凋亡诱导因子范文

凋亡诱导因子范文（精选9篇）

凋亡诱导因子 第1篇

目前,人TRAIL在多种表达系统中获得表达,如大肠杆菌[4,5,6,7,8]、毕赤酵母[9]、昆虫细胞[2]和哺乳动物细胞[1]等,其中大肠杆菌表达系统具有遗传背景简单、技术成熟和周期短等优点,是研究最多的系统,但目前大肠杆菌表达的TRAIL多以包涵体或融合蛋白形式表达,包涵体和融合蛋白均需前处理过程而影响蛋白的最终产率和成本,而蛋白可溶形式则克服这些问题,更有利于进一步的产业化。

本研究通过对大肠杆菌宿主和诱导温度进行优化,最终获得TRAIL高表达的可溶形式蛋白,体外活性检测结果表明,获得的蛋白质具有良好的抑制多种癌细胞增殖的能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株和细胞株

大肠杆菌DH5α为作者实验室保存,表达质粒pET43.1a及表达菌株均购自Promega公司。测活所用各种癌细胞株均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 试剂

所有工具酶购自Promega公司;胶回收试剂盒GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit购自GE Healthcare公司;缓冲液A:50 mmol/L PB、0.15 mol/L NaCl,pH 8.0;缓冲液B:50 mmol/L PB,pH 8.0;缓冲液C:20 mmol/L PB,pH 7.0,LB培养基购自Oxoid公司。

1.2 方法

1.2.1 TRAIL基因合成和重组质粒构建

根据GenBank(登录号:HSU37518)合成TRAIL(编码114-281aa)序列,分别在5′端和3′端引入NdeⅠ和SalⅠ酶切位点,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

利用NdeⅠ、SalⅠ双酶切合成的TRAIL基因,与同样酶处理的pET43.1a载体连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,进行测序鉴定。

1.2.2 TRAIL蛋白表达

1.2.2.1 TRAIL在JM109(DE3)中表达

将构建重组质粒转化大肠杆菌JM109(DE3),挑取阳性转化子,转接于含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中,37℃、220 r/min振荡培养至OD600=0.6,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导5h,SDS-PAGE检测蛋白表达。

1.2.2.2 宿主筛选

将重组质粒分别转化BL21(DE3)、BL21pLysS(DE3)和Rosetta(DE3),SDS-PAGE检测表达,并与JM109(DE3)中蛋白表达量进行比较。将表达量较高的菌株在1mmol/L IPTG、28℃条件下诱导表达9h,收集诱导后菌体,超声波裂解后,SDS-PAGE分析蛋白表达形式。

1.2.2.3 诱导温度优化

确定宿主筛选后,对可溶形式表达最优的菌株进一步进行诱导温度优化(37℃、30℃、25℃和20℃),选择最适可溶表达形式的温度。

1.2.3 TRAIL纯化

收集菌体,超声破碎后离心除去沉淀。上清中加入终浓度65%(m/V)硫酸铵,4℃放置4h后,离心收集沉淀,用缓冲液A溶解,补加Tween80使其终浓度为0.2%(V/V)。用缓冲液A平衡Ni Sepharose 4B层析柱,上样,用含300 mmol/L咪唑的缓冲液A洗脱,收集洗脱峰。利用缓冲液B平衡的Sephadex G25对洗脱产物进行脱盐,脱盐产物再经用缓冲液B平衡的Q sepharose FF层析柱,收集穿出部分,用0.2 mmol/L NaH2PO4调节pH值至6.5,上样于缓冲液C平衡的Source 30 S柱,用含0.6 mmol/L NaCl的缓冲液C洗脱,收集目标产物。

1.2.4 体外活性检测

将人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人结肠癌细胞COLO205和HCT116、人胰腺癌细胞SW1990和人乳腺癌MDA-MB-231培养至对数生长期,分别消化后用培养基悬浮细胞,使其终浓度为3～5104个/mL,每孔100μL加入96孔细胞培养板中,37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后弃去培养上清,每孔加入200μL培养基稀释的TRAIL,终浓度分别为1 000、100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/mL,同时以培养基稀释的PBS作为空白对照,培养48 h后,磺酰罗丹明B染色15 min,酶标仪检测各孔的OD490值。 按公式(OD490对照孔- OD490给药孔)/ OD490对照孔100%计算抑制率,用GraphPad Prism 4软件四参数法计算IC50值。

2 结果与分析

2.1 TRAIL表达载体构建

构建TRAIL表达载体pET43.1a-TRAIL后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性转化子进行测序验证,结果表明基因片段与设计的TRAIL基因序列完全一致,并且阅读框正确。

2.2 TRAIL蛋白表达

2.2.1 TRAIL在JM109(DE3)中表达

阳性转化子经IPTG诱导后收集菌体,SDS-PAGE检测蛋白质表达,结果显示,与未诱导菌株相比,诱导后菌株总蛋白中出现分子量约为19 kDa的蛋白条带(图1),与TRAIL蛋白大小相符,表明TRAIL获得表达,利用ImageMaster VDS软件(Pharmacia Biotech)分析表明TRAIL表达量约占全菌总蛋白的30%。

1:蛋白分子量标准;2～5:阳性转化子诱导后菌体总蛋白;6:未诱导菌体总蛋白。

2.2.2 宿主筛选

将pET43.1a-TRAIL转化BL21(DE3)、BL21pLysS(DE3)、Rosetta(DE3)和JM109(DE3)宿主中,经过IPTG诱导,对全菌蛋白进行SDS-PAGE检测(图2 A、B)。经过软件分析,目的蛋白在JM109(DE3)和Rosetta(DE3)中表达量相当,高于在BL21(DE3)和BL21pLysS(DE3)中的表达量。

进一步分析JM109(DE3)和Rosetta(DE3)中蛋白的表达形式(图3),JM109(DE3)和Rosetta(DE3)中可溶形式蛋白含量分别约为70%和50%,而JM109(DE3)和Rosetta(DE3)菌体密度OD600分别为2.07和5,导致Rosetta(DE3)中可溶形式表达蛋白表达量为JM109(DE3)的2倍,最终选择Rosetta(DE3)作为TRAIL表达宿主。

A.1: 蛋白分子量标准; 2～4: BL21(DE3)菌株; 5～7: BL21pLysS(DE3)菌株; 8～11: JM109(DE3)菌株。B.1: 蛋白分子量标准; 2～6: Rosetta(DE3)菌株; 7: JM109(DE3)菌株。

A.1: Protein marker; 2-4: BL21 (DE3) strain; 5-7: BL21pLysS (DE3) strain; 8-11: JM109 (DE3) strain.B.1: Protein marker; 2-6: Rosetta (DE3) strain; 7: JM109 (DE3) strain.

1:JM109(DE3)未诱导菌体总蛋白;2:蛋白分子量标准;3～5:JM109(DE3)诱导;6～8:Rosetta(DE3)诱导;3,6:菌体总蛋白;4,7:裂解液沉淀;5,8:裂解液上清。

2.2.3 诱导温度优化

在37℃、30℃、25℃和20℃温度条件下,诱导Rosetta(DE3)中TRAIL表达,利用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达形式(图4 A、B)。

软件分析表明:诱导温度为37℃、30℃、25℃和20℃时,TRAIL可溶形式蛋白所占比例分别为33%、47%、55%和55%;结合蛋白质表达量和细胞密度,30℃和25℃条件下可溶形式蛋白表达量相当,高于37℃和20℃表达量,最终选择25℃为诱导温度。

经过优化,最终选择Rosetta(DE3)为宿主、诱导温度为25℃,TRAIL可溶形式蛋白含量为55%。

2.3 TRAIL纯化及体外活性检测

经过多步纯化后,获得纯度高于95%的TRAIL蛋白质样品。

体外活性检测结果表明,制备的TRAIL蛋白质样品对5种不同来源的癌细胞株增殖均具有显著的抑制作用,抑制率达到70%～92%,并且具有明显的量效关系(图5),对HCT 116、MDA-MB-231、COLO 205和NCI-H460的IC50分别为2.57、7.01、10.20和12.56 ng/mL。

A.1: 蛋白分子量标准; 2～4: 37℃诱导; 2: 全菌总蛋白; 3: 裂解液上清; 4: 裂解液沉淀。B.1: 蛋白分子量标准; 2: 诱导前全菌总蛋白; 3～5: 30℃诱导; 6～8: 25℃诱导; 9～11: 20℃诱导; 3, 6, 9: 全菌总蛋白; 4, 7, 10: 裂解液沉淀; 5, 8, 11: 裂解液上清。

A.1: Protein marker; 2-4: Product induced at 37℃; 2: Total protein; 3: Supernatant of lysate; 4: Pellet of lysate.B.1: Protein marker; 2: Uninduced product of Rosetta (DE3); 3-5: Product induced at 30℃; 6-8: Product induced at 25℃; 9-11: Product induced at 20℃; 3, 6, 9: Total protein; 4, 7, 10: Pellet of lysate; 5, 8, 11: Supernatant of lysate.

