鼻咽癌细胞株范文

鼻咽癌细胞株范文（精选7篇）

鼻咽癌细胞株 第1篇

鼻咽癌的主要治疗手段为放疗,不同分化程度的鼻咽癌细胞对放射线的敏感性不同。鼻咽癌细胞株CNE-1和CNE-2有多种micro RNA的表达存在差异,其中mi R-7是差异最显著的micro RNA之一[8]。Mi R-7参与调控细胞发育和EGFR通路的激活,而EGFR通路与放射敏感性密切相关[9,10]。本研究旨在探讨分化程度不同的鼻咽癌细胞株X线辐射后mi R-7的表达差异,以研究mi R-7在放射敏感性中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2由广州南方医院肿瘤中心提供;新生牛血清购自美国Hyclone公司;1640培养基购自美国GIBCO公司;Trizol、琼脂糖凝胶及Two-step MMLV platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Kit均购自美国Invitrogen公司;mi R-7特异性茎环引物购自广州莱德尔公司。

1.2 仪器与设备

直线加速器2100C,美国Varian公司;分光光度计ND-1000,美国Nano Drop公司;荧光定量PCR ABI7500,美国Applied Biosystems公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

完全培养基组分为10%新生牛血清+90%1640培养基。培养箱条件为37℃、5%二氧化碳(CO2)。

1.3.2 细胞照射

细胞接种于6孔板,对数生长期时,使用直线加速器产生6 MV X线进行一次性辐射。辐射时培养板上加盖2 cm厚有机玻璃板使细胞处在剂量建成区下相对均匀区。源皮距为100 cm,辐射处方剂量分别为2、4、6、8和10 Gy,剂量率均为300 c Gy/min。

1.3.3 克隆计数

细胞照射后在标准状态下培养10～14 d,克隆形成后同时收获。采用甲醇固定细胞集落15 min,Giemsa染色30 min,自然晾干后进行克隆计数。细胞数≥50个的集落被作为存活克隆予以计数。

1.3.4 细胞存活分数计算

克隆形成率(PE)=(集落数/细胞接种数)100%,存活分数(SF)=计数所得克隆数/(接种细胞数PE)。

1.3.5 细胞存活曲线绘制

采用GraphPad Prism5.0软件,按线性二次模型拟合两种细胞存活曲线,求出相应的数学模型参数α、β、α/β值以及2Gy照射时的细胞存活分数SF2。

1.3.6 总RNA提取

用Trizol裂解细胞,按说明书操作步骤,提取对照组细胞及2、6和10 Gy组照射后2 h和10 h细胞的总RNA。总RNA样本进行分光光度计检测及1.5%琼脂糖凝胶电泳。选择A260/A280=1.80～2.00,电泳条带清晰、完整的样品进行下一步实验。

1.3.7 q PCR

特异性茎环引物逆转录mi R-7,随机六引物逆转录内参基因18s rRNA。使用两步法试剂盒进行染料法荧光定量PCR。预实验确定qPCR体系反应中各引物浓度、c DNA稀释倍数及其加入量,使各引物的扩增效率为1.80～2.20[11]。

1.4 PCR数据处理及统计学分析

选择未照射的CNE-1细胞为参照样本,ΔΔCt法得出各组各时间点的mi R-7相对表达值。数据均由SPSS 13.0进行t检验,检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 CNE-1、CNE-2细胞放射敏感性差异比较

按线性二次模型拟合CNE-1、CNE-2细胞的存活曲线(见图1)。根据数学模型计算出细胞的数学模型参数值(见表1)。CNE-1细胞存活曲线参数α、α/β均小于CNE-2细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05)。说明CNE-1细胞有较高的辐射抵抗性。2 Gy照射后的细胞存活率(SF2)也显示了同样的结果。

注:SF2est为预测值,SF2read为实测值

2.2 X线辐射后CNE-1、CNE-2细胞miR-7表达的变化

不同实验组X线辐射后,不同时间点的mi R-7表达量相对值见表2。对照组中,低分化鼻咽癌细胞株CNE-2的mi R-7表达较高分化鼻咽癌细胞株CNE-1高(P<0.05),前者为后者的2.51倍。

在辐射后早期,2种细胞的表达即出现明显差异,此种差异随着辐射剂量的变化而变化(见图2A)。2 Gy组2种细胞mi R-7表达量均增加,且相互间差异增大,表现为:CNE-1的相对含量由1.00增加到7.89(P<0.05);CNE-2由2.51增加到49.44(P<0.05);CNE-2/CNE-1由对照组的2.51增加到6.27。6 Gy组2种细胞mi R-7表达均有所减少(P<0.05),但CNE-2减少更明显(由2.51下降到0.67),2种细胞间mi R-7表达量差异无统计学意义(P>0.05)。10Gy组2种细胞mi R-7表达增加(P<0.05),以CNE-1增加为著(由1.00增加到16.34),且超过了CNE-2的含量(P<0.05)。

辐射后晚期,2种细胞mi R-7表达情况与早期不同(见图2B)。2 Gy组CNE-1细胞表达与早期相比差异无统计学意义(P>0.05);CNE-2细胞表达量明显下降,由早期49.44下降到0.15(P<0.05)。6 Gy组CNE-1细胞辐射后mi R-7表达量由早期的减少恢复到未照射水平(P>0.05),而CNE-2细胞表达水平则未能恢复到对照组水平(P<0.05);2种细胞间mi R-7表达量差异无统计学意义(P>0.05)。10 Gy组2种细胞表达mi R-7较早期均减少(P<0.05);CNE-1表达量仍高于对照组,CNE-2则低于对照组,且CNE-1表达量高于CNE-2(均P<0.05)。

3 讨论

X线对细胞的主要杀伤作用导致DNA双链断裂。X线在使细胞DNA双链断裂的同时,也打破EGFR通路磷酸化与去磷酸化的平衡,导致EGFR通路激活,增强DNA-PK蛋白的合成,DNA-PK依赖的非同源性末端修复也随之启动,修复DNA双链[12]。EGFR通路中AKT蛋白的激活可通过内在放射抵抗性、细胞增殖和缺氧3个方面增强放射抵抗作用[13]。因此,EGFR高表达可提高细胞的放射抵抗性。Mi R-7可抑制EGFR通路的2个关键蛋白AKT、ERK1/2[14]。在低分化上皮细胞中,EGFR的表达高于高分化或正常上皮细胞[15],与mi R-7的表达一致。推测mi R-7与EGFR是动态平衡的关系。

鼻咽癌细胞株CNE-1和CNE-2有多种micro RNA的表达存在差异,其中mi R-7是表达差异最显著的micro RNA之一[8],关于X线照射后鼻咽癌细胞micro RNA的变化未有报道。本实验研究了分化程度不同的鼻咽癌细胞株X线辐射后mi R-7的表达差异,发现辐射后2种细胞均增加mi R-7的表达。当剂量从2 Gy增加到6 Gy,2种细胞的mi R-7均呈递减趋势。辐射后DNA断裂,EGFR通路激活,EGFR在极短时间内表达增高[16],与之形成平衡的mi R-7也相应增加。随着放射线剂量增高,DNA断裂增多,需要EGFR通路活性进一步增强,miR-7则须受到相应抑制以充分释放修复机制的潜能。当照射剂量增加到10 Gy时,miR-7又再次增高。因为EGFR表达更进一步增强时,miR-7也须相应增高,从而达到新的平衡,否则EGFR通路中AKT、PI3-K的过表达,导致细胞过度缺氧,影响细胞增殖[13]。

