抗肝纤维化范文

抗肝纤维化范文（精选8篇）

抗肝纤维化 第1篇

1 对象与方法

1.1 对象

选择我院2006年10月-2007年6月期间住院病人25例, 男性22例, 女性3例;年龄在20～55岁之间, 平均年龄 (42.5±7.33) 岁。诊断为慢性乙型病毒性肝炎, 同时具备以下指标:ALT 80～150IU/L, Bil<17μml/L, B超提示无腹水。血清肝纤维化指标:透明脂酸 (HA) 、Ⅳ型胶原 (Ⅳ-C) 、Ⅲ型前胶原 (pcⅢ) 和层粘蛋白 (LN) , 4项指标中有2项或2项以上超过正常值上限者为异常;≤2倍者为轻度异常, >2倍者为中度异常。其中肝纤维化指标轻度异常者10例, 中度异常12例。

1.2 方法

采用深圳科兴生物制品有限公司生产的IFHalb (赛若金) 300万IU/d, 肌注, 1次/d, 15d后改成隔日1次, 75d, 共90d为1疗程。对照组25例病人, 男性22例, 女性3例, 年龄在19～48岁之间, 平均年龄 (40.6±11.7) 岁。肝纤维化指标轻度异常13例, 中度异常8例, 见表1。与干扰素治疗组比较差异不显著 (P>0.05) 采用常规治疗, 用药不限。

1.3 观察项目

观察肝功能、血常规;透明脂酸 (HA) 、Ⅳ型胶原 (IV-C) 、Ⅲ型前胶原 (pcⅢ) 和层粘蛋白 (LN) 。试剂由北京生化试剂高技术实验室提供。

1.4 结果

治疗前两组肝纤维化指标均明显高于正常值 (P<0.01) 。两组之间差异不显著 (P>0.05) , 见表2。用药后患者均有不同程度的乏力、发热、关节酸疼, 体温在37.8～38.8℃之间。由于用药前患者对该药的副作用已有明确的了解, 辅以卧床休息, 未经处理, 症状自行消退。应用IFN (干扰素) 治疗后, 3例病人血小板下降, 4例病人白细胞下降, 继续治疗的同时加用蜂龄胶囊后升至治疗水平, 2例病人治疗过程中血清谷丙转氨酶增高达150IU (正常值<40IU, 至治疗结束时降至正常, 两组患者血清白蛋白无明显变化。)

以上研究结果表明, IFNα使治疗组肝纤维化指标显著改善。

2 讨论

干扰素是一类具有高活性、多功能的诱生蛋白, 具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。其抗纤维化的作用随着对干扰素研究的深入逐步被认识。

2.1 IFN抗纤维化的机理

2.1.1 抑制细胞外基质的合成:

Numaguclu等[1]研究发现, α、β、γ3种干扰素均有显著抑制3T3L1前脂细胞Ⅰ型前胶原mRNA转化生长因子 (TGF) β1mRNA的表达及细胞生长的作用。说明IFN直接抑制细胞外基质形成, 减少胶原合成。Guido等[2]对44例慢性病毒型肝炎患者用IFN治疗前后进行肝活检, 用免疫组织化学和半定量评分法研究中发现, IFNα结束治疗后Ito细胞对α平滑肌纤维蛋白表达明显减少, α平滑肌纤蛋白标记的细胞数量减少和组织学改善密切相关, 说明IFN直接抑制细胞外基质形成细胞合成胶原, 防止肝纤维化产生。

2.1.2 促进细胞外基质的降解:

肝纤维化是一个动态过程, 治疗肝纤维化不但要抑制纤维化的形成, 还要促进其降解。有人用IFNα治疗肝纤维化大鼠模型[3], 15d后血清生化标志物降至正常, 肝组织结构恢复正常。有研究表明[4], 血清HA水平与肝纤维化程度一致, 经过IFNα治疗慢性丙型肝炎6个月及12个月时, pcⅢ、Ⅳ型胶原和HA明显下降, 提示IFNα治疗慢性肝炎随着肝炎症状的改善, 血清肝纤维化标志物下降。可见, IFN对促进肝纤维化组织降解的作用, 有利于肝脏功能的恢复。

2.2 病毒与抗纤维化的关系

IFN有广谱的抗病毒作用, 它是通过靶细胞相互作用, 合成抗病毒蛋白, 使其形成抗病毒状态来实现的。有人有IFN治疗前后肝组织学检查, 按肝纤维化评分发现, 疗程结束后, 病毒指标HCV-RNA阴转组肝脏坏死、炎症和纤维化评分明显改善, 半年后血清III型前胶原和Ⅳ型胶原78片段平均显著下降, 而对照组无此变化, 提示IFN抗纤维化作用与抗病毒作用密切相关。病毒性肝炎抗纤维化治疗, 首先是针对原发病的治疗, 其次为抑制纤维化形成的各个环节, 以及促进其降解吸收。IFN有可靠的抗病毒、抗炎作用, 能消除病原减少对肝纤维形成细胞的刺激, 细胞外基质的形成, 增加胶原酶活性, 促进细胞外基原的降解, 从而达到抗纤维化的作用。

2.3 纤维化治疗的疗效评价

从本研究中发现, 慢性病毒性肝炎肝纤维化指标轻度异常的患者, 在应用IFNα3个月时肝纤维化指标恢复较好, 而肝纤维化指标中度异常者 (大于2倍正常值以上) 则恢复较差。从而提示肝纤维化指标的恢复与治疗前的水平相关。是否由于疗程较短, 或者疗程结束后观察时间尚短, 有待于继续对6个月、12个月后进行观察。肝脏组织学和血清肝纤维化标志是目前观察肝纤维化的主要指标, 但是血清肝纤维化和肝脏炎症程度有关。随着炎症的好转, 肝脏受损程度的好转, 纤维化指标的血清含量也可下降, 尤其是HA、抗炎、抗肝损伤药物和抗肝纤维化两类药物需要区别。

总之, IFN抗肝纤维化的作用逐渐被认识, 可以通过其抗病毒、抗炎作用消除病原, 减少对肝纤维化形成细胞的刺激, 减少细胞外基质的合成, 促进其降解, 从而达到抗纤维化的作用。但是由于其剂量大, 副作用多, 需要我们严格掌握适应症, 选择适当剂量, 延长疗程, 以确保抗肝纤维化的安全有效性。

关键词：赛若金,肝纤维化

参考文献

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中药单体抗肝纤维化实验研究概况 第2篇

【关键词】 肝纤维化；中药；单体；实验研究

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）11-0026-02

肝纤维化（hepatic fibrosis）是因乙肝、丙肝等肝炎病毒的持续感染或其他化学物质、血吸虫等因素引起的肝脏纤维组织弥漫性增生，是慢性肝炎向肝硬化发展的必经阶段。随着对肝纤维化研究的不断深入，国内外学者认为，肝纤维化的形成与肝脏的实质细胞、非实质细胞及炎症细胞等密切相关。由于多种致病因子的作用激活了肝星状细胞（HSC）使之转化成肌成纤维细胞，同时大量合成胶原等细胞外基质（ECM），从而造成ECM过度沉积，最终导致肝纤维化的发生。

中医药治疗肝纤维化在临床取得了确切的疗效，引起国内外学者越来越多的关注。文献资料表明，抗肝纤维化研究较多的单味中药有三七[1]、丹参、丹皮、赤芍、当归、土鳖、桃仁、叶下珠、溪黄草、黄芪、排钱草、黄根等；中药复方有复肝宁、甲乙煎、揉肝抑纤饮、肝心宁等。上述研究，部分已在药效学研究的基础上，对其抗肝纤维化活性部位成份及其作用机制进行研究，但对中药单体或从中药中提取出的有效成分的研究不多。近年来，应用分子生物学技术来研究抗肝纤维化的作用机制较多，集中在细胞学基础研究、细胞外基质研究、细胞因子研究三个方面[2]，而对与肝纤维化相关的血液生化指标及肝组织病理变化的观测也是研究的热点。本文拟围绕以上四个方面的研究，就中药单体抗肝纤维化实验研究作一综述。