3 讨论

在我国,恶性肿瘤死亡率位居所有疾病之首,且近几年人口老年化加剧、生活节奏加快和环境污染等因素,导致癌症发病率快速增加。而TRAIL前期研究结果表明[10,11],有望提供一种新的癌症治疗方式,开发成新型癌症治疗药物。

目前,多家国内、外制药企业进行TRAIL开发,但重组表达TRAIL形式多为包涵体或融合[4,6,7,8],所以存在着收率低、成本高等诸多问题,不利于大规模工业生产。本研究成功将TRAIL在大肠杆菌中表达,进一步对宿主和诱导温度优化,使最终可溶形式表达的TRAIL达到总表达量的55%,整体工艺比文献报道简单[12]。经过较简单的纯化后,获得纯度大于95%的蛋白质纯品,体外细胞活性检测结果表明,获得TRAIL样品对5种不同来源的癌细胞增殖均具有显著的抑制作用,抑制率达到72～90%,与国外报道一致[13,14],证明获得的TRAIL样品具有良好的抑制多种肿瘤细胞增殖活性。

总之,利用本研究策略,TRAIL在大肠杆菌中以可溶形式获得高效表达,简化了发酵和纯化工艺,且纯化获得的样品具有良好的生物学活性,为其开发为抗肿瘤药物奠定了良好的基础。

摘要：目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)高表达工程菌株,以获得具有生物学活性的重组TRAIL蛋白。方法:合成TRAIL基因,转到大肠杆菌中,IPTG诱导获得成功表达;进一步优化,增加可溶形式的蛋白质。利用硫酸铵对发酵液进行沉淀,经Ni柱、阴离子和阳离子交换柱层析,最终获得蛋白质纯品,对其进行体外活性检测。结果:经过IPTG诱导后,TRAIL达到菌体总蛋白的30%;经过优化,可溶形式蛋白达到55%。纯化获得纯度高于95%的TRAIL样品,体外测活结果表明:TRAIL蛋白能有效抑制多种肿瘤细胞增殖,抑制率达到70%～92%。结论:重组TRAIL以可溶形式得到高效表达,且具有较好的生物学活性,为其开发成药用蛋白奠定基础。

凋亡诱导因子 第2篇

用氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人髓系白血病细胞株U937细胞凋亡,并研究其作用机制.用脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术(TUNEL法)、流式细胞仪和DNA断裂分析检测细胞凋亡;用免疫组化检测c-fos、c-jun和c-myc蛋白表达,RT-PCR显示c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达水平.结果表明ox-LDL可致U937细胞凋亡,其作用具有浓度效应;ox-LDL可以上调c-fos、c-jun和c-myc基因表达,使c-fos、c-jun和c-myc蛋白合成增多,最终诱导U937细胞凋亡.

作 者：杨向东 杨永宗 黎健 YANG Xiang-Dong YANG Yong-Zong LI Jian 作者单位：杨向东,杨永宗,YANG Xiang-Dong,YANG Yong-Zong(衡阳医学院心血管病研究所,衡阳,421001)

黎健,LI Jian(卫生部北京老年医学研究所,北京,100730)

凋亡诱导因子 第3篇

【关键词】 芹菜素；膀胱癌；细胞增殖；细胞凋亡

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）12-0047-03

Abstract：Objective To study the effects of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， the MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. Apoptosis of 5637 cells was observed under a fluorescence microscope using Hoechst 33258 staining， 5637 tumorigenicity was messaured by soft colony formation assay. Results Apigenin causes concentration-dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. 5637 cells treated with apigenin showed significant morphological changes of apoptosis， and the cell tumorigenicity was inhibited as apigenin concentration increased. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells.

Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Proliferation； Apoptosis

膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤，其中移行细胞癌（Transitional Cell Carcinoma，TCC）占90%，又称为尿路上皮癌，其中70%～85%的移行细胞癌为表浅性膀胱癌[1]。临床中非肌层浸润性膀胱癌的常用治疗方法为经尿道膀胱肿瘤切除术[2]。然而，经尿道膀胱肿瘤切除术后的患者有50%～80%的复发，10%～25%的患者复发后发展为肌层浸润性膀胱癌[3]。为了抑制膀胱肿瘤的复发及进一步恶化，化疗以及免疫治疗被广泛用于浅表性膀胱癌患者的术后治疗中。较常用的膀胱内化疗及免疫治疗的药物包括顺铂、丝裂霉素 C、卡介苗以及干扰素-α[4-5]。这些方法虽然在一定程度上取得疗效，但是通常给患者带来不可逆转的系统毒性以及严重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[6]。因此，寻求无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物十分迫切。

芹菜素（5，7，4′-三羟基黄酮，Apigenin， API），又称芹黄素，是一种广泛存在于多种水果和蔬菜中的黄酮类化合物，具有多方面的药理作用[7-8]，以抗肿瘤作用最为突出。实验证明芹菜素在体外能够显著抑制多种类型的癌细胞的生长和诱导其凋亡，包括：宫颈癌[9]、卵巢癌[10]、结肠癌[11]、胃癌[12]等，而在膀胱癌中的作用研究鲜有报道。本实验观察了芹菜素对人膀胱癌5637细胞的生长抑制以及诱导凋亡作用。

1 材料与细胞

1.1 试剂 芹菜素（质量分数≥98%，批号：22806）购自阿拉丁公司；MTT，低熔点琼脂糖、二甲基亚砜（DMSO），蛋白酶抑制剂购自Sigma；Hoechst 33258，购置南京碧云天。RPMI 1640培养基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均购自GIBCO公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞株及细胞培养 人膀胱癌细胞株5637购自中国科学院上海细胞库；培养于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5% CO2、95% O2细胞培养箱内常规传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

2 实验方法

2.1 MTT法检测芹菜素对膀胱癌细胞5637增殖的影响 将5637细胞以3×103/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后分别加入不同浓度的芹菜素（20、40、80μmol/L），每孔100μl，每个浓度设4个复孔，同时以不加芹菜素为空白对照组培养72h 后，向每孔中加入5.0g/L的MTT 20μl继续培养4h，弃上清，向每孔中加入DMSO 200μl溶解结晶体，置于摇床振荡30min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪490nm波长处测定每孔吸光度值（A），并计算细胞增殖率（%）=（药物处理孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。实验重复3次，计算平均值。

2.2 Hoechst 33258 细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变 将5637细胞以2×105/孔接种于6孔板中，80μmol/L芹菜素（以不加芹菜素为空白对照组）作用24h后，吸去培养液，用PBS清洗2次，迅即加入4%的多聚甲醛液固定10min后，吸去固定液，以PBS清洗1次，加入5.0mg/L的Hoechst 33258，染色10min，用PBS 清洗3次后，在Zeiss Axio Observer A1荧光倒置显微镜下以340nm 激发光观察细胞凋亡形态并随机拍照。