高分化细胞调控机制发育较完全,相对健全的调控机制使mi R-7随着辐射剂量的增加,无论是抑制还是增高,都能很好地调控;而低分化细胞,平衡调控机制发育不完全。表现为2 Gy组CNE-2细胞照射后mi R-7表达显著增加,与CNE-1细胞相比,过度表达mi R-7,抑制了DNA的修复,使放射敏感性上升;在6 Gy组与10 Gy组,辐射后CNE-2细胞过度抑制mi R-7,使mi R-7不能有效地抑制EGFR过表达,导致细胞过度缺氧,增殖能力下降。

综上所述,X线辐射后,分化程度不同的鼻咽癌细胞中mi R-7的表达模式不同,可能是导致细胞放射敏感性不同的原因之一。因此,对于增强或减弱放射敏感性,miR-7可能是一个重要的调控点,还有必要研究它的上游调控机制,进一步明确mi R-7在放射抵抗中的作用。

摘要：目的 探讨不同分化程度的鼻咽癌细胞株X线辐射后miR-7表达的变化。方法 2种细胞均分为对照组(未辐射)、2Gy组、6Gy组和10Gy组,X线辐射细胞株,线性二次模型拟合CNE-1、CNE-2细胞存活曲线,Trizol法提取细胞总RNA。茎环法特异性逆转录miR-7,染料法实时定量PCR,以对照组CNE-1细胞为参照样本,ΔΔCt法得出各样品miR-7的相对倍数。结果 对照组CNE-2细胞miR-7的量是CNE-1的2.51倍。2Gy组CNE-1细胞miR-7表达量增加,CNE-2细胞则由早期的49.44下降到晚期的0.15。6Gy组两种细胞miR-7含量差别不大。10Gy组CNE-1的miR-7含量高于CNE-2。结论 分化程度不同的鼻咽癌细胞经不同剂量的X线辐射后,miR-7表达量各不相同。分化程度不同的鼻咽癌细胞的放射敏感性差异,可能是由调控miR-7表达能力不同造成的。

鼻咽癌细胞株 第2篇

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品;小牛血清购自杭州四季青生物工程公司;紫杉醇为施贵宝公司提供,分子量为853.9,原液浓度为30 mg/5 m L,实验前将紫杉醇用生理盐水稀释配成所需贮存液,4℃保存备用;噻唑蓝(MTT)为Sigma公司试剂,浓度为5 g/L,4℃保存;二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品;二氧化碳恒温培养箱(日本制造);Olympus倒置显微镜(日本制造);超净台(苏州净化设备厂);扫描电子显微镜(飞利普XL20);Olympus普通光学显微镜(日本制造)。

1.2 细胞培养与分组

鼻咽癌CNE-1细胞株由中南大学肿瘤研究所提供,接种于10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,37℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养,取传代后2 d的细胞(即处于指数生长期的细胞)制成4.0104个/m L细胞悬液,以200μL/孔接种于96孔培养板内,各组平行种6个复孔。分组时取3种不同温度(39℃、41℃和43℃)、不同浓度紫杉醇(0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 nmol/L),采用组内分组设计,共分15个组,各浓度组均设37℃为对照组(共5组)。待细胞培养48 h后弃原培养液,每孔加入200μL以上不同浓度紫杉醇的新鲜培养液,对照组加相应量二甲基亚砜(DMSO),作用48h后,分别置于39℃、41℃和43℃的培养箱中加热30 min,(设37℃为对照组)。重新放回37℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱继续培养48 h后进行细胞增殖率测定。

1.3 细胞增殖率测定

采用MTT法,每孔加5 g/L MTT 20μL,继续培养4 h,取出培养板,倾去培养液,加入200μL DMSO,室温振荡10 min,在酶标仪(SLT spectra)上测定波长490 nm处每孔A值,计算细胞增殖率:细胞增殖率=(实验组A值/对照组A值)100%。

1.4 光学显微镜和扫描电镜观察

CNE-1细胞用戊二醛固定后,分别进行光镜、扫描、电镜观察并摄像。

1.5 克隆形成测定

经不同温度(39℃、41℃和43℃)、不同浓度紫杉醇(0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 nmol/L)联合处理48 h后的CNE-1细胞按1104个细胞/(m L平皿)接种到35 mm平皿中,同时加入15%小牛血清,每隔3 d换液1次,培养2周后,用瑞氏姬姆萨染色,在显微镜下计数≥50个细胞组成的细胞克隆数。

1.6 细胞DNA提取及琼脂糖凝胶电泳观察

取加热41℃时不同浓度紫杉醇处理后的CNE-1细胞用胰蛋白酶消化收集1106细胞,PBS缓冲液洗涤3次,溶于1 m L细胞提取液中(0.1mol/L Na CL,0.2 mol/L蔗糖,0.01 mol/L ETDA,0.3mol/L Tris HCl 8.0),混匀,加入65μL 100 g/L SDS裂解液裂解细胞,65℃水浴30 min后加入200μL 8 mol/L醋酸钾,冰浴60 min,离心12 000 g10 min,取上清加入0.6倍异丙醇,置室温5 min后离心12 000 g,10 min,700 ml/L乙醇洗涤沉淀并干燥,加含20 mg/L RNase的TE 15μL消化,37℃30min,加5μL上样缓冲液,在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳5 V/cm,紫外灯下观察DNA条带并摄影。

1.7 统计学方法

用Excel软件对实验组与对照组进行t检验,并计算P值,以P<0.05为差异有显著性。细胞抑制率用百分比表示。

2 结果

2.1 加热与紫杉醇化疗联合应用对He p-2细胞增殖的影响

加热41℃组细胞增殖率与其他不同温度同剂量组比较均降低,差异均有显著性(P<0.05);39℃和43℃组细胞增殖率与37℃对照组比较均升高,39℃或43℃联合0.01 nmol/L紫杉醇化疗时CNE-1细胞增殖能力最强。各组细胞增殖率比较,见表1。

2.2 细胞形态学及超微结构观察

经紫杉醇联合热疗处理24 h后,细胞发生一系列变化,由于细胞不同步,同一时间有多种形态共存。倒置显微镜观察活细胞,表现为细胞先变圆,折光性强,48 h后其中一些细胞再贴壁,但体积增加,折光性不好,这类细胞仍在生长,72 h后还有50%细胞存在,有些细胞开始皱缩,漂浮(见图1A),而对照组细胞生长良好(见图1B)。瑞氏姬姆萨染色后光镜观察所见:凋亡细胞变化特征有两种,一种为间期凋亡特征,主要为细胞核染色质固缩,聚集于核边成块状、环状或新月状,失去微绒毛,核碎裂,胞浆浓缩,有空泡出现,细胞膜出泡,凋亡小体形成,见图2,另一种为分裂期凋亡特征,主要为染色体散乱分布于细胞中,细胞膜出泡,进而染色体聚集成团,形成凋亡小体,见图3,到后期,凋亡小体及残留的凋亡细胞进行次级坏死。