1 细胞学基础的研究

肝星状细胞在肝纤维化发展变化过程中发挥着重要的作用，活化后的肝星状细胞不仅合成胶原能力增强，而且也是基质金属蛋白酶（MMPs）和组织抑制因子（TMPs）的主要来源。TMPs是抑制MMPs的一组多功能因子。在肝纤维化动物模型中，TMP-1表达水平增加而MMP表达会相应减少，当两者平衡失调，纤维型胶原将发生沉积，导致肝纤维化程度加重。

赵东强等[3]在体外培养HSC的基础上，采用MTT法、透射电镜、流式细胞术及Tunel技术进行观测，发现丹参单体IH764-3具有抑制HSC增殖与促进HSC凋亡的作用。

熊果酸是一种广泛存在于多种药用植物的中药单体，申氏等[4]通过体外诱导活化型HSC-T6细胞，发现熊果酸抑制HSC-T6增殖，其诱导HSC-T6细胞凋亡可能与降低Bcl2/Bax比值，激活caspase3蛋白有关。

兰天等[5]采用转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激人肝星状细胞株（LX-2）誘导肝纤维化细胞模型，通过虎杖苷进行干预，利用Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。发现虎杖苷能显著抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞α-SMA的表达。

刘丽等[6]应用体外细胞培养技术，观察丹参单体H764-3对鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶及其组织抑制因子表达的影响，发现丹参单体H764-3干预MMP-13mRNA的表达强度明显上调，同时TMP-1mRNA表达受到抑制。

川芎嗪是从伞形科植物川芎的根茎提取出来的有效成分，别名四甲基吡嗪。川芎嗪抑制HSC的增殖，减少Collagen-I 的合成从而具有抗肝纤维化作用[7]。

2 细胞外基质的研究

在正常状态下，肝内细胞外基质的各成分按一定的比例合成和分解，处于动态平衡的过程。肝纤维化发生后，这种平衡被打破，细胞外基质的合成大于降解，便会在肝内大量沉积。可以说细胞外基质来源于其产生细胞，而大量沉积又对细胞产生重要的影响，其作用的过程既复杂又相互影响。

武氏[8]等通过CCL4复制大鼠肝纤维化模型，发现三七皂苷单体Rg1、Rb1除可减少狄氏间隙内的胶原纤维及贮脂细胞增生外，还能明显抑制血清ALT活性及HA、PCⅢ水平，具有抗肝纤维化的作用。

段氏等[9]四氯化碳造模的同时给予三七总皂苷单体Rbl，检测肝功能、血清Ⅲ型前胶原、透明质酸、层粘蛋白等指标的变化，并观察肝纤维病理变化。发现三七总皂苷能改善肝纤维化大鼠的肝功能，降低血清 PCⅢ、 HA、 LN含量，明显减轻肝组织胶原的沉积，改善肝纤维化程度；而人参皂苷 Rbl不能改善肝纤维化程度。

3 细胞因子的研究

转化生长因子β1（TGF-β1）具有促进间质细胞分化和增殖，增加细胞外间质的沉积、抑制其降解的作用，被认为是肝纤维化形成过程中的一个重要的调控因子。肝脏在正常状况下TGF-β1的表达较少，而损伤后其表达会显著增加。

丹酚酸B是从丹参中提取出的水溶性活性成分，丹酚酸可抑制由转化生长因子刺激诱导HSC的增殖和活化[10]，此外，丹酚酸还可下调TNF-α水平，减轻肝组织炎症程度，保护肝脏细胞不受破坏[11]。

姜黄素是一种黄色的酸性酚类物质，可从姜科姜黄属植物姜黄中提取。姜黄素能够作用于瘦素，从而抑制血小板衍化生长因子（PDGF）、血管生长因子（VEGF）等因子的表达，并对活化的HSC具有抑制作用[12]。其可通过抑制NF-κB依赖性TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1、COX-2 等基因表达，阻止炎症因子诱导的肝脏炎症性损伤，从而阻止肝纤维化的发生与发展[13]。

芍药苷是主要从毛莨科植物芍药中提取出的活性成分，具有抗炎和免疫调节作用。从芍药苷的化学结构分析，因其分子中含多个酚羟基，可清除自由基活性，抗氧化作用使其可促进肝细胞再生从而实现抗肝纤维化作用[14]。闻氏[15]采用放免法、RT-PCR法、Western-blotting法和免疫组化法分别观测血清及肝组织中TNF-α转录和表达情况，结果发现芍药苷可显著降低血清及mRNA水平的TNF-α表达；而在Western-blotting法和免疫组化法中，仅在Ⅰ组和Ⅲ组，芍药苷明显降低TNF-α的含量。

4 其他生化指标研究

慢性肝病发生病变后，血清ALT、AST、HA、LN及肝组织中MDA、SOD等指标与肝病的严重程度呈现相关性。随着病情的加重，此类肝纤维化指标亦随着发生变化。通过观测这些指标的改变情况，可以了解受试物的抗肝纤维化作用。杜仲多糖能抑制血清HA、LN水平的升高，降低肝纤维织中MDA水平和SOD、GSH-Px活性，提示杜仲多糖能提高肝组织的抗氧化酶活性，抑制自由基产生，缓解肝脏损伤，从而达到抗肝纤维化作用[16]。

同为多糖类成分，朱氏[17]通过观察狗肝菜多糖对二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化作用，发现狗肝菜多糖也可以降低血清中ALT、AST、TBIL等水平，其抗肝纤维化作用可能与保肝降酶有关。

苦参碱是从中药苦豆子或苦参中提取出来的一种生物碱，杨文卓等[18]通过半乳糖胺诱导方式复制肝纤维化模型，观察氧化苦参碱干预前后肝指数、血及肝组织生化、羟脯氨酸含量、TGβmRNA表达水平、电镜及病理组织学改变，结果提示，氧化苦参碱可降低大鼠ALT、AST、TGFβ1水平，降低肝组织羟脯氨酸含量；提高肝组织内SOD、GST-PX水平，给药各组desmin及α-SMA水平的明显低于模型组。而宋健等[19]采用CCL4制备肝纤维化模型，发现苦参素可显著改善肝功能，降低PC-Ⅲ、LN、HA水平，组织学检查也显示具有抗肝纤维化作用。

无论在肝星状细胞激活、凋亡或者细胞外基质大量合成与沉积过程中，均与黏附分子密切相关。而E-钙粘附素作为黏附分子中的重要一员，在不同阶段肝纤维化大鼠肝组织均有表达，且随着纤维化程度的加重而表达增强，在肝纤维化发展变化中的作用越来越受到关注。万荣等[20]通过研究E-钙粘附素在不同肝纤维化阶段的表达情况以及在抗肝纤维化中药单体白黎芦醇干预下表达的变化发现，白黎芦醇可以明显改善大鼠肝纤维化程度，并减少E-钙粘附素 mRNA水平。

牛磺酸是從中药牛黄中提取出来的有效成分，对细胞具有保护作用。牛磺酸无论是对由牛血清白蛋白静脉注射复制的大鼠肝纤维化模型[21]，还是对由CCL4诱导的肝纤维化模型[22]，均可改善大鼠肝组织中的病理变化，提示其具有抗肝纤维化作用。