2.3 软琼脂克隆形成实验检测芹菜素对5637克隆形成能力的影响 将1×103个5637细胞悬浮液1ml RPMI 1640 （0.3%低熔点琼脂糖，10%FBS， 1%双抗）并加入不同浓度的芹菜素（40、80μmol/L），接种于预处理的6孔板中，同时以不加芹菜素为空白对照组。6孔板预先放入1ml RPMI 1640 （0.6%低熔点琼脂糖， 10%FBS， 1%双抗）。培养3周以后，细胞克隆形成，采用0.01%结晶紫染色，观察计数。实验重复3次。

2.4 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，实验数据均以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P< 0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用 不同浓度芹菜素处理的细胞的增殖均受到不同程度的抑制，与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用呈一定的浓度依赖性，采用不同浓度（20、40、60、80μmol/L）处理后，随着浓度的增加，其抑制效果更明显。见图1。

3.2 芹菜素对5637细胞克隆形成能力的抑制作用 不同浓度芹菜素处理的细胞克隆形成能力均受到严重的抑制，与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。芹菜素对5637细胞的克隆形成能力的抑制作用呈一定的浓度依赖性，采用不同浓度（40、80μmol/L）芹菜素处理后，随着浓度的增加，其抑制效果更明显。见图2。（图2左图为芹菜素对5637细胞克隆形成抑制作用的观察；右图为芹菜素对5637细胞克隆形成抑制作用的统计学分析。）

3.3 芹菜素诱导5637细胞凋亡的形态学变化 采用Hoechst 33258染色的细胞核结果显示，80μmol/L芹菜素处理后，大量的5637细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征；与此相比，对照组的活细胞，细胞核膜完整，核呈圆形或椭圆形，染色质分布较均匀，细胞核为蓝色均匀淡染，并未见凋亡细胞（图3左图为芹菜素对5637细胞凋亡诱导的细胞核形态观察；右图为芹菜素对5637细胞凋亡诱导的统计学分析）。以上实验结果表明芹菜素可诱导5637细胞凋亡。

4 讨论

芹菜素作为一种广泛存在于植物中的天然黄酮类化合物，近年来已成为研究的热点[13]，但有关芹菜素抗膀胱癌作用的实验研究比较少。逃逸了正常细胞增殖的调控体系而自主地无限生长是肿瘤细胞的典型特征。通过MTT实验实验结果显示，20、40、60、80μmol/L芹菜素对人膀胱癌5637细胞的增殖能力具有显著的抑制的作用，且随着浓度的增加抑制效果更加明显，呈现出良好的和量效关系。芹菜素抑制膀胱癌细胞增值的主要机制，可能与其直接抑制5637细胞生长，并诱导5637细胞凋亡等有关。

在有机体中，细胞凋亡是一个复杂的生理和病理过程，肿瘤的增值与凋亡是调控肿瘤的发生、发展的最重要的因素之一。研究肿瘤的发生发展机制，寻找抑制肿瘤细胞增值，增加肿瘤细胞凋亡的分子药物，是抑制肿瘤生长，阻碍肿瘤发生、发展的一个重要途径。我们通过Hoechst 33258细胞核染色结果显示，80μmol/L芹菜素处理人膀胱癌5637细胞，大部分细胞细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征。肿瘤的自我更新能力是肿瘤细胞一个重要特征，我们采用软琼脂克隆形成实验检测芹菜素对膀胱癌5637细胞自我更新能力的影响[14]，结果显示，40、80μmol/L芹菜素对人膀胱癌5637细胞的克隆形成能力具有显著的抑制的作用，且随着浓度的增加抑制效果更加明显，呈现出良好的和量效关系。

总之，我们的研究发现芹菜素作为一种植物提取的活性成分，能够抑制人膀胱癌5637细胞的增殖以及克隆形成，并诱导其凋亡，芹菜素有望成为无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物。

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凋亡诱导因子 第4篇

近来研究表明TGF-β1表现出和瘤细胞增殖、新生血管、细胞转移和免疫抑制等一定的相关性, 肿瘤微循环中的细胞因子TGF-β1可以启动肾细胞的转移过程, 对肿瘤的发生、发展起到调控作用[2], 因此TGF-β1可以作为抗转移的一个潜在靶点, 现就本研究的结果内容报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

786-0细胞株 (北京博奥森生物技术有限公司) , 1640培养基 (北京博奥森生物技术有限公司) , CO2培养箱 (Bekman, 美国) , 流式细胞仪 (BD, 美国) , TGF-β1 (北京博奥森生物技术有限公司) 。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组。

肾癌786-0细胞常规下培养、传代, 将细胞分为实验组 (腺病毒转染组) 以及正常对照组 (未转染) 分别培养。

1.2.2 携带h TGF-β1基因重组腺病毒的构建。

将携带TGF-β1基因的腺病毒 (Ad-h TGF-β1) 与穿梭质粒p DC 316-m CMV-EGFP连接、重组, 用Lipofectamine 2 000介导与骨架质粒共同转染293 T细胞, 进行培养传代扩增。

1.2.3 Ad-h TGF-β1转染后的检测。

用RT-PCR检测, 引物由博奥生物科技有限公司合成, TGF-β1上游5'-GCAACAATTC-CTGGCGATAC-3', 下游5'-AGGCAGAAGTTGGCATGGTAG-3', β-actin上游5'-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3', 下游5'-GT-CACGCACGATTTCCCGCT-3'。

1.2.4 细胞凋亡检测。

分别于干预作用后24、36、48、60、72 h胰酶消化细胞, 制备细胞悬液, PBS冲洗、离心3遍, 加入PI 5μL后置流式细胞仪读取数据。

1.3 统计学处理

应用SPPS17.0统计软件进行数据分析, 组间比较采用多因素方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

转染24 h后TGF-β1 m RNA的表达与对照组比较明显增强, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。实验组24、36、48、60、72 h的凋亡率分别为 (7.55±0.03) %、 (8.53±0.11) %、 (13.47±0.23) %、 (15.51±0.26) %、 (16.59±0.26) %, 与对照组细胞各时相点比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。

3 讨论

肾癌的发生涉及多种癌基因协同作用, 当肾癌相关的原癌基因与抑癌基因之间的平衡被打破, 控制细胞增殖的原癌基因持续或过高表达, 同时抑癌基因不表达或失活时, 便会形成肾癌[3]。研究表明TGF-β1与肿瘤的发生、生长密切相关, TGF-β1表现出与肿瘤的增殖、新生血管生成、迁移与转移, 以及免疫抑制作用的相关性[4]。本次研究采用腺病毒在肾癌786-0系中转染TGF-β1因子, 研究结果表明24、36、48、60、72 h的凋亡率与对照组细胞各时相点比较差异显著, 进一步证实TGF-β1基因的表达缺失可能是肾癌发生、发展的关键环节。因此深入研究TGF-β1与肿瘤的发生、生长的关系对于肾癌的早期诊断与基因治疗都有重大意义。

参考文献

[1]HRABE JE, O&apos;LEARY BR, FATH MA, et al.Disruption of thioredoxin metabolism enhances the toxicity of transforming growth factorβ-activated kinase 1 (TAK1) inhibition in KRAS-mutated colon cancer cells[J].Redox Biol, 2015, 8 (5) :319-327.

[2]YUE B, QIU S, ZHAO S, et al.Lnc RNA-ATB mediated E-cadherin repression promotes the progression of colon cancer and predicts poor prognosis[J].J Gastroenterol Hepatol, 2015, 10 (21) :13206-13207.