注:1)与各浓度37℃比较,P<0.05;2)与各浓度41℃比较,P<0.05

2.3 克隆形成检测

加热41℃组克隆生成率与其它不同温度同剂量组比较均降低,差异有统计学意义(P<0.05);39℃和43℃0.1 nmol/L紫杉醇组克隆生成率与37℃对照组比较均升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。加热41℃时不同浓度紫杉醇对CNE-1细胞克隆生成率均有明显抑制作用;39℃或43℃联合0.01 nmol/L紫杉醇化疗时CNE-1细胞克隆生成能力最强。各组细胞克隆生成率比较,见表2。

2.4 梯状DNA的观察

注:1)与各浓度37℃比较,P<0.05;2)与各浓度41℃比较,P<0.05

用0.10 nmol/L浓度紫杉醇联合热疗41℃处理CNE-1细胞,发现48 h后便可出现梯状DNA,大小为180 bp及其整倍数,72 h后条带更加明显,见图4。

3 讨论

热疗是继手术、化疗和放疗之后肿瘤综合治疗的一种方法,临床上常使用热疗来配合放化疗以提高肿瘤综合治疗的疗效。有实验发现热疗与紫杉醇化疗药联合应用具有协同作用[6],推测其原理可能是[7]:(1)热疗使细胞膜通透性改变,促使药物进入肿瘤细胞,还可以抑制紫杉醇作用后细胞对DNA损伤的修复。(2)热疗可促进紫杉醇诱导细胞凋亡。(3)热疗增加温度依赖性药物的抗肿瘤活性,热疗可使药物向细胞外泵出减少,增加细胞内的药物浓度,防止和消除肿瘤细胞的耐药性,因此热疗可以增加对耐药肿瘤细胞的杀伤活性。(4)热化疗联合可覆盖肿瘤病灶的全部,肿瘤周边部位血供较为丰富,肿瘤细胞多为富氧细胞,化疗对该群细胞的杀伤具有优势,而肿瘤中心部位呈酸性环境,由于血管和血流的异常使中心部位温度较高,且细胞多为乏氧细胞,热疗对乏氧细胞的敏感性较高,因此对该群细胞的杀伤具有优势,这样热化疗联合更容易杀灭两个细胞群。

紫杉醇具有诱导多种肿瘤细胞凋亡,细胞凋亡伴随特征性的形态学及生化变化,细胞膜起泡,胞核和胞质聚集,核小体间DNA断裂,染色质固缩,细胞核裂解,内容物由膜性结构包裹形成多个小体样结构(Apoptotic body),其DNA琼脂糖凝胶电泳呈“梯状”带形,并在显微镜和电镜下观察到典型的凋亡细胞形态学改变。有研究发现,热疗对紫杉醇抑制肺癌细胞生长可增效5~100倍,对小鼠乳腺癌FM3A的抑制也有明显的协同作用,但是对乳腺癌MCF-7细胞及SW1573、L-929等细胞无协同效果[8~10]。可见,紫杉醇在与热疗联合使用时,还是有其相对的优势,在临床使用中需要根据不同情况来选择紫杉醇,以期达到最理想的治疗效果。

目前,动物体内实验结果均提示紫杉醇与热疗有明显的协同作用。紫杉醇主要作用靶点是DNA,可以与DNA形成链内交联体,还可通过链间交联而破坏DNA的复制从而发挥抗肿瘤作用。本研究对两者联合作用机制进行初步探讨,认为热疗通过不同信号通道调节细胞周期蛋白的表达来增强紫杉醇对肿瘤细胞的抑制作用。

URANO等[11]认为,加热温度控制在40.5℃~43.0℃时多数化疗药物的细胞毒作用达到最大。本实验结果表明,加热可以增强紫杉醇对CNE-1细胞的细胞毒作用,在小剂量化疗药物作用时,41℃的温热作用即可明显提高紫杉醇对CNE-1细胞抑制作用,又具有稳定的热、药协同效能,是最佳的作用温度;而加热39℃和43℃时,在一定浓度范围内CNE-1细胞增殖活性有明显增加,与KAPPEL等[12]研究结果一致。这一结果提示只有在一定的药物浓度下,加热控制在特定温度才能增强紫杉醇的细胞毒作用,不合适的温度作用有可能加速肿瘤细胞的生长和转移,因此紫杉醇与热疗联合应用时应注意温度与浓度的控制。热与抗肿瘤药物联合应用的优势是利用它们的互补作用,在减少化疗药物用量、降低热疗温度的情况下保持甚至提高疗效,笔者认为紫杉醇具备上述优点,作为热化疗联合应用治疗鼻咽癌的首选化疗药物,有着十分广阔的前景。而对于39℃及43℃低药物浓度作用时出现肿瘤细胞增殖明显增加的现象,其机制有待进一步研究。

肿瘤热化疗作为肿瘤综合治疗的一种新模式,已经在国内较逐渐开展起来。热化疗结合了热疗的优势与特点,使热疗与化疗相互促进,提高了局部药物浓度,降低全身毒性,展现出广阔的前景和应用价值。通过对肿瘤热化疗基础研究的不断深入及临床应用的成功经验,相信会使更多的肿瘤患者从中受益。

参考文献

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鼻咽癌细胞株 第3篇

1 材料和方法

1.1 材料

人鼻咽癌CNE-1细胞株人鼻咽癌CNE-1细胞株购于中国典型培养物保藏中心 (中国武汉市) 。EVn-50为棕褐色粉末, 200mg/瓶, 批号:20061008, 由中南大学药学院提供。RPMI-1640培养基、溴化四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 、二甲基亚砜 (DMSO) 、为上海欣美公司产品;新生小牛血清由美国sigma公司生产。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人鼻咽癌CNE-1细胞采用含10%小牛血清的RPMI-1640培养, 培养条件为5%CO2, 37℃及饱和湿度条件下培养箱中培养, 每 (2~3) 天传代一次。

1.2.2 MTT比色法

取对数期生长的人鼻咽癌CNE-1细胞, , 调节细胞浓度为1.0104个/m L, 接种于96孔板上, 每孔200μL。加入20μL/孔的EVn-50, 使其终浓度分别为 (0.1、0.3、1.0、3.0和10.0) μg/m L。溶媒对照组加入等量细胞悬液和含0.02%DMSO 10μL/孔。每组设3个复孔, 孵育48h后, 加入MTT液10μL/孔 (5mg/m L) , 继续培养4 h, 平板离心机1 000rpm离心5分钟后, 弃上清, 加入100μL/孔的DMSQ, 使用570nm波长测定吸光度A值.按IR (%) = (1一药物处理组A均值/溶媒对照组A均值) x100%计算细胞增殖活性相对抑制率。IC50用Calcusyn程序计算。

