蛋白质组学技术

蛋白质组学技术（精选9篇）

蛋白质组学技术 第1篇

1 蛋白质组以及蛋白质组学的概念

蛋白质组的概念由澳大利亚Wilkins和Willians于1994年提出, 指的是由一个基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质广泛参与细胞的功能及调节, 蛋白质组决定细胞乃至组织和器官的表型。不论是处于正常状态还是急慢性疾病状态下[2]。

2 蛋白质组学在高血压病中的研究

目前国内外的研究大多对其发病的机制感兴趣, 故研究多集中在高血压模型动物的组织蛋白质组学研究。

2.1 高血压模型动物心肌组织的研究

刘丽等[3]运用蛋白质组学技术探讨腹主动脉缩窄 (AAC) 高血压大鼠 (SHR) 左心室差异蛋白质表达, 及其在左室肥厚发生机制中的作用, 结果显示, 鉴定的21个蛋白质中, 相对于假手术组有14个蛋白质上调, 4个蛋白质下调, 3个蛋白为AAC组新出现。NCBI数据库检索后发现上调蛋白质包括:肌球蛋白轻链、心肌A肌动蛋白蛋白原、B肌球蛋白重链、3磷酸甘油醛脱氢酶、线粒体核糖体蛋白L15、G蛋白偶联受体34、酪氨酸蛋白激酶ZAP-70、RIKENcDNA 9030617003、天冬氨酸tRNA合成酶等, 下调蛋白为H 转运ATP合成酶、卜三脂酰辅酶A脱氢酶等, 两组蛋白表达差异有统计学意义。由此认为高血压大鼠心肌中参与糖酵解蛋白、信号转导通路蛋白、基因表达调控蛋白增加, 最终心肌细胞结构蛋白增加导致心肌肥厚。

Jin等[4]运用2-DE技术对SHR大鼠心肌蛋白表达进行了研究, 与Wistar大鼠相比有20个差异表达的蛋白质点, 其中13个点被证明与SHR大鼠早期与血压维持高水平及其进展有关, 而另外7个在后期高表达, 并且这些高表达的蛋白可以被血管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI) 类药物依那普利和氯沙坦逆转。

金贤等[5]取4周、20周龄雄性SHR和WKY大鼠, SHR在血压未升高时就已存在心肌肥厚。经二维凝胶图比较共找出27个差异蛋白点, 质谱分析鉴定出20个差异蛋白, 涉及能量代谢、线粒体氧化磷酸化和氧化应激反应等。

2.2 高血压模型动物肾脏组织的研究

Thongboonkerd[6]运用2-DE和MALDI-TOF-MS技术研究高血压大鼠肾脏蛋白质组表达的变化。结果发现肾脏蛋白表达谱在E-H诱导的高血压组和SH处理组不同, 血管舒缓素结合蛋白Kallistatin在各组中均有表达, 但仅在长期E-H30表达降低。Kallistatin的减少将导致血管中血管舒张因子总量的减少, 从而引起或加重高血压。α1-抗胰蛋白酶A1AT、肾舒血管素活化的抑制因子在E-H30组表达上调, 但在血压正常的SH30组下调。此外, 平滑肌收缩素 (SMCE, 包括肌球蛋白) 、房肽素和蛋白质二硫化物异构酶 (PDI) 在E-H30组上调, 但在SH30组下调。Kallistatin、A1AT、PDI的一致改变提示舒血管素通路在E-H诱导的高血压发病机制中起作用。

杜于茜等[7]研究氯沙坦干预SHR大鼠后蛋白表达的变化, 两组凝胶的平均蛋白点数分别为570±48、686±30。氯沙坦干预后有13个蛋白表达发生了显著变化, 表达增强4个, 表达降低4个, 蛋白点消失5个。对13个差异蛋白点进行质谱分析, 鉴定出的7个蛋白质为Heat shock protein (HSP) 、Tubulin alpha-1 chain、Transthyretinprecursor、Liver regeneration-related protein LRRG03等。

2.3 高血压模型动物主动脉的研究

Delbosc等[8]对两种不同种系的高血压大鼠的主动脉进行研究, Fischer 和Brown Norway (BN) 大鼠分别分为对照组和干预组[N (Omega) -nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) , 一种抗高血压药物], 结果显示BN大鼠干预组血管重构不明显。运用质谱技术对Fischer大鼠干预组表达有差异的蛋白进行研究, 差异蛋白是:ubiquitin, smooth muscle (SM) 22alpha, thymosin beta4, and C-terminal fragment of filamin A。