[3]SEEGER P, MUSSO T, SOZZANI S.The TGF-βsuperfamily in dendritic cell biology[J].Cytokine Growth Factor Rev, 2015, 26 (6) :647-657

凋亡诱导因子 第5篇

依地福新是目前所发现的第一个通过激活细胞内Fas/CD95死亡受体而起作用的抗癌药物, 其抗癌机制涉及到膜阀 (membrane raft) 介导的过程[2]。在本实验中笔者将Fas、FADD、caspase-8酶原转入到酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae, S cercvisiae) 细胞中, 然后用依地福新进行处理, 以确定依地福新是否能激活Fas/FADD/caspase-8这一凋亡通路, 从而进一步阐明依地福新促细胞凋亡的机制。

1资料与方法

1.1 试验菌株

试验中使用的酿酒酵母菌株为:BY4742, MAT his3Δ leu2Δ lys2Δ ura3Δ。pGILDA质粒和大肠埃希菌活化态细胞DH5α, 均购自于Invitrogen Life Techologies (USA) 。

1.2 主要试剂

依地福新由华北生物制药公司 (合肥, 河北) 生产;酵母膏 (Yeast Extract) 、和TRIZOL试剂由GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA) 生产;DeadEndTM Fluorometric TUNEL System均购自于美国Promega公司。RT-PCR试剂盒购自于美国Invitrogen公司。NucleoSpin○RPlasmid Kits购自于美国BD Biosciences Clontech公司。其他试剂均为市售分析纯。

1.3 主要实验器械

荧光显微镜为Leica FW4000型, 由美国Leica公司生产。凝胶电子成像系统为IS1000 DIGITAL IMAGING SYSTEM, 由美国Alpha Innotech公司生产。PCR自动扩增仪为PE9600, 由美国Perkin Elmer公司生产。

1.4 实验方法

1.4.1 Fas、FADD、caspase-8酶原的PCR扩增

经检索GenBank, 获得Fas、FADD、caspase-8酶原完全CDS编码。根据引物设计原则, 并加入酶切位点, 设计引物后分别进行PCR, 并经琼脂糖凝胶和DNA序列测定确定准确无误后进行穿梭载体的构建。

1.4.2 Fas、FADD和caspase-8酶原穿梭载体的构建

用JETQUICK PCR纯化试剂盒将Fas、FADD、caspase-8酶原PCR扩增产物分别进行纯化, 测序验证正确后, 分别用相应的限制性内切酶将Fas、FADD、caspase-8酶原的PCR产物进行消化后, 以T4连接酶将目的基因与pGILDA表达载体连接, 连接液转化感受态DH5α细胞, 提取质粒, 酶切验证正确后, 进行DNA序列测定 (基康公司, 上海) 。构建出的重组表达载体分别命名为pGILDA-Fas、pGILDA-FADD、pGILDA-procaspase-8。

1.4.3 半乳糖诱导的人Fas、FADD和caspase-8在S.

cerevisiae中的表达 通过S. cerevisiae细胞的电转化, 笔者得到了含有pGILDA质粒、Fas/FADD、Fas/FADD/caspase-8的三种不同克隆的酵母细胞。将细胞生长于含有2%的半乳糖的MM培养基中, 通过半乳糖启动子诱导Fas、FADD、caspase-8的表达。

1.4.4 液体培养基中S.

Cerevisiae细胞的生长抑制试验 将细胞生长于含有2%的半乳糖的MM液体培养基中, 并加入2.0μM的edelfosine以诱导S. Cerevisiae产生凋亡应答。分别于0 h、1 h、3 h和6 h测定其OD595值。通过计算各自OD595的比值比较存活细胞的数目, 以判断细胞凋亡的程度。

1.4.5 固体培养基中S.

Cerevisiae细胞的生长抑制试验 将细胞稀释成1×、10-1×、10-2×和10-3×, 然后用复制板将细胞接种于含有2%半乳糖和5uM edelfosine的YPAD培养基中, 并置于32℃培养箱中培养, 分别于48 h和72 h进行观察并拍照。

2.5 统计学分析

S. Cerevisiae细胞的生长率用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 组间比较采用单因素方差分析和Student-Newman-Keuls多重比较t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 依地福新对液体培养基中半乳糖诱导的表达人Fas、FADD、caspase-8基因的S.

Cerevisiae生长的影响在液体培养基中S. Cerevisiae细胞各组之间在0 h和1 h时, 细胞生长率差异无统计学意义;当细胞生长到3 h后, 转染了pGILDA质粒和Fas/FADD基因的酵母细胞生长不受影响, 呈指数生长, 约2 h生长一代, 两组之间生长率比较没差异有统计学意义 (P>0.05) ;而转染了Fas/FADD/caspase-8的酵母细胞, 生长3 h后, 其生长率明显受到影响, 细胞生长停滞, 有活力的细胞越来越少, 两组生长率与pGILDA和Fas/FADD组比较有显著性差异 (P<0.05) 。

2.2 地福新对固体培养基中半乳糖诱导的表达人Fas、FADD、caspase-8基因的S.

Cerevisiae生长的影响 在固体培养基中, 转染了pGILDA质粒和Fas/FADD基因的酵母细胞在各种不同的稀释浓度, 于48 h和72 h观察时都可见细胞生长, 表明这两种酵母细胞在含有2%半乳糖和5 uM 依地福新的YPAD培养基中生长不受影响;但转染了Fas/FADD/caspase-8的酵母细胞生长明显比转染了pGILDA质粒和Fas/FADD基因的酵母细胞迟缓。在48 h观察时可见, 转染了Fas/FADD/caspase-8的酵母细胞在10-3×浓度时未见细胞生长;72 h观察时, Fas/FADD/caspase-8组细胞在10-3×浓度有少量细胞生长。

3讨论

凋亡是一种程序性细胞死亡, 对生物体维持内环境的稳定和多细胞生物的生存起重要的作用[1]。机体在清除自反应免疫细胞、病毒感染细胞和不可修复的、有恶性转化危险的遗传损伤细胞时都会发生凋亡。凋亡是一个由许多调节物质和效应物质组成的复杂网络, 它可被各种毒素或外来信号 (如, 乙醇、活性氧ROS、各种受体的配体等) 、各种细胞内活动 (如, 有丝分裂缺陷、修复失败) 所激活。几乎所有的凋亡过程在其最后阶段都具有独立的调节通路, 凋亡具有典型的生物化学和形态学标志, 这些标志包括caspase激活, 膜气泡化, 核DNA碎片形成和细胞皱缩。酵母作为一种简单的生物模型体系, 可能有助于阐明这种凋亡调节机制。

依地福新能选择性的诱导凋亡, 然而许多正常的人类细胞对其促凋亡作用具有抵抗性, 包括成纤维细胞、分叶核中性粒细胞、静止期淋巴细胞、骨髓祖细胞等[2]。依地福新诱导的凋亡涉及Fas/CD95死亡受体[3]、JNK、线粒体、活性氧, c-Jun和caspase-3[4]。

本实验笔者观察到, 带有克隆基因的S. Cerevisiae细胞, 经半乳糖诱导后能产生目的基因的蛋白。S. Cerevisiae细胞的生长抑制试验表明, 转染了Fas/FADD/caspase-8的酵母细胞生长抑制或迟缓。

通过实验观察笔者认为, 进入到胞内的依地福新通过未知的某种方式促使Fas三聚化, 使胞内的DD区构象改变, 然后与接头蛋白FADD (Fasassociated death domain) 的DD区结合, 而后FADD的N端DED区 (death effector domain) 就能与caspase-8前体蛋白结合, 形成DISC (death-inducing signaling complex ) , 引起caspase-8通过自身剪切激活, 它们启动caspase的级联反应, 进一步降解胞内结构蛋白和功能蛋白, 最终导致细胞凋亡。

参考文献

[1]张辉, 喻莉萍, 王彬, 等.依地福新抗spm1重组酵母生长作用研究.医药导报, 2008, 27 (8) :919-921.

[2]张辉, 方云祥.酵母与凋亡.湘南学院学报 (医学版) , 2006, 8 (4) :69-72.

[3]Gajate C, Mollinedo F.The antitumor ether lipid ET-18-OCH (3) induces apoptosis through translocation and capping of Fas/CD95into membrane rafts in human leukemic cells.Blood, 2001, 98:3860-3863.

姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展 第6篇

近50年的研究表明,姜黄素可以用于预防和治疗肿瘤,对多种肿瘤细胞的产生、增殖、转移均具有抑制作用,如结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、白血病等。其可能的作用机制有诱导肿瘤细胞凋亡、改变细胞受体连接、阻断细胞内信号反应等。细胞凋亡(cell apoptosis)是一种由基因调控的细胞主动死亡过程,是机体生长发育、细胞分化、生理及病理性死亡的重要机制。众多细胞实验和动物实验均已经证明,姜黄素具有确切的诱导肿瘤细胞凋亡的活性。其抗癌谱较广,是一种具有广阔开发前景的中药,亟待进一步对其作用机制深入研究,以便及早在临床上推广使用。

1 抑制NF-KB活化

NF-KB是一类在动物细胞中广泛表达的转录因子,其主要生理功能之一是通过诱导凋亡抑制基因的转录,拮抗细胞凋亡的发生。姜黄素可以抑制A2780细胞生长和诱导凋亡,用不同浓度的姜黄素作用于A2780细胞爬片12h后,NF-KB蛋白(P65)表达均有下调。最近发现,姜黄素抑制NF-k B活化是通过抑制诱导IKBa磷酸化的激酶活性而发挥作用,影响细胞表面黏附分子、趋化因子、TNF、MMP9、COX2和NOS的表达。由于NF-KB参与细胞的存活和增殖过程,因此抑制NF-KB活化也可部分解释姜黄素诱导的抗增殖和诱导凋亡的效应。

2 抑制转录共激活因子P300活性和表达

P300是一种重要的组蛋白乙酰基转移酶,它能乙酰化核心组蛋白N末端的赖氨酸残基,使核小体组蛋白与DNA的结合稳定性下降,进而使转录机器与染色体的结合成为可能。在细胞中可与多种基因转录活化因子结合而形成辅化因子复合体。除乙酰化作用外,P300还可以在转录起始复合体的形成中起支架或桥梁的作用。目前研究表明,P300作为一种核蛋白,它们具有调节细胞增殖、分化、细胞周期,DNA的损伤修复和凋亡的作用圈。姜黄素能抑制胃癌SGC-7901细胞P300的m RNA和蛋白质的表达,并能抑制组蛋白H3、H4乙酰化,c-myc表达也明显抑制,但野生型P53表达则不受抑制。且P300的抑制与组蛋白H3、H4乙酰化程度及c-myc抑制程度具有明显的相关性。这可能是姜黄素抑制乙酰化酶P300后,抑制了组蛋白的乙酰化,使染色体的结构变得紧密,不便于c-myc的启动子区域与调节蛋白结合,从而抑制了原癌基因c-myc表达。另有研究发现姜黄素能够抑制转录共激活因子p300活性和表达,可能是姜黄素对抑制B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞增殖作用,并促进其凋亡的作用机制之一。

3 上调caspases蛋白酶

胱冬蛋白酶属于ICE/CED3蛋白酶家族成员,目前发现至少有14种之多,分别命名为casepases1-casepases14。与细胞凋亡密切相关,它是通过级联反应,最终激活核酸内切酶来实现的。姜黄素可呈时间及剂量依赖性抑制Raji细胞增殖,可显著促进Raji细胞凋亡;Western blot检测表明,在25umol/L(IC50)作用24小时,Raji细胞与对照组相比,胱冬蛋白酶8和9的表达明显增高,提示胱冬蛋白酶8和9在Raji细胞增殖和凋亡中起重要的作用。说明姜黄素诱导Raji细胞死亡受体Fas的表达增强,激活了caspase 8,从而启动caspase级联发应,使线粒体下游caspase 9效应酶激活,最终诱导细胞凋亡。姜黄素能够诱导黑色素瘤A375细胞的凋亡,并呈时间和剂量依赖性。免疫组化检测Caspase-3蛋白表达,原位杂交检测Caspase-3 m RNA,结果发现Caspase-3表达增加,说明Casepase-3参与了姜黄素诱导A375细胞凋亡的发生和发展同。姜黄素能明显抑制U251细胞的增殖并且诱导其凋亡,FAK蛋白表达减少,caspase-3活性增强,各种caspase抑制剂(如zDEVD-fmk,z-IETD-fmk、z-LEHD-fmk、z-VAD-fmk等)可抑制姜黄素诱导的U251细胞凋亡。姜黄素通过抑制FAK蛋白的表达和激活caspase途径可诱导U251细胞凋亡,这提示我们caspase-3作用于FAK,以去除FAK抑制凋亡的作用,使细胞最终凋亡。

4 抑制Survivin表达率

survivin是IAP家族成员之一,分布于有丝分裂元件,具有调控细胞有丝分裂和抑制细胞凋亡的功能。survivin在大多数正常组织中未被检测,但在肿瘤组织中过量表达。survivin已经成为癌症治疗的一个重要靶点。姜黄素能抑制胃癌细胞SGC-7901和MKN-45的生长并促进其凋亡,其发生与Survivin表达率下降有关。邱学德也发现姜黄素能够诱导膀胱肿瘤细胞株T24和BIU87凋亡,姜黄素可使肿瘤细胞株的Survivin m RNA表达量降低。

5 调节Bcl-2家族相关基因蛋白表达

Bc1-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。线粒体上,Bcl-2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用,调控线粒体结构与功能的稳定性,发挥着细胞凋亡“主开关”的作用。Bcl-2家族包括两类蛋白质:一类是抗凋亡蛋白,另一类是促凋亡蛋白。姜黄素在初治AML患者原代细胞时,可使抗凋亡蛋白Mc1-1下调,促凋亡蛋白Bax、Bak上调。第一次证明了姜黄素可诱导初治AML患者原代细胞的凋亡,并发现姜黄素诱导白血病细胞凋亡的机制之一是调节Bcl-2家族成员Mc1-1、Bax、Bak的表达,进一步证实各成员之间存在复杂的相互关系。采用免疫细胞化学法发现,姜黄素诱导SKOV3细胞凋亡的作用与下调Bcl-2、MTP53的表达及上调Bax、Fas的表达有关。

6 改变线粒体膜电位

有文献报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程。杨甫文等发现姜黄素诱导鼻咽癌细胞凋亡可能与改变线粒体跨膜电位,释放Cyt C,上调Fas基因表达,激活caspase-3酶有关。这提示线粒体跨膜电位是姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的新靶点。

7 展望

凋亡诱导因子 第7篇

关键词：姜黄素,细胞凋亡,肺癌

细胞凋亡是多细胞生物体维持机体平衡的关键。机体组织细胞增殖及调控机制失调, 引起肿瘤发生, 因此细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种重要机制。大量的动物实验和体外细胞实验表明, 姜黄素有较强的诱导肺癌细胞凋亡作用。姜黄素是从姜黄属植物中提取的一种有效成分, 姜黄素药理作用广泛, 其抗氧化、抗感染、抗凝、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗抑郁、抗肿瘤、抗HIV病毒等作用已被普遍认可。其中抗肿瘤作用是印度学者Kuttan于1985年首次提出, 目前对于姜黄素的抗肿瘤作用已有大量的实验研究证实, 诱导肿瘤细胞凋亡是其发挥抗肿瘤作用的主要机制之一。

1 姜黄素诱导肺癌细胞凋亡的机制

1.1 抑制核因子-κB活化

核因子-κB (NF-κB) 未受刺激时与特异性抑制蛋白形成无活性的复合体而存在于细胞胞浆中, 受到刺激后的NF-κB发生磷酸化并讲解, 转而进入细胞核中, 从而引起靶基因的表达。NF-κB对多种细胞因子、趋化因子、粘附分子及急性期反应蛋白基因的表达均具有高效的诱导作用, 同时也参与调控炎症反应放大与延续的多种酶基因的表达。肿瘤、慢性炎性相关性疾病、自身免疫性疾病等的发生、发展与NF-κB过度活化密不可分[1,2]。Biswas等[3]研究发现, 姜黄素可以通过诱导肺泡上皮细胞A549的谷胱甘肽合成, 来抑制NF-κB的活化, 诱导肺癌细胞凋亡。NF-κB组成性活化可以抑制肿瘤细胞凋亡, 而组成性激活的NF-κB表达于大多数肿瘤细胞中, 正常细胞则多不表达, 姜黄素就是通过抑制NF-κB组成性活化来发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