5 结语

中药防治肝纤维化具有独特优势，针对肝纤维化发生的多个环节进行抗肝纤维化研究取得很大的进展，中药单体在抗肝纤维化作用机制研究方面也呈现出多方向、多层次展开的局面。就目前研究现状来看，多集中在细胞学、细胞外基质及细胞因子的研究，而对肝的再生及调节方面研究较少。肝细胞是高度分化而较少分裂的一类细胞，但仍保留着增殖的功能[2]。当发生肝纤维化时，占绝对多数的肝实质细胞并不能健康有序地增殖，而是被非实质细胞代偿性增生所替代。所以，找到科学有效的措施和手段让肝实质细胞能健康有序地增殖应该成为中药单体抗肝纤维化实验研究的重点之一，也应得到更多的关注和重视。

目前，对于肝纤维化的机制研究已经从原来的病理组织学研究发展到细胞学、细胞因子及其分子水平的研究，研究对象也从中药提取物、有效部位发展到有效成分甚至单体。研究不断深入的同时，不能忽视中医整体辨证论治理论的指导，否则，中药单体抗肝纤维化的实验研究就将成为中药的去中药化研究。

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单味中药抗肝纤维化机制研究概述 第3篇

1 莪术

莪术为姜科植物蓬莪术的根茎,辛、苦、温,具行气破血、消积止痛作用,是治疗肝纤维化肝硬化的常用中药。莪术抗肝纤维化机制如下:(1)莪术可通过对血小板衍生因子(PDGF)受体介导的细胞内信号转导通路的干扰来抑制肝星状细胞(HSC)的增殖和细胞外基质(ECM)的合成,从而降低ECM在肝内的沉积[2]。(2)莪术可调节细胞凋亡相关蛋白bax、bcl-2表达,抑制肝细胞凋亡,起到抗肝纤维化作用[3]。(3)莪术提取物β榄香烯可抑制HSC的血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)分泌和血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA(AT1R mRNA)表达,减少HSC活化[4]。(4)莪术油能通过抑制HSC-T6细胞的白细胞介素6(IL-6)、金属蛋白酶抑制物(TIMPs)表达,降低对基质金属蛋白酶(MMPs)的抑制,从而使MMPs对ECM的降解增强[5,6]。(5)莪术醇通过抑制HSC-T6细胞TGFβ1、P450a表达,降低氧应激和脂质过氧化反应,抑制HSC活化和ECM生成,从而达到抗肝纤维化作用[7]。

2 三七

三七为五加科人参属植物三七的干燥根,其味甘、微苦,性温,归肝、胃、心、小肠经。临床观察发现,三七可提高肝病患者的血浆白蛋白[8],抑制成纤维细胞、肝星状细胞增殖及细胞内外Ⅰ型胶原的生成等[9]。其有效成分三七总皂苷可以抑制活化HSC增殖、诱导活化HSC凋亡,改善肝纤维化病理分级[10],具有很好的抗肝纤维化疗效。三七总皂苷抗肝纤维化机制如下:(1)通过多途径减少TGF-β1mRNA和蛋白的表达,减轻HSC细胞的活化,达到减少胶原纤维产生的作用[11,12,13]。(2)通过抑制磷脂酶A2(sPLA2)、前列腺素E2(PGE2)水平来减少对肝细胞的炎症刺激和库普弗细胞激活[14,15],抑制肝组织中NF-κBp65 / IκBα的过度表达[16],使肿瘤坏死因子α(TNFα)的生产减少,降低血清IL-6的水平[17],抑制肝组织中成纤维细胞及胶原纤维增生。(3)降低肝组织羟脯氨酸,减轻贮脂细胞增生及胶原的沉积[18]。(4)通过抗炎、抗坏死、防治HSC增生并转化为肌成纤维细胞,抑制成纤维细胞合成、分泌胶原,而达到抗肝纤维化目的[19]。

3 柴胡

柴胡始载于《本经》,列为上品。其味苦、辛,性微寒,归肝胆经。研究表明,北柴胡和春柴胡均具有良好的抗肝纤维化作用,而北柴胡疗效优于春柴胡[20]。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷能显著降低血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)含量,提高血清白蛋白(ALB)的含量,从而抑制或逆转肝纤维化[21]。柴胡皂苷根据化学结构不同分为SSa、SSb1-4、SSc、SSd、SSe、SSf、SSh等单体成分,其中最具活性的成分是柴胡皂苷d(SSd)[22]。柴胡及其有效成分抗肝纤维化的作用机制是:(1)通过减少TGFβ1及PDGF的表达而抑制HSC增殖活化,从而下调TIMP-1/MMP-1从而促进细胞外基质降解,减少其沉积[23]。(2)SSd可降低血液和肝组织中丙二醛(MDA)的含量、升高超氧化物歧化酶(SOD)的酶活力,从而增强机体清除活性氧的能力和抗脂质过氧化来保护肝细胞免受损伤从而防治肝纤维化[24,25]。(3)SSd可降低α-SMA表达,抑制HSC活化和增殖,从而减少肝内纤维组织增生[26]。(4)SSd可提高体内白细胞介素10(IL-10)、一氧化氮(NO)含量,从而降低TNF-α水平,抑制胶原合成,刺激胶原酶的产生,阻止肝纤维化的发生、发展[27]。(5)SSd能明显增高血清锌含量、降低钙离子含量,从而保护肝细胞,提高胶原酶活性,促进胶原降解[28]。

4 鳖甲

鳖甲含有蛋白质、多肽、氨基酸、多糖等物质,化学成分较为复杂。传统的炮制理论认为醋制具有增强药物入肝消积、软坚散结的作用,故临床上治疗肝病常用醋鳖甲。研究证实鳖甲醋制前后化学成分及其含量发生了变化,且醋制后产生了一些新的有效成分[29,30]。炙鳖甲能降低肝硬化患者Chlid-Pugh积分值,增加血清白蛋白,缩小脾脏,有一定的逆转肝纤维化肝硬化的作用[31]。唐尹萍等[32]用葡聚糖凝胶G-25、G-15对鳖甲的活性部位进行分离,得到Bj61-Bj68共8个部位,再采用MTT比色法确定Bj66、Bj67具有明显的抑制大鼠肝星状细胞系HSC-T6的增殖作用,即为鳖甲的抗肝纤维化活性部位。鳖甲合成多肽可以诱导HSC的凋亡,抑制HSC增殖,发挥抗肝纤维化的功能,且其作用呈剂量依赖性[33]。高建蓉等[34]研究发现鳖甲对肝星状细胞影响的物质基础为小分子肽类物质,其作用机制是通过抗脂质过氧化、改善肝组织病理、改善肝功能、调控细胞因子水平及信号传导通路等而发挥抑制HSC活化增殖及ECM合成分泌、促进ECM降解吸收等综合作用,阻断和治疗肝纤维化[35]。

5 水蛭

水蛭,为水蛭科日本医蛭、宽体金线蛭、茶色蛭等的干燥虫体,始载于《神农本草经》,其味咸苦,性平,有毒,入肝经。水蛭主要含蛋白质,新鲜水蛭唾液中含有一种抗凝血物质——水蛭素。《本草汇言》云:“水蛭逐恶血,散瘀血之药也。”常用于癥瘕、积聚、蓄血证、血瘀经闭、跌打损伤、瘀血肿痛以及干血痨证,为内科、妇科及伤科常用药[36]。现代研究表明,水蛭具有良好的抗纤维化作用[37],可运用于肝纤维化的临床治疗。水蛭及其有效单体水蛭素抗肝纤维化的机制如下:(1)通过抑制HSCs [Ca2+] i的升高,阻断或抑制了HSCs的Ang-Ⅱ信号转导通路,从而抑制HSCs活化与增殖[38]。(2)通过下调Smad4 mRNA的表达抑制肝脏细胞外基质异常增生[39]。(3)通过下调结缔组织生长因子mRNA的表达,抑制肝脏细胞外基质异常增生发挥抗肝纤维化作用[40]。

