抗病性鉴定范文

抗病性鉴定范文（精选10篇）

抗病性鉴定 第1篇

1 材料与方法

1.1 材料

供试茄子品种共3 1个:崖城红茄、T G黑美女、京茄A号、茄杂2号、茄子品种1、黑长茄、早生大丸、朗格、黑塔茄子、德都线长茄、紫条茄、茭瓜茄、六叶茄、三叶茄、大笨茄、兴城紫园茄、新长畸、早二红茄、长野狼、牛角茄、辽茄4号、大叶白花、一口茄、狗尾巴茄、丹东早紫茄、荷包茄、沁阳紫园茄、阳高茄子、武冈白茄、渡口茄和早乌棒墨茄。

病害普查及品种鉴定试验于2012年在金陵科技学院园艺站温室试验田进行。按随机区组设计,每个品种1个小区,每小区面积10 m2,种植茄子40株。常规栽培管理,依具体情况及时浇灌和施肥,整个生育期不施任何杀菌剂,靠病圃内自然发病。

1.2 病害调查方法

病害发生情况:调查每个品种的所有植株。

发病率计算公式为:

发病率=(发病植株数/每个品种总株数)100%

病情指数调查:采用试验小区内棋盘式10点取样法,根据生长植株的具体情况随机调查。具体方法为每1个点调查1株,每1株自下向上调查15个叶片,按病情分级标准记载病情级数,每隔3 d调查1次,连续调查3次,计算平均病情指数。

病情分级标准为:0级,叶片上无病斑;1级,叶片上发现零星病斑;2级,病斑面积为叶面积的1/4;3级,病斑面积为叶面积的1/4～1/3;4级,病斑面积为叶面积的1/3以上或落叶。

病情指数的计算公式为:

病情指数=[Σ(各级病叶数各级代表值)/(调查总叶数最高级代表值)]100

1.3 田间抗病性鉴定

1.3.1 鉴定时间

茄子成株期为播后9 0～1 0 0 d。温室温度15～20℃,湿度大于80%,环境条件比较适合灰霉病的发生。

1.3.2 鉴定方法

鉴定方法采用以病情指数为基础[9],以相对抗病性指数进行抗(耐)感划分。

相对抗病性指数=1-相对病情指数

相对病情指数=鉴定品种平均病情指数/对照品种平均病情指数

其中以病情指数最高者作为对照品种。

1.3.3 品种抗病性评价

抗(耐)感划分:以相对抗病性指数为划分依据,将茄子品种的田间抗病性鉴定结果分成4个级别,即为高抗(HR),相对抗病性指数0.90～1.00;中抗(MR),相对抗病性指数0.70～0.89;中感(MS),相对抗病性指数0.40～0.69;高感(HS),相对抗病性指数<0.40。

2 结果与分析

根据对温室试验田内31个茄子品种的病害普查结果(见表1)可知,在温室田间湿度较大的条件下,31个品种茄子均有植株感染灰霉病,发病率最高的为黑长茄,发病率为77.8%,最低为早乌棒墨茄,发病率为10%。大多染病植株从叶片边缘处先感染,发病较重的植株,其下部叶片大面积干枯并产生灰色霉层。以崖城红茄为对照品种,31个品种中,早乌棒墨茄、渡口茄等11个品种的相对抗病性指数在0.9以上,为高抗品种,占品种总数的35.48%;德都线长茄等10个品种的相对抗病性指数在0.73～0.88,为中抗品种,占品种总数的32.26%;茄杂2号等6个品种的相对抗病性指数在0.45～0.69,为中感品种,占品种总数的19.35%;崖城红茄、TG黑美女和京茄A号的相对抗病性指数分别为0、0.30和0.37,为高感品种,占品种总数的9.68%。

3 小结

系统地搜集、保存、评价和研究抗原是抗病育种工作的最重要基础。本研究通过自然病圃法鉴定和比较了31个茄子品种对灰霉病的抗病性,结果表明,在31个品种中,崖城红茄、TG黑美女和京茄A号3个品种为高感品种;茄杂2号等6个品种为中感品种,德都线长茄等10个品种为中抗品种,早乌棒墨茄、渡口茄、武冈白茄等11个品种为高抗品种。

本试验研究表明,不同茄子品种对灰霉病抗性存在差异。灰霉病作为真菌性气传病害,影响其发生的气候条件主要包括田间温度和空气相对湿度,但不同品种、不同群体密度可能存在差异,影响抗病性的鉴定结果。所以,本研究的后续研究应在人工接种单一病原的条件下,对已有的茄子品种资源进行抗性筛选,以期能成功挖掘和利用近缘物种的优良基因库,从而进一步提升选育品种的抗性,为防治灰霉病提供优良的茄子品种资源。

摘要：在温室自然发病的条件下,调查了31个茄子品种的灰霉病发生情况,并鉴定了其抗病性。结果表明:31个品种茄子均有植株感染灰霉病,发病率最高的为黑长茄,发病率为77.8%,最低为早乌棒墨茄,发病率为10%。崖城红茄、TG黑美女和京茄A号为高感品种;茄杂2号等6个品种为中感品种;德都线长茄等10个品种为中抗品种;早乌棒墨茄、渡口茄等11个品种为高抗品种,为自然发病圃中筛选出的较抗病品种。

关键词：茄子品种,灰霉病,抗病性鉴定

参考文献

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[2]李成林,杜世义,王晓丽.茄子主要病害的识别与防治[J].吉林蔬菜,2009,(2):37-38.

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[4]梁伟伶,台莲梅,靳学慧,等.马铃薯早疫病菌室内杀菌剂筛选及配比试验[J].植物保护,2009,35(4):168-17.

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[6]温晓涵,张喜春.引进番茄品种抗晚疫病苗期鉴定及抗性品种筛选[J].中国农学通报,2010,26(4):189-194.

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[8]陈灵芝.茄子种质资源抗黄萎病鉴定结果[J].甘肃农业科学,2006,(1):21-23.

抗病性鉴定 第2篇

论文中英文摘要

作者姓名：丁新华

论文题目：水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

作者简介：丁新华，男，1980年06月出生，2002年09月师从于华中农业大学王石平教授，于2008年06月获博士学位。

中

文

摘要

水稻白叶枯病和稻瘟病分别是由白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起，是世界水稻生产中的两大重要病害，造成巨大的损失。通过改良水稻自身防御体系来有效的控制病害，是一种即经济又“绿色”的方法。鉴定水稻抗病相关基因，研究水稻抗病机理对改良水稻有着重要的科学意义和应用前景。

植物激素生长素诱导的信号通常被认为调节植物的生长和发育。本研究报道的水稻基因GH3-8是一个生长素反应基因，在依赖于生长素的发育中发挥功能，同时也调节不依赖于水杨酸和茉莉酸的信号路径的抗病反应。白叶枯病病菌诱导水稻至少在被侵染部位合成生长素，而生长素继而诱导水稻大量合成松弛细胞壁的蛋白质－伸展蛋白（α-和β-expansins），破坏细胞壁对病原菌的先天屏障作用，以利病原菌在水稻中生长繁殖。在携带有抗病基因Xa21或Xa26抗病水稻品种中，病原菌引起的水稻感染部位生长素的合成可诱导水稻快速合成IAA酰胺合成酶GH3-8。GH3-8通过催化IAA－氨基酸的合成抑制生长素的作用，从而阻止细胞壁的松弛，增强植物对病原菌的自身免疫功能。超量表达GH3-8基因增强水稻对白叶枯菌的抗性，同时也延缓了植株的生长和发育，至少部分因为抑制了生长素信号从而抑制了α-和β-expansins。本研究结果揭示了病原菌利用生长素作为毒性因子侵染水稻的机理、以及水稻应对这一毒性因子的调控途径，同时也从一个方面解释了植物在抗病反应中通常要付出生长被抑制的代价的原因。

超量表达GH3-8导致植株不育。通过正反交试验显示GH3-8超量表达植株是雄性和雌性都不育。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雌蕊柱头发育不正常；通过激光共聚焦显微镜对雌蕊胚囊观察发现，GH3-8超量表达植株的成熟胚囊发育不正常，这可能是GH3-8超量表达植株雌性不育的原因。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雄蕊和野生型无异，但花粉碘染显示GH3-8超量表达植株大部分花粉都败育，这可能是GH3-8超量表达植株雄性不育的原因。通过分析GH3-8基因表达模式显示GH3-8基因特异在雄蕊高表达，并随着花的发育表达强弱也不断变化，而在雌蕊基本检测不到表达。组织和时间的特异表达也印证了GH3-8在调控花的发育中作用。利用酵母单杂交技术，筛选得到和GH3-8基因启动子互作的几个生长素反应因子。其中OsARF8超量表达激活GH3-8基因的表达，证明OsARF8是调控GH3-8基因表达的转录因子。通过分析OsARF8基因表达模式显示OsARF8基因特异在雌蕊高表达，而在雄蕊表达很低。OsARF8基因超量表达植株和野生型植株相比育性下降。花粉碘染显示OsARF8基因超量表达植株大部分花粉败育；检测雌蕊没有发现和野生型有显著

差异。花粉的育性下降可能是OsARF8超量表达植株育性下降的原因。生长素信号路径中的基因（OsARF8和GH3-8）的不正常表达影响了水稻育性，说明生长素信号可能在调控水稻育性中有重要作用。检测水稻穗发育中生长素分布也显示生长素和穗的发育密切相关。