1.2 上调caspases蛋白

Caspase (天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶) 是一组能够选择性切割某些蛋白质, 造成细胞凋亡的蛋白酶。其诱导细胞凋亡的通路主要由两种—死亡受体接到的信号传导途径 (外源性) 和线粒体依赖途径 (内源性) 。当死亡诱导信号复合物行成后, 可诱导caspase-8自身活化, 活化的caspase-8进一步激活caspase-3, 活化的caspase-3与特定的凋亡底物结合, 引起细胞凋亡。在线粒体依赖途径中, 细胞色素C与凋亡细胞蛋白激酶活因子Apl结合, 启动caspased的级联反应, 引起细胞凋亡。外源性和内源性的凋亡途径均可引起细胞凋亡, 外源性途径主要由caspase-8启动。不论是内源性还是外源性凋亡途径均是通过活化caspase-3和caspase-7使细胞发生凋亡, 研究发现[4], 姜黄素作用于肿瘤细胞后, 能够增强caspase-8的表达, 从而启动外源性凋亡途径, 诱导人肺癌细胞凋亡。

1.3 抑制丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号通路

对于MAPK信号通路的研究目前也比较多, 细胞外调节蛋白激酶在真核细胞中常见, ERK1/2MAPK是细胞增殖及恶性转化过程中的关键环节。研究发现[5], ERK1/2 MAPK信号通路, 在肺癌细胞中被明显激活, Vicent等[6]在非小细胞肺癌中发现ERK1/2高表达, 且ERK1/2磷酸化增加[7], 通过抑制其磷酸化, 发现能够抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡, 从而起到抗肺部肿瘤的作用。李子广等[8]通过实验研究显示, 姜黄素作用于A549细胞, 可使p-ERK1/2的表达明显降低, ERK1/2信号通路处于抑制状态, 姜黄素能够有效抑制ERK1/2MAPK信号通路且呈浓度依赖性, A549细胞中磷酸化的ERK1/2被抑制, 但总ERK1/2不受影响。实验结果表明姜黄素通过抑制A549细胞中ERK1/2信号通路, 调节MMPs蛋白的表达, 诱导A549细胞的凋亡。

1.4 抑制凋亡相关蛋白Survivin的表达

凋亡抑制蛋白 (IAP) 家族中的凋亡相关蛋白Survivin广泛表达于恶性肿瘤组织中[9], 能够抑制凋亡和调节细胞增殖。Survivin主要表达于胚胎、发育的胎儿组织和多数肿瘤组织中, 可能是通过干涉caspase的功能而达到抑制肿瘤细胞凋亡的作用, 可作为治疗癌症的一个重要靶点。Survivin作用于caspase, 通过外源性和内源性凋亡途径抑制caspase-3和caspase-7的活性, 达到阻断细胞凋亡的目的, 也有研究显示[10], Survivin基因可能是与caspase-9结合, 从而阻断caspase-9依赖的凋亡信号传导。黄东生[11]等的体外细胞实验中, 姜黄素作用于人肺癌细胞SPC-A1 24h后, 人肺癌细胞SPC-A1中得Survivin表达显著降低;郑伟等[12]实验研究中, 将姜黄素作用于人肺腺癌细胞株A2后, Survivin表达水平降低。由此可见, 姜黄素可以抑制凋亡相关蛋白Survivin的表达, 减轻其对caspase-3和caspase-7的抑制, 诱导人肺癌细胞的凋亡。

1.5 调节Bcl-2家族相关基因蛋白表达

Bcl-2基因由239个氨基酸残基组成, 包括2个内含子和3个外显子。Bcl-2为膜性相关蛋白的一种, 多表达于正常细胞活化和发育过程中, 也表达于成熟组织中, 但是在凋亡细胞中不表达或低表达。Bcl-2家族成员中, 抑制凋亡蛋白和促进凋亡蛋白共同存在, 细胞是否发生凋亡一定程度上决定于二者存在的比例。Pillai[13]等的实验研究中, 姜黄素分别作用于人肺癌细胞A549及p53缺陷型的H1299细胞12h后, 两种肺癌细胞中p53、bcl-2及bcl-XL基因表达均有明显降低, 增加姜黄素作用浓度后, Bak和caspase表达水平也有下降, 发现姜黄素不仅是能够引起p53基因缺陷型细胞的凋亡, 也可以引起p53高表达细胞的凋亡, 提示姜黄素能够通过Bcl-2 bax信号传导途径诱导人肺癌细胞凋亡。有研究证实[14]:Survivin蛋白的表达也与Bcl-2联系颇深, 进而推测两者可能协同发挥抗凋亡机制, 而姜黄素作用后引起Survivin表达降低, 从而减低与Bcl-2的协同作用。

1.6 升高活性氧 (ROS) 水平

细胞有过呼吸产生的代谢产物及衍生的含氧物质统称为ROS, 有证据表明, ROS升高一方面可激活caspase, 诱导细胞凋亡, 另一方面可能影响ATP水平及caspase活性决定细胞或凋亡、坏死或耐受。Bhaumik等[15]实验发现姜黄素能够促进氧自由基释放, 使ROS进入细胞内发挥活性。张静等[16]研究中, 姜黄素作用于肺腺癌A549细胞, ROS水平用荧光强度衡量, 空白对照组ROS最低, 姜黄素处理组ROS浓度随时间推移和剂量增加而增加, 说明氧化应激参与姜黄素作用后A549细胞的凋亡过程, ROS浓度的升高可通过多种凋亡途径诱导A549细胞凋亡。

1.7 活化细胞内第二信使 (c AMP)

在某些细胞凋亡过程中, 细胞内第二信使cAMP是引起其发生凋亡的信号, cAMP浓度上升至一定程度, cAMP依赖性的蛋白激酶A被激活, 使位于靶蛋白上的某些氨基酸磷酸化, 影响其生物学功能, 从而诱导细胞凋亡。黄冬生等[17]的实验研究中, 姜黄素作用于人肺腺癌细胞 (SPC-A1) 后, 细胞内cAMP浓度升高, 且具有浓度依赖性, 即姜黄素作用浓度越高, 则细胞内cAMP浓度越高, 从而发挥诱导肺腺癌细胞 (SPC-A1) 发生凋亡。

2 展望

凋亡诱导因子 第8篇

1 单味中药诱导肝癌细胞凋亡

莪术是姜科植物郁金的根茎,其挥发油中含有多种抗癌有效成分,如榄香烯、莪术醇、莪术酮等。有研究从细胞凋亡和细胞周期的角度探讨莪术油抑制癌细胞SMMC-7721生长的作用机理。荧光显微镜观察结果显示:1.0 mg/ml的莪术挥发油作用于肝癌细胞SMMC-7721 24 h后,细胞形态出现明显的凋亡特征,细胞核凹陷或固缩成均一的致密物。流式细胞仪检查结果表明莪术油作用后细胞凋亡率可达28.15%,细胞周期被阻滞在S期。莪术油可通过影响DNA复制和蛋白质合成,并将细胞阻滞在S期,进而诱导肝癌细胞凋亡[1]。

姜黄素是中药姜黄的主要成分,近年研究发现姜黄素能抑制实验动物皮肤癌、胃癌及体外培养细胞的生长。有研究采用MTT法[2],流式细胞术与透视电镜观察姜黄素对人肝癌细胞QGY增殖和凋亡的影响。结果发现:姜黄素有抑制人肝癌细胞QGY生长,干扰细胞周期分布,诱导细胞凋亡的作用。其抑瘤率与药物浓度和作用时间正相关。流式细胞分析姜黄素可使细胞生长停滞于S期,阻碍细胞DNA合成,延长细胞周期,并有凋亡峰出现。电镜观察:姜黄素作用组织细胞呈明显坏死,并可见细胞凋亡碎片。