6 冬虫夏草

冬虫夏草为虫草菌的子座与其宿主蝙蝠蛾科昆虫绿蝙蝠蛾幼虫尸体的复合体,是一种名贵的中药材,其人工培养品叫虫草菌丝。研究表明,虫草菌丝提取物既能显著抑制肝硬化的形成,也可有效促进已成型的肝硬化逆转[41],具有很好的抗肝纤维化肝硬化作用。虫草菌丝抑制并逆转肝纤维化的机制如下:(1)抑制TGFβ1表达,从而下调PDGF表达,抑制HSC活化,减少Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成[42]。(2)通过调节解偶联蛋白2(UCP2)的适度表达、减轻内毒素血症等下调TNFα的表达而抑制HSC活化,降低细胞外基质的合成和分泌[43]。(3)降低基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性,减轻肝窦内皮细胞损伤和表型改变,抑制肝窦毛细血管化的启动和形成[44]。(4)抑制IFN-γ与IL-4的蛋白表达,从而抑制异常增加的辅助T淋巴细胞免疫应答,并通过这种对细胞免疫损伤的抑制而发挥抗肝纤维化作用[45]。(5)降低肝脏羟脯氨酸含量,减少肝内胶原和脂质的沉积,减轻肝细胞炎症坏死,抑制肝脏纤维化[46]。(6)降低肝组织MDA含量及肝组织谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性分,提高肝组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及SOD活性,从而减轻过氧化损伤,保护肝细胞,减少胶原生成[47]。

7 讨论

丹参抗肝纤维化作用机制研究进展 第4篇

1 丹参化学成分及作用

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salviamiltiorrhiza bunge)的干燥根及根茎。其有效成分有水溶性和脂溶性两大类,脂溶性部分主要为二萜醌类化合物(包括丹参酮、隐丹参酮等);水溶性部分主要为酚酸类化合物(包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸等)[2]。

1.1 丹参水溶性成分

丹参水溶性成分主要是以丹参素为基本结构的酚酸类化合物,多数命名为丹酚酸(Salvianolic acids,SA),目前已分离出丹酚酸A、B等7种化合物。丹参总酚酸化合物具有很强的抗氧化作用,可以清除超氧阴离子和羟自由基,抑制脂质过氧化反应,进而减轻肝损伤,对生物膜过氧化损伤具有保护作用[3,4],能抑制Fe2+半胱氨酸系统和维生素C烟酰胺腺苷嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)所引起的肝脏微粒体脂质过氧化,明显减少肝微粒体丙二醛生成量[5]。丹参单体IH 76423是中国科学院血液病研究所发现的一种丹参水溶性成分,分子量为158。陈岳祥等[6]发现,IH76423显著减轻四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)大鼠肝纤维化程度,降低肝羟脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型前胶原m RNA含量,降低血清透明质酸与层黏蛋白水平,改善肝功能,组织学检查也显示抗肝纤维化作用;研究还发现,IH76423显著降低肝组织丙二醛含量,说明其抗肝纤维化机制之一在于抗肝脂质过氧化。赵东强等[7]证实IH76423抑制HSC增殖并促进其凋亡细胞增殖受c AMP/c GMP(磷酸腺苷/磷酸鸟苷)调控,c AMP升高或(和)c GMP降低可抑制细胞增殖。实验发现,IH76423促进HSC内c AMP,并可降低细胞钙调蛋白水平,提示IH76423抑制HSC增殖的机制在于影响细胞内c AMP与钙调蛋白[8]。

丹酚酸A(salvianolicacid A,SA-A)分子式为C26H22O10,分子量为494。大量研究证实其有良好的抗氧化与抗肝纤维化作用。丹酚酸A抗脂质过氧化作用为维生素E的千余倍。胡义扬等[9]发现,肝细胞脂质过氧化损伤后,其分泌产物可促进HSC活化,同时发现ALT活性升高,丙二醛含量升高,促进HSC增殖作用明显,说明过氧化产物是刺激HSC活化的重要因素。经丹酚酸A作用后,肝细胞培养上清中丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)活性及肝细胞丙二醛含量降低,该肝细胞条件培养液对HSC的增殖作用也显著降低,Ⅰ型胶原合成和m RNA表达量同时减少,说明丹酚酸A通过抗肝细胞脂质过氧化损伤,抑制HSC活化的旁分泌激活途径,而发挥抗肝纤维化作用。刘成海等[10]发现,丹酚酸A可抑制体外培养的大鼠HSC增殖、Ⅰ型胶原分泌与沉积,抑制前胶原α2m RNA表达,提示丹酚酸A对HSC活化功能有直接抑制作用。体内实验发现,丹酚酸A可降低CCl4慢性中毒大鼠ALT、AST活性和肝组织丙二醛含量,从而证实丹酚酸A有显著抗脂质过氧化肝损伤的作用;另一方面,SA-A可降低肝脏羟脯氨酸含量,减轻肝组织纤维化程度,抑制肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积,有显著抗肝纤维化的作用。胡义扬等[11]还发现,SA-A可降低CCl4损伤大鼠肝组织Ⅰ型胶原m RNA表达量,提示丹参能在基因转录水平上调节胶原代谢。

丹酚酸B抗肝脂质过氧化损伤,崔云华[12]等研究丹酚酸B(SA-B)对大鼠肝星状细胞细胞内氧化水平及增殖细胞核抗原(PCNA)的影响,发现丹酚酸B可降低细胞内氧化程度,抑制3,4-甲二氧基苯异丙胺(Methylene dioxyamphetamine,MDA)刺激后肝星状细胞PC-NA的表达,丹酚酸B的抗氧化和抗增殖这两方面的作用可能有一定的联系。丹酚酸B能减轻D2半乳糖胺和CCl4所致的大鼠肝细胞坏死,显著降低ALT、AST活性和提高肝非实质细胞前列腺素的生成量[13]。丹酚酸B可显著降低二甲基亚硝胺诱导的纤维化肝组织的丙二醛和羟脯氨酸含量,有良好的抑制纤维化肝脏胶原合成与促进沉积胶原(Ⅰ、Ⅲ型)降解的作用,且其抗肝纤维化作用与抗脂质过氧化作用有关[14]。

丹酚酸B抑制肝星状细胞活化,干预胞内信号转导。丹酚酸B能抑制体外传代培养的HSC活化,抑制胶原合成,减少胶原纤维的沉积。HSC活化后还大量合成分泌层黏蛋白,增生的Ⅰ型胶原与层粘蛋白组成了完整的基底膜,使狄氏间隙毛细血管化,并进一步激活HSC。刘平、朱大元等研究发现:丹酚酸B可有效逆转慢性乙肝肝纤维化,能抑制HSC的增殖,抑制活化HSC的转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)自分泌及活化;降低I型前胶原m RNA表达与胶原蛋白的生成。其抑制TGF-β1及信号转导通路中促分裂原活化蛋白激酶(MAPK1的活化可能是丹酚酸B抑制Ⅰ型前胶原m RNA表达重要的途径之一,干扰狄氏间隙毛细血管化形成,既能减轻肝纤维化,又能抑制HSC进一步活化,其信号转导途径主要通过Smads蛋白介导[15~17]。刘成海等[10]以TGF-β1刺激的体外原代培养大鼠HSC活化,同时以丹酚酸B作用,结果发现丹酚酸B抑制细胞胶原分泌、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)与纤维蛋白酶原激活物抑制因子的蛋白表达,下调Ⅰ型前胶原基因表达;并且抑制细胞质与细胞核内Smad 2、3的蛋白表达,抑制Smad2蛋白胞内磷酸化及其核转位,说明丹酚酸B抗肝纤维化、抑制HSC活化的机制在于抑制TGFβ1在HSC的信号转导。王晓玲[18]等认为丹酚酸可抑制TGF-β1促进细胞Ⅰ型胶原m RNA表达的作用以及干预TGF-β1在HSC胞内信号转导中的转录因子表达及其生物效应。