在水稻品种明恢63中抑制一个维生素B1合成基因OsDR8的表达，显著提高了转基因植株对白叶枯病和稻瘟病的敏感。外源应用维生素B1可以互补抑制OsDR8基因对水稻植株抗病的影响。几个防御反应基因包括防御信号路径的早期功能基因OsPOX和OsPAL基因以及路径下游基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR4、OsPR5 和OsPR10的表达在OsDR8抑制表达的植株中下降。这些结果说明OsDR8影响植株的抗性可能是通过影响防御反应基因的表达，OsDR8的功能在信号路径的上游。另外，维生素B1的积累可能是水稻植株对白叶枯病和稻瘟病的抗性所必须的。

通过筛选水稻T-DNA插入突变体库，发现一个类病斑突变体。侧翼序列分析显示T-DNA插在一个基因（命名为OsDR9）的开放读码框。预测的OsDR9基因编码由180个氨基酸组成的功能未知蛋白。OsDR9基因在茎和幼穗中表达很低，而在幼苗、剑叶、叶鞘和愈伤表达较高，在根中没有检测到表达。另外OsDR9基因在老叶中比新叶表达更高。突变体对稻瘟病和胡麻叶斑病表现高抗。对有类病斑的叶片进行组织化学检测和DNA断裂分析显示细胞死亡具有凋亡特征。病程相关蛋白PR4和PR8以及稻瘟病相关基因AOS2在突变体中上升表达。突变体植株也积累了自发荧光物质、SA、JA和植保素（momilactone A 和 sakuranetin）。突变体提高了超氧化物和H2O2的水平。将一个来源于水稻品种日本晴的包含有OsDR9基因的10.5kb片段转入突变体02Z15AM37，转基因植株类病斑表型消失，说明由于T-DNA插入导致的OsDR9突变是是引起类病斑表型的原因。这些结果说明OsDR9是水稻抗病和细胞凋亡的一个负调节子。

关键词：

水稻；白叶枯病；稻瘟病；抗病相关基因；生长素；水杨酸；茉莉酸；基础抗性；发育；伸展蛋白；GH3；维生素B1；类病斑突变体；凋亡；植保素；活性氧物质

Isolation and Functional Characterization of Pathogen-induced Defense-responsive Genes of Rice

Xinhua Ding

ABSTRACT Rice bacterial blight disease caused by Xanthomonas oryza sative pv.oryza and fungal blast disease caused by Magnaporthe grisea, are two of the most devastating diseases of rice worldwide.These two diseases cause tremendous yield loss each year.Efficient control of disease through improving rice defensive system is economic and green way.Characterizing rice disease resistance related genes and elucidating the mechanism of rice disease have important significance in science and application for improving rice.The signaling induced by the plant growth hormone auxin is generally recognized to regulate plant growth and development.Here we report that rice GH3-8, an auxin-responsive gene functioning in auxin-dependent development, activates disease resistance in a salicylic acid– and jasmonic acid–signaling-independent pathway.Bacteria induce accumulation of indole-3-acetic acid(IAA), the major type of auxin, in rice.IAA induces the expression of α-and β-expansins, the proteins that are known to loose cell wall, the native barrier of biotic intruder, to facilitate the growth of cells.In resistance rice variety carrying Xa21 or Xa26, the infection of bacteria induce rice to synthesize GH3-8 in infection site of rice.GH3-8 encodes an IAA-amino synthetase that prevents free IAA accumulation and looseness of cell wall.Overexpression of GH3-8 results in enhanced disease resistance and retarded growth and development, which is at least partly due to inhibiting the expression of α-and β-expansins via suppressing auxin signaling.Here we show the mechanism of bacteria hijacks auxin as virulence factor to infect rice, and the regulating pathway of rice to the virulence factor;in addition to, explain the cause that plants growth was restrained in disease resistance.Overexpression of GH3-8 results in sterility of plants.Analysis of forward cross and reverse cross showed that GH3-8-overexpressing plants were male sterility and female sterility.We found that the stigmas of GH3-8-overexpressing plants are abnormal by morphological observation.We observed the mature embryo sac of GH3-8-overexpressing plants using laser scanning confocal microscopy.The result showed that the mature embryo sacs of GH3-8-overexpressing plants were abnormal.This may be the reason of female sterility.No obvious difference was observed in stamen between GH3-8-overexpressing plants and wide type in stamen, but the most of pollen of GH3-8-overexpressing plants were sterile.This may be the reason of male sterility.GH3-8 had high expression level in stamen, and the expression of GH3-8 changes as the development of flower.Tissue and time differential expression confirmed the role of GH3-8 in regulating flower development.We gained several auxin responsive factors(ARFs)that interacted with the promoter of GH3-8 by analysis of yeast one hybrid.Overexpression of OsARF8 in Mudanjiang 8 activated the expression of GH3-8.This result suggested that OsARF8 is the transcription factor in regulating the expression of GH3-8.OsARF8 had high expression level in pistil, and very low expression level in stamen.GH3-8-overexpressing plants had lower fertility than wide type.The most of pollen of OsARF8-overexpressing plants were sterile.The overexpression of Auxin signaling genes(OsARF8

抗病性鉴定 第3篇

关键词 香草兰根（茎）腐病 ；Fusarium oxysporum ；病原鉴定 ；进化树 ；致病性

分类号 S435.73

Abstract Vanilla fusarium rot is adevastating disease. Few molecular identification and phylogenetic analysis based on rDNA-ITS sequences of the pathogen were reported. In this study， 9 isolates were obtained from 3 towns， Xinglong， Changfeng and Nanlin， of Wanning city in Hainan province. Koch's postulatestest， identifications of morphology and rDNA-ITS sequences blast were performed， results prove that the pathogen is Fusarium oxysporum. Then the phylogenetic tree was constructed based on the sequences of rDNA-ITS and the pathogenicity of the pathogens were determined， results show that strains were clustered into 2 clades with apparently genetic distance in the phylogenetic tree， and the pathogenicity of the cladeⅡwas stronger than that of the cladeⅠ. This study is useful for us to understand of vanilla fusarium rot disease from the perspective of molecular and might be conducive to the disease control.

Keywords vanilla fusarium rot ； Fusarium oxysporum ； pathogen identification ； phylogenetic tree ； pathogenicity香草兰[Vanilla fragrans （salisb.） Amess （V.planifolia）] 是一种兰科香料作物，素有“食品香料之王”的称誉，广泛应用于食品和化妆品行业[1]。香草兰于20世纪60年代被引入我国海南和云南（西双版纳），因其经济价值高一度被大力推广种植。但是由于生产前期投入高、病害发生严重等原因，香草兰种植面积在近年来呈下降趋势[2]。香草兰根（茎）腐病是香草兰上危害最严重的病害之一。该病害全年均可发生，在多雨季节（7～10月份）发生较重，严重时可导致减产50%以上。近年来，该病害的爆发流行已经成为限制香草兰产业发展的重要瓶颈之一。

对于香草兰根（茎）腐病的病原物，国内外仅有少量报道。1927 年Tucker 首先报道了该病害，并将病原物命名为尖孢镰刀菌香草兰致病变种（FusariumbatatatisWr. Var. Vanillae Tucker）[3]。1963年Gordon将其重命名为尖孢镰刀菌香草兰专化型F. oxysporum Schl. sp. Vanillae（Tuck） Gordon[4]。在1969年Alcornero和Santi认为香草兰根（茎）腐病是由尖孢镰刀菌香草兰专化型和茄腐皮镰刀菌（F. solani）混合侵染而引起的[5]。2010年Pinaria等人从印度香草兰产区分离了542株镰刀菌，涵盖镰刀菌属的12个种，发现仅尖孢镰刀菌对香草兰具有致病性[6]。在国内，1986年，黄伙平对福建香草兰根腐病病原进行了鉴定，认为病原物是尖孢镰刀菌香草兰专化型[7]。1998年，阮兴业等人对云南省西双版纳和海南省的香草兰病害进行了综合报道，认为两地的香草兰根（茎）腐病属2种镰刀菌（尖孢镰刀菌香草兰专化型和茄腐皮镰刀菌）混合侵染导致，其中尖孢镰刀菌香草兰专化型是主要病原菌[8]。2011年，刘爱勤等人对海南的香草兰病害进行调查，发现香草兰根（茎）腐病危害重大，其病原物鉴定结果与阮兴业等人相同[9]。但是，在以上报道中，病原物鉴定仅采用传统鉴定方法，没有涉及利用核糖体基因转录间隔序列（Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer，rDNA-ITS）对香草兰根（茎）腐病菌进行辅助鉴定。在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）网站的GenBank中能够搜索到一些香草兰根（茎）腐病菌rDNA-ITS序列，其来源菌株均被鉴定为尖孢镰刀菌或者尖孢镰刀菌香草兰转化型，但没有找到相关的文章报道。

nlc202309010118

为了进一步了解香草兰根（茎）腐病病原物，本课题组在海南省万宁市兴隆、长丰和南林三个地方采集香草兰根（茎）腐病样本，进行病原菌分离纯化、形态学鉴定、分子鉴定、系统发育树构建、致病性分析等工作。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究微生物培养所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）[10]；病害样本采集于海南万宁的兴隆、长丰和南林等地；所用的试剂盒包括天根生化科技（北京）有限公司的“快速DNA 提取扩增套装”、“DNA 纯化回收”试剂盒和宝生物工程（大连）有限公司“pMD 18-T Vector Cloning Kit”；所用的仪器主要有：恒温振荡器（NBS，Inonova 44R）、光学显微镜（Olympus，BX51）、生物培养箱（Percival，E-30B）、水平电泳仪（Tanon，EPS2000）、凝胶成像仪（LongGene，LG2020D）和台式离心机（Heal Force，Neofuge 18R）。