从中药当归或川芎中提取的水溶性成份阿魏酸钠(Sodium ferulate),可诱导Bel-7402肝癌细胞的凋亡。SF作用于Bel-7402肝癌细胞后,可见DNA中段成梯形表现,DNA百分比在S期明显降低,在G2/M期明显增加,故SF可诱导入Bel-7402肝癌细胞凋亡,抑制其增殖[3]。

薏苡仁提取物抗肝癌的作用机理之一是诱导细胞凋亡和上调p53基因表达。有实验应用MTT法[4],免疫组化法及电镜观察34例肝癌患者的癌细胞在体外培养经薏苡仁提取物处理后的变化,并与对照组(6种常用的化疗药物:卡铂、顺铂、氟尿嘧啶、羟基喜树碱、丝裂霉素、阿霉素)比较。发现薏苡仁提取物对肝癌细胞抑制作用可达30%以上。经薏苡仁提取物处理后的肝癌细胞有明显的凋亡现象和p53增高,与对照组比较有显著性差异。电镜观察薏苡仁提取物组肝癌细胞出现细胞膜小泡和形成凋亡小体等细胞凋亡的特征性变化。

黄芪总提取物有诱导肝癌细胞凋亡,抑制其增殖的作用。不同剂量的黄芪总提取物(20 mg/L、40 mg/L和80 mg/L)可明显促进人肝癌HepG-Ⅱ细胞的凋亡和Bel-7402细胞的DNA亚G1峰升高,分别使HepG-Ⅱ细胞的凋亡率由4.5%增至25.4%、57.0%、74.6%;使Bel-7404细胞的凋亡率由4.5%增至43.6%、48.1%、50.5%。黄芪总提取物(80 mg/L)可促进人肝癌HepG-Ⅱ细胞核Bel-7404细胞野生型p53(wtp53)的表达,并有降低突变型p53(mtp53)表达的趋势。故此认为黄芪总提取物诱导肝癌细胞凋亡的机理与其上调肝癌细胞wtp53表达,下调mtp53的表达有关[5]。

守官是传统的中药材,为壁虎科动物无蹼壁虎或其它几种壁虎的总称。宋《圣济总录》已有守官入药记载,明《本草纲目》记载:守官咸,寒,有毒,研末内服,治瘰疬初起。作为咸寒软坚中药,守官长期用来治疗瘰疬癌肿[6]。

多糖是抗肿瘤中药常见的水溶性有效成分[7,8,9]。有关守官化学成分的研究均来考察多糖的作用。有实验以肝癌细胞试作体外预试,发现守官的水提醇沉部分可显著抑制肝癌细胞生长,但不影响肝癌细胞的存活,进一步从守官水提醇沉部分中分离研制守官硫酸多糖[10]。通过对守官硫酸多糖调节肿瘤生物学行为的研究发现,守官硫酸多糖不诱导肝细胞凋亡,但可显著抑制肝癌细胞的生长并诱导其往成熟肝细胞方向分化,且不影响正常肝细胞的增殖和存活。对肿瘤细胞的选择性作用(靶向性)充分体现了中医药在肿瘤治疗中的特色和优势[11]。守官硫酸多糖可促进淋巴细胞增殖,肝癌抗原活化的淋巴细胞的细胞毒作用,促进淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用,从传统抗肿瘤中药中分离纯化新的抗肿瘤活性化合物,通过研究生物活性成分,对肿瘤细胞生物化学行为的影响,阐明中药药效作用物质基础,并比较该类化合物药理活性与传统中药药理论的关系[12]。有助于深入认识中医药抗肿瘤作用的机制。

曾有研究认为多糖可通过活化免疫系统发挥抗肿瘤作用,但对肿瘤细胞无直接作用,但近年的研究不断发现多糖具有直接的抗肿瘤作用[5]。梁金菇又名姬松茸,是属于担子菌纲的一种菌类植物的地上菌丝体。有人观察了梁金菇多糖对SMMC-7721细胞凋亡以及凋亡抑制基因Bcl-2的影响,发现经梁金菇多糖处理的SMMC-7721出现核固缩凋亡小体形成,琼脂糖凝胶电泳出现凋亡特征性DNA梯带。凋亡细胞发生率与药物浓度和作用时间呈正相关。经梁金菇多糖处理后的SMMC-7721细胞内Bel-2表达较对照组降低。说明梁金菇多糖可通过抑制细胞内Bel-2表达,诱导肝癌细胞凋亡。

青蒿脂钠为青蒿素类的衍生物,是一种新型的抗疟药,近年来发现青蒿脂钠具有抗肿瘤的作用。

2 总结与展望

细胞凋亡作为一种基本的生命现象,贯穿于个体生长、发育、死亡的整个生命过程。细胞的增殖与凋亡是细胞生命过程中必然存在的相互关联、相互影响的两种基本现象。肝癌的发病机制与细胞增殖与凋亡的失衡有密切关系,肝癌的迅速生长是癌细胞增殖旺盛与凋亡减少的结果。有关中药诱导肝癌细胞凋亡的体内外实验均已经取得一定的成果。研究表明中药可通过下列途径诱导肝癌细胞的凋亡:(1)影响细胞凋亡相关基因的表达:①P53依赖性途径:上调肝癌细胞wtp53表达,下调mtp53的表达,改变wtp53和mtp53表达比例,下调p21 wafcⅡ/apl表达;②p53非依赖性途径:上调肝癌细胞Bax表达,下调Bcl-2表达,改变Bcl-2和Bax表达比例。(2)影响细胞周期:①细胞周期阻滞于G0/G1期:阻滞细胞DNA复制合成并诱导凋亡;细胞周期阻滞于S期:影响细胞DNA复制合成并诱导其凋亡;细胞周期阻滞于G2/M期:阻止细胞分裂并诱导凋亡。

凋亡诱导因子 第9篇

关键词：纳米雄黄,肺癌,细胞凋亡,诱导作用

肺癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居各种恶性肿瘤之首,70%~80%的肺癌患者确诊时已丧失了最佳的根治性切除机会,因此,化疗是治疗肺癌不可或缺的手段。但由于细胞的毒性作用,同时也损伤了宿主机体的免疫系统,所以在肿瘤的治疗过程中,杀伤肿瘤细胞与保护机体的免疫功能具有同等重要的作用。高效低毒或无毒的治疗方法一直是肿瘤治疗的难点。中药具有长效、持久、不良反应少等特点,因此,肺癌患者先进行以化疗为主的综合治疗,再用中药调节,已成为肿瘤治疗的一条新途径[1]。雄黄具有良好的抗肿瘤作用,但其存在潜在毒性大、难溶等缺点。纳米级雄黄的生物利用度和药效要优于传统雄黄制剂,且毒副作用较小[2,3]。有关雄黄及纳米雄黄对实体肿瘤作用差异的研究报道较为少见,笔者主要观察雄黄、纳米雄黄对人肺癌A549细胞的诱导凋亡作用,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验药物

雄黄原药粉为西安中药集团公司生产;纳米雄黄采用行星式球磨机(QM-3SP2型,南京大学仪器厂)球磨法[3]自行制备,制备的雄黄纳米颗粒呈圆形,大小基本均匀,电镜下测量的平均粒径为(72.72±22.18)nm,符合纳米药物制剂的要求。纳米雄黄用KCl饱和硝酸溶液溶解,Na OH溶液的p H值调至7.0,PBS定容,配成2mg/m L的储备液,过滤除菌,4℃保存备用。

1.2 材料

RPMI 1640(美国Gibco公司);新生小牛血清(兰州荣晔生物科技有限责任公司);PE标记的鼠抗人CD133抗体购自e Bioscience公司;PE标记的鼠抗人Ig G1为Caltag公司产品;FITC标记的抗乳腺耐药蛋白(BCRP)抗体购自Biovision公司;AnnexinⅤ/PI凋亡检测试剂盒购自e Bioscience公司;多药耐药蛋白(P-gp)单抗(MRK16,Kamiya Biomedical公司),PE标记的羊抗鼠Ig G2a(Caltag公司)。雄黄原药购自西安中药集团公司。

