调节因子范文

调节因子范文（精选7篇）

调节因子 第1篇

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

Caco-2细胞株(上海生物研究所),TNF-α(Sigma公司),RNeas Mini kit(大连宝生物工程有限公司),T7体外转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司),Real time quantitative PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

1.2 细胞培养

从上海生物研究所购得Caco-2细胞,应用含有10%胎牛血清、青霉素-链霉素双抗液和用Na HCO3调节p H值的1 640培养液,将Caco-2细胞在37℃和50 m L/L二氧化碳的条件下进行培养,实验时取5组非同代、7 d生长达融合的细胞,添加0、50、100、200和400 ng/m L浓度的TNF-α继续培养24 h后,收集Caco-2细胞提取总RNA,-130℃保存以待做Real-time PCR使用。

1.3 用Re a l-time P CR方法检测Ca co-2细胞中S C mRNA和IRF-1 mRNA的相对表达量

用大连Takara公司提供的试剂提取RNA,提取的RNA利用凝胶电泳定量。在体外将每个样本RNA 100 ng转录为c DNA,然后进行定量PCR反应。引物如下:PIGR-F:5'-TGTTGCCACCACTGAGA GCAC-3';PIGR-R:5'-CTTTGTAGGCCATCTCGGCT TC-3';IRF-1-F:5'-GTGGAAGTTGTGCCGGACA-3';IRF-1-R:5'-CATCCTCATCTGTTGTAGCTTCAGAG-3';GAPDH-F:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3';G-APDH-R:5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'。PCR反应条件为95℃10 s,然后95℃5 s和60℃20 s循环45次,最后60℃1 min和95℃5 s。按下列公式进行相对表达量分析:SC m RNA的相对表达量=2-(CTtest-CTGAPDH)100%,校正结果以TNF-α为0ng/mL时的表达量为1,其余组与之比较。

1.4 统计学分析

采用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验,P<0.01为差异有显著性。

2 结果

2.1 TNF-α对Ca co-2细胞中P IGR mRNA相对表达量的影响

检测的m RNA以0 ng/mL TNF-α时PIGR m RNA的相对表达量设为1,通过管家基因GAPDH的校正得出TNF-α的浓度为50、100、200和400ng/mL时PIGR m RNA的相对表达量分别为(3.14±0.14)、(5.23±0.19)、(6.45±0.23)和(8.44±0.18),与无TNF-α(即浓度为0 ng/mL)刺激Caco-2细胞时的PIGR m RNA相对表达量相比明显升高(P<0.01),如图1所示。

2.2 TNF-α对Ca co-2细胞中IRF-1 mRNA相对表达量的影响

检测的m RNA以0 ng/mL TNF-α时IRF-1m RNA的相对表达量设为1,通过管家基因GAPDH的校正得出TNF-α浓度为50、100、200和400ng/mL时IRF-1 m RNA的相对表达量分别为(6.20±0.21)、(9.00±0.19)、(10.90±0.23)、(14.50±0.25),与无TNF-α(即浓度为0 ng/mL)刺激Caco-2细胞时的IRF-1 m RNA相对表达量相比明显升高(P<0.01),如图2所示。

3 讨论

PIGR是肠上皮细胞产生的属于免疫球蛋白超家族的蛋白分子,是黏膜免疫系统的一种重要转膜糖蛋白,负责将新合成的IgA转运到细胞表面,在转运过程中,PIGR细胞外部分的SC与二聚体IgA结合形成分泌型IgA(secretory IgA,SIgA),SIgA是肠道免疫屏障的重要组成成分,一直被认为是肠道第一线的免疫防御,它覆盖并保护肠黏膜免受有害细菌的入侵,阻止慢性炎症的发生[4,5]。当细菌黏附和入侵肠道时,可激活黏膜免疫诱导SIgA大量分泌。SIgA在肠道主要是发挥免疫排除作用[6,7]和免疫平衡作用[7],减少细菌易位,限制细菌穿透肠上皮[8]。游离SC作为微生物的重要清除因子可保护上皮免受侵袭[9],是防御大肠杆菌、抵御原虫和中和霍乱毒素的重要因子[10,11,12],对肠黏膜有保护作用[13]。

TNF-α发挥着广泛的生物学效应,既诱导炎症前反应,也促进组织的发育和修复。作为脂多糖生物学效应的一个中心介质,TNF-α在肠道免疫防御和免疫介导的病理过程中也起着一定的作用。TNF-α是肠道免疫的一种重要调节因子,包括激活先天抗病毒和抗细菌活性,以及在先天适应性免疫反应的信号转换中起重要作用[14],TNF-α也诱导转录因子IRF-1的合成[15]。IRFs是调节抗病毒反应的转录因子家族,因在病毒感染时能够结合到免疫反应性纤维结合素(immunoreactive fibronectin,IFN)基因的启动子上诱导和调节IFN的表达而得名,是一类与调节细胞对IFN和病毒感染的应答有关的DNA相关蛋白家族,是一类多功能的转录因子,在干扰素转录调控、先天性免疫和适应性免疫调控、细胞因子信号转导、细胞增殖调控、造血干细胞的发育、淋巴细胞的分化以及自稳平衡等方面都有着重要的作用,含有9种转录因子。IRF-1是第一个被定义的IRF家族成员,在多种细胞内持续表达,在宿主防御中起重要作用,如对于不同的刺激,IRF-1参与多种基因表达的调节和参与先天适应性免疫反应。IRF-1固定到PIGR基因外显子1的一个组分上,与NF-κB相互作用刺激转录。IRF-1参与许多前炎症基因的转录、下调细胞增殖、促进凋亡和Th1应答等过程。

已有报道[16]称,细胞因子IL-4和IFN-γ在促进PIGR m RNA合成的同时,亦促进转录因子IFR-1 m RNA的表达,增强转录活性。IRF-1也参与TNF-α促进PIGR基因表达的转录调节,并且有时间依赖性[17]。低剂量(0.5 ng/mL)TNF-α引起IRF-1表达的增加与引起PIGR表达的增加有相关性,但高剂量(10 ng/mL)TNF-α引起IRF-1表达的增加与引起PIGR表达的增加无相关性[18],本文研究表明随TNF-α浓度增高,PIGR m RNA和IRF-1 m RNA均显著升高。

摘要：目的 研究TNF-α对Caco-2细胞表达多聚免疫球蛋白受体(PIGR)和干扰素调节因子-1(IRF-1)的影响。方法 用不同浓度的TNF-α刺激Caco-2细胞后,采用Real-time PCR方法检测Caco-2细胞表达PIGR和IRF-1的变化。结果 TNF-α浓度为50、100、200和400 ng/mL时,PIGR mRNA和IRF-1 mRNA的相对含量分别为(3.14±0.14)、(5.23±0.19)、(6.45±0.23)、(8.44±0.18)和(6.20±0.21)、(9.00±0.19)、(10.90±0.23)、(14.50±0.25),与无TNF-α刺激时比较,Caco-2细胞表达PIGR和IRF-1明显增加(P<0.01)。结论 TNF-α上调Caco-2细胞中PIGR和转录因子IRF-1的表达。

调节因子 第2篇

1 P选择素 (P-selection, PS)

PS是动脉粥样硬化发生中的单核细胞黏附与迁移的必须条件和最重要因素之一。刘纪宁等[2]研究发现, 丹参及其提取物的作用位点在于PS, 可以阻断靶细胞与PS的黏附。丹参缩酚酸是拮抗PS作用的主要成分, 最高拮抗效果接近95%, 丹参酮ⅡA磺酸钠拮抗效果不超过90%。王阶等[3]采用多组分的三七总皂苷 (血塞通软胶囊) 与阿司匹林作对照, 对高黏血症患者进行治疗观察, 发现运用三七总皂苷治疗后患者PS的表达显著下降。提示三七总苷具有显著降低血小板表面活性、抑制血小板白细胞的黏附和聚集、抗血栓形成等作用。史国峰等[4]的研究表明, 健脾祛痰化瘀方药 (沥水调脂胶囊) 含药血清对轻度修饰低密度脂蛋白 (ox-LDL) 诱导的内皮细胞表达PS具有抑制作用, 能够保护内皮细胞, 为其防治动脉粥样硬化发生发展的可能机制。

