程度的下降, 以1mmol/L时对端粒酶活性的下调作用最明显, 而且当用较低浓度 (1μmol/L) GABA作用时对端粒酶活性亦有下调作用。由于端粒酶与细胞生长、繁殖、衰老及肿瘤的发生密切相关, 因此推测GABA对端粒酶活性的下调作用可能与肿瘤细胞的生长、代谢等方面有关。

在外周区域和中枢神经系统中一样, GABA通过结合突触后离子型GABAA受体和代谢型G A B A B受体诱发神经抑制。GABAA受体是G A B A-门控氯离子通道, 可受c A M P、C a 2+和细胞容积的调节[3]。在宫颈癌中, 细胞肿胀能够活化ATP-依赖性氯离子流, 而这种现象并不存在于正常宫颈中, 提示容积-活化氯离子流的激活与人类宫颈鳞状上皮的恶性转化有关。而在宫颈癌中容积-调节性离子通道与细胞周期有关, 在细胞周期特别是G1/S转换期, 细胞显著增大, 这使细胞容积自身稳定性紊乱[4]。同时有报道认为端粒酶主要是在S期被激活的, GABA对Hela细胞端粒酶活性的下调作用可能是通过减少S期细胞的百分率而实现的[5]。

大量研究已证实端粒酶活性在组织发育和自身稳定过程中特定的生理条件下被修饰[6]。除了生长相关的调节, 端粒酶活性主要受分化和细胞外及细胞内信号调节, 如紫外照射、α-干扰素和雌激素等。本实验结果表明GABA能够引起Hela细胞端粒酶活性下调, 而这种下调作用可能与肿瘤细胞的代谢、生长、繁殖及恶化有关。这一结果使人们对端粒酶在恶性肿瘤中的作用有了进一步的了解。另外, 也提示将端粒酶抑制剂与某些抗癌剂结合起来为更有效的肿瘤治疗, 特别是肿瘤耐药性的解决提供了新思路。

摘要：目的探讨γ-氨基丁酸 (GABA) 对Hela细胞端粒酶活性的影响。方法用不同浓度γ-氨基丁酸作用于体外培养的hela细胞, 用自动电泳凝胶成像分析仪进行结果分析。结果1mmol/L的GABA作用48h时, Hela细胞的端粒酶活性降低最显著。结论GABA对Hela细胞端粒酶活性起下调作用, 其下调作用可能与其抑制肿瘤细胞增殖、恶化有关。

关键词：γ-氨基丁酸 (GABA) ,Hela细胞,端粒酶

参考文献

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端粒酶抑制剂 第7篇

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药品

通道化噎丸：80 g/瓶，为复方中药制剂，河南中医学院第二临床医学院制剂中心提供（批号20070716）。端粒酶PCR-ELISA检测试剂盒（Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA ILUS，德国Roche公司产品）。

1.2 主要器材及仪器

NO-11型PCR扩增仪（德国Biometra公司）。

1.3 细胞系

人食管癌Eca-109细胞由河南省医学科学研究所提供。

1.4 方法

1.4.1 动物含药血清的制备

取雄性200 g Wistar大白鼠，随机分成空白血清组（空白组）6只，通道化噎丸低剂量组（5%）、通道化噎丸中剂量组（10%）、通道化噎丸高剂量组（15%）各6只。每鼠以4 ml/d通道化噎丸合药血清灌药，空白组给予等量生理盐水灌胃，于给药第7天，麻醉后剖腹经腹主动脉无菌采血，离心10 min(1 500 r/min），无菌分离血清。用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃冰箱保存备用[1,2,3,4,5]。

1.4.2 实验方法与操作

取对数生长期人食管癌Eca-109细胞，经0.2%胰酶消化后，计数，以2×105/ml接种于小培养瓶中，培养48 h备用。

取三种浓度的通道化噎丸含药血清加入24孔板中。每个浓度设5个复孔，每孔加入2×104/ml细胞，以生理盐水、5-FU(100μg/ml）分别作阴性和阳性对照，依次在12、24、48、72、96 h分别取3孔收集细胞（约5×105个），PBS洗2次，加入200μl裂解液，4℃裂解30 min,1 500 r/min离心10 min，将上清（约150μl）置-70℃保存备用或即用[6,7,8,9]。

1.4.3 TRAP-PCR-ELISA实验

取上述提取液3μl，加入25μ反应混合物，在PCR扩增仪上运行。取2.5μl PCR产物加入10μl变性液反应，洗涤后加入耦联过氧化物酶的地高辛抗体100μl，室温孵育30 min，最后加入100μl POD的底物TMB，显色10 min，在酶标仪上测吸光度A值，波长为450 nm和630 nm，吸光度差值△A=A450 nm-A630 nm，△A代表细胞端粒酶活性[10,11,12]。

1.5 统计学处理

数据以均数±标准差表示，用统计软件SPSS 15.0分析，计量资料比较采用t检验，P<0.05表示有显著性差异。

2 结果

含药血清培养后的食管癌Eca-109细胞端粒酶活性表达情况见表1。

与空白组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

空白组食管癌Eca-109细胞端粒酶活性较高，通道化噎丸中、高剂量组及5-FU组与空白组比较，端粒酶活性表达明显降低，有非常显著差异性（P<0.01）；通道化噎丸低剂量组与空白组比较，有显著差异性（P<0.05）。

3 结论

大量研究表明，绝大多数的恶性肿瘤中发现有端粒酶活性，而且其活性水平与肿瘤的进展程度一致[12,13]。因此，抑制端粒酶活性就有可能成为治疗癌症的有效途径[14,15]。通道化噎丸组方为熟地、山药、茯苓、山茱萸、泽泻、丹皮、山豆根、天南星、半夏、郁金和三七等，方中以六味地黄汤补肾阴并循经顾护食管以扶正，佐以化痰散结、行气散瘀之药以涤邪，共奏滋阴润燥、扶正抗癌之效。本研究切合噎膈病机，开展本方对端粒酶活性影响的实验，结果表明，正常大鼠血清培养的食管癌细胞端粒酶活性水平较高，通道化噎丸中、高剂量组与空白组比较，端粒酶活性水平均大幅度降低，有非常显著差异性（P<0.01），说明中药通道化噎丸制备的中、高含药血清具有显著的抗癌和促进癌细胞向正常细胞转化的作用。其中，中、高剂量组疗效较低剂量组好，显示了一定的量效关系。通道化噎丸含药血清中、高剂量组疗效突出，较空白组有明显的

·短篇论著·

疗效，表明中药配合在放、化疗增效减毒、改善患者生存质量方面具有显著的优势，有待进一步开发研究和应用。

摘要：目的:观察通道化噎丸含药血清对食管癌Eca-109细胞端粒酶活性的影响,探讨该药抑瘤诱导凋亡的作用机制。方法:以不同浓度的含药血清孵育体外培养的人食管癌Eca-109细胞,检测其端粒酶的活性变化。结果:通道化噎丸含药血清可显著降低食管癌细胞端粒酶的表达,低、中、高剂量组与空白组比较,有显著性差异(P<0.05和P<0.01)。结论:通道化噎丸可下调Eca-109细胞的端粒酶活性,从而诱导食管癌细胞凋亡,抑制转移,改善肿瘤预后。