1.2 方法

1.2.1 病害样本采集和病原菌分离、纯化

2014年3～4月，分别于海南万宁的兴隆、长丰和南林等地采集香草兰根（茎）腐病病害样本。在发病严重的园块中选择处于发病初期且病害症状典型的茎蔓，用剪刀剪下收集，每园块采集样本1～2个。然后进行病原物分离纯化。将病样冲洗干净后，在超净工作台中用30%次氯酸钠消毒5 min，70%酒精消毒30 s，无菌水清洗3次后将病健交界处切成小块放在PDA培养基[10]上。将PDA平板置于26℃恒温培养箱中培养3 d。待平板中长出菌落后，从菌落边缘挑取菌丝转接于新的PDA平板中培养，重复转接5次进行纯化。

1.2.2 形态学鉴定

将分离得到的菌株接种到PAD平板上，在26℃恒温条件下培养4 d后观察菌落形态，并用单反相机（Canon EOS550D）拍照。培养14 d后用光学显微镜（Olympus BX51）在400倍视野下观察菌丝、分生孢子和厚垣孢子形态，用Image-Pro Plus 6.1图像分析软件进行图像采集和分析。

1.2.3 柯赫氏法则验证

将分离得到的菌株接种到PDA平板上，在26℃恒温条件下培养2周后将培养基打成直径0.5 cm的菌块备用。将土壤和椰糠在121℃条件下灭菌30 min，冷却后装入花盆中备用。将健康的香草兰茎蔓（去除嫩梢）后剪成50 cm长度定植在花盆上，每盆2株。用消毒过的大头针在香草兰茎节气生根基部刺3个深约0.3 cm的伤口。将准备好的菌块放置于伤口上，用无菌水脱脂棉保湿，用无菌PDA块作为对照。在室温条件下培养3周后观察结果。从发病茎秆中再次分离病原物，将分离菌株与接种菌株进行比较。

1.2.4 基因组DNA提取和rDNA-ITS序列扩增

本研究所用引物为真菌rDNA-ITS区通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。该引物扩增区间为：部分18SrDNA、ITSⅠ区-5.8SrDNA-ITSⅡ区和部分28SrDNA。引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成。基因组DNA提取和ITS序列扩增使用天根生化科技（北京）有限公司的“快速DNA提取扩增套装”试剂盒进行。基因组提取方法和PCR扩增体系均参照说明书进行。PCR程序为：94℃ 45 s，（94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s）×30个循环，72℃ 10 min，12℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后在紫外凝胶成像仪下观测和拍照。

1.2.5 rDNA-ITS区序列的克隆、测序和BLAST比对

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，将大小约500 bp的目标条带用天根生化科技（北京）有限公司的“DNA纯化回收试剂盒”进行纯化回收。回收产物通过宝生物工程（大连）有限公司“pMD 18-T Vector Cloning Kit”进行TA克隆，然后转入Escherichia coli TOP10感受态细胞中。通过菌落PCR筛选出阳性克隆子后送到深圳华大基因科技服务有限公司测序。测序结果在NCBI网站的基本局部比对搜索工具（The Basic Local Alignment Search Tool， BLAST）进行序列比对分析，根据ITS序列的同源性对分离菌株进行鉴定。

1.2.6 致病性测定

接种菌块与香草兰苗的准备与本文1.2.3小节相同。用消毒过的手术刀片在香草兰茎上横切1个深约0.3 cm的伤口，将准备好的菌块放置于伤口上，用无菌水脱脂棉保湿，以无菌PDA块作对照，每个处理10株。在室温条件下培养3周后统计病斑长度。使用SPSS 16.0对数据进行单向比较（One-way ANOVA）分析。

1.2.7 系统发育树的构建

除了本研究获得的9个香草兰根（茎）腐病菌株外，其它12个菌株的rDNA-ITS序列均从GenBank下载获得。以2株大豆猝死病病原菌F. solani（登陆号分别为AF125027和AF124995）为外群，首先用Clustal X 2.1软件进行序列比对分析，然后使用MEGA6.06软件采用Neighbor-joining计算方法和bootstrap检验方法（1 000次重复）进行系统发育树构建。

2 结果与分析

2.1 病害样本采集和病原菌分离、纯化

共从海南万宁的兴隆、长丰和南林等地采集香草兰根（茎）腐病病害样本12个。从病害样本中分离纯化出菌株9个，菌株编号及其来源详见表l。

2.2 形态学鉴定

9个菌株在PDA平板上培养4 d后，其菌落形态十分一致：菌落正面气生菌丝呈白色棉絮状（图1A），菌落背面中心区域略带紫红色（图1B）。培养14 d后，挑取少量菌丝于载玻片上，在显微镜400倍视野下观察分生孢子形态，9个菌株的观察结果一致：可以观测到小型分生孢子（图1C中虚线箭头所示）、大型分生孢子（图1C中实线箭头所示）和厚垣孢子（图1D中箭头所示）。经Image-Pro Plus 6.1图像分析软件测量得出小型分生孢子大小约为（2.3～4.5）μm×（5.0～15.5）μm，大型分生孢子（3.0～5.8）μm×（4.0～15.0）μm，厚垣孢子直径约为5.5～13.0 μm。分生孢子和厚垣孢子的形态特征与刘爱勤等人[11]所述F. oxysporum的形态特征一致。因此，将这9个菌株鉴定为F. oxysporum。

鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定 第4篇

1 材料与方法

1.1 病原分离

分别采自沙河 (Z1) 、永年 (Z2) 、姚庄 (Z3) 、邯郸县 (Z4) 、馆陶 (Z5) 。除Z2株自临床表现有神经症状的病死鸡脑部外, 其余四株均自发病鸡病变明显的肝脏分离。

1.2 培养基

营养琼脂 (p H7.3+0.1) :杭州天和微生物试剂有限公司生产, 批号20090917。

麦康凯 (不含结晶紫) 琼脂 (pH7.2~7.3) :杭州天和微生物试剂有限公司生产, 批号20090929。

伊红美蓝琼脂 (pH7.2+0.1) :杭州天和微生物试剂有限公司生产, 批号20090731。

三糖铁琼脂 (pH7.5~7.6) :杭州天和微生物试剂有限公司生产, 批号20090523。

兔血平板:将无菌营养琼脂 (pH7.3+0.1) 100mL加热溶化, 待冷至55℃~60℃时, 以无菌操作加入无菌脱纤维兔血10mL;立即轻轻振荡混匀, 不使产生泡沫, 随即装入灭菌的平皿, 即成血平板。待平板凝固后, 置37℃培养24h, 4℃冰箱保存。

1.3 分离培养

从上述各地鸡场分离的5株细菌分别接种于普通营养琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、血液琼脂培养基、经37℃培养18~24h, 观察并记录结果。

1.4 显微镜观察

分别挑取各株的单个菌落, 进行革兰氏染色, 镜检。

1.5 病原菌的生化特性鉴定

采用肠科细菌生化常规微量鉴定管。在净化台上, 用接种针取纯化后的单个菌落 (挑取同一个菌落) 接种于生化管中, 置灭菌平皿内倒置, 37℃培养24~48h, 观察结果。其中甲基红实验、靛基质实验需加指示剂。

1.6 药物敏感试验

药敏试纸是购于杭州天和微生物试剂有限公司, 用含有青霉素G、丁胺卡那霉素、先锋霉素V、庆大霉素、复方新诺明、氟哌酸、环丙沙星、红霉素、氯霉素等9种抗菌药物纸片, 对分离的菌株分别进行药敏实验, 按常规方法进行。

1.7 血清型测定

将普通营养琼脂培养基上的培养物用少量0.5%石碳酸生理盐水洗下, 制成浓稠菌悬液, 121℃高压2h, 破坏其“K”抗原, 冷却后按常规做玻片凝集实验, 1min后, 观察结果。

2 结果

2.1 分离培养

分离培养结果见表1。

2.2 显微镜检查结果

显微镜检查多数为两端钝圆, 散在或成对的小杆菌, 革兰氏阴性, 大小为0.4~0.7μm2~3μm。

2.3 细菌的生化特性性结果观察

分离的5株病原菌生化试验结果见表2。

2.4 药物敏感试验结果

药物敏感试验结果以丁胺卡那霉素最为敏感, 抑菌圈直径为20~25mm。氯霉素、庆大霉素为中敏, 抑菌圈直径为16~18mm。红霉素、青霉素G耐药。

注: (+) 为阳性、有气泡产生+为阳性为阴性

2.5 血清型测定结果

由于大肠杆菌的血清型较多, 据有关报道, 作者选用了临床上常见的血清型来测定其血清。选用了O1、O2、O88、O35、O11、O116、O157、O135、O22、O53、O86的阳性血清作玻片凝集试验。结果测得Z3株的血清型为O78, Z2株的血清型为O86, 其他两株可能为其他血清型。

3 讨论

通过对5株病原大肠埃希氏杆菌鉴定结果表明, 除Z2株外其它符合大肠杆菌的特性。可能是因Z2株是由鸡脑中分离到到的, 临床上此型少见, 而且能通过血脑屏障的大肠杆菌血清型甚少。其型有独特之处。通过上面一系列试验可以证实所分离到的病原菌为大肠杆菌。

许多其他微生物均可引起类似于大肠杆菌引起的病变。在鉴别诊断中应考虑的疾病有:支原体、沙门氏病、巴氏杆菌病、丹毒、衣原体和葡萄球菌病。它们也能引起致死性败血症或气囊、心包、关节和其它内脏纤维蛋白浓性炎症。此外, 大肠杆菌病亦是一种常见的呼吸道系统或肠道病毒性感染的并发症。

通过药物第三试验, 临床诊疗上可以指导我们合理用药, 有经济和时间上避免额外损失。此外, 这5 株大肠杆菌致病机理是否由毒素所引起, 限于时间关系作者未能进行产毒与动物回归实验。