1.3 统计学方法

采用SPSS14.0统计软件进行统计学处理, 计量资料采用均数±标准差表示, 运用单因素方差分析, P<0.05为有统计学意义。

2 结果

EVn-50对人鼻咽癌CNE-1细胞增殖活性均有抑制作用, 与溶媒对照组比较, 在EVn-50浓度为0.1μg/m L时差异有统计学意义 (P<0.05) ;在EVn-50浓度为 (0.3、1.0、3.0和10.0) μg/m L时, 差异有显著统计学意义 (P<0.01) , 且呈浓度依赖性, 其IC50为1.03μg/m L, 见表1及图1。

注:与溶媒对照组比较, *P<0.05, △P<0.01

3 讨论

黄荆为马鞭草科直立灌木, 黄荆的果实为黄荆子, 呈褐色, 近球形, 质坚硬不易破碎, 气香, 味微苦和涩。黄荆子具有多种药用功效[6,7]。在国内, 古代的《本草纲目拾遗》及《唐本草》等均有记载, 认为黄荆子是治疗哮喘、关节痛、失眠、抗癌等疾病的良药。

在西方国家, 尤其是欧洲国家黄荆子也一直被认为是治疗和缓解妇女经前综合症以及缓解更年期症状的首选药物。随着科技的进步和发展, 黄荆子也被众多的中外学者进行了更深层次的成分化学分析以及体内外实验研究, 进一步地论证了黄荆子的药理功效, 并且还发现了一些黄荆子的新的药用价值。最近, 黄荆子的抗肿瘤作用引起了大家的广泛关注。众多的研究表明黄荆子提取物对于呼吸系统和消化系统及妇科的多种肿瘤细胞的生长增殖均有抑制作用[8~10]。但黄荆子提取物是否同样对鼻咽癌细胞的增殖有抑制作用, 目前的研究还不多。

本文采用MTT比色法观察了黄荆子乙酸乙酯提取物对人鼻咽癌CNE-1细胞增殖活性的影响。结果显示, 黄荆子乙酸乙酯提取物EVn-50对人鼻咽癌CNE-1细胞具有明显增殖抑制作用, 浓度分别为 (0.1、0.3、1.0、3.0和10.0) 的EVn-50对鼻咽癌CNE-1细胞的相对增殖活性的抑制率分别为13.33%、38.24%、59.62%、67.41%和78.34%。与溶媒对照组比较, 在EVn-50浓度为0.1μg/m L时差异有统计学意义 (P<0.05) ;在EVn-50浓度为 (0.3、1.0、3.0和10.0) μg/m L时, 差异有显著统计学意义 (P<0.01) , 且呈浓度依赖性, 其IC50为1.03μg/m L。

总之, 从本次实验结果我们可以证实黄荆子的乙酸乙酯提取物EVn-50对人鼻咽癌CNE-1细胞具有明显增殖抑制作用, 这为研究黄荆子乙酸乙酯提取物EVn-50的抗肿瘤作用提供了初步实验依据, 其具体的机制以及在体内治疗鼻咽癌的有效性还有待作进一步探讨。

摘要：目的:探讨黄荆子乙酸乙酯提取物提取物 (EVn-50) 对人鼻咽癌CNE-1细胞株增殖疗效的影响。方法:对人鼻咽癌CNE-1细胞进行体外培养, 分别以不同浓度的 (EVn-50) 与人鼻咽癌CNE-1细胞共同孵育48 h, 采用MTT比色法测定EVn-50对人鼻咽癌CNE-1细胞增殖活性的影响。结果:EVn-50能抑制人鼻咽癌CNE-1细胞的增殖。结论:人鼻咽癌CNE-1细胞的增殖能够被EVn-50有效的抑制, 且呈浓度依赖性。

关键词：鼻咽癌,黄荆子,增殖

参考文献

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鼻咽癌细胞株 第4篇

关键词：鼻咽肿瘤/病理学,叶酸受体,免疫组织化学,免疫细胞荧光

叶酸在DNA及RNA合成、表现遗传过程、细胞增殖与生存的代谢过程中起到重要作用，已有的研究显示叶酸受体在正常组织中的表达保守[1]，而在一些恶性肿瘤组织中高度表达[2,3]，其作为肿瘤分子靶向治疗潜在靶位的作用越来越受到关注。鼻咽癌是我国南方高发恶性肿瘤之一，近20年来化疗已作为鼻咽癌治疗的重要手段，但全身给药副反应严重。我们采用免疫组织化学和免疫细胞荧光技术对鼻咽癌组织与细胞株中叶酸受体的表达进行了比较研究。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备

小鼠抗人叶酸受体IgG单克隆抗体(LK26)购自abcam公司(ab3361);即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司;FITC标记山羊抗小鼠IgG二抗(进口分装)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;DAPI荧光封片剂购自德国Vector公司。其他细胞培养试剂：新生小牛血清、青-链霉素液为奥地利PAA公司产品，0.25%胰酶购自杭州吉诺公司，RPMI-1640干粉和无叶酸RPMI-1640培养液为美国GIBCO公司产品，其他分析纯试剂购自广州化学试剂厂。主要设备：SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化公司)，Galaxy St型二氧化碳培养箱(英国RS Biotech公司)，TS100倒置显微镜(日本Nikon公司)，荧光显微镜(德国铼卡公司)，低速离心机(上海安亭科学仪器厂)，恒温水浴锅(英国Grant公司)，恒温干燥箱(德国BINDER公司)。

1.2 鼻咽癌组织标本

2008年5月～2008年11月南方医科大学珠江医院耳鼻咽喉头颈外科就诊并接受鼻咽部活检、常规病理诊断为鼻咽癌的患者中选取临床资料完整的20例。其中男性14例，女性6例;年龄30～54岁，中位年龄41.8岁，均为首次就诊、无治疗史。临床分期(92’长沙分期标准)：Ⅱ期11例，Ⅲ期5例，Ⅳ期4例。病理类型：20例中非角化型鳞癌(WHOⅡ型)8例，其余均为鼻咽未分化癌(WHOⅢ型)(12例)。另外随机抽取8例慢性鼻炎患者和恐癌志愿者正常鼻咽部黏膜标本作为阴性对照。所有标本离体后(鼻咽癌组织及鼻咽部正常鼻咽黏膜标本以活检钳取出后)立即投入液氮内保存，择期行冰冻切片(片厚5μm)连续切片，行HE和免疫组织化学染色。

1.3 鼻咽癌细胞株

鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、HNE2以及宫颈癌细胞株Hela购自中山大学北校区实验动物中心细胞库，HNE-1购自中南大学湘雅医学院细胞库，SUNE-1、5-8F细胞株由南方医科大学肿瘤研究所惠赠。细胞常规培养于含10%新生牛血清和1%青、链霉素双抗的RPMI-1640培养液中，培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度5%。定期观察细胞生长情况，当生长至80～90%密度时用0.25%胰酶消化，进行传代培养。选择对数生长期、状态良好的细胞以胰酶消化、PBS洗涤重悬成5106/m L细胞悬液制成细胞涂片，冰丙酮液固定10 min后自然风干，行免疫细胞荧光染色。