2 单核细胞趋化因子-1 (MCP-1)

MCP-1是趋化和激活单核细胞的重要细胞因子。血管内皮细胞和平滑肌细胞等在受到刺激因素的作用时, MCP-1的表达可明显增加, 诱导单核细胞黏附于血管内皮细胞, 并迁入内皮下间隙经激活分化为巨噬细胞摄取脂质, 转化为泡沫细胞, 是AS形成的早期事件[5]。MCP-1还可能通过促进巨噬细胞表面清道夫受体 (SR) 的表达而促进巨噬细胞与内皮下基质的黏附, 使巨噬细胞难以返回循环血中。MCP-1影响着单核细胞从黏附迁移到泡沫化的全过程。血浆中MCP-1水平的高低被认为是评价动脉粥样硬化治疗效果的一个重要指标[6]。郝群等[7]发现补肾宁心方含药血清可能通过抑制内皮细胞分泌趋化因子、下调内皮细胞表面黏附分子的表达, 抑制内皮细胞对单核细胞的趋化及相互黏附。从而发挥对血管内皮细胞的保护作用。顾耘[8]采用人脐静脉内皮细胞原代培养, 加ox-LDL共同孵育造成血管内皮细胞损伤模型, 用中药血清药理学方法将软脉煎药物血清作用于细胞模型, 用ELISA法测MCP-1, 并设舒降之 (辛伐他汀) 组进行对照。结果模型组MCP-1显著升高, 软脉煎组和舒降之组均能显著地降低升高MCP-1水平, 两组差异无统计学意义。推测软脉煎防治AS的作用与降低MCP-1水平有关。刘镘利等[9]采用原代培养方法获得人脐静脉内皮细胞, 随机分为对照组、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 刺激组和TNF-α+姜黄素组。先用TNF-α刺激血管内皮细胞0.5 h, 再加入不同浓度的姜黄素共同孵育1 h与单纯TNF-α刺激作对照, 检测姜黄素对细胞及其上清液中MCP-1蛋白表达的影响。结果姜黄素通过抑制炎症因子MCP-1的表达调节血管内皮细胞的炎症反应, 从而发挥保护血管内皮细胞, 防止动脉粥样硬化的作用。董波等[10]通过高脂饮食建立兔AS模型, 采用RT-PCR检测腹主动脉MCP-1 mRNA的表达。结果脑心通可降低主动脉MCP-1 mRNA的表达降低MCP-1的表达水平, 减少泡沫细胞的形成。对AS的发生发展起预防和治疗作用。黄水清等[11]证明当归补血汤全方组ox-LDL趋化单核细胞的数目比模型组减少, 而单味黄芪、当归组未见此变化, 说明当归补血汤可抑制ox-LDL对单核细胞的趋化, 可见中药复方中各药之间协同作用的重要性。

3 C-反应蛋白 (CRP) 和TNF-α

AS是一种慢性炎症增生性疾病, 如诱发内皮细胞分泌和表达黏附分子和化学趋化因子[12];促进巨噬细胞表达细胞因子和组织因子及对低密度脂蛋白 (LDL) 的摄取[13];促进白介素-1 (IL-6) 和内皮素-1 (ET-1) 的分泌;促进主动脉内皮细胞表达纤溶酶原激活物抑制剂并增强活性;扩大其他炎性介质的促炎症效应[14]。石刚等[15]的临床观察证实, 冠心病患者由稳定型心绞痛到不稳定型心绞痛, 最后发展为急性心肌梗死, 血清CRP水平逐渐增加。张明雪等[16]用高胆固醇饮食建立AS动物模型, 测定CRP、总胆固醇 (TC) 、三酰甘油 (TG) 、LDL - C等指标, 取主动脉制定光镜样本。结果模型组家兔血脂TC、TG、LDL-C、主动脉斑块/内膜面积比值明显高于正常组, 而中药干预组显著低于模型组;与空白组比较, 模型组家兔CRP明显升高, 而中药干预组低于模型组。益气活血中药复方能抑制动脉硬化炎症反应, 降低TC、TG、LDL-C。葛岚等[17]应用益气活血解毒汤 (人参、丹参、连翘、黄芩、牡丹皮、水蛭) 干预冠心病 (CHD) 模型家兔血脂及炎性细胞因子水平。结果模型对照组CRP较正常对照组明显增高, 益气活血解毒汤组及辛伐他汀组CRP明显降低。

TNF-α主要来源于单核/巨噬细胞。研究发现TNF-α可活化内皮细胞, 逆转其正常生理功能, 引起细胞死亡、LDL氧化、白细胞黏附、血小板聚集、血栓形成、平滑肌细胞增生、基质金属蛋白酶 (MMP) 表达增加。吴辉等[18]以近年来备受关注的冠心病新的发病机制—— 炎症机制为偶合点, 检测了82例冠心病患者体内几种主要炎症因子 (包括肿瘤坏死因子) 的水平, 将82例患者辨证分为痰热组和非痰热组, 痰热型冠心病患者体内血脂、血糖与非痰热型患者相比无统计学意义, 而TNF-α等细胞因子指标在痰热型患者明显高于非痰热型患者, 差异有统计学意义, 提示冠心病中医痰热证候与体内炎症活动有密切关系。表现在这类患者体内高敏感性炎症因子水平的异常增高。这可能提示冠心病痰热证之实质所在。文川等[19]观察6种常用活血中药 (赤芍、丹参、川芎、三七、桃仁和酒大黄) 对ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块炎症反应和血脂的影响。结果酒大黄组和对照组AS斑块内炎症因子MCP-1、TNF-α表达较模型组明显减少。说明活血中药通过抑制炎症反应对成熟斑块有一定的稳定作用。疏血通注射液 (水蛭、地龙) 能显著降低TNF-α等细胞因子水平, 延缓细胞因子介导的AS过程, 起到保护血管内皮细胞 (VEC) 的功能, 与对照组 (用阿司匹林、洛伐他汀、单硝酸异山梨酯注射液) 相比有统计学意义[20]。研究发现粉防己碱[21]能抑制炎症因子IL- 1β、TNF- α合成和分泌的作用, 也能抑ox-LDL对NF-κB的激活, 发挥双重抗AS作用。

4 黏附分子

多种原因可导致血管内皮功能发生紊乱, 血管内皮细胞 (VEC) 表达黏附分子增加, 在细胞黏附分子的介导下, 炎症细胞沿血管内皮细胞滚动黏附, 渗透到内皮细胞下, 并分泌释放各种细胞活性物质, 引起血管平滑肌细胞增生, 泡沫细胞形成, 最终导致AS斑块的形成。柏正平等[22]研究表明CHD心脉瘀阻证、痰阻心脉证患者血浆细胞间内皮细胞黏附分子 (ICAM-1) 、血管内皮细胞黏附分子 (VCAM-1) 明显高于虚证组和对照组, 提示CHD实证存在黏附分子异常表达, 可能处于慢性炎症状态。而斑块内的炎症过程使斑块从稳定转变为不稳定, 易于引起破裂和血栓形成, 为中医药治疗CHD实证提供抗黏附、抗炎依据。黄秀兰等[23]以原代培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 为研究对象, 采用中药血清药理学方法、免疫荧光染色、流式细胞仪等技术, 以平均荧光强度代表细胞VCAM-1水平。结果冠心康能通过下调ICAM-1 mRNA的水平, 继而减少ICAM-1蛋白的合成, 减少细胞间的黏附, 从而减少单核细胞、中性粒细胞或平滑肌细胞在内膜的增生、迁移, 以及减少上述细胞在内皮下的积聚, 减少泡沫细胞的生成, 从而保护血管内皮细胞[24]。李春深等[25]运用免疫细胞化学技术, 通过进行内皮细胞培养, 观察内皮细胞缺氧损伤后, 黏附分子在细胞质的表达情况, 观察救心胶囊对缺氧损伤内皮细胞黏附分子释放的影响。结果缺氧损伤使VCAM-1、ICAM-1表达显著升高。救心胶囊组, VCAM-1、ICAM-1表达显著降低。说明救心胶囊能显著降低黏附分子表达, 保护内皮细胞免受炎症介质损伤。