通过对鸡大肠杆菌的分离鉴定, 我对大肠杆菌有了进一步了解, 而且对鸡嗜脑型大肠杆菌有了新的认识。据作者调查鸡嗜脑型大肠杆菌在我省发现并分离的报道比较少。这对有效控制我省鸡大肠杆菌病有重要意义。

摘要：2010年3月以来, 作者自河北省冀南地区具有明显的气囊炎、心包炎、肝周炎、卵黄性腹膜炎以及脑炎等病症的不同发病鸡群分离到5株 (Z1、Z2、Z3、Z4、Z5) 病原菌。通过对分离菌增殖纯化、显微镜检查、生化实验、药物敏感实验、血清型鉴定证明所分离到的细菌均为大肠杆菌, 其中Z2株为嗜神经性大肠杆菌, 这对有效控制我省鸡大肠杆菌病奠定了基础。

抗病性鉴定 第5篇

生物菌肥是以作物秸秆为原料，采用复合有益菌发酵而成，使用生物菌肥防治花生土传性病害，目的是起到以菌抑菌、全面保护的作用。2014年我们针对邹城市花生死棵现象进行了生物菌肥防治试验，即在常规施肥的基础上增施生物菌肥，重点研究菌肥对花生的农艺性状、产量以及抗病性的影响，试验具体情况如下：

一、材料与方法

1. 试验材料 试验在山东省邹城市香城镇张马村花生生产基地进行，土壤为轻砂壤土，土壤pH值为6.5，微酸性，土地平整，交通便利，灌溉方便，因土传性病害为害，花生死棵率常年在10%左右，虽然每年均采用药剂防治，但是防治效果并不理想。试验地前茬为秋玉米。供试花生品种为山花9号。供试菌肥为遮光条件下发酵的生物菌肥。

2. 试验设计与方法 根据生物菌肥用量设置6个处理，即每亩施用量分别为10千克、15千克、20千克、25千克、30千克、35千克，依次编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6，以不使用生物菌肥作为对照（CK）。随机区组设计，重复3次。小区面积13.3米2，小区长5.5米、宽2.4米。每个小区种植170穴。生物菌肥均在播种时穴施。播种时间为4月27日，其他各项农艺措施同常规栽培一致，9月6日收获。

3. 项目调查 在花生生长期间调查植株长势，包括叶色，常见土传性病害根腐病、茎基腐病、白绢病等，以及叶部病害叶斑病、网斑病等发病率，用发病的植株数除以调查的总株数得到发病率。花生收获后，各处理小区随机取样10株，调查主茎高、第一对侧枝长、单株分枝数（不统计二级分枝）、单株荚果数（包括双饱果、单饱果、秕果）等。小区单独收获，单独计产，算出平均值。随机抽取10穴调查早衰现象，以早衰率表示。早衰率即出现早衰的植株除以调查的总株数所得到的百分数。饱果率即饱满的果实数除以果实总数所得到的百分数。

二、结果分析

1. 不同处理对花生农艺性状的影响（见表1）

由表1可以看出，不同处理对花生田间主要农艺性状产生较大的影响，施用生物菌肥的植株叶色浓绿，早衰率在2.0%～3.0%之间，植株的主枝、侧枝壮而不旺。各处理中主茎最高的是处理A1为46.5厘米，较对照48.3厘米降低1.8厘米;最矮的主茎是处理A6为45.3厘米，较对照降低3.0厘米。处理中最长的第一对侧枝出现在处理A1上为48.8厘米，较对照53.4厘米短4.6厘米;最短的第一对侧枝出现在A6上为46.3厘米，较对照短7.1厘米。各处理平均分枝数在9.2～9.6条之间，对照为10.1条，差异不显著，这可能与品种特性有关。由于对照的主茎明显高于处理且茎秆较弱，这正是其植株倒伏的主要原因。6个处理花生倒伏面积在6.9%～8.0%之间，而对照高达10%～30%。收获时目测植株根系，处理的根群均大于对照，由于处理的根系壮大，在生长中后期几乎没有表现早衰现象，早衰率最高的处理A1小于3.0%，最低的处理A6小于1.9%，而对照早衰率高达30%以上。品种特性的原因处理与对照单株结果数均在20个左右，但是处理与对照相比较，果实的饱满度有差异。在所有处理中，单株双饱果数最多的是处理A6为15.5个，较对照9.7个增加5.8个，增加59.8%;单株双饱果数最少的是处理A1为13.3个，较对照9.7个增加3.6个，增加37.1%。单株单饱果数最多的是A5为5.5个，较对照3.7个增加1.8个，提高48.6%;单株单饱果数最少的是处理A2为5.2个，同比对照3.7个多1.5个，高出40.5%。所有处理单株双饱果数和单饱果数均远远高于对照。单株在所结果数相差不大的情况下，对照秕果为6.5个，秕果最多的处理A1为1.2个，比对照少5.3个，减少81.5%。

2. 不同处理对花生常见病害的影响 重点调查了花生常见的根茎部病害发生为害程度，饱果成熟期，植株萎蔫以致最终死亡，拔出植株主根呈现黑褐色即定为根腐病为害;如根茎以上出现白色的菌丝体，即定为发生了白绢病;花生茎基部腐烂，出现死棵现象即定为茎基腐病; 20%以上的叶片出现病斑即定为感染了叶部病害（见表2）。

从上表可以看出，处理A1至A6花生根腐病呈现阶梯状下降的趋势，A1、A2发病率均为3.5%，A3为3.3%，A4、A5均为3.2%，A6为2.7%，而对照根腐病发病率为15.6%，根腐病发病率最高的处理A1、A2与对照相比相差12.1%。花生茎基腐病与白绢病，处理与对照相比没有显著差异，茎基腐病发病率均在2.6%～2.8%之间，白绢病发病率在3.3%～3.5%之间。处理中叶斑病发病率最高的是处理A1为6.7%，与对照20.3%相比低13.6%;发病率最低的是处理A6为5.9%，与对照相比低14.4%。网斑病发病规律与叶斑病几乎一致，处理中最高发病率出现在处理A3上为2.3%，比对照10.4%低8.1%;最低的是处理A6为1.9%，比对照低8.5%。

3. 不同处理对花生荚果性状的影响 荚果的性状与果实的饱满度有很大关系，近几年在鲁西南地区花生饱果成熟期出现长时间干旱，严重影响了果实的饱满程度，对花生荚果性状如百果重、百仁重、千克果数、千克仁数等均有影响（见表3）。

从表3可以看出，所有处理中百果重最大的是处理A6为269.9克，同比对照249.4克增加20.5克，提高8.2%;百果重最小的是处理A1为265.3克，比对照249.4克增加15.9克，提高6.4%。其他统计数字如百仁重、饱果率、双仁果率延续了这一规律，即随着生物菌肥施用量的增加产生正效应。施用生物菌肥，花生饱果率最低的处理A1为93.9%，比对照67.3%高出26.6%，因此千克果数以及千克仁数都少于对照。

4. 不同处理对花生产量的影响 由于施用生物菌肥影响了花生饱果率，势必对花生产量造成影响，收获自然晾干后，我们逐一统计了不同处理小区的产量（见表4）。

从表4可以看出，施用生物菌肥能够提高单位面积的花生产量，处理A1同比对照增产2.55%;增产最高的为处理A6，同比对照增产13.76%。总之，施用生物菌肥能够促进花生高产，施用量的多少与花生产量呈现正相关。

三、小结与讨论

从上述试验结果可以看出，在生产条件相同的情况下，施用生物菌肥能够改良土壤结构，增强土壤通透性，为花生根系创造良好的生长环境，促使植株壮而不旺，抗病、抗倒能力增强。生物菌肥具有良好的疏水性和保水性，干旱年份能够源源不断地为花生根系提供水分，雨水较多的年份能够将多余的水分保留下来，在一定程度上规避了土壤水分过多对花生根系的伤害。由于具备这一特点，在花生饱果成熟期，不会因为土壤干旱导致果实饱满度低，这正是使用生物菌肥后花生果实饱满度高的原因，在花生果实数目一致的情况下，果实饱满度是影响花生产量的主要因子，因此使用生物菌肥能够实现增产。由试验结果可以看出，在相同的管理条件下，花生产量与抗性同使用生物菌肥的数量呈正相关。至于每亩使用量的多少，还需要进一步的研究与验证。

（作者联系地址：山东省邹城市农业技术推广站 邮编：273500）

抗病性鉴定 第6篇

1材料与方法

1.1试验材料

来源于山西金鼎生物种业股份有限公司的西瓜材料38份, 其中35份为试验材料 (试验编号为V-1～V-35, 另3份为对照, 其中CK-1为抗病品种, CK-2为感病品种, CK-3为空白对照) 。

1.2试验方法

试验于2011年4月7月在南化农场进行了田间自然鉴定和综合性状的比较, 并且同步在公司防虫温室内进行了苗期人工接种WMV-Ⅱ和ZYMV的鉴定筛选。

1.2.1试验设计

随机区组排列, 重复3次。小区面积40 m2, 定植40株, 株距0.5 m, 行距2 m, 在温室内接种病毒及空白对照接种清水处理。

1.2.2接种和调查

每份材料40株, 分成两组, 一组于两片子叶展平时接种ZYMV, 另一组在第一片真叶展平时接种WMV-Ⅱ。所用毒源均来源于山西金鼎种业生物育种中心, 病叶最先采自运城地区田间发病株, 经实验室ELISA检测, 再经国家生物重点实验室检测确认后接种在西葫芦叶片上, 采用人工摩擦法接种, 接种浓度WMV-Ⅱ按1∶3～5、ZYMV按1:8进行, 均以pH7.6、0.2M磷酸盐缓冲液为接种缓冲液。接种后18 d调查局部症状, 25 d调查系统症状, 30 d调查病情指数。