1.4 免疫组织化学检测

组织标本冰冻切片、室温下干燥10 min,4%多聚甲醛室温固定10 min,PBS清洗后过氧化氢甲醇溶液(30%过氧化氢与纯甲醇按1∶50新鲜配制)室温孵育15 min灭活内源性过氧化物酶，5%BSA室温20 min封闭非特异抗原位点，加入小鼠抗人叶酸受体IgG一抗湿盒内孵育，4℃过夜。阴性对照以PBS液替代一抗，以已知叶酸受体表达阳性组织作为阳性对照。一抗孵育结束后按照博士德SABC即用型染色试剂盒说明书进行，常规苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜观察。

1.5 免疫细胞荧光检测

细胞涂片经冰丙酮固定，PBS清洗后加过氧化氢甲醇溶液室温孵育15 min灭活内源性过氧化物酶，5%BSA室温20 min封闭非特异抗原位点，加入小鼠抗人叶酸受体IgG一抗湿盒内孵育，4℃过夜。阴性对照加PBS液，以已知高表达叶酸受体的Hela细胞作为阳性对照。一抗孵育结束后PBS清洗、加入羊抗小鼠FITC荧光二抗室温作用1 h,PBS清洗后加DAPI荧光封片剂室温作用5 min，封片和在荧光显微镜下观察。

1.6 结果判断与统计学分析

免疫组织化学阳性信号呈棕黄、棕褐色，免疫细胞荧光阳性呈绿色荧光，定位于细胞膜上。按照参考文献方法在计算机上用Image-pro Plus图像分析软件统计着色细胞的个数，以5个高倍视野中阳性细胞数量百分比～5%、5～25%、25～75%、75%～分别计为阴性(-)、弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)，由两位病理诊断医生在未知标本分组的情况下进行判读[4]。采用SPSS 13.0软件包通过χ2检验、Pearsonχ2检验、拟然比χ2检验对实验数据进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 叶酸受体在鼻咽癌组织中的表达与临床特征的关系

免疫组织化学染色显示85%的鼻咽癌组织表达叶酸受体(17/20)，其中强阳性8例，阳性5例，弱阳性4例，见图1;而对照组正常鼻咽黏膜组织中未见叶酸受体表达(0/8)，差异具有统计学意义，见表1。晚期(Ⅲ+Ⅳ期)鼻咽癌组织中叶酸受体阳性比例高于早期(Ⅱ期)鼻咽癌;非角化鳞癌和鼻咽未分化癌两种病理类型的叶酸受体表达情况无明显差异;与性别、年龄等因素无明显相关性，见表2。

2.2 叶酸受体在鼻咽癌细胞株中的表达

免疫细胞荧光法检测6株国内建株的鼻咽癌细胞，仅发现HNE1细胞FR呈强阳性表达，其阳性水平与高表达FR的Hela细胞相当，阳性定位于细胞膜表面，胞质与胞核未见特异着色;其余5株细胞均未发现有表达，见图2。

3 讨论

叶酸又称蝶酰谷氨酸、维生素B9、维生素B11，是一种人体必需的水溶性维生素，是包括核苷酸从头合成在内的一碳单位转移反应的辅因子，在涉及DNA及RNA合成、表观遗传过程、细胞增殖与生存的代谢过程中扮演关键角色。叶酸受体(folate receptor,FR)是细胞膜表面糖基化的磷脂酰肌醇锚定的糖化多肽，可以与5-甲基四氢叶酸及游离叶酸特异结合，并且通过受体介导的胞吞机制将叶酸及其衍生物高效、特异的载入细胞[5]。

叶酸受体有3种常见亚型：FRs-α，FRs-β，FRs-γ;FR-α，FR-β是细胞膜相关蛋白，通过GPI锚定在细胞膜上，两者具有约70%的同源性。FR-α和FR-γ缺少修饰GPI锚附着的羧基末端信号肽，组成上属于分泌型蛋白[6]。在正常组织中FR的表达高度保守：FR-α微量表达于正常成人组织极化的上皮细胞管腔面[1]。FR-β见于正常髓细胞生成的后期和激活的巨噬细胞[6]，少量表达于肝脏;胎盘的羊膜和绒膜表达FR-α和FR-β[6]。FR-r仅见于造血细胞[7]。在许多恶性肿瘤中FR-α，FR-β呈显著高表达，其中上皮源性肿瘤一般高表达FR-α，如：卵巢癌(卵巢非黏液腺癌)、子宫和宫颈癌、肺癌、室管膜的脑肿瘤等[2,3]，而FR-β高表达于非上皮源性恶性肿瘤包括骨肉瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤、淋巴瘤、白血病等[1]。

鼻咽癌是我国高发的恶性肿瘤之一，尤其在华南地区其发病率居世界首位[8]，目前的治疗手段以放疗、化疗为主，总体的5年生存率在50%左右[9]。对于晚期(Ⅲ、Ⅳ期)癌或不能行根治性放疗的患者，化疗是首选的治疗方法[10]。但目前临床上采用的是静脉注射全身给药化疗，药物全身分布不能选择性的进入肿瘤细胞，因此产生许多难以避免的化疗副反应。叶酸受体介导的细胞内吞转运机制以及叶酸受体表达的组织分布特点为靶向恶性肿瘤的载药和释药奠定了基础，为增强常规化疗的杀伤特异性提供了条件。但是目前国内外尚无鼻咽癌组织中叶酸受体表达情况的报道。有学者以叶酸受体阳性的KB细胞作为鼻咽癌细胞株进行叶酸受体靶向的实验研究[11]，但是美国细胞菌种库(American type culture collection,ATCC)中明确指出KB细胞(编号CCL-17)是被宫颈癌Hela细胞污染的人上皮癌细胞株。我国是鼻咽癌“大国”，国内已经建立的多个鼻咽癌细胞株是该肿瘤研究的宝贵资源，明确这些细胞株叶酸受体表达情况可为叶酸受体靶向治疗提供合适的实验模型。本研究通过免疫组织化学法对新鲜鼻咽癌组织进行检测，发现鼻咽癌组织显著高表达叶酸受体，阳性率达85%，并且近一半为强阳性表达。通过对鼻咽癌患者临床病理资料分析发现，临床分期晚的鼻咽癌叶酸受体阳性率更高;这与其他学者对子宫内膜癌、肺癌的研究结果一致[12,13]。ALLARD将485例原发性子宫内膜腺癌标本制成组织芯片，用免疫组织化学的方法检测FR-α过表达情况，并运用比例危险率模型分析FR-α水平和无进展生存之间的联系，发现FR-α过表达在分化差的病例中更常见，其无进展生存期较短[13]。IWAKIRI采用定量RT-PCR检测肺癌FR表达水平，发现肺鳞癌中临床分期晚的FR表达高[12]。这些现象提示FR表达水平和部分肿瘤分化程度、预后间存在相关性。我国鼻咽癌病理特点与欧美等地区不同，绝大部分为低分化或未分化癌，本研究中鼻咽癌组只包括非角化分化型癌和鼻咽未分化癌两种病理类型，缺乏欧美地区常见的高分化鳞癌病例，同时尚未对这些患者长期随访。尽管如此，叶酸受体在临床分期晚、病理分化差的鼻咽癌中显著高表达的研究结果为探索叶酸受体靶向药物的开发提供了分子基础。