5 结 语

调节因子 第3篇

1.1 一般资料

60例来自医院肝病科2010年6月~2011年6月的门诊和住院患者。将其中27例HBe Ag阳性和肝功能丙氨酸转氨酶(ALT)异常者,划为乙型病毒性肝炎(HB)现症患者,即A组:男17例,女10例,平均年龄(39.14±3.36)岁,平均病程(4.2±1.61)年。将22例HBe Ag阳性和肝功能ALT持续正常者,划为无症状HBV携带者,即B组:男15例,女7例,平均年龄(34.31±6.72)岁,平均病程(4.92±8.63)年。将11例HBe Ag阴性和肝功能ALT正常以及HBV-DNA阴性者,划为非活动性HBs Ag携带者[2],即C组:男8例,女3例,平均年龄(35.90±6.15)岁,平均病程(4.15±6.13)年。设正常对照组:为各型病毒性肝炎血清学检测指标阴性的健康体检者10例,男6例,女4例,平均年龄(36.60±3.63)岁。诊断标准按照2000年全国第十次病毒性肝炎与肝病学术会议(西安)修订的病毒性肝炎防治方案[3];并在3个月前未经免疫调节剂和抗病毒治疗,并排除合并其他病毒性肝炎和免疫性疾病的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 血清病毒标志物指标观察

包括HBs Ag、抗-HBs、HBe Ag、抗-HBe及抗-HBc,HBV-DNA(罗氏荧光定量法)。高病毒载量为HBV-DNA≥1×107拷贝/m L,中载量为1×105~6拷贝/m L,低载量为<1×105拷贝/m L。均由医院检验科检测。

1.2.2 血清生化学指标观察

包括ALT、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、r-谷酰胺转肽酶(GGT)、总胆红素(TB)、白蛋白(A)及球蛋白(G),统一由医院检验科检测。

1.2.3 细胞因子含量检测

受试者均于清晨无菌采血,血清分离后存放-50℃冰箱中备检。IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12测定均采用双抗体夹心ELISA法。试剂购自深圳晶美生物工程有限公司进口分装,具体步骤严格按照说明书操作。仪器为DNX-9620电脑洗板机、DG30ZZA型酶标检测仪,购自北京普朗新技术有限公司。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0软件包进行统计学处理,计量资料数据以均数±标准差表示,比较采用t检验,两两比较q检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HBV感染者细胞因子含量检查比较

HBV感染者各组IL-2、IL-12含量较正常对照组均下降,IL-4、IL-10均升高,差异有统计学意义(P<0.05),IFN-γ普遍降低但各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。A组现症患者IL-2、IL-12的活性显著高于B组无症状HBV携带组和C组非活动性HBs Ag携带组(P<0.05)。见表1。

2.2 病毒载量与细胞因子含量的关系

IFN-γ、IL-2各组与正常对照组比较显著下降(P<0.05),IFN-γ下降幅度为≥107组和105~6组>、<105组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。IL-12也普遍降低,各组差异无统计学意义(P>0.05)。IL-4、IL-10各组含量明显高于对照组(P<0.05),含量随病毒载量增高而增加。≥107组和105~6与<105组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

机体感染HBV会有不同的临床表现和预后。慢性乙型肝炎发病主要是免疫应答导致的肝细胞损伤,CD4+T辅助(Th)细胞在肝细胞损伤的免疫反应中起着核心的调节作用。根据CD4+Th产生的细胞因子不同分为Th1和Th2等细胞亚群,Th1分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子,主要介导细胞免疫反应,在一定条件下,还可刺激B细胞产生抗体;Th2分泌IL-4、IL-10等细胞因子,主要促进B细胞增殖并分化成浆细胞,介导体液免疫。Th1/Th2应答的动态平衡是机体处于正常免疫状态的保证[4]。这两种细胞因子发挥作用时相互拮抗,使得Th1和Th2成为功能上相互抑制的适应性调节T细胞亚群[5],本研究结果显示,IFN-γ、IL-12、IL-2较正常组血清含量均下降,而IL-4、IL-10均升高,提示HBV感染者Th1/Th2免疫应答失衡或紊乱。

IFN-γ由活化T细胞产生,是促进Th1分化的关键性因子,它能直接抑制Th2的分化从而使Th1的分化占优势;IL-12主要由单核细胞、巨噬细胞产生,它和IFN-γ可直接调节Th1的分化,还可促进NK细胞和T细胞产生IFN-γ,从而发挥对Th2的抑制和对Th1的促进作用。IFN-γ、IL-12含量较正常组降低,IFN-γ降低程度伴随病毒载量增加而降低,显示Th1细胞免疫应答在HBV感染者中受到不同程度的抑制。IL-4对启动Th2的分化起最为关键作用,IL-4含量越高,则对Th1细胞产生IFN-γ的抑制作用越强[6]。IL-10主要通过抑制Th1细胞产生IFN-γ、IL-2等,来促进Th2的分化。结果表明IL-4和IL-10含量均升高,且含量伴随病毒载量增高而增加,显示HBV致病与免疫应答中Th2介导的体液免疫活性偏高有关系。含量偏高的IL-4和IL-10抑制了Th1群细胞的功能,使Th1分泌IFN-γ和IL-2的量减少,细胞免疫效应降低,机体清除病毒能力减弱,导致病毒持续感染。同时也进一步证实了HBV致机体免疫应答低下。IL-2在HBV感染者中虽然普遍偏低,但在HB现症患者中其活性显著高于无症状HBV携带者和非活动性HBs Ag携带者(P<0.05),提示在有病毒复制的HB现症患者中,Th1群细胞免疫应答处在相对活跃状态,与有关报道相符[7]。IL-2主要由活化的淋巴细胞产生,是调节机体免疫功能最主要淋巴因子之一。它属于Th1群细胞因子,能增强CTL、NK、LAK等杀伤细胞的活性清除HBV。HB现症患者ALT异常,提示Th1群细胞免疫应答导致了肝细胞的损伤。

注:与正常对照组比较,dP<0.05;与A组比较,a P<0.05

注:与正常对照组比较,dP<0.05;与≥107组比较,a P<0.05;与<105组比较,c P<0.05

综上所述,HBV感染者临床表现呈多样性,它与免疫应答状况以及免疫调节细胞因子含量变化有关联。在HBV感染与免疫反应中,Th1/Th2免疫应答失衡或紊乱,直接影响了CTL、NK、LAK和B细胞功能的正常发挥,致使病毒清除能力下降从而导致疾病慢性化。对HBV感染者进行免疫状况和免疫调节的细胞因子研究,对于进一步阐明其发病机制以及应用细胞因子干预治疗慢性肝炎患者,判断药物治疗效果,临床转归和预后预测具有重要意义,有待继续深入研究。

摘要：目的 研究慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者免疫状况以及免疫调节细胞因子含量变化情况,了解病毒载量、肝功能与IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12等细胞因子含量变化情况的临床意义。方法 收集27例HBeAg阳性和肝功能ALT异常者为HBV感染现症患者为A组;22例HBeAg阳性和肝功能ALT持续正常者为无症状HBV携带者为B组;11例HBeAg阴性和肝功能ALT正常以及HBV-DNA阴性者为非活动性HBsAg携带者为C组;设正常对照组。采用双抗体夹心ELISA法定量检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12血清含量。结果 HBV感染者各组IL-2、IL-12含量较正常对照组均下降,IL-4、IL-10均升高,差异有统计学意义(P<0.05),IFN-γ普遍降低但各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。A组现症患者IL-2、IL-12的活性显著高于B组无症状HBV携带组和C组非活动性HBsAg携带组(P<0.05);IL-4、IL-10含量各组均低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05),患者各组间差异无统计学意义(P>0.05)。病毒载量与细胞因子含量的关系:IFN-γ、IL-2各组与正常对照组比较显著下降(P<0.05),IFN-γ下降幅度为≥107组和1056组>、<105组,差异有统计学意义(P<0.05)。IL-12也普遍降低,各组差异无统计学意义(P>0.05)。IL-4、IL-10含量各组明显高于对照组(P<0.05),含量随病毒载量增高而增加。中、高病毒载量组与低病毒载量组差异有统计学意义(P<0.05),低病毒载量组与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV感染状态和病毒量与免疫调节细胞因子IL-2、IL-12、IL-4、IL-10含量变化有一定的关联性。

关键词：HBV感染者,免疫调节,细胞因子

参考文献

[1]王豪.慢性病毒性肝炎的治疗现状与评价[J].中国预防医学杂志,2001,2(3):180.