1.2.3分级标准

病情:

0级:植物叶片无病斑或花叶, 生长正常。

1级:植物1/5以上叶片有病斑或花叶, 生长正常。

2级:植物1/3以上叶片有病斑或花叶, 生长基本正常。

3级:植物1/2以上叶片有病斑或花叶, 不能坐瓜或果实失去商品性。

4级:植物2/3以上叶片有病斑或花叶, 植株严重矮化, 不能正常生长或接近死亡。

1.2.4 ELISA检测

通过ELISA检测, 掌握是否接种上病毒, 以及病毒的种类和病毒含量。ELISA按常规方法进行。

2结果与分析

2.1熟性

在35份材料中, 从播种到始收为85～90 d的有3份 (V-13、V-16和V-25) , 90～100 d的有4份 (V-7、V-10、V-22和V-27) , 110 d以上的有两份 (V-4和V-31) 。而CK-1为93 d, CK-2为97 d。

2.2果实性状

2.2.1单瓜重

单瓜重最大的是V-29, 为22 kg;最轻的是V-4, 为5 kg, 单瓜重一般为7～10 kg。

2.2.2含糖量

西瓜材料的中心糖一般为12°, 最高的是V-7, 中心糖为13°, 其次是V-15和V-26。

2.3产量

2.3.1商品瓜产量

经方差分析, 各材料间商品瓜产量差异显著, 以V-15产量最高, 为6 000 kg/667 m2;其次是V-7和V-26, 分别为5 500 kg/667 m2和5 000 kg/667 m2;产量介于4 500～5 000 kg/667 m2的材料有25份, 产量低于4 500 kg/667 m2的有V-21、V-25、V-28和V-16等7份。CK-1和CK-2产量分别为5 300 kg/667 m2、4 700 kg/667 m2。

2.3.2总产量

总产量最高的是V-15, 为6 700 kg/667 m2;其次是V-7和V-26, 分别为6 400 kg/667 m2和6 200 kg/667 m2;CK-1和CK-2分别为5 200 kg/667 m2和4 800 kg/667 m2, 总产量与商品瓜产量基本一致。

2.3.3抗性分析

苗期人工接种WMV-Ⅱ和ZYMV, 结果表明, 35份材料中没有对WMV-Ⅱ表现高抗的材料, 表现抗病的材料有两份 (V-7和V-31) , 而耐WMV-Ⅱ的有6份 (V-15、V-16、V-22、V-26、V-29和V-32) , 其余的27份 (V-13、V-18、V-21和V-23等) 表现感病。在对ZYMV的抗性表现中, V-31表现高抗, 表现抗病的有5份 (V-7、V-15、V-20、V-23和V-26) , 耐病的有8份 (V-22、V-24、V-28和V-29等) 。同时抗WMV-Ⅱ和抗 (或高抗) ZYMV的有两份 (V-7和V-31) , 抗ZYMV兼耐WMV-Ⅱ的有两份 (V-15和V-26) , 对WMV-Ⅱ和ZYMV都表现耐病的有3份 (V-22、V-32和V-29) 。苗期人工接种与田间自然鉴定的结果趋势基本相同, 只是田间自然发病明显低于苗期人工接种的。

2.3.4 ELISA检测情况

通过ELISA检测, 除了个别样品和人工接种的空白对照没有检测出病毒, 其余样品均检测出含有WMV-Ⅱ和ZYMV两种病毒, 说明都接种上了病毒。同时检测出抗性好的植株病毒含量少, 反之则较多。抗性好的植株病症不明显, 但含有病毒, 说明其耐病毒。

3小结

经过苗期人工接种和田间自然鉴定, 35份材料中有4份材料表现为抗或耐WMV-Ⅱ和ZYMV, 并且综合农艺性状表现良好, 可作为优良育种材料进一步利用。

(1) V-7:对WMV-Ⅱ和ZYMV的抗性均高于抗病对照。果实椭圆形, 底色深绿, 覆中宽蓝条, 果型美观;长势强健, 较易坐果;瓤色大红, 中心糖12～13°, 梯度小, 口感风味较好。一般单瓜重8～10 kg, 最大达18 kg, 产量在所有材料中居第二位, 为6 400 kg/667 m2, 早熟, 全生育期86 d左右, 开花至果实成熟27 d。

(2) V-15:对ZYMV的抗性高于抗病对照, 表现为抗ZYMV、耐WMV-Ⅱ。果实椭圆形, 皮色墨绿, 覆隐中条, 十分美观, 是“新红宝”理想的替代品种;生长旺盛, 节间短, 易坐果;平均单瓜可达12 kg, 产量居第一位, 为6 700 kg/667 m2;瓤红、质脆, 不易倒瓤, 中心含糖12°, 梯度小。早熟, 全生育期95 d左右, 开花到成熟32 d。

(3) V-26:抗病性接近于抗病对照品种, 表现为耐WMV-Ⅱ、抗ZYMV。平均单瓜重7～8 kg, 产量居第三位, 为6 200 kg/667 m2。果皮深绿覆墨绿色条纹, 全生育期100 d左右, 果实发育期31 d。植物生长健壮, 易坐瓜, 瓤色大红, 脆质, 多汁, 少籽, 中心糖12°, 口感好, 皮薄耐贮运。

抗病性鉴定 第7篇

由于APP对多种抗生素都易产生耐药性,因此疫苗接种是防治该病的有效措施。目前,国内主要使用灭活疫苗预防和控制该病,但由于APP的血清型较多,不同血清型APP的交叉保护效果十分有限,因此研制适应当地流行型菌株的疫苗是现阶段防治该病最为有效的办法,同时开发交叉保护效果较好的新型疫苗也将是防治该病的必然选择,而当前这两项工作的开展都离不开地方流行菌株的分离与鉴定,鉴于此,本试验分离、鉴定了4 株APP菌株,旨在为下一步疫苗的研制开发工作打下坚实的基础。

1 材料

1. 1 病料

20 份疑似猪传染性胸膜肺炎的发病猪肺脏组织,采自新疆不同地区猪场。

1. 2 培养基

绵羊鲜血琼脂培养基、胰蛋白大豆培养基、脑心浸液培养基均由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司制备,使用前加入终浓度为10 μg /m L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD) 。

1. 3 标准阳性血清

APP 1 ~ 12 型标准阳性血清,购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.4引物

根据参考文献[4 - 5]分别合成APP种属鉴定引物( apx IVF和apx IVR,oml AF和oml AR) 、血清1 型分型引物( Ap1F和Ap1R) 和血清7 型分型引物( Ap7F和Ap7R) ,引物信息见表1,引物由北京博迈德科技发展有限公司合成。

bp

1. 5 主要试剂

NAD,购自Roche公司; 革兰氏染液、微生物生化鉴定管( 使用前加入终浓度为10 μg /m L的NAD) ,均购自杭州天和微生物试剂有限公司; Taq DNA聚合酶、d NTPs、DL - 2 000 Marker,均购自美国Thermo公司。

1. 6 试验动物

雌性健康昆明小鼠,体重为18 ~ 22 g,购自新疆医科大学实验动物中心; 12 ~ 13 周龄健康易感猪,购自新疆天康畜牧科技有限公司。

2 方法

2. 1 菌株的分离纯化

用75% 乙醇棉球对病料外表面消毒,剪取少量病变组织涂布于绵羊鲜血琼脂培养基,36 ~ 38 ℃、5% CO2培养箱中培养24 ~ 36 h,观察菌落形态,挑取典型的单个菌落进行革兰氏染色镜检,将疑似菌落接种于胰蛋白大豆培养基上进行纯化增殖培养。

2. 2 分离菌株的鉴定

2.2.1生化特性鉴定

将疑似APP菌株接种于相应的培养基或微量生化鉴定管中进行以下试验: 溶血性试验、NAD依赖性试验、CAMP试验、糖发酵试验( 包括葡萄糖、麦芽糖、甘露醇) 、M. R试验、V - P试验、尿素酶试验、硝酸盐还原酶试验[6]。

2.2.2血清型鉴定

取生化特性鉴定为APP的菌株,采用改良Nielsen法( 琼脂扩散法) 进行血清型定型。收集分离菌株的培养物,以酚水提取抗原。按照常规方法制备琼脂板,中间孔加入提取的抗原,周围孔加入各型标准阳性血清,放入湿盒中,置37 ℃培养24 h后观察结果。判断标准: 以抗原孔与抗体孔之间出现清晰白色沉淀线为阳性。

2.2.3种属PCR鉴定

1) 模板制备。用接种环挑取纯化的单个菌落至含20 μL无菌水的EP管中,沸水浴5 ~ 10 min; 立即冰浴,待完全冷却后,12 000 r / min离心1 min ; 取上清液,于2 ~ 8 ℃ 条件下保存,备用。2) 二重PCR扩增。PCR反应体系( 总体积为50 μL) : 吸取10 × Buffer 5 μL,2. 5 mmol/L d NTP 4 μL,25 mmol / L Mg Cl24 μL,10 μmol / L ApxIVF 1 μL,10 μmol / L Apx IVR 1 μL,10 μmol / L Oml AF1 μL,10 μmol / L Oml AR 1 μL,Taq DNA聚合酶0. 5 μL,双蒸水30. 5 μL,模板2 μL。PCR反应程序:94 ℃ 预变性4 min; 94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃1 min,共30 个循环; 最后72 ℃ 再延伸10 min。于1% 琼脂糖凝胶中电泳30 min,紫外灯下观察结果。3) 结果判定。 若PCR扩增得到大小为346 bp和950 bp的目的片段,即可判定所分离的菌株为APP。