鼻咽癌细胞株 第5篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月-2014年4月本院放疗科收治住院的鼻咽癌患者60例, 随机数字表法分为研究组与对照组, 研究组30例, 其中男13例, 女17例, 年龄32~66岁, 平均 (45.8±2.7) 岁;均经病理确诊, 其中分化型非角化性癌7例, 未分化型非角化性癌23例;以UICC 2002分期为标准, Ⅰ期4例, Ⅱ期15例, Ⅲ期11例。对照组30例, 其中男16例, 女14例, 年龄29~68岁, 平均 (42.9±3.8) 岁;均经病理确诊, 其中分化型非角化性癌7例, 未分化型非角化性癌23例;以UICC 2002分期为标准, Ⅰ期5例, Ⅱ期13例, Ⅲ期12例。两组患者的年龄、性别、病理分型和癌症分期比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 纳入标准

(1) 鼻咽癌病理诊断明确; (2) 血常规、肝、肾功能及心电图基本正常; (3) KPS评分≥70分, 预计生存期>3个月; (4) 年龄在18~70岁; (5) 患者自愿并签署同意书。

1.3 剔除标准

(1) 伴发急慢性感染者; (2) 自身免疫疾病者; (3) 糖尿病和严重创伤者; (4) 口服药物困难者; (5) 伴有严重心、肝、肾功能障碍者, 不适继续治疗者; (6) 患者1个月内接受过免疫制剂治疗者。

1.4脱落标准

(1) 因其他并发症中断放疗或使用免疫制剂者; (2) 不能耐受放疗或中药, 退出者; (3) 治疗中死亡者。

1.5 方法

1.5.1 研究方法

研究组患者行三维适形放疗, 采用直线加速器6 MV-X线和10 Mev电子线, 常规分割, 每次剂量200 c Gy, 5次/周, 肿瘤累积剂量66~70 Gy[4]。并且从放疗第1天起, 服用以黄芪、女贞子为主扶正培本汤剂, 组方如下:黄芪30 g, 女贞子30 g, 党参30 g, 白术10 g, 茯苓15 g, 制首乌18 g, 淮山18 g, 当归15 g, 川芎7 g, 白芍15 g, 枸杞15 g, 炙甘草5 g, 紫河车10 g, 1日1剂, 分两次服, 直至放疗结束。对照组患者除不服用中药外, 其他治疗同研究组。

1.5.2 检测方法

两组患者放疗前及放疗结束时, 分别采空腹外周静脉血样, 流式细胞仪检测T淋巴细胞群 (CD3、CD4、CD8、CD4/CD8) 和NK淋巴细胞数据, 并作分析比较。

1.6 统计学处理

数据采用SPSS 19.0统计软件, 计量资料以 (±s) 表示, 两组间比较采用t检验, 多组间两两比较采用单因素方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前细胞免疫功能的比较

治疗前两组患者细胞免疫功能各指标比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

2.2 两组治疗后细胞免疫功能的比较

与治疗前比较, 研究组的CD3、CD4、CD4/CD8和NK细胞有一定下降, CD8略有上升, 但差异无统计学意义 (P>0.05) ;与治疗前比较, 对照组的CD3、CD4、CD4/CD8和NK细胞下降明显, CD8明显上升, 差异均有统计学意义 (P<0.05) ;与研究组治疗后比较, 对照组的CD3、CD4、NK细胞显著下降 (P<0.05) , CD8明显上升 (P<0.01) , 见表2。

*与对照组比较, P<0.05

3 讨论

免疫缺陷是恶性肿瘤的特征之一, 大部分肿瘤患者的细胞免疫功能较正常人低下。放射治疗作为鼻咽癌主要治疗手段, 放射线对人体细胞缺乏选择性, 在杀灭癌细胞的同时也会杀伤正常细胞, 也可能损害机体的细胞免疫功能[5]。文献[3, 6-7]资料表明, 鼻咽癌患者的外周血中CD3、CD4、NK淋巴细胞百分数常下降, 而CD8升高, CD4/CD8下降甚至倒置。

目前国内鼓励推广中医中药技术临床防病治病的研究, 特别是针对恶性肿瘤等慢性病的扶正培本治疗, 取得了积极效果。贞芪扶正汤剂用益气滋阴补肾类中药组方而成, 方中黄芪具有较好的扶正效果, 大量体内外实验及临床研究表明, 黄芪多糖对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫及巨噬细胞功能均有明显的增强作用[8], 能提高网状内皮系统吞噬功能, 增强T细胞、NK细胞活力, 介导多种体液及细胞免疫, 并且具有明显抑制肿瘤细胞作用[4,9]。女贞子能明显提高T淋巴细胞功能, 是较好的免疫调节药物, 女贞子提取物通过抑制VEGF, TGF-α表达具有抗肿瘤作用[10,11]。现代医学表明, 党参煎剂可明显促进脾淋巴细胞DNA和蛋白质的生物合成, 对白细胞介质-2的产生有明显增强作用, 对小鼠网状内皮系统的吞噬功能也有增强作用, 党参多糖对人胃腺癌细胞和肝癌细胞的增殖有抑制作用[12,13]。此外方中白术、茯苓等也有激活细胞免疫功能, 增强机体抵抗能力作用, 方中诸药在辨证的基础上, 配伍成方, 相互促进, 对于提高患者免疫功能, 具有协同作用[14,15]。

本研究中, 研究组治疗后CD3、CD4、CD4/CD8和NK细胞有一定下降, CD8略有上升, 但差异均无统计学意义 (P>0.05) , 提示研究组患者免疫功能下降不明显。研究组与对照组比较, CD3、CD4、NK细胞显著上升 (P<0.05) , CD8明显下降 (P<0.01) , 表明以黄芪、女贞子为主扶正培本汤剂对改善鼻咽癌放疗患者机体免疫抑制和纠正免疫调节机能紊乱状态有积极作用, 对维持后续治疗有重要意义。

摘要：目的:观察贞芪扶正汤剂对鼻咽癌放疗患者细胞免疫功能的影响。方法:随机数字表法将60例鼻咽癌放疗患者分为研究组和对照组, 每组各30例。对照组进行单纯三维适形放疗, 研究组于三维适形放疗第1天始, 服用以黄芪、女贞子为主扶正培本汤剂, 1日1剂, 直至放疗结束。观察两组患者治疗前后外周血CD3、CD4、CD8、CD4/CD8和NK淋巴细胞数据变化。结果:与治疗前比较, 研究组的CD3、CD4、CD4/CD8和NK细胞有一定下降, CD8略有上升, 但差异均无统计学意义 (P>0.05) ;对照组的CD3、CD4、CD4/CD8和NK细胞下降明显, CD8明显上升, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。治疗后与研究组比较, 对照组的CD3, CD4, NK细胞显著下降 (P<0.05) , CD8明显上升 (P<0.01) 。结论:以黄芪、女贞子为主扶正培本汤剂有提高鼻咽癌放疗患者细胞免疫功能的作用, 对维持后续治疗有重要意义。