[2]史鸣树,闵建荣.乙型病毒性肝炎[M].北京:人民军医出版社,2009:49-54.

[3]中华医学会传染病学与寄生虫病学会分会,肝病学分会.病毒性肝病防治分案[J].中华肝脏病杂志,2001,19:56-62.

[4]梦泽,李晓军.免疫学检验的热点与难点[J].临床检验杂志,2000,18(1):60.

[5]陈慰峰,金伯全.医学免疫学[M].4版.北京:人民卫生出版社,2004:136-174.

[6]金伯泉.细胞和分子免疫学[M].2版.北京:科学出版社,2001:399.

调节因子 第4篇

干扰素调节因子在先天免疫和适应性免疫中发挥重要的作用[1]。迄今为止, 大多数文献报道脊椎动物干扰素调节因子家族具有10个成员, 即IRF1-IRF10, 它们分别属于4个亚小家族:IRF1亚家族、IRF3亚家族、IRF4亚家族和IRF5亚家族, 其中IRF4、IRF8、IRF9和IRF10属于IRF4亚家族[2]。近年来, 在鱼类中还发现了第11个IRF, IRF11, 它类似于IRF1和IRF2[3]。

在脊椎动物中, 硬骨鱼类是一个大的种群。在许多领域, 硬骨鱼类发挥了非常重要的作用。例如在比较生物学中研究器官发生时斑马鱼Danio rerio和青鳉Oryzias latipes是其模式生物[4];在研究色素细胞和黑素瘤发育过程中常常用月光鱼Xiphophorus maculatus作为其重要的研究对象[5];红鳍东方豚Takifugu rubripes和黑青斑河豚Tetraodon nigroviridis由于其基因结构紧凑, 常常作为研究基因组结构的模型[6];三刺鱼Gasterosteus aculeatus来源于东非的大型湖泊, 它是研究物种分化和进化机制的最传统的模型生物[7]。此外, 对罗非鱼Oreochromis niloticus[8]、牙鲆Paralichthys olivaceus[9]和草鱼Ctenopharyngodon idella[10]的基因也开展了大量的研究。

IRF4、IRF8、IRF9和IRF10功能有相同之处, 但也有明显的差异[1]。此前, 未见将硬骨鱼类结构和功能综合在一起的相关报道。本文采用生物信息学方法阐明IRF4、IRF8、IRF9和IRF10在基因结构、系统进化树、蛋白相似率及保守结构域等方面的异同, 揭示鱼类这些基因的保守和分化, 进而为阐明它们功能的异同提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

青鳉、红鳍东方豚、黑青斑河豚、三刺鱼、罗非鱼、月光鱼、牙鲆和草鱼基因组DNA序列和蛋白序列。

1.2 方法

1.2.1 基因数据库及其基因结构分析

从Ensembl (http://www.ensembl.org) 数据库上下载青鳉、红鳍东方豚、黑青斑河豚、三刺鱼、罗非鱼和月光鱼基因序列, 从和National Center for Biotechnology Information (NCBI) 数据库上下载牙鲆和草鱼基因组序列。所有下载的序列再通过NCBI Blast TP进行验证。利用SIM4 (http://pbil.univ-lyon1.fr/sim4.php) 程序去查找外显子和内含子, 并计算它们的长度。

1.2.2 进化树的构建

首先利用Clustal W对蛋白序列进行比对, 然后利用Mega4.0构建系统进化树。进化树采用Poisson correction和pairwise deletion方法, 利用bootstrap analysis (1 000 times) 计算进化树每个分支可信度。构建进化树的蛋白序列登录号均列举在基因后面。

1.2.3 相似性分析

利用Clustal W软件对蛋白序列进行比对, 然后采用DNAStar Meg Align程序计算蛋白序列间的相似性。

1.2.4 保守结构域的分析

利用Pfam (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN) 软件分析干扰素调节因子的保守结构域。再将干扰素调节因子的DNA结合域DBD和IAD序列提交到SWISS-MODEL (http://www.swissmodel.expasy.org) 软件进行蛋白结构同源性分析。

2 结果与分析

2.1 基因结构

2.1.1 IRF4

在斑马鱼中发现了3个IRF4基因, 分别命名为IRF4a、IRF4b和scaf NA1075-seg (序列不完整) 。但在青鳉、红鳍东方豚、黑青斑河豚、三刺鱼、罗非鱼和月光鱼基因组上仅有2个IRF4基因 (图1) 。IRF4基因组大小变化范围很广, 从3 034 bp到25 107 bp。基因组最长是斑马鱼IRF4a, 最短的是红鳍东方豚IRF4a。各种鱼类IRF4外显子-内含子组成存在差异。绝大多数IRF4基因有8个外显子, 但在斑马鱼、青鳉、红鳍东方豚中另一个IRF4有9个外显子;黑青斑河豚、三刺鱼中另一个IRF4基因有10个外显子, 而罗非鱼另一个IRF4仅有7个外显子。虽然外显子变化较大, 但在月光鱼中两个IRF4基因都有8个外显子, 而且处于相同位置的外显子长度基本相同。此外, 几乎所有的IRF4基因第1个外显子、第2个外显子和倒数第2个外显子较保守, 长度分别为198bp、187bp和113bp。

2.1.2 IRF8

各种硬骨鱼类中IRF8基因具有非常类似的结构, 含有8个外显子和7个内含子 (图2) 。而且外显子的长度非常相似, 在红鳍东方豚、黑青斑河豚、三刺鱼、月光鱼中处在相同位置的外显子具有相同的长度 (第3个外显子除外) 。罗非鱼除了第3个外显子和第8个外显子以外, 其余外显子的长度都与上面4种长度相同。但是斑马鱼和青鳉外显子的长度变化较大, 除了第2个外显子和第7个外显子长度与上述5种鱼一致, 其余都存在较大的差异 (图2) 。

2.1.3 IRF9

硬骨鱼类IRF9的基因组长度变化较大, 从斑马鱼的22672bp到黑青斑河豚的888bp (图3) 。在斑马鱼、三刺鱼、罗非鱼和月光鱼中IRF9含有9个外显子和8个内含子, 而且在不同鱼类中前面3个外显子具有类似的长度。而在青鳉和红鳍东方豚中IRF9基因具有8个外显子, 第1、2、3和第6个外显子与斑马鱼对应的外显子具有相同的长度。与其他鱼类IRF9相比, 黑青斑河豚IRF9分化很大, 它具有2个IRF9基因, 其中一个仅有3个外显子, 长度为888bp, 另一个具有5个外显子, 长度为1 711bp。尽管如此, 黑青斑河豚第1个IRF9基因第2个外显子与其他鱼类的第2个外显子长度均相同 (123bp) , 第2个IRF9基因前3个外显子与其他鱼类对应外显子长度也都相同, 分别为57bp、123bp和181bp (图3) 。

2.1.4 IRF10

硬骨鱼类IRF10基因具有类似的结构, 含有8个外显子和7个内含子, 而且第2和第7个外显子在不同鱼类中长度基本一致。斑马鱼、青鳉和草鱼第一个外显子长度相同。但红鳍东方豚IRF10基因具有10个外显子, 但其第2和第7个外显子与其他鱼类对应外显子具有基本一致的大小, 分别为196bp和119bp (图4) 。

2.2 进化关系分析

干扰素调节因子4亚家族分为4个亚支, IRF4、IRF8、IRF9和IRF10各成一支。此外, IRF4又进一步分为2个小支, 分别命名为IRF4a和IRF4b。几乎每个物种均含有IRF4a和IRF4b。这说明IRF4基因在硬骨鱼类中复制2次, 形成2个基因。但在斑马鱼中还发现了第3个IRF4基因, Zebrafish-IRF4-Scaf_1075。而牙鲆仅发现一个IRF4基因, 从进化树上看, 它属于IRF4b。从进化树上看, 这4种IRF中IRF4与IRF10亲缘关系最近, 它们聚为一大支 (图5) 。