1.2 丹参脂溶性成分

主要为丹参酮Ⅱ(TanshinoneⅡ),包括ⅡA和ⅡB,丹参酮ⅡA是天然的抗氧化剂[19]。刘永刚等[20]研究发现,丹参酮ⅡA可降低CCl4和D2半乳糖胺小鼠肝损伤血清ALT、AST和肝组织匀浆丙二醛含量,其对肝脏的保护作用是通过清除氧自由基,发挥抗氧化、减轻脂质过氧化损伤的作用。

2 丹参抗肝纤维化作用机制

2.1 改善肝脏微循环

肝窦毛细血管化是肝纤维化的重要病理特征,以肝窦内皮细胞失窗孔,内皮下基底膜形成为特征。改善肝脏微循环,对促进肝纤维化的逆转有重要意义。丹参具有扩张血管增加血流量的作用,并可改善微循环,加速血流,使毛细血管网开放增多,以增加毛细血管张力和降低毛细血管通透性,徐列明等[16]研究证实丹参抗肝纤维化的部分机理在于减轻肝血窦阻力,增加肝血流,并能抑制活化储脂细胞的增殖,通过抑制储脂细胞生成细胞外基质而减少胶原纤维在肝内沉积及干扰狄氏间隙基底膜的形成而减轻肝窦毛细血管化,从而促进肝细胞功能恢复。

2.2 抗自由基过氧化损伤

自由基是细胞损伤的直接原因,毒物进入肝细胞内,经代谢产生自由基,引起脂质过氧化反应,导致肝细胞膜破坏与细胞坏死。CCl4、酒精和铁过载引起的肝纤维化中,自由基及其脂质过氧化是肝纤维化发生的重要原因。蒋树林等[21]通过大鼠实验证实丹参对肝纤维化有显著抑制作用,其机制之一是丹参对肝纤维化鼠肝脏线粒体脂质过氧化反应的抑制,而且这种抑制存在着一定的量-效与时-效关系薛惠明等[22]也证实,丹参可降低CCl4和二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine,DMN)诱导的肝纤维化大鼠肝组织丙二醛含量,显著提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性,有抗自由基及脂质过氧化损伤的作用。崔东来[23]通过实验探讨中药丹参干预应用四氯化碳诱导大鼠实验性肝纤维化,显示丹参具有抗肝纤维化作用,机制可能与调控TGF-β1、白细胞介素-6(IL-6),减少胶原组织的合成及其促进自由基清除,抗脂质过氧化作用有关。

2.3 抑制胶原生成促进病理沉积胶原的降解

胡义扬等[24]通过丹参提取物对CCl4和DMN诱导的大鼠肝纤维化实验研究,证实丹参提取物可显著改善肝组织损伤和纤维化程度,同时显著降低肝组织羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)和3,4-甲二氧基苯异丙胺(MDA)含量,有显著的抗肝纤维化作用,其作用机理与胶原代谢有直接的影响。王祯苓等[21]通过丹参治疗肝纤维化大鼠实验,认为丹参抑制肝脏胶原增生,可促进沉积的纤维降解吸收。胶原降解主要受MMPs活性调控,Wasser等[25]发现丹参可提高肝纤维化大鼠肝组织MMP m RNA表达抑制金属蛋白酶组织抑制因子21(Tissue inhibitor of metalloproteinase 21,TIMP21)m RNA表达。王爱民等[26]也证实复方丹参合剂能提高肝组织与血清胶原酶活性,促进胶原降解而逆转大鼠免疫损伤性肝纤维化,说明丹参促纤维化肝胶原降解的机制在于上调MMPs活性。

2.4 促进损伤肝细胞的修复,抑制炎性因子释放

炎性因子如肿瘤坏死因子2α(Tumor necrosis factor 2α,TNF2α)、血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)等可刺激肝脏间质细胞活化,促进肝纤维化发生。因此抑制炎症及炎性因子释放有防止肝纤维化发生的重要意义。张赤伟等[27]观察丹参对体外培养肝细胞[3H]胸腺嘧啶核苷酸掺入量的影响,结果丹参能促进肝细胞DNA的合成及肝细胞再生,同时肝窦内皮细胞易受炎症损伤,损伤后内皮素合成与分泌增加,丹参能降低异常升高的血清内皮素和ALT,恢复肝细胞、肝窦内皮细胞形态。王祯苓等[25]证实,丹参水煎剂明显降低CCl4诱导的急、慢性肝损伤大鼠的血清ALT水平,减轻肝细胞变性坏死,促进肝功能恢复,同时减少肝脏胶原沉积。TNF2α为巨噬细胞释放,可介导内毒素效应,导致肝细胞变性坏死,而丹参可降低TNF2α以防治肝损伤[28]。复方丹参可使动物肝脏的DNA合成率显著增加,说明丹参具有促进肝再生的作用[29]。

2.5 抑制HSC活化

HSC活化的重要表型特征在于细胞增殖及纤维生成能力增强,抑制HSC活化是抗肝纤维化的重要策略。丹参能抑制体外传代培养HSC的活化标志物α2平滑肌肌动蛋白(α2-smooth muscle actin,α2-SMA)的表达,抑制细胞Ⅰ型胶原生成[30]。刘丽等[31]研究丹参大鼠肝星状细胞(HSCs)增殖及胶原合成的抑制作用以及对粘着斑激酶(FAK)的影响,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测FAK m RNA,结果发现丹参具有抑制HSC增殖和胶原合成与促进HSC凋亡的作用,下调FAK是丹参抑制HSCs增殖及胶原合成的分子机制之一。郑元义等[32]研究认为丹参素对大鼠免疫性肝纤维化有明显的防治作用。其主要机制为丹参素对HSC明显的增殖抑制作用。韩涛等[33]证实,中药复方丹参能抑制HSC增殖,显著降低HSC2T6细胞Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原m RNA水平,并发现丹参能上调间质胶原酶基因表达而抑制TIMP21基因表达,从而增强胶原降解。蔡方刚等[3]认为丹参抗肝纤维化作用可能与TGF-β1和Ⅰ型胶原m RNA的表达下调有关。

γ-干扰素抗肝纤维化作用研究 第5篇

1 材料与方法

1.1 材料

细胞系:HSC细胞株 (r HSC-99) , 由北京大学人民医院肝胆外科中心冷希圣教授惠赠;试剂:透明质酸 (HA) 、层粘连蛋白 (LN) 、Ⅲ型前胶原 (PCⅢ) 放射免疫分析测定盒均购于上海海军医学研究所生物技术中心;注射用人重组IFN-γ购于上海克降生物技术有限公司。

1.2 细胞培养与分组

复苏r HSC-99冻存细胞株, 用含10%胎牛血清DMEM常规培养, 选生长状态良好、处于对数生长期的细胞, 以1105个/mL/孔的浓度接种于3块96孔板中, 每孔100μL, 放置于37.0℃、5%CO2孵育箱中过夜后, 用灭菌PBS洗3遍细胞, 加入无血清培养液继续培养16~24h, 使细胞生长进入同步期;弃上清液, 加入含不同浓度IFN-γ (空白对照、100、250、500、1000U/mL) 的无血清DMEM培养液, 每板各不同浓度组均设18复孔;3块96孔板分别继续培养24h、48h及72h。

1.3 上清液的收取及PCⅢ、LN、HA含量测定

按照24h、48h及72h分别收取3块96孔板的上清液, 收取方法:每板上不同浓度组内18个复孔中任意3个复孔收为1管, 每组6管, 每个时间点均为5个浓度组共计30管。按组及时间分别做好标记, 于-20℃冰箱中保存待用。严格按照试剂盒说明书由专业人员操作测定PCⅢ、LN、HA含量。