2.2.4血清型PCR鉴定

1)PCR扩增。PCR反应体系(总体积为50μL):吸取10×Buffer 5μL,2.5 mmol/L d NTP 4μL,25 mmol/L Mg Cl24μL,10μmol/L Ap1F(或Ap7F)1μL,10μmol/L Ap1R(或Ap7R)1μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,双蒸水32.5μL,模板2μL。PCR反应程序:94℃预变性4 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,共30个循环;最后72℃再延伸10 min。于1%琼脂糖凝胶中电泳30 min,紫外灯下观察结果。2)结果判定。若使用Ap1F和Ap1R引物PCR扩增得到大小为754 bp的目的片段,可判定所分离的菌株为APP1型;若使用Ap7F和Ap7R引物PCR扩增得到大小为396 bp的目的片段,可判定所分离的菌株为APP7型。

2. 3 致病性试验

2.3.1小鼠致病性试验

1)攻毒用菌液的制备。将分离菌株按照0.2%的接菌量加到100 m L脑心浸液培养基中,于36~38℃、200 r/min复苏培养16 h。取复苏菌液按照1%的接菌量加到100 m L脑心浸液培养基中,培养6~8 h至对数生长中期,用脑心浸液培养基10倍梯度稀释至适宜浓度。2)小鼠攻毒。以腹腔注射的方式进行小鼠攻毒,攻毒剂量为0.5 m L/只。每株分离菌株10只小鼠,另设10只健康对照小鼠,在同等条件下隔离饲养,攻毒后连续7 d观察小鼠的食欲、活力及死亡状况。所有存活小鼠于攻毒后第7天剖检,观察主要脏器病变情况。参照Reed-Muench法计算小鼠LD50。

2.3.2猪只致病性试验

1 ) 攻毒用菌液的制备。将分离菌株按照0. 2% 的接菌量加到100 m L脑心浸液培养基中,复苏培养16 h; 取复苏菌液按照1% 的接菌量加到100 m L脑心浸液培养基中,培养6 ~ 8 h至对数生长中期; 取适量菌液,以8 000 r/min离心10 min; 弃上清液,用PBS溶液( 0. 01 mol / L,p H值7. 4) 重复洗菌1 次,所得沉淀用PBS溶液( 0. 01 mol/L,p H值7. 4) 10 倍梯度稀释至适宜浓度。2) 攻毒。以气管攻毒的方式对猪只进行攻毒,攻毒剂量为5 m L/头。每株分离菌株5 头猪,另设5 头健康对照猪,在同等条件下隔离饲养,攻毒后连续14 d观察并记录试验猪的临床症状。攻毒后14 天剖检所有试验猪,观察试验猪肺脏的病变情况。3) 试验猪发病的判断标准。同时存在下列症状可判断为发病: 临床可见猪只精神萎靡、食欲减退、咳嗽、呼吸困难等症状或死亡; 剖检肺脏有出血点或化脓灶,胸膜和肺脏有纤维素性粘连。

3 结果

3. 1 病原菌的分离纯化结果

将病料涂布于绵羊鲜血琼脂培养基培养24 ~36 h,可见乳白色、露珠状( 直径约为2 mm) 、中间微隆起、呈 β - 溶血的单个菌落,革兰氏染色镜检为革兰氏阴性小球杆菌。在含10 μg /m L NAD的胰蛋白大豆培养基上生长良好。

3. 2 分离菌株的鉴定结果

3.2.1生化特性鉴定结果

对疑似APP菌株进行生化特性鉴定,有4 株分离菌株符合APP的生化特性,这4 株分离菌株均呈现 β - 溶血特性,生长依赖NAD,CAMP试验阳性,可发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇,M. R和V - P试验阴性,尿素酶和硝酸盐还原酶试验阳性,结果见表2。

3.2.2血清型鉴定结果

在4 株分离菌株所制备的抗原中,有2 株与APP 1 型标准阳性血清之间出现1 条沉淀线,有2 株与APP 7 型标准阳性血清之间出现1 条沉淀线,与其他血清型标准阳性血清之间均未出现沉淀线。因此,这4 株分离菌株中,有2 株判为APP 1 型菌株,2 株判为APP 7 型菌株。

3.2.3种属PCR鉴定结果

对分离菌株纯培养物进行种属PCR鉴定,结果见图1。

由图1 可知,这4 株分离菌株均可扩增出与预期目的条带大小一致的346 bp和950 bp的目的片段,PCR鉴定为APP菌株。

注: + 表示结果为阳性; - 表示结果为阴性。

1~4.4株分离菌株;5.阴性对照;M.DL-2 000 Marker。

3.2.4血清型PCR鉴定结果

对种属PCR鉴定确定为APP的4 株分离菌株进行分型鉴定,结果在4株分离菌株中,有2 株可扩增出与预期大小一致的754 bp的目的片段,见图2,鉴定为APP 1 型,分别命名为APP 1 型331 株、332 株; 另2 株菌株可扩增出与预期大小一致的396 bp的目的片段,见图3,鉴定为APP 7 型,分别命名为APP 7 型337 株、338 株。

1~4.4株分离菌株;5.阴性对照;M.DL-2 000 Marker。

3. 3 致病性试验结果

3.3.1小鼠致病性试验结果

健康对照组小鼠全部正常; 4 株分离菌株腹腔注射小鼠后,24 ~ 72 h内部分小鼠出现急性死亡,剖检死亡小鼠可见肺脏弥散性出血、脾脏肿大等症状。各菌株对小鼠的LD50分别:APP 1 型331 株为1. 1 × 103cfu / m L,APP 1 型332 株为2. 9 × 102cfu / m L,APP 7 型337 株为3. 4 ×108cfu / m L,APP 7 型338 株为1. 9 × 108cfu / m L,结果见表3。

M.DL-2 000 Marker;1~4.4株分离菌株;5.阴性对照。

3.3.2猪只致病性试验结果

攻毒后72 h内猪只出现死亡,剖检死亡仔猪可见双侧肺叶呈典型的猪传染性胸膜肺炎病变。发病仔猪表现出食欲减退、精神萎靡、咳嗽和呼吸困难等临床症状。14 d后对所有猪只进行剖检,可见不同程度的肺脏病变,肺脏色泽变暗,切面脆弱呈颗粒状,肺脏表面有大小不同的脓肿样结节,表面纤维素性渗出与胸膜粘连等。接种各菌株后的发病情况如下: APP 1 型331 株4 头发病,APP 1 型332 株5 头发病,APP 7 型337 株3 头发病,APP 7 型338 株5 头发病。

4 讨论

4 株APP分离菌株的种属PCR鉴定结果与生化特性鉴定结果完全一致、分型PCR鉴定结果与标准阳性血清定型结果也完全一致,鉴于PCR鉴定方法的敏感度高、操作便捷,本试验将进一步完善PCR方法对APP菌株的鉴定工作; 同时,采用PCR方法对患病猪只进行快速诊断也将是下一步的研究工作。

APP菌株的分离不仅为实验室疫苗研制提供了必需的原始菌种,同时也对新疆地区APP菌株的流行情况有一定的参考意义。

5 结论

本试验共分离出4 株APP菌株: 血清1 型2 株,分别命名为APP 1 型331 株、APP 1 型332 株; 血清7型2 株,分别命名为APP 7 型337 株、APP 7 型338株。APP 1 型332 株对小鼠和猪的毒力强于APP 1 型331 株; APP 7 型338 株对小鼠和猪的毒力强于APP7 型337 株。

参考文献

[1]蔡宝祥.家畜传染病[M].2版.北京:中国农业出版社,1996.

[2]LOFTAGER M K,ERIKSEN L,NIELSEN R.Antibodies against Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 in mucosal secretions and sera of infected pigs as demonstrated by an enzyme-linked immunosorbent assay[J].Res Vet Sci,1993,54(1):57-62.

[3]斯特劳,阿莱尔,蒙加林,等.猪病学[M].8版.赵德明,张中秋,沈建中,泽.北京:中国农业大学,2000.

[4]XIAO G S,CAO S J,DUAN L L,et al.Identification and detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in infected and subclinically infected pigs by multiplex PCR based on the genes Apx IVA and Oml A[J].Agricultural Sci China,2006,5(2):146-154.

[5]ANGEN O,AHRENS P,JESSING S G.Development of a multiplex PCR test for identification of Actinobacillus pleuropneumoniae serovars 1,7,and 12[J].Vet Microbiol,2008,132(3/4):312-318.