2.3 相似性

蛋白相似性显示:罗非鱼IRF4b基因和月光鱼IRF4b, 红鳍东方豚和黑青斑河豚IRF4b蛋白全长相似率最高, 均达到88%。不同物种IRF4b蛋白相似率为58~88%, 而IRF4a相似率稍低, 为54~85%。两种IRF4蛋白间相似率就低得多, 例如黑青斑河豚IRF4b和青鳉IRF4a相似率仅为40%。而在同一个物种中, IRF4b和IRF4a相似率从49%变化到55%。由于斑马鱼IRF4-scaf1075基因序列不完整, 因而在计算蛋白相似率时将其排除在外。

在IRF4亚家族中, 不同物种IRF8相似性最高。红鳍东方豚IRF8和黑青斑河豚IRF8相似率最高, 达87%。其次为月光鱼和罗非鱼IRF8, 它们相似率为84%。IRF8间相似率最低的为青鳉和斑马鱼, 它们相似率仅为60%。斑马鱼IRF10和草鱼IRF10间相似率为78%, 而其他物种间相似率为47~58%。在4种IRF中, 不同物种中IRF9相似率最低。其中罗非鱼和月光鱼IRF9相似率最高, 为71%, 而斑马鱼和黑青斑河豚相似率仅为35%。

方框代表外显子, 水平线代表内含子, 不保守外显子和保守外显子分别用黑色框和白色框表示, 外显子上、内含子下的数字分别代表其核苷酸数目。Boxes represent exons and lines adjacent to exons represent introns.Unconservative exons and conservative exons are shown as black boxes and white boxes, respectively.The number of nucleotides in each exon and intron is, respectively, shown above and below the corresponding element.

方框代表外显子, 水平线代表内含子, 不保守外显子和保守外显子分别用黑色框和白色框表示, 外显子上、内含子下的数字分别代表其核苷酸数目。Boxes represent exons and lines adjacent to exons represent introns.Unconservative exons and conservative exons are shown as black boxes and white boxes, respectively.The number of nucleotides in each exon and intron is, respectively, shown above and below the corresponding element.

2.4 保守结构域

所有的IRF4蛋白在N-末端均含有一个DNA结合域 (DBD) , 它包括5个间断的色氨酸残基。在IRF4蛋白的C-末端含有一个干扰素调节因子关联结合域 (IAD) (图6) 。此外, 在斑马鱼IRF4a (AA266-AA292) 、红鳍东方豚IRF4a (AA259-AA266) 和月光鱼IRF4a (AA271-AA287) 蛋白中均有一个富含丝氨酸的区域, 这个区域是在病毒感染后IRF磷酸化并与其他IRF结合, 从而激活清除病毒信号通路的区域[11]。在月光鱼IRF4b (AA129-AA196) 和黑青斑河豚IRF4b (AA266-AA304) 蛋白中还发现了富含脯氨酸的结构域。在三刺鱼IRF4a (AA275-AA286) 、青鳉IRF4a (AA294-AA304) 和罗非鱼IRF4a (AA290-AA301) 蛋白中还发现锌羧肽酶结构、锌结合信号2结构。

在罗非鱼IRF9蛋白中除含有DBD和IAD结构域之外, 还发现一个富含脯氨酸的结构域 (AA235-AA269) , 在其他鱼类中这个区域也富含脯氨酸残基。此外, 在各种鱼类的IRF9蛋白中还发现有一个核定位信号, 位于AA124-142。人类IRF9蛋白含有2个核定位信号, 分别位于AA66-70和AA81-85, 而且这些区域是非常保守[12]。在硬骨鱼类IRF9中也同样存在保守的K66、K68以及AA81-85保守区域。

IRF8和IRF10在其前面120个氨基酸残基中也都含有一个DNA结合域, 它们包含5个色氨酸残基, 色氨酸残基间间隔11~19个氨基酸 (图6) 。

3 讨论

IRF4基因最早是在1995年从鼠中发现的[13], 次年, 在人类中也发现了IRF4基因[14]。随后, 在其他物种包括鱼类中依次都克隆到IRF4基因。鱼类中IRF4基因结构组成变化很大, 而且基因分化也较大。在斑马鱼中发现有3个IRF4基因, 而在其他大多数鱼类中有2个IRF4基因。系统进化树显示硬骨鱼类IRF4基因分为2支, 一支命名为IRF4a, 另一支命名为IRF4b。IRF4a和IRF4b几乎都存在在所有的鱼类中。但迄今为止, 在哺乳动物、鸟类和两栖类仅发现有1个IRF4基因, 从进化上说, 它们属于IRF4b[15]。这说明在鱼类进化中曾发生过基因组染色体复制[16]。此外, 在人、鼠和红原鸡Gallus gallus的IRF4 c DNA上包含2个可能的起始密码子M, 它们上游均未发现终止子[13,14,17]。其中第一个M与起始信号Kozak序列 (gccagcc ATGg) 更为一致[18], 因而定义为起始密码子。这种现象也在斑马鱼IRF4a、IRF4b和红鳍东方豚IRF4a中存在。而且IRF4基因存在不同的转录本, 例如斑马鱼IRF4b和虹鳟Oncorhynchus mykiss IRF4有2个转录本, 红鳍东方豚IRF4a有7个转录本[19]。干扰素调节因子家族成员均含有DNA和IAD结合域, IAD介导IRF间或IRF与其他转录因子间形成同源或异源二聚体, 这有助于结合到启动子上, 并调控基因的转录[20]。本文涉及到的IRF4均具有这个结构域, 但在虹鳟中发现一个IRF4转录本, 它并不具有IAD结构域[19]。

方框代表外显子, 水平线代表内含子, 不保守外显子和保守外显子分别用黑色框和白色框表示, 外显子上、内含子下的数字分别代表其核苷酸数目。Boxes represent exons and lines adjacent to exons represent introns.Unconservative exons and conservative exons are shown as black boxes and white boxes, respectively.The number of nucleotides in each exon and intron is, respectively, shown above and below the corresponding element.

IRF4和IRF8均能与其他转录因子尤其是Ets家族成员PU.I结合在一起, 调节B细胞和T细胞发育过程中重要基因的表达[21,22]。虽然IRF4和IRF8都介导树突状细胞核巨噬细胞发育和功能方面, 但仅有IRF8在抗病毒反应中发挥重要的作用[23]。但IRF4在IL-21介导的Th17发育过程中起到至关重要的作用[24]。在硬骨鱼类中两者的诱导表达也有差异。大菱鲆Scophthalmus maximus受Poly I:C诱导后12h, 脾脏IRF8基因表达上调了8倍[25]。但条石鲷Oplegnathus fasciatus受Poly I:C诱导后24h, 头肾中IRF4基因表达明显上调了2.7倍, 但在诱导后6h、12h和48h时IRF4基因却下降了。而IRF8基因在Poly I:C诱导后12h和24h表达明显上调, 6h和48h表达却下降了[15]。在虹鳟中也发现了类似的现象, Poly I:C诱导后12h和24h头肾中IRF8表达明显上升, 但IRF4在诱导后12h基因表达明显下调[19]。本文研究发现在硬骨鱼类IRF4基因中存在富含丝氨酸的区域, 但未在IRF8基因中发现这个区域, 这个区域这个区域是在病毒感染后IRF磷酸化并与其他IRF结合, 从而激活清除病毒信号通路的区域[11]。此外, 在IRF4蛋白结构上还发现富含脯氨酸的结构域、锌羧肽酶结构、锌结合信号等, 这些结构域在IRF8蛋白上也未曾发现。这也许可以说明两者在功能上的差异。

IRF9在IFN-α和IFN-γ信号通路中也能发挥重要作用[1,26]。鲫Carassius auratus IRF9具有2个核定位信号, 一个位于DNA结合域, 另一个紧邻DNA结合域, 而这2个核定位信号是IRF9进入细胞核时必需的结构。但人IRF9仅包含一个核定位信号[12]。软件预测, 其他硬骨鱼类IRF9基因同样具有核定位信号, 这时它们进入细胞核介导抗病毒反应必需的结构域。