1.4 统计分析

实验数据以均数±标准差 (x軃±s) 表示, 应用SPSS11.5软件包, 组间比较采用单因素方差分析, 变量之间的相关性用线性相关回归分析, P<0.05为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 IFN-γ对rHSC-99细胞形态和生长的影响

于倒置纤维镜下可见rHSC-99细胞贴壁生长良好, 呈现星状、梭状等, 在所有实验IFN-γ的浓度下均未见细胞形态有明显改变。

2.2 IFN-γ对rHSC-99细胞分泌PCⅢ、HA和LN的影响

观察发现:①IFN-γ对r HSC-99细胞分泌PCⅢ、HA和LN的抑制作用随着用药剂量的增加而明显增强 (P<0.05) ;②IFN-γ在作用24、48和72h后, 对r HSC-99细胞分泌PCⅢ、HA和LN的抑制作用逐渐增强 (P<0.05) 。如图1、图2、图3所示。

3 结论

(1) 不同剂量的IFN-γ对rHSC-99细胞的形态无明显影响作用。

(2) IFN-γ对rHSC-99细胞培养上清液内PCⅢ、LN、HA含量的抑制作用具有浓度效应依赖关系、时间效应依赖关系, 以及量效平台期。

(3) 本实验进一步证实IFN-γ具有抑制肝纤维化的作用, 可在临床上推广应用, 但需注意使用合适的剂量和治疗周期。

4 讨论

肝纤维化是多种慢性肝病晚期共有的组织学变化, 是多种类型细胞、氧化压力、细胞因子和生长因子等一系列复杂作用的结果。HSC具有生成ECM, 分泌细胞因子以及收缩等多种功能, 在肝硬化、门静脉高压症的发生发展中起到关键性的作用[4]。

本实验通过放射免疫分析法检测得知IFN-γ在100U/mL~1000U/mL浓度对r HSC-99细胞分泌ECM具有抑制作用, 其抑制作用在一定的剂量范围内及时间区间内具有剂量依赖性和时间依赖性。可见IFN-γ对r HSC-99细胞分泌ECM具有强大的抑制作用, 这与既往多数学者的实验结果相一致。IFN-γ抗纤维化的可能机理如下:①Rockey等[5]报道IFN-γ能抑制HSC活化, 并减少总蛋白的合成;②Weng等[6]报道IFN-γ降低成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA水平, 使胶原合成减少, 同时促进胶原降解;③通过抑制其它细胞因子而影响ECM的沉积[7,8];④Saile等[9]报道IFN-γ对于激活的HSC具有促进凋亡的作用。

因IFN-γ对r HSC-99细胞分泌ECM的抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性, 可推断其用于临床时掌握一个合适的用药剂量及治疗周期十分必要。近年来, 许多学者作了大量的研究来评价外源性IFN-γ对肝纤维化的影响, 并分析了肝纤维化患者内源性IFN-γ水平的变化规律, 为IFN-γ的临床应用奠定了理论基础。相信随着研究的不断深入, 能为最终征服肝纤维化提供一条崭新的思路。

参考文献

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抗肝纤维化 第6篇

1 临床资料

1. 1 诊断标准采用2000 年中华医学会与寄生虫病分会, 肝病学分会联合制订的《病毒性肝炎防治方案》［1］及中国中西医结合学会肝病专业委员会制定的《肝纤维化中西医结合诊疗指南》［2］中的诊断标准; 中医辨证分型标准参照2002年中华人民共和国卫生部颁布的《中药新药临床研究指导原则》中的慢性乙型肝炎的辨证分型标准［3］, 辨证为气阴两虚、瘀血内结证。

1. 2 一般资料病例均为2008 年1 月~ 2011 年1 月济南市传染病医院的肝炎门诊就诊患者。随机分为治疗组和对照组。治疗组40 例, 其中男29 例, 女11 例; 平均年龄 ( 42.56 ±10.02 岁) ; 平均病程11.15 ±6.38 年。对照组40例, 其中男31 例, 女9 例; 平均年龄 ( 44.10 ±9.32) 岁, 平均病程 ( 12.33 ±5.61) 年。两组在性别、年龄、病程等方面均无显著性差异 ( P >0.05) 。治疗前两组均签署知情同意书。

2 方法

2. 1 治疗方法治疗组: 用芪冬复肝合剂, 其成分为黄芪3g ( 相当于中药饮片30g) 、麦门冬3g ( 相当于中药饮片30g) 、蚤休2g ( 相当于中药饮片10g) 、三七粉3g。方由深圳999 药业股份有限公司提供的免煎颗粒冲剂组成, 每日1剂, 180 日为1 疗程。对照组: 予大黄虫丸 ( 广东阳江制药厂生产) 口服, 每次40 丸, 每日3 次, 180 日为1 疗程。两组均辅以饮食、休息、情志调理及保肝降酶药。

2. 2 肝纤维化指标检测采用化学发光法检测, 试剂盒购于北京源德生物工程有限公司。

2. 3 统计学处理采用SPSS16. 0 统计软件进行处理, 计量资料以 ( ±s) 表示, 采用t检验; 计数资料采用 χ2检验。

3 结果

3. 1 疗效标准参照2002 年中华人民共和国卫生部《中药 ( 新药) 临床研究指导原则》［3］疗效标准判定。

3. 2 两组疗效分析结果见表1 ~ 2。

与对照组比较△P<0.05, △△P<0.01

与本组治疗前比较*P<0.05, **P<0.01;与对照组治疗后比较△P<0.05

4讨论

肝纤维化是各种损害因素导致的肝细胞发生炎症坏死, 肝内纤维结缔组织异常增生的过程, 其形成机制不外乎肝脏细胞外基质 ( ECM) 主要包括各种胶原、非胶原糖蛋白、蛋白多糖的合成增加和/或降解减少所导致的ECM过度沉积所致。其间大致经历数年甚至数十年的演化过程。

中医学认为“久病必虚”、“久病入络”。无论何种因素损害肝脏皆可导致肝失疏泄, 日久耗气伤阴, 气伤不能率血运行, 阴伤无以润泽血脉而致络脉瘀阻, 瘀久可以滋生肝热, 热毒内生。因此在治疗方面宗《素问·阴阳应象大论》“治病必求于本”、“虚者补之”、“结者散之”之旨, 从益气养阴、活血散结入手, 精选药物, 合理配方, 组成芪冬复肝合剂。其中黄芪、麦冬益肝气、养肝阴为君药, 一阳一阴相得益彰; 田三七通脉行瘀, 改善肝脏微循环, 助黄芪、麦冬增强益气养阴的效果为臣药; 蚤休为苦泄解毒之品, 《本草正义》谓“能入足厥阴肝经, 清解肝胆之郁热”为佐使药。全方共奏益气养阴、活血解毒散结之功效。现代药理研究证实黄芪含黄酮、皂甙类成分, 可抑制胶原合成并促进其降解而对实验性肝纤维化具有治疗作用［4］。麦冬具有免疫调节、抗衰老、抑制平滑肌细胞增值的作用［5］。三七皂甙能明显降低肝纤维化大鼠血清中Ⅲ型前胶原 ( PC - Ⅲ) 、透明质酸 ( HA) 、层黏蛋白 ( LN) 的含量［6］。蚤休的化学成分甾体皂甙、黄酮苷及氨基酸具有抗肿瘤、止血止痛、抑菌消炎、免疫调节等作用［7］。通过瞬时肝弹性测定表明芪冬合剂具有明显的增强肝脏弹性作用［8］。本研究结果表明芪冬复肝合剂治疗组显效率为65% , 总有效率为90% ; 与对照组相比有显著性差异 ( P <0. 05) , 且能显著降低层黏蛋白 ( LN) 、透明质酸 ( HA) 、Ⅲ型前胶原 ( PC -III) 、Ⅳ型胶原的血清水平, 两组相比有显著性差异 ( P <0.05) 。表明芪冬合剂对肝纤维化具有确切临床疗效, 益气养阴、活血散结是肝纤维化的重要治法。