抗病性鉴定 第8篇

1 材料

现场采集了病死鸡的脑、肺脏、气管、肝脏、腺胃和肠等组织作为病料, 冷冻保存, 送检。

标准强毒F48E9株, 购自中国兽医药品监察所。

2 方法

2.1 病料的处理

将病鸡的脑、肺脏、气管、肝脏、腺胃和肠等组织样品剪成小块, 用研磨器研磨, 用灭菌PBS按照1︰4制备悬液, 反复冻融3 次, 8 000 r/min 离心10 min;弃沉淀, 取上清液加入终浓度为4 000 IU/mL 的青霉素、链霉素, 37 ℃ 作用1.5 h, -20 ℃ 保存, 备用。

2.2 病毒的分离与鉴定

取处理好的病毒液经尿囊腔接种5枚10日龄的SPF鸡胚, 每枚接种0.2 mL, 每12 h观察鸡胚生长情况。弃去24 h内死亡的鸡胚, 收集36～96 h死亡的鸡胚, 置4 ℃冰箱过夜后无菌抽取尿囊液分装并置于-20 ℃保存, 采用OIE标准规定的β-微量法[2]进行血凝试验 (HA) 和血凝抑制试验 (HI) 。

2.3 动物回归试验

取10只30日龄左右的SPF鸡, 将分离毒经滴鼻、点眼途径攻毒, 0.1 mL/只, 另设接种生理盐水对照组。攻毒后分别隔离饲养, 连续观察2周, 记录发病情况, 并采集发病鸡只病料进行病毒分离。

2.4 病毒的蚀斑纯化

将所分离的毒株用鸡胚有限稀释法进行纯化:分别将剩余NDV分离株的尿囊液作10倍连续稀释, 取110-3, 110-4, 110-5, 110-6, 110-7, 110-8 6个稀释度, 每个稀释度病毒液接种5枚10日龄SPF鸡胚, 每胚0.1 mL, 间隔12 h观察鸡胚生长情况。弃去24 h内死亡的鸡胚, 取出24～96 h内死亡的鸡胚置4 ℃冰箱保存。将96 h还没有死亡的鸡胚直接放入4 ℃冰箱冻死, 收获鸡胚尿囊液, 并测HA效价。选HA效价高于4 lb、稀释倍数较大的鸡胚尿囊液再作10倍系列稀释, 按上述同样方法接种10日龄SPF鸡胚, 如此连续3次, 纯化好的病毒于-70 ℃保存, 备用。

2.5 致病力试验

2.5.1 鸡胚半数致死量 (EID50) 的测定

将纯化好的分离毒分别作110-6, 110-7, 110-8, 110-9, 110-10 5个稀释度, 每个稀释度接种5枚SPF鸡胚, 0.1 mL/胚, 弃掉24 h内死亡的胚, 之后每隔8 h照胚1次, 记录每个稀释度鸡胚死亡数。

2.5.2 最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间 (MDT) 测定

按世界动物卫生组织 (OIE) 标准提供的方法操作, 能够使所有鸡胚致死的病毒的最大稀释倍数即为病毒的最小致死量 (MLD) 。MDT是最小致死量引起鸡胚死亡的平均时间, 判定标准:MDT<60 h为速发型, ≥60 h～90 h为中发型, >90 h为缓发型。

2.5.3 1日龄雏鸡脑内致病指数 (ICPI) 的测定

按OIE标准提供的方法操作, 每日观察发病和死亡情况, 死亡计2分, 发病计1分, 正常计0分, 按下列公式计算ICPI的值:ICPI= (8 d内累计死亡数2+8 d内累计发病数1) /8 d内累计观察鸡总数。判定标准:ICPI>1.60为速发型, ≥1.20～1.60为中发型, <1.20为缓发型。

2.6 高母源抗体雏鸡的攻毒试验

选取测得新城疫HI效价>6 lb的雏鸡, 取分离株尿囊液经口、鼻、眼接种10只有新城疫母源抗体的雏鸡, 每只雏鸡接种分离新城疫0.2 mL, 接种毒量为200鸡胚半数致死量, 同时设立对照组, 正常饲喂, 每天观察试验鸡的发病、死亡情况。

3 结果

3.1 病毒的分离鉴定结果

鸡胚接种病料后, 大多数在接种后40～76 h死亡, 对照组于接种后96小时冻死。死亡胚体多数全身出血, 尤其胚体的头部、颈部和脚爪出血严重;对照组鸡胚正常。

收集死亡鸡胚的尿囊液, 按β-微量法进行血凝试验, 测得所有死亡鸡胚的尿囊液均具有血凝价 (7～9 lb) 。分离株的这种血凝性可被NDV标准阳性血清所抑制, 而不能被流感H5、H9亚型和EDS-76阳性血清所抑制, 说明所分离的此株具有血凝性的分离毒为新城疫病毒, 命名为Fr0903。

3.2 动物回归试验结果

接种毒株的SPF鸡大都在48小时开始出现呼吸道症状。发病鸡只闭目站立、缩颈、不食、颈羽逆立, 接种后第3天开始死亡, 并且于4 d内全部死亡。对照鸡未见异常。剖检病死鸡, 与自然发病鸡症状相同, 表现为气管、腺胃乳头、十二指肠、泄殖腔黏膜、盲肠扁桃体等出血。从病死鸡的脑、肝脏、脾脏、气管和肺脏等病料中分离到了有血凝性的病毒, 经血凝抑制试验鉴定为新城疫病毒。

3.3 病毒的蚀斑纯化结果

分离毒株Fr0903能够在无胰酶的鸡胚成纤维细胞培养物上形成蚀斑, 按照新城疫蚀斑形成的规律来说, 这株新城疫分离毒属于新城疫强毒株。病毒在感染细胞后63～75 h形成无色、透明、清亮的圆形蚀斑。显微镜下观察, 蚀斑中心为不着色的死细胞, 周围被吞噬大量中性红颗粒的正常细胞包围 (见162页彩图1) 。分离株在第1代纯化时, 蚀斑出现的时间、大小不均一, 选取相隔4 mm以上、数量占优势的蚀斑经第2, 3代纯化后, 出斑时间逐渐规律, 一般在75小时左右出现蚀斑, 大小趋于一致。蚀斑的形态多为圆形, 也有一些形状不规则, 但与正常细胞的界限比较清楚。经3代蚀斑纯化的病毒液, 接种于鸡胚成纤维单层细胞后, 均可在48～77 h出现细胞病变, 表现为细胞肿大、变圆、合胞体形成, 久之则细胞拉网、脱落。

3.4 病毒的致病性测定结果

3.4.1 EID50

将接种不同病毒稀释度的鸡胚孵化, 连续观察5 d, 并作记录, 见表1。按Karber法[3]计算Fr0903株的EID50结果为110-8.5/0.1 m L。

3.4.2 分离毒株及F48E9株的MDT

结果见表2。

3.4.3 分离毒株及F48E9株的ICPI

结果见表3。

MDT为44.0 h, 小于60 h;ICPI为1.89, 大于1.60, 证实所分离到的Fr0903毒株属于速发型毒株。

3.5 高母源抗体雏鸡的攻毒试验结果

试验鸡于攻毒24 h后开始发病, 出现精神萎糜、厌食等症状, 48 h后出现神经症状, 64 h后开始死亡, 96 h内死亡8只, 120 h内10只攻毒鸡只全部死亡。死亡鸡剖检发现有较典型的新城疫病变。

4 结论

1) 从河北唐山丰润地区种鸡场发病鸡群中采集病料, 经病毒的分离和鉴定可确定分离到的病毒为新城疫病毒。

2) 根据病毒回归试验可确定该分离株为强毒株。

3) 根据高母源抗体雏鸡的攻毒试验可说明该分离株对鸡有很强的致病性, 传统疫苗已经不能有效地使鸡群对毒株产生保护力。

参考文献

[1]刘华雷, 王志亮, 吴延功, 等.2005年中国新城疫病毒分子流行病学研究[J].畜牧兽医学报, 2006, 37 (12) :340-344.

[2]郑明球.家畜传染病学实验指导[M].3版.北京:中国农业出版社, 2001:108-109.

抗病性鉴定 第9篇

16S r RNA素有“细菌化石”之称, 16S r RNA存在的保守区为所有的细菌所共同拥有, 具有十分高的保守性, 因此, 通过设计细菌通用引物是可以将此实现菌种鉴定的[4]。PCR技术具有高特异性、高灵敏度和操作简易等诸多特点, 目前它已经被广泛应用于食源性致病菌检测技术的研究和开发[5]。本次试验利用PCR技术和16S r RNA保守性高的这些特点, 建立一种鸡致病性大肠杆菌16S r RNA PCR快速鉴定方法。

1 试验材料

1.1试验器材

解剖器材、显微镜恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、PCR仪、电泳仪、琼脂凝胶成像系统等。

1.2药品和试剂

营养肉汤培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、营养琼脂培养基 (购自杭州滨和微生物试剂有限公司) 、革兰氏染色液试剂盒 (购自青岛高科园海博生物技术有限公司) 、生化发酵管 (购自杭州微生物试剂有限公司提供) 、MIX (Taq DNA聚合酶、d NTPs、缓冲液) 、DL2000DNA Marker、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 (购自北京天根生物科技有限公司) 。

大肠杆菌ATCC35218 (DZK) 、金黄色葡萄球菌ATCC29213 (JZK) 、乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094 (SZK) 、肺炎克雷伯氏菌CMCC46117 (KZK) 标准菌株购于中国兽医监察所。

2 试验方法

2.1病料采集

从西昌市周边3个养鸡场 (编号为XN、GC、ZM) 中采集的疑似病鸡在无菌条件下取出的心 (X) 、肝 (G) 、脾 (P) 、肾 (S) 作为病料。

2.2病原菌分离鉴定

2.2.1病原菌分离培养

无菌采集病料深部组织接种于营养琼脂培养基, 37℃, 培养16~24 h, 挑取典型菌落2~3个接种于伊红美兰培养基和麦康凯培养基, 37℃, 培养16~24 h, 挑取典型菌落2~3个接种于营养琼脂培养, 37℃, 培养16~24 h后, 备用。

2.2.2生化鉴定

对分离出的病原菌接种于蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等生化发酵管, 置于37℃, 培养24 h, 观察。