2002年, IRF10首次在红原鸡中被发现, 它与红原鸡IRF4具有高度的同源性[27]。2011年, 在牙鲆中报道了IRF10基因, 它在病毒免疫反应和细菌免疫反应中均能发挥重要作用[28]。本文的系统进化树再一次证实了IRF4和IRF10亲缘关系较近。而且它们的诱导表达也很相似。大西洋鳕仔鱼细胞在受Poly I:C诱导后24h, IRF4基因表达上调了14.54倍, IRF10上调了约10倍, 显示它们在大西洋鳕先天抗病毒免疫中均发挥重要的作用[29]。但是相对于IRF4来说, 不同鱼类IRF10基因组成更保守, 蛋白间的相似率更高。IRF8也是如此。Huang Bei等研究表明脊椎动物IRF4、IRF8、IRF9、IRF10在基因组上均与Fox家族成员相邻, 它们是由同一个祖先分化而来的[3]。但它们分化的程度不同, IRF8和IRF10分化小, 而IRF9和IRF4分化大。但它们具体的先后顺序及分化距离有待进一步研究。

方框代表外显子, 水平线代表内含子, 不保守外显子和保守外显子分别用黑色框和白色框表示, 外显子上、内含子下的数字分别代表其核苷酸数目。Boxes represent exons and lines adjacent to exons represent introns.Unconservative exons and conservative exons are shown as black boxes and white boxes, respectively.The number of nucleotides in each exon and intron is, respectively, shown above and below the corresponding element.

利用CLUSTERW and MEGA 4.0 (NJ法) 构建系统进化树。重复1 000次。序列来源于Ensembl和Gen Bank数据库。A neighbor-joining phylogenetic tree of IRFs proteins was constructed based on the analysis of protein sequences by the computer program CLUSTERW and MEGA 4.0.Reliability of the tree was assessed by 1 000 bootstrap repetitions.The sequences of IRFs used for the analysis are derived from the Ensembl Database and Gen Bank Database.

摘要：目的:为了阐明硬骨鱼类IRF4、IRF8、IRF9和IRF10在进化上的保守及分化。方法:从Ensembl和NCBI数据库下载基因的DNA和蛋白序列, 绘制基因框架图, 利用Mega 5.0构建系统进化树, 采用DNAStar计算蛋白相似率, 利用Pfam软件分析保守结构域。结果:IRF8和IRF10是相当保守的。各种硬骨鱼类中IRF8和IRF10基本一致。不同物种IRF8蛋白相似性最高 (60%87%) , 其次为IRF10 (4978%) 。但IRF9和IRF4分化较大。硬骨鱼类有12个IRF9基因, 13个IRF4基因。不同物种IRF4蛋白相似率为5488%, IRF9更低 (3571%) 。此外, 在硬骨鱼类IRF9和IRF4蛋白上还发现有多种结构域。结论:硬骨鱼类IRF8和IRF10非常保守, 不同物种均含有8个外显子和7个内含子, 蛋白相似性分别达到60%87%和4978%。IRF4和IRF9分化更大, 不同物种基因数量从1变化到3, 蛋白相似率低。

调节因子 第5篇

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年SD大鼠30只, 雌性, 体重180~220 g, 由贵阳医学院实验动物中心提供。随机分为三组, 每组10只, 第一组正常对照组, 第二组哮喘模型组, 第三组红霉素干预组。

1.2 主要实验试剂和器材

1.2.1 试剂

卵蛋白 (ovalbumin egg, OVA) 购自美国Sigma公司;氢氧化铝由贵阳医学院免疫实验室提供;白百破疫苗由贵州省防疫中心提供;注射用乳糖酸红霉素:大连美罗大药厂 (产品批号:20040404) 。Eotaxin试剂盒购于大连泛邦生物工程有限公司。

1.2.2 仪器

益鸟牌超声雾化器402型 (上海合力医疗器械厂) ;磁极80-2离心沉淀器 (上海手术器械厂) ;光学显微镜 (Olympus) 。

1.3 实验方法

1.3.1 哮喘模型的构建

参照文献[7]将第二及三组大鼠于第1天和第8天腹腔注射10%OVA 100 mg、氢氧化铝100 mg及白百破疫苗1 m L。第15天开始将大鼠 (每次8~10只) 放入自制的密闭雾化箱内 (60 cm×40 cm×30 cm) , 每天超声雾化吸入1%O VA (OVA 300 mg+NS 30 m L) 30 min, 持续7 d;以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、打喷嚏、抓耳、点头呼吸及站立不稳等表现视为激发成功。第三组动物于每日激发前半小时灌胃予红霉素180mg/ (kg·d) [8] (溶解于1 m L 5%的葡萄糖水中) ;第一组动物用生理盐水代替OVA, 2周后超声雾化吸入生理盐水30 min, 每日雾化吸入前半小时灌胃予5%的葡萄糖水1 m L, 连续7 d。第二组于每日激发前半小时灌胃予5%的葡萄糖水1 m L。处理大鼠前1 h再雾化1次, 处死、取材并作相应测定。

1.3.2 肺组织病理分析

将右肺浸入10%甲醛溶液中固定12~24 h。取右肺中叶组织, 常规石蜡包埋、切片, 用于HE染色、光镜观察。

1.3.3 病理形态学积分方法

根据肺充血、肺水肿、肺出血、支气管黏膜变性、支气管黏膜坏死脱落、支气管肺炎、间质性肺炎、肺组织坏死、肺脓肿、肺纤维化、肺泡上皮增生、肺泡腔内巨噬细胞、血管内皮增生、局灶性肺气肿改变, 按程度“无、轻、中、重”分别计“0、1、2、3分”, 然后累计总分。

1.3.4 血清和BALF的采集以及BALF细胞计数与分类

大鼠末次激发后, 股动脉放血处死。全血3 000 r/min离心10 min, 留取血清保存在-70℃冰箱留作eotaxin的测定。打开胸腔, 结扎右侧肺门, 剥离左肺。用生理盐水灌洗左肺每次3 m L, 共3次, 回收BALF, 回收率为70%以上。取约50μL置于细胞计数板上, 作细胞总数计数, 其余以3 000 r/min离心10 min, 将上清液分装并保存在-70℃冰箱留作eotaxin的测定。离心沉渣涂片, Wright-Giemsa染色油镜下行嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞分类计数。

1.3.5 eotaxin在血清和BALF中的浓度测定

采用双抗夹心ELISA法, 严格按试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学处理

计量数据以均数±标准差 (±s) 表示, 应用SPSS 11.5软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析 (ONE WAY ANOVA) , 方差齐者用最小有意义差异t检验 (LSD-t检验) , 不齐者直接用Dunnett’s T3检验;相关性检验采用Pearson直线相关性分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF细胞总数及分类计数结果

哮喘组BALF中细胞总数、EOS绝对值和EOS占细胞总数的百分比 (EOS%) 均显著高于对照组 (P<0.01, F值分别为87.183、485.331及685.677) ;EM组细胞总数、EOS绝对值和EOS%显著低于哮喘组 (P<0.01) , 但仍高于对照组 (P<0.01) 。哮喘组巨噬细胞比例较对照组显著下降 (P<0.01, F值为112.727) , EM组巨噬细胞比例显著升高 (P<0.01) , 但仍明显低于对照组 (P<0.01) 。哮喘组淋巴细胞及中性粒细胞比例与对照组比较显著升高 (P<0.01, F值分别为75.875及74.208) , EM组显著低于哮喘组 (P<0.01) , 但仍高于对照组 (P<0.01) 。见表1。

2.2 肺组织病理改变

光镜下空白对照组肺组织结构正常, 肺泡腔内有个别炎症细胞渗出, 支气管壁及周围可见极少量炎症细胞。哮喘组肺组织结构轻度破坏, 支气管上皮中度变性、坏死、脱落, 支气管壁明显增厚、支气管壁及周围, 血管周围可见大量炎症细胞浸润, 肺泡腔内有较多的炎症细胞浸润, 肺泡间隔增厚, 组织黏膜充血水肿。红霉素组肺组织结构正常, 肺泡腔及支气管周围的炎症改变较哮喘组明显减轻。见图1。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与对照组和哮喘组比较, P<0.01

A:空白对照组 (HE×100) ;B:哮喘模型组 (HE×100) ;C:红霉素干预组 (HE×100)