1.3 方法

1.3.1 靶细胞和细胞培养

肺癌A549细胞由兰州大学医学实验中心保存。细胞接种于含15%新生牛血清(兰州荣晔生物科技有限责任公司)的RPMI 1640培养液(美国Gibco BRL公司)中,置37℃、5%CO2和全湿条件下培养,取对数生长期细胞用于实验。

1.3.2 MTT比色法测A549细胞增殖活性

A549细胞(0.8105/mL)接种于96孔培养板(Costar)中,分别加入终浓度为10~100μg/mL的雄黄和纳米雄黄,培养24h、48h和72h后MTT法检测。自动酶标仪(Bio-Tek Power wave X)于570nm处测吸光度(A)值,计算细胞增殖抑制率(inhibition rate)和半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)[4]。

1.3.2 Annexin v/PI双标记检测凋亡细胞

A549细胞经不同浓度的雄黄、纳米雄黄处理48h后,收集细胞,PBS洗涤,重悬于Binding Buffer中,加入Annexin V和PI,室温避光染色15min,流式细胞仪(FCM,Beckman-Coulter Epics XL)检测正常、早期凋亡和晚期凋亡细胞[5]。

1.3.4 Caspase-3活性的检测

收集纳米雄黄处理24h的A549细胞,PBS洗涤。加入FITC荧光标记的活化Caspase-3特异性抑制物DEVD-FMK,37℃孵育1h,离心去上清,wash buffer 0.5m L洗2次,重悬于500L的wash buffer中,FCM检测活化Caspase-3的含量。检测重复3次。

1.3.5 P53蛋白表达水平测定

收集不同浓度纳米雄黄处理48h后的细胞,PBS洗涤,加入细胞固定剂和通透剂,再加入鼠抗人P53单抗避光孵育30min,PBS洗涤;然后加入FITC标记的羊抗鼠Ig G二抗避光孵育30min,PBS洗涤。FCM检测P53蛋白的阳性率和平均荧光强度。检测重复3次。

1.3.6 BAX蛋白表达水平测定

收集20μg/m 和50μg/mL纳米雄黄处理48h后的细胞,PBS洗涤。加入细胞固定剂和通透剂,再加入PE标记的鼠抗人BAX单抗,PE标记的鼠Ig G1为对照,FCM检测BAX蛋白的阳性率和平均荧光强度。检测重复3次。

1.3.7 Bcl-2蛋白表达水平测定

收集20μg/mL和50μg/mL纳米雄黄处理48h后的细胞,PBS洗涤。加入细胞固定剂和通透剂,再加入FITC标记的鼠抗人Bcl-2单抗,FITC标记的鼠Ig G1为对照,FCM检测Bcl-2蛋白的阳性率和平均荧光强度。检测重复3次。

1.4 统计学处理

计量资料结果采用表示,应用SPSS 13.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 纳米雄黄抑制肺癌A549细胞的增殖活性

纳米雄黄呈时间浓度依赖性抑制A549细胞增殖,24h、48h和72h的IC50值分别为81.82μg/mL、49.92μg/mL和32.99μg/mL,(P<0.01)。见表1。

雄黄原药也呈时间浓度依赖性抑制A549细胞增殖,24h、48h和72h的IC50值分别为401.32μg/mL、255.72μg/mL和84.64μg/mL,但其抑制作用明显小于纳米雄黄对A549细胞增殖的抑制作用(P<0.01),见表2。

2.2 雄黄原药和纳米雄黄诱导A549细胞凋亡

用50μg/mL和100μg/mL纳米雄黄作用48h后,Annexin V/PI染色显示凋亡细胞明显增高,凋亡率分别为12.53%和69.19%,100g/mL凋亡以晚期凋亡为主,见图1。用50μg/mL和100μg/mL的雄黄作用A549细胞48h后,细胞的凋亡率也随着时间的延长和浓度增加而增高,凋亡率分别为11.18%和45.6%,见图2。用非纳米雄黄处理的A549细胞的凋亡率明显低于用纳米雄黄处理的A549细胞的凋亡率。

2.3 纳米雄黄增强A549细胞中Caspase-3的活性

20μg/mL、50μg/mL纳米雄黄处理细胞24h,细胞Caspase-3活性增强,活化Caspase-3增高了1.67倍、3.19倍,见表3。说明纳米雄黄主要通过caspases依赖途径诱导A549细胞凋亡。

2.4 纳米雄黄对A549细胞P53蛋白的影响

分别用50g/mL、100g/mL、150g/mL的纳米雄黄处理A549细胞24h后,A549细胞表达的P53蛋白的阳性率升高分别为10.9%、14.3%、23.7%和16.8%,150g/mL的P53阳性率虽略有降低,但较之于正常对照细胞仍升高。处理48h的细胞P53阳性率分别为18.4%、32.2%、5.18%和2.20%,100g/mL、150g/mL处理的A549细胞的P53阳性率降低,见图3。

2.5 纳米雄黄对A549细胞Bax蛋白与Bcl-2蛋白表达的影响

20μg/mL和50μg/mL的纳米雄黄处理A549细胞48h,BAX蛋白表达增高,见表4。表达阳性率由对照的(79.50±0.50)%增高到(92.45±0.35)%和(96.90±0.00)%;表达强度增高1.16倍和1.22倍。

注:与对照(0μg/mL)比较,aP<0.01,bP<0.05,cP>0.05。

3 讨论

细胞凋亡(apoptosis)指的是细胞在发育和形态建成中,出现的一种不同于细胞坏死的正常生理死亡过程。细胞凋亡具有高度的保守性,可以通过死亡受体、线粒体、凋亡抑制蛋白和Caspase酶等多个水平实现,其中caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白和P53蛋白等在调控的信号转导中扮演着非常重要的角色。近年来,众多的研究表明,肿瘤的发生、发展不仅与肿瘤细胞分化异常、细胞增殖过度有关,而且与细胞凋亡减少有关。目前,临床上应用较多的抗肿瘤药被发现均可诱导肿瘤细胞凋亡,诱导凋亡是其抗肿瘤的重要机制之一。是否能引起肿瘤细胞凋亡已成为评价化疗药物优劣的一个重要指标,利用相关的凋亡诱导、调控机制诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗肿瘤的一个重要的途径[6]。

近年来,关于中草药抗癌作用机制的研究不断发展[7],雄黄是传统中医药中常用的硫化物矿物类中药,主要活性化学成分为As4S4或As2S2。现代药理学研究表明,雄黄具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤的作用,雄黄制备成纳米级超细颗粒后,其生物利用度和药效均明显提高,毒副作用也较小[2,3]。我们的研究表明,纳米雄黄可有效抑制肺癌A549细胞的增殖,并诱导其凋亡,从而激活Caspase-3活性,通过Caspases依赖途径诱导肺癌细胞凋亡,促进P53和BAX的表达,A549细胞高表达Bcl-2蛋白,经纳米雄黄作用后Bcl-2表达的阳性率不仅没有降低,反而还有略微升高,推测这与纳米雄黄作用后细胞群中癌干细胞的含量(比例)增高有关。AnnexinⅤ/PI双染色显示,雄黄处理的A549中的凋亡细胞数会随着药物浓度的增高而急剧增高,但凋亡率低于纳米雄黄A549群体细胞,这提示雄黄、纳米雄黄均能诱导A549群体细胞凋亡,但雄黄对A549细胞的凋亡诱导作用要低于纳米雄黄。我们的初步研究结果对采用纳米雄黄来治疗临床实体肿瘤具有重要的意义。

参考文献

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[2]李方.砷剂的生物学作用及应用前景[J].国外医学:中医中药分册,2001,23(3):134.

[3]王晓波,袭荣刚,李忠亮,等.纳米级雄黄粉体的制备[J].解放军药学学报,2002,18(3):129-133.

[4]WANG DH,WEI HL,ZHAO HS,et al.Arsenictrioxide overcomesapoptosis inhibition in K562/ADM cells by regulating vitalcomponents in apoptotic pathway[J].Pharmacol Res,2005,52(5):376-378.

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