2.3致病力试验

将试验菌液浓度调整为1个麦氏单位, 细菌浓度为3×108clf/L菌液备用。

将1日龄的雏鸡进行分组, 雏鸡处理见表1。

对5组雏鸡连续观察48 h的, 并每12 h记录一次雏鸡的发病和死亡情况。试验结束后将雏鸡全部处死, 并无菌采取病料回收菌株。

2.4 16S rRNA PCR检测方法的建立

2.4.1引物设计

本次试验根据Gen Bank中公布的大肠杆菌16S r RNA通用引物, 由上海杰李生物公司合成, 其PCR产物为552 bp。

2.4.2病原菌的PCR扩增

本试验采用单菌落PCR, 试验采用采用25μL体系, 见表2。

反应程序为:94℃预变性5 min, 94℃变性45 s、56.1℃退火45 s、72℃延伸50 s, 共35个循环, 最后72℃延伸5 min。

反应结束后取10μL PCR产物, 于1%琼脂糖凝胶, 以115 V、100 m A于1×TBE缓冲液中电泳45 min后, 将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像、记录。2.4.3克隆测序将回收的PCR产物按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明, 对DNA回收后, 送至上海杰李生物公司进行克隆测序。并在美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 数据库, 运用Blast软件进行比对。

3 试验结果

3.1解剖结果

病死鸡关节肿胀变形, 皮肤及大腿肌肉内可见散在出血点, 肝脏明显肿大, 心包膜增厚, 小肠黏膜充血, 可见散在出血点。

3.2病原菌分离培养结果

病料接种于营养琼脂上, 可见圆形、半透明、表面湿润的单个菌落;麦康凯培养基上可见光滑的粉红色菌落;伊红美兰培养基上有黑色有金属光泽的圆形菌落。挑取典型菌落经革兰氏染色后, 可见革兰氏阴性的短杆菌两端钝圆, 大多数散开排列少数有2个连在一起, 与相关的文献描述一致[6], 如图1所示。

3.3生化鉴定结果

生化鉴定试验结果如表3所示。

注:+表示产酸不产气;⊕表示产酸又产气。

从表3可以看出, 菌株DZMG与菌株DZK的生化特性一致, 而且菌株DGCG1和DCGP3的生化特性与菌株DZK的生化特性基本相同, 所以初步判定DZMG、DGCG1、DGCP3这3株菌株符合大肠杆菌的生化特性。

3.4致病力试验结果

分离到的3株菌株 (DZMG、DGCG1、DGCP3) 进行致病力试验的结果如表4所示。

从表4可以看出本次试验所用的3株菌株均存在致病性, 而且DZMG致病力最强, 死亡率100%;DGCP3的致病力次之, 死亡率75%;DGCG1的死亡率只有50%。

3.5试验菌株16S rRNA检测结果

将PCR产物, 通过凝胶成像系统观察的结果如图2所示。

M-Marker;1-DZK;2-DZMG;3-DGCG1;4-DGCP3;5-JZK;6-SZK;7-KZK

从图2可以看出, 试验菌DZMG、DGCG1、DGCP3均得到552 bp的特异性条带, 而对照菌JZK、SZK、KZK均未得到相应条带。

3.6测序结果

经过克隆测序后发现试验菌株的16S r RNA基因序列与鸡致病性大肠杆菌16S r RNA序列同源性为100%。

4 讨论与分析

本次试验通过对病原菌分离培养、生化试验和致病力试验, 结果表明, 3株试验菌株 (DZMG、DGCG1、DGCP3) 均为致病性大肠杆菌。同时, 对3株菌株进行分子生物学鉴定, 所得到的16S r RNA序列通过在NCBI数据库中运用BLAST程序进行比对, 结果发现3个试验菌株与大肠杆菌的同源性达到100%, 根据Mat suki的研究, 凡是16S r RNA序列的同源性大于97%便可认为是同一种[7], 说明16S r RNA对菌株的鉴定结果与分离培养生化鉴定的结果是一致的。但是, 传统的分离鉴定试验存在试验周期长、工作量大而繁杂、准确性差等问题, 而16S r RNA PCR鉴定方法则周期短、成本低、准确性高等优势。

近几年, PCR技术在实验室检测技术中发展快速, 在医学检验方面有着十分突出成果[8]的技术, 并广泛应用到了环境细菌学检验、临床细菌学检验、流行病学调查等领域。随着集约化养鸡业发展迅速, 鸡致病性大肠杆菌病是生产中常见细菌病, 并在一定程度上危害养鸡业的健康发展, 给养禽业发展造成严重的经济损失[9]。所以, 建立一种该病快捷的检测方法, 对鸡大肠杆菌病的快速诊断、预防、治疗和控制等方面都具有积极作用。

参考文献

[1]栗艳.鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].畜禽业, 2013, (10) :12-13.

[2]陶勇.四川鸡源致病性大肠杆菌血清型鉴定及质粒DNA分析[D].雅安:四川农业大学, 2001.

[3]李宏娟.鸡致病性大肠杆菌的耐药性监测及基因型研究[D].保定:河北农业大学, 2008.

[4]杨苗, 程安春, 汪铭书, 等.基于鸭疫里默氏杆菌16Sr RNA PCR检测方法的建立和应用[J].四川农业大学学报, 2007, 3:343-347.

[5]赵红庆.五种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR检测研究[D].长春:中国人民解放军军事医学科学院, 2007.

[6]师福山, 赵德明.禽大肠杆菌的分离与16S r RNA的鉴定[J].中国畜牧兽医, 2009, 2:111-113.

[7]李永峰, 任南琪, 杨传平, 等.16S r DNA测序快速鉴定废水生物处理系统目标细菌[J].哈尔滨工程大学学报, 2005, 6:806-810.

[8]杨洋.PCR技术检测测乳品中金黄色葡萄球菌研究[D].保定:河北农业大学, 2005.

抗病性鉴定 第10篇

1 材料与方法1.1 材料

1.1.1 猪胴体淋巴结:随机采取西宁市某屠宰场猪胴体肩前淋巴结30份, 置4℃冰箱, 待检。

1.1.2 培养基:普通营养肉汤、半固体培养基、麦康凯琼脂平板及葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、V-P、吲哚、H2S等生化培养基。

1.1.3 诊断血清:15种肠道致病性大肠埃希氏菌诊断血清 (购于卫生部兰州生物制品研究所) 。

1.1.4 试验动物:健康小白鼠4只 (16~18 g) 购于青海地方病研究所。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离:无菌采取少许淋巴结接种于营养肉汤中, 37℃培养18~24 h后, 再分别各取肉汤培养物2~3环, 分别接种于麦康凯琼脂平板上, 37℃培养18~24 h后, 观察菌落形态。

1.2.2 细菌纯化培养:挑取可凝固菌落涂片、革兰氏染色、镜检并进行细菌的纯化培养。

1.2.3 血清学试验:操作步骤依据肠道致病性大肠埃希氏菌诊断血清 (15种) 操作说明书进行。

1.2.4 动物试验:选取4株疑似致病性大肠杆菌的培养物分别用灭菌生理盐水无菌稀释, 再与麦氏比浊管进行比浊, 选取浓度为3108 个/mL, 分别腹腔注射小白鼠4只, 0.2 mL/只, 观察结果。

2 结果

2.1 菌落形态及培养特性

营养肉汤变浑浊, 在麦康凯琼脂平板上形成圆形、光滑、隆起的粉红色菌落;普通琼脂平板上形成圆形、隆起、边缘整齐、湿润、中等大小、灰白色、半透明的菌落。

2.2 涂片、染色及镜检

经革兰氏染色镜检可见两端钝圆、中等大小的革兰氏阴性小杆菌。

2.3 生化试验

生化试验结果见表1。

2.4 血清学试验

将14株疑似大肠杆菌进行血清学鉴定, 其中分离出致病性6株、O55K59阳性率为42.85% (6/14) ;O86K61 3株占21.42% (3/14) ;O26K60 2株, 占14.29% (2/14) ;O128 K67、O125K70、O111 K58各1株, 占7.14%。

2.5 动物试验

小白鼠在24~48 h内全部死亡。

2.6 剖检

采集肝脏分离获得与原分离菌株一致的革兰氏阴性小杆菌。

3 讨论

从此次随机采集的30份猪胴体淋巴结样品中, 分离出致病性大肠杆菌14株, 阳性率为46.67% (14/30) 。经血清学鉴定, 14株致病性大肠杆菌分别为O55K59、O86K61、O26K60、O28K67、O125K70、O111K58。其中O55K59为优势菌株, 它可引起人、犊牛、羔羊、仔猪等大肠杆菌病, 出现腹泻症状。表明该批猪胴体中致病性大肠杆菌带菌率较高, 应该引起有关部门的关注。

目前在我国中小规模养殖场中, 由于资金投入不足、养殖设备简陋、饲养环境和卫生条件差, 加之平时的饲管不良和预防消毒工作不扎实, 致使猪只抵抗力降低, 易造成致病性大肠杆菌的感染;同时养殖场滥用抗生素, 极易造成耐药性菌株产生和药物残留, 给大肠杆菌病的防制带来较大的困难。

大肠杆菌是寄居在温血动物肠道后段的条件性致病菌, 在屠宰过程中一些大肠杆菌的污物可能污染胴体, 加之养猪场及屠宰场的粪便及污物很容易污染水源、饲料及外界环境引起大肠杆菌病的暴发和流行。在公共卫生上, 应引起高度的重视, 通过改善饲养管理, 进行科学的补饲, 定时消毒, 对提高预防大肠杆菌病的发生和流行具有重要的意义。

在食品的加工、储藏、运输、销售等过程中感染了致病性大肠杆菌, 在适宜的条件下大量生长繁殖, 同时产生毒素。如被动物采食后极易引起大肠杆菌的感染或发生中毒, 大肠埃希氏菌引起食物中毒主要发生在夏、秋两季。因此要消毒和防止虫媒传播肉品, 加强卫生监督, 这样才能减少或杜绝猪胴体污染大肠杆菌病的机率。

参考文献

[1]恽时锋, 潘震寰, 郑明球.鸡大肠杆菌病研究进展[J].畜牧与兽医, 1998, 30 (6) :227～230.