2.3 组织病理形态学积分

卵蛋白致哮喘后, 病理形态学积分明显升高, 哮喘模型组与对照组相比, 有显著差异 (P<0.01, F=29.11) 。EM组低于模型组 (P<0.05) , 但仍高于对照组 (P<0.05) 。见表2。

2.4 BALF中eotaxin浓度

哮喘组eotaxin浓度显著高于对照组 (P<0.01) ;EM组eotaxin浓度低于哮喘组 (P<0.05) , 但高于对照组 (P<0.05) 。见表3。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与对照组和哮喘组比较, P<0.05

2.5 BALF中eotaxin水平与EOS数量之间的相关性

将红霉素组和哮喘组大鼠合并计算, BALF中eotaxin浓度与EOS数量之间的相关系数为0.553 (r=0.553) , P<0.05, 说明eotaxin水平与EOS数量之间呈显著正相关。见图2。

2.6 血清中eotaxin浓度

哮喘组eotaxin浓度显著高于对照组 (P<0.01) ;红霉素组eotaxin浓度低于哮喘组 (P<0.05) , 但高于对照组 (P<0.05) 。见表4。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与哮喘组、对照组比较, P<0.05

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与哮喘组、对照组比较, P<0.05

3 讨论

本实验采用了目前国内已经比较成熟的大鼠哮喘动物模型。大鼠的致敏采用低剂量卵白蛋白, 并用氢氧化铝和白百破疫苗作为免疫佐剂行腹腔注射, 2周后超声雾化吸入卵蛋白进行激发, 诱发气道过敏性炎症。建立的大鼠模型具有哮喘发作特有的症状, 如明显的呼吸困难、站立不稳以及口唇发绀等表现;结合实验动物的病理表现显示哮喘动物模型建立成功。

正常情况下, 肺组织内仅有少量EOS存在, 但哮喘时EOS数量显著增加, 表明存在某种选择性调节EOS生成和聚集的分子机制, 这已在动物哮喘模型中用免疫组化方法得到证实[9]。趋化因子是一类由中性粒细胞、单核细胞等多种细胞分泌产生并具有趋化活性的细胞因子[10]。eotaxin是一种高度选择性EOS趋化因子。eotaxin的特异性受体CCR-3主要位于EOS细胞膜, 在其他白细胞较少见[11], 因此, eotaxin对嗜酸粒细胞的趋化具有高度特异性[12]。本实验观察到哮喘大鼠BALF中eotaxin水平显著高于正常对照组, 而且eotaxin水平与EOS计数呈显著正相关。表明eotaxin在哮喘嗜酸细胞性炎症过程中起着重要的作用。血中eotaxin水平亦显著高于正常对照组。因此, 抑制炎性细胞、组织细胞表达eotaxin及阻止eotaxin趋化和激活EOS可能是哮喘防治的一个新措施。

调节因子 第6篇

关键词：BDNF,能量平衡,运动,骨骼肌

脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)主要通过TrkB受体酪氨酸激酶发挥其对神经元的作用。BDNF与其受体TrkB在脑内广泛表达[1],最近研究表明BDNF也可在非神经组织表达,如骨骼肌等[2]。BDNF可调节神经发育和突触可塑性,其在下丘脑调节体重和能量代谢通路中也起重要作用。另外,最近研究显示BDNF不仅在中枢代谢通路中起重要作用,而且在骨骼肌代谢中作为重要的调节者[2]。

1 BDNF与神经退行性疾病

BDNF在神经元的存活、生长、维持中起重要作用[3],在学习和记忆保持中也起重要作用[4]。阿尔茨海默病患者海马和血清中BDNF表达下降。亨廷顿氏综合症患者和帕金森症患者BDNF水平均有所下降。另外,抑郁症患者血清BDNF水平与正常人相比有所下降。血清BDNF水平是老龄妇女学习和一般认知功能受损的生物标记物。

2 BDNF与代谢障碍

肥胖和2型糖尿病患者循环系统中BDNF水平较低[5],在2型糖尿病非肥胖患者中血浆BDNF水平下降,提示BDNF可通过不同的途径调节肥胖和胰岛素抵抗。另外,BDNF在摄食失调和调节体重中起一定作用。

低BDNF水平不仅存在于神经退行性疾病,而且也存在于代谢疾病。神经营养因子如BDNF可能不仅在痴呆和抑郁中起重要作用,也可能在2型糖尿病等代谢疾病中起一定作用。

3 动物学代谢研究

动物学研究显示,BDNF在能量平衡和胰岛素信号通路中起重要作用。BDNF可降低肥胖大鼠的摄食量和血糖水平[6]。中枢或外周注射BDNF可导致食物摄入下降和能量输出增加,改善肥胖合并糖尿病大鼠的高胰岛素血症和高葡萄糖血症。BDNF基因导入可引起体重显著下降,缓解肥胖相关的胰岛素抵抗。尽管BDNF对食欲调节信号通路有一定的影响,但其降血糖作用并不完全归结于其降食欲作用。BDNF注射对血糖平衡起至关重要的作用,可改善肥胖大鼠的胰岛素抵抗。

BDNF与其受体TrkB有高亲和性,而TrkB与通过胰岛素受体底物1/磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B介导的胰岛素信号转导通路是耦合的。这条特殊的途径不仅可调节神经元存活和突触可塑性,而且对胰岛素受体信号转导和胰岛素抵抗也起着重要的调节作用[7],提示BDNF在胰岛素敏感性方面可能发挥了一定的作用。

4 BDNF和运动

2型糖尿病、心血管疾病、痴呆和抑郁等患者循环中BDNF水平下降,运动可增加循环中BDNF水平,因此,运动可在一定程度上降低2型糖尿病、心血管疾病、痴呆及抑郁等疾病的风险。体力活动不足和适度的体力活动,均可改变啮齿类动物脑内BDNF的表达,当剥夺大鼠习惯性的运动时,其脑内BDNF和TrkB信号下调。也有研究显示高脂膳食可降低海马内BDNF水平,而运动可逆转BDNF下降和海马突触可塑性受损[8]。转轮运动结合能量限制,或者是这两种方式结合可提高肥胖小鼠海马的BDNF水平,海马BDNF水平的上升伴随着海马颗粒神经元第二、三级树突树突棘密度的增加,这提示糖尿病可对海马结构产生不利的影响,但通过增加能量输出和降低能量摄入可缓解糖尿病及其引起的认知功能受损。

BDNF可能与外周代谢有关。啮齿类动物研究显示骨骼肌收缩时骨骼肌细胞中BDNF mRNA表达增加,这些BDNF来源于骨骼肌层的神经元。也有研究显示,骨骼肌细胞可表达BDNF mRNA,运动可通过抑制组蛋白去乙酰化酶来增加BDNF mRNA的表达[9]。最初的研究显示运动后骨骼肌BDNF mRNA和蛋白质表达增加,然而骨骼肌来源的BDNF似乎并没有释放进入血液循环。细胞培养结果显示:电刺激时骨骼肌细胞表达BDNF mRNA和蛋白质增加,但并未释放入细胞培养基中,这就排除了BDNF来源于其他细胞的可能性。另外,BDNF增加了AMPK和ACCβ的磷酸化,增加了体内和体外的脂肪氧化。

5 结语

调节因子 第7篇

试验通过荧光定量PCR技术研究鸡、鹌鹑和杂交种胚胎期调节肌肉发育因子的表达量来探索MyoG和Pax7这2个因子的表达特点。比较同种基因在鸡、鹌鹑和杂交种上表达规律的不同和探索上述2个基因之间的调控关系。

1 材料和方法

1.1 材料

鸡胚胎、鹌鹑胚胎、杂交种胚胎由石河子大学动物科技学院实验室小型孵化机孵化;TRIzol Reagent、RNase Inhibitor、DNase、M-MLV逆转录酶、Olig (dT) Primer, 由天根生化科技 (北京) 有限公司生产。

1.2 方法

样品的取得:将获得的种蛋放入石河子大学动物科技学院实验室小型孵化机孵化。孵化条件:温度 (38.0±0.5) ℃, 湿度60%~70%。第7天至第21天每2 d取样1次。每个时间点取3个平行样。13天以前的取全胚胎, 之后分别取胸肌 (约100 mg) 。取样后放入液氮中过夜, 再转入-80 ℃冰箱里保存。