参考文献

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抗肝纤维化 第7篇

关键词：赤芍,指纹图谱,抗肝纤维化作用,谱效关系,粒度

2010年版《中华人民共和国药典》( 一部) 规定赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根[1],具有清热凉血、散瘀止痛之功效。赤芍在心血管系统方面的药理作用显著[2,3],但也有相关药理实验[4,5]表明赤芍具有一定的抗肝纤维化作用。

中药材经粉碎后[6],可以使细胞破壁,粉体比表面积增大,具有良好的溶解性、化学活性和生物活性,有助于提高中药有效物质的溶出和吸收,提高生物利用度,从而增强临床疗效。因此,可看出中药材的不同粉碎粒度对其质量势必会产生重要影响。中药材的质量长期以来多以单一指标进行控制和评价质量,难以真正体现中药的多效性和整体性[7]。因此指纹图谱与中药药效评价相结合的评价模式应运而生,从而更有针对性地控制中药质量[8,9]。

本研究以赤芍为模型药,采用四甲基偶氮唑盐( thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT) 法研究不同粉碎度对赤芍抑制肝星状细胞LX-2增殖的影响,同时考察不同粉碎度赤芍药材的谱效关系,一方面为中药材质量控制建立有效的方法,另一方面为阐明粉碎度对中药材质量的影响提供客观和实证参考。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1材料所购买的赤芍药材经解放军三〇二医院袁海龙研究员鉴定,为毛茛科植物川赤芍Paeo-nia veitchii Lynch的干燥根; 肝星状细胞LX-2 ( 北京协和细胞资源中心) 。

1. 1. 2仪器精密电子天平( BT-25S型,赛多利斯科学仪器有限公司) ; 岛津高效液相色谱仪 ( LC-20AT型,含在线脱气机,四元梯度泵,自动进样器,DAD检测器) ; 电子调温电热套( MYB型,天津市中环实验电炉有限公司) ; 旋转蒸发仪( RE52型,上海亚荣生化仪器厂) ; XDS-1B倒置生物显微镜( 北京京瑞天下科技有限公司) ; Multiskan GO全波长酶标仪( Thermo Scientific) 。

1. 1. 3试剂芍药苷对照品( 批号110736-200422,中国药品生物 制品检定 所 ) ; 胎牛血清 ( 批号DPEO166,美国Hy Clone公司) 。四甲基偶氮唑盐( MTT,批号1324B37) 、二甲基亚砜( dimethyl sulfox-ide,DMSO,批号20120305224) 均购于美国Amresco公司; 色谱乙腈,重蒸水,其余试剂均为分析纯。

1. 2 方法

1. 2. 1样品制备取赤芍药材于40℃干燥30分钟,经粉碎后,分别过100目( S1) 、150目( S2) 、200目( S3) 、300目( S4) 筛,制成不同粒度的赤芍粉末样品,备用。

1. 2. 2 HPLC测定赤芍药材指纹图谱方法建立

色谱条件: 色谱柱为Alltima C18柱( 250 mm×4. 6 mm,5μm) ; 流动相为乙腈( A) - 0. 1% 磷酸溶液( B) ,梯度洗脱程序为: 0 ~ 10分钟,5. 0% ~ 9. 0% A,10 ~ 16分钟,9. 0% A,16 ~ 22分钟,9% ~ 10. 0% A,22 ~ 23分钟,10% ~ 11. 0% A,32 ~ 42分钟,11. 0% ~12. 0% A,42 ~ 60分钟,14. 0% ~ 15% A,60 ~ 70分钟,15. 0% ~ 22. 0% A,70 ~ 85分钟,22. 0% A; 体积流量为1. 0 m L/min; 室温,检测波长为242 nm,进样量为10μL。

对照品溶液制备: 取芍药苷对照品适量,精密称定,置量瓶中,加甲醇制成每1 m L含芍药苷40. 26μg的对照品溶液,即得。

供试品溶液制备: 分别精密称取不同粉碎粒度赤芍药材各2. 0 g,分别置于50 m L锥形瓶中,加入50% ( v / v) 乙醇25 m L,称重,超声提取50分钟,取出放冷,补足重量,摇匀,取续滤液,用0. 22μm微孔滤膜滤过,即得。部分冷冻干燥,供抗肝纤维化试验。

1. 2. 3细胞培养复苏后的肝星状细胞LX-2均匀接种于DMEM培养液中 ( 含20% 胎牛血清;1×10 U / L青霉素; 100 mg / L链霉素以及所需氨基酸和葡萄糖等营养物质) ,于培养箱( 37℃,5% CO2)中培养,当细胞处于对数生长期时,用胰酶消化,培养液悬浮细胞。调整细胞浓度后,每孔200μL接种于96孔培养板培养24小时[10],细胞单层铺满孔底后,备用。

1. 3 统计学处理

采用SPSS 19. 0统计软件对数据进行One-WayANOVA分析及Pearson相关性分析,P < 0. 01时认为具有显著性差异。

2 结果

2. 1 共有峰的标定

采用相对保留时间标定共有指纹峰,结果赤芍HPLC指纹图谱标定了19个共有峰,峰11为芍药苷,见图1。

( OD/490nm)  ± s,n = 6)

注: 与空白对照组比较,aP < 0. 01

图 1 不同粒度赤芍的 HPLC 指纹图谱

2. 2 抗肝纤维化作用研究

2. 2. 1样品添加量考察结果按照1. 3操作将复苏后的肝星状细胞LX-2均匀接种96孔板,随机分成8组( 10% 、20% 、30% 、40% 空白对照组及10% 、20% 、30% 、40% 赤芍药材提取液的提取液组) ,每组设6个平行孔。空白对照组加入含相应浓度生理盐水的DMEM培养基,赤芍药材提取液的提取液组加入含相应浓度提取液的DMEM培养基,作用24小时,吸除96孔板的上清液,每孔加入5 mg/m L的MTT液20μL,继续孵育4小时,加入DMSO 200μL,振荡10分钟后,使结晶物充分溶解。在490 nm波长下,用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值( OD490) ,结果见表1。由表1可知,肝星状细胞LX-2增殖受生理盐水浓度的影响不大,赤芍提取溶液组4种浓度对肝星状细胞LX-2增殖有抑制作用,采用单因素方差分析,20% 、30% 、40% 提取液组与相应浓度的空白对照组比较有显著性差异( P < 0. 01) 。40% 赤芍药材提取液组抑制效果最好。

2. 2. 2不同粒度赤芍药材提取液对肝星状细胞LX-2增殖的影响按照1. 3操作将复苏后的肝星状细胞LX-2均匀接种96孔板,调整细胞浓度后,接种于96孔( 每孔200μL) 培养板培养24小时,加入40% 赤芍药材提取液,每组设6个平行孔,作用24小时,吸除96孔板的上清液,每孔加入5 mg /m L的MTT液20μL,继续孵育4小时,加入DMSO200μL,振荡10分钟后,使结晶物充分溶解[10]。在490 nm波长下,用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值( OD490) ,计算各样品提取液的细胞抑制率,抑制率( % ) = ( OD0- OD1) / OD0×100% ,其中OD1为给药组OD490值,OD0为空白对照组OD490值,结果见表2。由结果可知,不同粉碎粒度的赤芍药材提取液对肝星状细胞LX-2增殖均有影响( P < 0. 01) ,200目与300目赤芍药材提取液对肝星状细胞LX-2的抑制效果接近( P > 0. 05) 。