鼻咽癌细胞株 第6篇

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Survivin山羊抗人多克隆抗体,驴抗山羊Ig G FITC(荧光标记)二抗,购自天津灏洋生物公司;lipofectamineTM2000脂质体转染试剂,RNA提取试剂(TRIzol reagent)购自Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒及所用酶购自Ta Ka Ra生物公司。Survivin上游引物5'-AAATGCACTCCAGCCTCTGT-3',下游引物5'-TGTCGAGGAAGCTTTCAGGT-3',扩增产物为311 bp;内参照GAPDH上游引物5'-CCACCCATG-GCAAATTCCATGGCA-3',下游引物5'-TCTA-GACGGCAGGTCAGGTCCACC-3',扩增产物为598bp。引物均由上海博亚公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

人鼻咽癌5-8F细胞株,本实验室保种。在含10%小牛血清1640培养基、37℃、5%二氧化碳(CO2)浓度条件下培养。

1.2.2 Si R N A的设计与合成

Survivin特异性Si R-NA序列1:5'-UUUCUCCGCAGUUUCCUCAAAUU-CU-3';序列2:5'-AUCCAUGGCAGCCAGCUGCUC-GAUG-3';序列3:5'-AAUAAACCCUGGAAGUG-GUGCAGCC-3'。经BLAST查询,不与人其他基因同源。随机序列的si RNA序列为:5'-CGUACGCG-GAAUACUUCGACGAUCG-3',此序列不与人类任何基因序列同源。Si RNA序列由Invitrogen公司合成。

1.2.3 实验分组和转染

取对数生长期5-8F细胞,接种于10 cm2培养瓶中,培养细胞至融合达约50%时进行Si RNA转染。设:(1)对照组(脂质体试剂);(2)随机序列的si RNA对照组(转染随机序列si RNA);(3)Survivin特异性si RNA组。si RNA浓度为200 nmol/L,每组设3次重复。转染按脂质体转染试剂盒说明书进行,转染后再培养48 h,收集各组细胞进行Survivin表达分析。

1.2.4 流式细胞仪检测survivin蛋白表达

收集细胞于1.5 m L离心管中,用0.01 M PBS缓冲液(p H7.2)洗细胞3次,3 000 r/min离心去上清。用打孔液浸泡细胞15 min,使细胞浆中Survivin暴露。加入山羊抗人Survivin抗体100μL,37℃孵育60 min,室温条件下,用0.01 M PBS缓冲液(p H7.2)洗3次,离心去上清。加入驴Ig G封闭液100μL,室温放置5min,0.01 M PBS缓冲液洗细胞1次,离心去上清。加入驴抗山羊Ig G FITC抗体100μL,4℃孵育2 h(避光),用0.01 M PBS缓冲液(p H7.2)洗细胞3次,然后用1%的多聚甲醛固定,上流式细胞仪检测细胞荧光强度。

1.2.5 R T-PCR检测survivin m R N A表达

参照TRIzol试剂说明书提取总RNA,用DNaseⅠ消化总RNA中的痕量DNA,取0.1μg总RNA,参照一步法RT-PCR试剂盒说明书进行扩增反应。反应条件为:50℃15 min,94℃40s,57℃30 s,72℃1 min,35个循环,72℃5 min。设3种对照:分别用无核酸酶水替代RNA样品进行扩增;不加逆转录酶进行扩增;用阳性样品替代RNA样品进行扩增。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期

细胞培养至50%融合时进行si RNA转染,设:(1)对照组;(2)随机序列的si RNA对照组;(3)随机序列的si R-NA+放射组;(4)特异性Si RNA组;(5)特异性Si RNA+放射组。Si RNA浓度为200 nmol/L,每组进行3次重复。随机序列的si RNA+放射组和特异性Si RNA+放射组,转染Si RNA 24 h后,放射处理1次,剂量为6GY。细胞再培养24 h后,终止培养,收获细胞,PBS洗3次,离心去上清,加入预冷的70%乙醇4℃固定24 h。用流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞周期。细胞凋亡指数(AI)=亚二倍峰细胞数/总细胞数100%。

1.2.7 细胞增殖检测

细胞培养至50%融合时进行Si RNA转染,转染Si RNA 24 h后,放射处理1次,剂量为6 GY。细胞再培养24 h后,终止培养,收获细胞,在显微镜下计数。细胞生长抑制率(IR)=(1-实验组细胞数/对照组细胞数)100%。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 10.0软件进行方差分析与q检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 特异性S i R N A抑制鼻咽癌5-8F细胞S ur-vivin基因表达

特异性Si RNA组,Survivin表达强度(0.12±0.02)显著低于对照组[(2.48±0.15),(P<0.01)]和随机序列的si RNA对照组[(2.39±0.14),(P<0.01)];对照组与随机序列的si RNA对照组比较,Survivin表达差异无显著性(P>0.05)。

2.2 R T-P C R检测5-8F细胞S urvivin m R N A表达

特异性Si RNA组,Survivin m RNA表达明显低于对照组和随机序列的si RNA对照组,见图1。

M:PCR Marker;1:对照组;2:随机序列的si RNA对照组;3:特异性si RNA组

2.3 特异性si R N A和放射对5-8F细胞增殖的影响

特异性si RNA加放射组,细胞抑制率(33.7±1.5%)显著高于特异性si RNA组[(23.8±4.3%),(P<0.05)]和随机序列的si RNA加放射组[(15.5±1.7%),(P<0.01)]。对照组和随机序列的si RNA对照组比较,细胞抑制率差异无显著性(P>0.05)。

2.4 特异性si R N A和放射对5-8F细胞凋亡的影响

特异性si RNA加放射组,细胞凋亡率(24.67±0.50)显著高于特异性si RNA组[(20.30±0.44),(P<0.05)]和随机序列的si RNA加放射组[(6.58±0.38),(P<0.01)]。对照组(3.59±0.44)和随机序列的si R-NA对照组(3.68±0.11)比较,细胞凋亡率差异无显著性(P>0.05),见图2。

2.5 特异性S i R N A和放射对5-8F细胞周期的影响

特异性Si RNA加放射组,S/G1比率(2.76±0.186)显著高于特异性si RNA组[(1.91±0.067),(P<0.01)]与随机序列的si RNA加放射组[(0.585±0.066),(P<0.01)];对照组[(0.338±0.018),(P<0.01)]和随机序列的si RNA对照组[(0.354±0.021),(P<0.01)]比较,细胞周期无明显改变。

3 讨论

Survivin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成员之一,具有抗凋亡和调节细胞分裂双重功能[4]。Survivin基因的表达具有高度的肿瘤特异性,在多数肿瘤组织中存在着过表达,而在大多数正常组织中不表达[6];Survivin在肿瘤组织中的过表达与肿瘤的发生、发展、化疗敏感性以及预后密切相关,是肿瘤基因治疗的理想靶点[7]。RNAi(RNA interference)是双链RNA(double stranded RNA,ds RNA)介导转录后的基因沉默,具有高度的特异性和有效性,正成为基因功能研究、肿瘤和病毒性等疾病治疗的有力工具[8~10]。