1.2.1 样品总RNA提取及反转录 (RT)

用TRIzol Reagent试剂提取总RNA, 方法参照《分子克隆实验指南》第2版。

迅速提取新鲜胚胎或者从液氮中取出胚胎, 先加入200 μL TRIzol Reagent, 迅速研磨组织;再加入600~800 μL TRIzol Reagent于冰上裂解, 迅速猛烈摇匀2 min;静置20 min后, 加入200 μL氯仿, 剧烈震荡2 min, 摇匀, 冰上静置5~10 min, 12 000 r/min离心20 min;吸取上清液, 加入约400 μL 异丙醇, 混匀, 12 000 r/min离心5 min;弃上清液, 加入约1 mL 75%酒精, 重复操作1次;弃上清液, 倒置静置5~10 min 风干后加入20~40 μL 高压的DEPC水, 混匀;经1.5%变性琼脂糖凝胶电泳分离, EB染色后用凝胶成像系统照相观察RNA条带的完整性。对于较高质量的RNA样置于-80 ℃保存。用随机引物对样品总RNA进行反转录, 获得各样品cDNA。反转录体系:3 μg总RNA、5 μmol/L Random primer、10 mmol/L dNTP 1 μL、RNasin 20 U、M-MLV 200 U、5RT Buffer 10 μL, 总反应体积为50 μL。反转录时, 先将RNA模板、dNTP和随机引物在65 ℃变性5 min, 立即置于冰上, 再迅速加入其余试剂, 37 ℃反应60 min, 95 ℃变性5 min。反应后放入-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 探索PCR条件

从NCBI数据库下载鸡的MyoG、 Pax7和β-actin基因的mRNA序列, 利用软件Primer 5.0设计引物。PCR的反应体系 (25 μL) 如下:10Taq Buffer with (NH4) 2SO4 2.5 μL , MgCl2 (25 mmol/L) 1.5 μL , dNTP mix (5 mmol/L) 2 μL, Taq DNA polymerase (5 U/μL) 1 μL, RT反应产物2 μL, 上、下游引物 (10 μmol/L) 各1 μL, 去离子水14 μL。

1.2.3 PCR产物的回收与纯化以及MyoG和pax

7基因的分子克隆荧光定量PCR反应标准曲线的建立 回收与纯化严格按照回收纯化试剂盒操作说明书进行操作。

将回收的目的基因MyoG、 Pax7和β-actin PCR产物连接到PBS-T载体上, 并转化到DH5α感受态细胞中, 然后从菌液中分别提取重组质粒MyoG、 Pax7和β-actin, 将重组质粒稀释成1107、1106、1105、1104、1103、1102、10的浓度, 然后生成标准曲线。

1.2.4 实时荧光定量PCR条件的优化

应用荧光定量PCR 仪进行表达分析。不同时期样品都使用了6个生物学重复, 每个生物学样品都至少进行3次重复试验。PCR 反应选用宝生物工程 (大连) 有限公司的试剂盒, PCR反应体系为SYBR Green Master Mix 12.5 μL, Primer Forwand 2 μL, Primer Reverse 2 μL, cDNA模板或质粒模板2 μL, ddH2O 6.5 μL, 总体系为25 μL。反应程序为95 ℃ 5 s;95 ℃ 5 s, 退火温度 (目的基因或内参基因) 15s, 72 ℃ 15 s, 40个循环; 95 ℃ 1 min, 退火温度 30 s, 95 ℃ 30 s。

1.2.5 数据统计分析

数据采用SAS9.0进行方差分析, Duncan法进行平均值的多重比较, 最后用Excel绘制基因的柱状表达量图。

2 结果与分析

MyoG基因表达量的分析:MyoG基因在鸡胚胎期第9天就有了很少量的表达, 第17天时达到高峰;在鹌鹑胚胎期第7天有少量的表达 , 第15天达到高峰;在杂交种第7天开始表达, 第11天达到高峰。MyoG基因在鸡和鹌鹑胚胎后期达到表达高峰, 而在杂交种胚胎的中期就达到表达高峰。具体见图2。

Pax7基因表达量的分析:Pax7基因在鸡、鹌鹑和杂交种胚胎期的表达规律比较一致都是在胚胎的后期达到表达高峰。具体见图3。

3 讨论

试验结果表明, MyoG基因在鸡和鹌鹑胚胎肌肉发育后期达到表达高峰, 说明它主要在这个时间段发挥功能。这与国外报道的MyoG是肌细胞终末分化的关键因素相符合。该基因在杂交种胚胎期肌肉发育中期就达到表达高峰, 这既与父本表达特点不同也与母本表达特点不同。鸡和鹌鹑的肌肉都比较丰满但杂交种的肌肉要瘦小, 而王启贵[3]用明星肉鸡和丝羽乌骨鸡杂交的F群体为试验材料, 对MyoG基因上游调控区的变异与性状进行相关分析。将鸡的一些数量性状如出壳重、生长速度、屠体重、胸肌重、腿肌重、肝脏重、腹脂重与 MyoG基因启动子区的多态性片段进行分析。结果表明, 这些性状多数在性别和正反交组合间有显著差异。Hasty P等[4] 和Nabeshima Y等[5]通过胚胎干细胞基因打靶使小鼠 MyoG基因失活, 产生了突变纯合的小鼠, 与非转基因或杂合窝同伴相比, 由于骨骼肌的巨大缺损, 这些纯合突变小鼠在出生前后致死。国内外的研究都表明, MyoG对骨骼肌发育是必需的。由此可见, 杂交种的瘦小很可能与MyoG基因表达异常有关。

Wright 等的研究结果表明, MyoG是骨骼肌发育的一种正调控因子。Sehara等的研究表明, 在小鼠胚胎发生期间MyoG基因上游区促进骨骼肌细胞系的转录激活。Buo等的研究表明, MyoG基因上游序列促进转基因小鼠组织和发育特异性表达。此外细胞培养证实, MyoG能激活自身的转录。可见 MyoG基因表达异常的原因可能是调节它的上游因子表达异常而导致其表达异常。这需要对它的上游调控因子Pax3、MyoD、Myf5这3个因子表达特点的测定来确定, 也可能是它自身表达异常而导致下游的因子表达异常。当然也有可能是肌肉生成的调控机制发生了改变。这种改变可能是整个调节肌肉生成的基因调控网络发生了变化, 也可能是整个网络的局部发生了改变, 但这种表达异常还可能与杂交种胚胎期死亡率高有关系, 这需要进一步研究证明。

在试验中, Pax7在鸡、鹌鹑和杂交种胚胎期肌肉发育后期表达的特点基本相同, 说明Pax7不是杂交种胚胎期死亡的影响因子。此外, MyoG基因表达在杂交种胚胎肌肉发育过程出现不同于父本和母本时而Pax7在杂交种上的表达并没有异常, 也没有资料显示Pax7与MyoG之间有调控关系, 可见这两基因之间并没有调控关系。

摘要：为了研究MyoG、Pax7在鸡、鹌鹑和杂交种胚胎期的表达规律, 试验采用RT-PCR技术对MyoG、Pax7两个基因在鸡、鹌鹑和杂交种胚胎期不同时间点的表达量进行了检测。结果发现:Pax7在鸡、鹌鹑和杂交种胚胎期的表达特点相似;MyoG在杂交种上的表达特点与鸡和鹌鹑不同, 这种不同可能与杂交种胚胎期高死亡率有关。

关键词：杂交种,MyoG,Pax7,RT-PCR,鸡,鹌鹑

参考文献

[1]LIUC, MCFARLDC, VELLEMANS G.Effect of Genetic Selectio on MyoD and Myogenin expression in turkey s with different growthrates[J].Poultry Science, 2005 (84) :376-383.

[2]郑江, 邓忠良.pax7对肌肉形成作用的研究进展[J]重庆医科大学学报, 2007, 132:667-669

[3]王启贵.通过候选基因法对影响鸡肉质性状基因的研究[D].哈尔滨:东北农业大学, 2003.

[4]HASTY P, BRADLEY A, MORRIS J H, et al.VenutiJMOl son ENKleinWH.Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene[J].Nature, 1993, 364 (637) :501-506.