注: 与空白对照组比较:aP < 0. 01; 与 300 目组比较:bP < 0. 01

2. 2. 3赤芍药材谱效关系分析供试品溶液色谱图中以峰11( 芍药苷) 为参比峰,其相对峰面积为1,计算指纹图谱共有峰的相对峰面积比值,同时,计算各供试品溶液OD值与空白对照组OD值的差值R,样品S1、S2、S3、S4的R值分别为0. 1889、0. 2652、0. 3108、0. 3151。采用SPSS 19. 0软件对数据进行Pearson相关性分析,计算各特征共有峰与各粉碎粒度的赤芍药材提取液对肝星状细胞LX-2抑制的OD值的Pearson相关系数,结果见表3。其中300目赤芍提取液的抑制效果最好,19个特征峰中峰13与肝星状细胞LX-2抑制效果( OD值) 成负相关,其余各峰成正相关; 峰16相关系极低,呈极弱相关; 峰9相关性较峰16高,呈弱相关; 峰7、峰17相关性较高,呈强相关; 其余各峰均呈极强相关。

3 讨论

抗肝纤维化 第8篇

关键词：甘利欣,多烯磷脂酰胆碱,肝纤维化

目前, 肝脏纤维化是由多种原因引起的以肝内结缔组织的异常增生为病理过程的慢性肝损害, 是慢性肝病发展到肝硬化的必经过程。肝纤维化的进展常为慢性、隐匿性的, 早期尚有逆转为正常的可能, 晚期则为非可逆性的。多烯磷脂酰胆碱可提供高剂量、容易吸收利用的高能多烯磷脂酰胆碱, 这些多烯磷脂酰胆碱的在化学结构上与重要的内源性磷脂一致它们主要进入肝细胞, 并以完整的分子与肝细胞膜及细胞器膜相结合对肝纤维化具有一定的治疗作用。将甘利欣与多烯磷脂酰胆碱两药进行联合应用对治疗肝纤维化作用显著, 现报告如下。

1资料与方法

1.1 一般资料

选患者60例, 其中男35例, 女25例, 年龄19～60岁, 平均40.5岁, 病程平均4.5年。诊断符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》和2000年西安肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断分型标准[1], 同时符合下列条件:全部肝功能异常;血清肝纤维化指标透明质酸 (HA) , Ⅳ型胶原 (Ⅳ-C) , Ⅲ型前胶原 (PC-Ⅲ) , 层粘蛋白 (LN) 4项指标中≥2项异常, 超声检查有肝实质回声异常。

1.2 分组

将患者随机分为三组:①治疗组20例 (甘利欣和多烯磷脂酰胆碱) ;②对照组20例 (甘利欣组) ;③对照组20例 (多烯磷脂酰胆碱组) 。三组患者在性别、年龄、病程、病情轻重程度方面经统计学处理, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。治疗前三组患者肝功能均不正常, 血清肝纤维化指标较高, 所有患者均戒烟酒, 清淡饮食。

1.3 治疗方法

①治疗组:予甘利欣150 mg和多烯磷脂酰胆碱15 ml, 分别加入5%葡萄糖注射液200 ml静脉滴注, 1次/d, 2个月为1个疗程。②甘利欣组:予甘利欣150 mg加入5%葡萄糖注射液200 ml静脉滴注, 1次/d, 2个月为1个疗程。③多烯磷脂酰胆碱组:予多烯磷脂酰胆碱15 ml, 加入5%葡萄糖注射液200 ml静脉滴注, 1次/d, 2个月为1个疗程。

1.4 观察指标及检测方法

肝功能:包括血清总胆红素 (TBil) 、丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 、天门冬氨酸转氨酶 (AST) 、血清白蛋白 (AIb) 、球蛋白 (GIb) , 采用自动生化分析仪进行检测, 上述指标每2周检测1次。肝纤维化指标:包括透明质酸 (HA) , Ⅳ型胶原 (Ⅳ-C) , Ⅲ型前胶原 (PC-Ⅲ) , 层粘蛋白 (LN) , 均采用放射免疫法[2]。上述指标治疗前后各检测1次。

2结果

2.1 1个疗程后三种治疗方法对肝功能主要指标均有改变, 治疗组测定值 (TBil、ALT、AST) 较治疗前下降>60%, 对照组测定值 (TBil、ALT、AST) 较治疗前下降<40%, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

2.2 1个疗程后三组血清肝纤维化指标均有明显下降, 而治疗组下降幅度>60%, 优于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。

2.3 不良反应:三组患者用药后均无明显的不良反应。

3讨论

在正常肝组织中, 各种细胞及细胞外基质有精确的相对比例和特定的相对空间位置, 通过细胞之间、细胞与细胞外基质之间的信号传递精确地调控着结构、功能和代谢状态, 成为一个相对稳定的微生态系统。从动态的观点来看, 纤维增生是指各种细胞外基质合成增加, 而纤维分解则是指细胞外基质的降解过程;肝纤维化的发生、发展和转归取决于二者的“净效应”。目前认为肝纤维化是肝损伤持续存在, 组织发生修复时细胞外基质合成与降解失衡而引起的病理改变, 是涉及复杂的细胞及分子机制的动态过程。肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞是肝纤维化发生发展的核心环节, 各种致肝纤维化因素均肝星状细胞把作为最终靶细胞, 通过促使其转化为肌成纤维细胞这一共同途径导致肝纤维化的形成。 肝纤维化过程是肝细胞炎性坏死, 炎性反应刺激时肝脏内纤维化结缔组织增生的病理过程。肝纤维化的诊断迄今仍以组织病理检查最为可靠。近年来国内外学者致力于寻求反映肝纤维化无创性血清学指标。血清4项纤维化指标对于了解肝脏炎性活动和肝纤维化过程有较高的临床价值[3]。抗肝纤维化的药物治疗主要包括第一针对原发病去除致病因素, 如抗乙型肝炎、丙型肝炎病毒治疗、抗血吸虫治疗、戒酒等。第二针对肝纤维化本身的治疗, 如通过抑制炎症或脂质过氧化, 或者抑制肝星状细胞的增生活化, 以及促进胶原降解等。

甘利欣的主要成分为甘草酸二铵, 甘草酸二铵具有较强的抗炎、保护肝细胞膜和改善肝功能的作用。甘利欣可减轻因四氯化碳、硫代乙酰胺和D-氨基半乳糖对肝脏的形态损伤, 改善免疫性因子对肝脏形态的慢性损伤, 临床以应用于病毒性肝炎的治疗。一些资料还提示甘草酸二铵还具有直接抑制纤维细胞的增值与细胞外基质的产生[4]。

多烯磷脂酰胆碱可提供高剂量、容易吸收利用的高能多烯磷脂酰胆碱, 这些多烯磷脂酰胆碱的在化学结构上与重要的内源性磷脂一致。它们主要进入肝细胞, 并以完整的分子与肝细胞膜及细胞器膜相结合, 另外, 可分泌入胆汁。因此多烯磷脂酰胆碱通过直接影响膜结构使受损的肝功能和酶活力恢复正常;调节肝脏的能量平衡;促进肝组织再生。

本组采用甘利欣和多烯磷脂酰胆碱治疗慢性乙型肝炎, 治疗后与治疗前比较, Tbil 、ALT 、AST、A/G差异有统计学意义 (P<0.05) , 血清HA、Ⅳ-C、PC-Ⅲ在治疗前明显高于正常值, 经治疗后明显下降 (P<0.05) , 说明甘利欣联合多烯磷脂酰胆碱可明显减轻和抑制肝纤维化形成, 在改善肝功能及抗纤维化方面有互补作用, 值得进一步推广使用。

参考文献

[1]中华医学会, 病毒性肝炎防治方案, 中国肝脏病杂志, 2000, 8 (6) :324.

[2]陈桂轩, 翟洁卿, 甘利欣联合复方丹参抗肝纤维化的疗效观察.吉林医学, 2009, 30 (9) :808.

[3]缪国励, 石裕明.肝脏病理检查与血清肝纤维化指标的关系探讨.中西医结合肝病杂志, 2002, 12 (1) :39.