鼻咽癌细胞株 第7篇

甘氨双唑钠CMNa是我国研制的一种新型硝基米唑类放射增敏剂, 易扩散渗透进入肿瘤组织, 在肿瘤细胞内具有高度的浓聚性, 它能选择性增强放射线对乏氧细胞DNA双链的损伤, 并通过抑制DNA聚合酶β的活性而抑制受照乏氧细胞的潜在致死性损伤和亚致死性损伤的修复, 从分子水平提高乏氧细胞的放射敏感性。由于CMNa具有增敏作用且毒副反应轻, 不少学者探讨与放疗结合应用, 希望提高局部放疗治愈率。在人和动物实体瘤中普遍存在乏氧细胞[1], 实验观察与测定表明, 一般占细胞总数10%~20%左右, 但也有高达50%的乏氧细胞由于氧的缺乏, 使得氧对电离辐射所致肿瘤细胞DNA损伤固定作用减弱, 损伤逆转作用增强, 因此导致肿瘤细胞对放射治疗抗性增强, 从而易导致治疗失败。而放射增敏剂则是能够增强生物体放射敏感性的一类物质, 它可增强射线对肿瘤的杀伤能力, 特别是有助于解决实体肿瘤中乏氧细胞对射线的抗性而导致肿瘤放疗治愈率低的问题, 这对于临床提高放射治疗的效果有很重要的意义[2], 硝基咪唑类化合物是公认的肿瘤放疗增敏剂。甘氨双唑钠 (简称CMNa) 属于硝基咪唑类化合物, 具有亲水性和亲肿瘤细胞的桥式化学结构, 可将射线对肿瘤乏氧细胞DNA的损伤固定, 抑制其DNA损伤的修复, 从而提高肿瘤乏氧细胞对辐射的敏感性。本试验致力于研究甘氨双唑钠对鼻咽癌细胞的放射增敏作用。

1 材料与方法

1.1 材料:

人鼻咽癌细胞、注射用甘氨双唑钠 (广州莱泰生物制药有限公司生产) 、M TT、DM S O、酶联免疫检测仪。

1.2 细胞培养:

复苏细胞, 接种于培养瓶中。采用含10%小牛血清的DMEM培养液, 于37℃, 5%CO2培养箱内孵育, 待传三代后取对数生长期的细胞进行分装培养实验。

1.2.1 方法1:

收集对数生长期细胞, 调整细胞悬液浓度调待测细胞密度至5×106/ml。实验分为常规照射组和乏氧加不同浓度C M N a照射组, 每组三块板, CMNa浓度分别为0、0.20、0.3、0.40、0.6和0.80g/L。每组4个孔, 试验重复3次。将调整密度后的悬液按细胞数5×103/孔 (每孔100μl) 接种于96孔板内, 培养24 h。加入不同浓度的CMNa溶液, 将培养板置于乏氧照射盒内, 注入99.99%氮气30 min, γ射线单次照射4Gy。然后置于5%CO2培养箱内, 37℃孵育每隔24小时两组各取一块板, 倒置显微镜下观察细胞形态变化。然后每孔加入20μl MTT溶液 (5mg/ml, 即0.5%MTT) , MTT全称为3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-zy1) -3, 5-d i-phe nytet razoli umromi de, 是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT, 同时在细胞色素C的作用下, 生成蓝色 (或蓝紫色) 不溶于水的甲臜 (Formazan) , 继续培养4h, 终止培养后。小心吸去孔内培养液。每孔加入100μl二甲基亚砜, 振荡10min, 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570/630nm处测定吸光度A值。.同时设对照孔 (细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜) 。

1.2.2 3H-TdR掺入法测量不同浓度CMNa对DNA合成的影响:

细胞培养方法同1.2;分别在24, 48及72 h培养结束前16 h注入3H-TdR 1 u ci, 收获样品, 于低本底液闪计数仪上测得每分放射性计数。方法见文献。

1.3 统计学处理:

试验重复3次, 结果取x±s;采用SPSS 1210软件, 统计分析采用t检验和方差分析。

2 结果

2.1 乏氧环境下不同浓度CMNa对鼻咽癌细胞增值的影响

由图1, 2可见, 随着CMNa浓度的增大, 乏氧组细胞的增值率明显增加, 表明CMNa在乏氧环境下的放射增敏作用具有浓度依赖性。但存在一个最适有效浓度, 即0.4g/ml, 超过最适浓度后细胞增值率降低而死亡率升高;随着作用时间的延长药物浓度对细胞的影响逐渐减弱。

2.2 常规环境下CMNa对鼻咽癌细胞照射后细胞死亡率检测结果如上图所示

常规环境下, 鼻咽癌细胞照射后24、48、72h浓度分别为0、0.20、0.30、0.40、0.60和0.80g/L CMNa时细胞死亡率差异均无统计学意义 (P>0.105) , 表明在常规环境下CMNa对鼻咽癌细胞无明显放射增敏作用。

讨论

鼻咽癌实体瘤中存在大量乏氧细胞, 其对放射线的敏感性明显下降, 抗性增高, 是导致放射治疗失败的重要原因。增大照射剂量又会造成面颈部水肿、中耳炎、放射性龋齿等放射损伤效应发生概率大大增加[4]。因此, 适当的使用放射增敏药物, 可以达到提高肿瘤细胞杀伤比率, 降低放射治疗剂量, 减轻放射损伤效应的作用。CMNa基础研究和临床实验证实其对实体瘤乏氧细胞有明显的放射增敏作用, 对正常组织无明显影响, 并随药物浓度的增加呈现一定浓度相关性[5,6]。

一般来讲, 直径<1mm的肿瘤是充分氧合的, 超过这个大小便会出现细胞乏氧。实体瘤中乏氧细胞的比例为10%~50%, 瘤体越大, 乏氧细胞的比例越高。[7]本试验通过通氮气的方式使离体鼻咽癌细胞达到乏氧状态, 模拟体内的乏氧状况。未通氮气组由于离体培养细胞没有直径超过1mm的团块所以可以认为是充分氧合的。试验用药浓度亦根据临床剂量设计, 使之在人体安全使用范围内。结果显示在药物浓度为0.4g/l时乏氧细胞增值率最低, 3H-TdR掺入率亦最低, 提示此剂量为最佳药物浓度, 并且对于非乏氧组药物浓度变化对细胞死亡率没有显著影响, 提示CMNa对氧合细胞没有增敏作用。为此关于CMNa在不同剂量条件下对鼻咽癌细胞的放射增敏作用尚待进一步研究。

参考文献

[1]Price P, McMillan TJ.The use of none-clonogenic assays in measuring the response of cells in vitro to ionising radiation.Enr J Cancer.Review.Currt Radiat Oncol, 1994;30A (6) :838-841

[2]Hao H, Lu J.Survey of Radiosensitizing Agent s (Synt hesized chemicals and Gene Therapeutic Agent s) Since2000[J].J Chin Phar Sci, 2003, 12 (3) :164

[3]刘芬菊, 苏燎原, 刘克良.维生素A对淋巴细胞增殖效应的影响.营养学报.2001, 23 (3) 239-241

[4]Ciaccia AJ.Semin Radiat Oncol, 1996, 6 (5) ;46-58

[5]Zhang L, Mizumoto K, Sato N, et al.Quantitative determination of apoptotic death in cultured human pancreatic cancer cells bypropidium iodide and digitonin.Cancer Lett, 1999, 142:1292137.

[6]郑秀龙主编.甘氨双唑钠研究论文集.第1版.上海:第二军医出版社.2001, 5:1213