卞玉兰等[9]以SHR大鼠胸主动脉为研究对象, 结果在线性pH3～10范围内和分子量120 kDa以内, SHR的2DE图分离得到2 338±34个蛋白点, WKY得到2 102±48个蛋白点, 总共1 870个点匹配, 匹配率约为80%。用软件对凝胶图进行分析, 选择有2倍以上差异表达的蛋白点有50个, 其中有27个点在SHR中表达丰度比WKY高, 有23个点在WKY中表达丰度比SHR高。通过胶内酶解后进行一级质谱, 得到20个蛋白点的PMF图谱用 Mascot软件搜索NCBI非冗余库, 获得这些蛋白点的身份, 结果总共有10个点经鉴定后具有较可信的结果, 其功能主要有4大类:酶蛋白、信号通路蛋白、参与胞质分裂过程的蛋白和其他。

2.4 高血压模型动物脑血管的研究

李书林等[10]用自发性高血压卒中型大鼠 (SHR/SP) 试验, 结果表明, 青年组Wistar大鼠脑血管壁明胶酶A (MMP-2) 和明胶酶B (MMP-9) 的表达很少, 而在SHR/SP组大鼠的血管壁表达较多。自发性高血压大鼠Ⅳ型胶原酶在血管壁表达的增强, 可能是长期高血压致使血管内皮受到应力的损伤, 来自血流的切应力和血液的压力 (法向应力) 作用于血管壁, 激发炎性介质的瀑布反应有关。这些因子促进平滑肌细胞、内皮细胞等的基质金属蛋白酶表达。基质金属蛋白酶分解ECM而破坏基底层, 并开放血-脑屏障是脑卒中病情加重的重要因素。老年组大鼠MMP-2、MMP-9的表达也明显高于青年组, 与高血压大鼠差异无统计学意义。这可能是老年鼠由于动脉内膜的增厚, 引起小动脉中层的慢性缺血缺氧, 导致炎症介质、自由基等的产生增加, 从而激活明胶酶, 引起一系列病理生理变化。

2.5 高血压模型动物血清、尿蛋白的研究

Sironi等[11]将三种品系的大鼠[SHR, 自发性高血压易中风大鼠 (SHR/SP) 、Wistar大鼠]应用盐负荷处理一段时间后, 用双向凝胶电泳等测定血清和尿中的蛋白改变, 结果发现, 在中风前至少4周SHR/SP血清中就检测到炎症反应的标志蛋白, 包括高水平的硫抑素 (thiostatin) , 在中风前和盐负荷处理数周后, SHR/SP尿中就出现一些分泌蛋白 (转铁蛋白、血红素结合蛋白、清蛋白、α2-HS糖蛋白、血管舒缓素结合蛋白、α1-抗胰蛋白酶、Gc-球蛋白和转甲状腺蛋白) , 此结果提示, 在磁共振成像检测到脑的异常体征前, 不典型的炎症反应和广泛的血管渗透性改变就已经发生。

3 蛋白质组学在高血压中医证型的研究

“证”是中医对疾病某一阶段的特定病理生理过程的认识, 是中医理论中的基本概念, 也是辨证论治体系的基础。将蛋白质组学方法引入中医“证”的研究, 对中医证相关蛋白质进行筛选和鉴定, 为中医“证”本质的研究提供新的思路与方法。证的特征与蛋白质组有相似之处, 且证候的形成及不同治疗方法的治疗效果必然有其物质基础, 而这种物质基础就有可能反映在蛋白质变化水平上。

萧梅芳等[12]研究15例高血压病肝阳上亢证患者及15例高血压脑出血肝阳化风证蛋白表达的差异。结果提示:肝阳上亢证与肝阳化风证有6个相同表达的蛋白质, 18个差异表达的蛋白质。鉴定出的蛋白质涉及细胞骨架蛋白、代谢酶类、细胞信号转导蛋白、抗氧化蛋白、血液蛋白等。电压依赖性阴离子通道蛋白 (VDAC) 在肝阳化风组及肝阳上亢组表达下调, 提示两证与氧化应激条件下VDAC下调, 启动细胞凋亡有关。

熊新贵等[13]研究17例高血压脑出血肝阳化风证患者、10名健康对照、23例高血压肝阳上亢证患者的血清蛋白质表达谱。3组血清中共有8个蛋白质点呈现差异表达, 鉴定出5个蛋白质为:血清淀粉样前体蛋白, 铜蓝蛋白, 维生素D结合蛋白, 载脂蛋白C-Ⅲ和转铁蛋白。推测其可能与高血压脑出血肝阳化风证存在一定相关性, 其具体机制还有待进一步研究。

4 蛋白质组学在高血压中药治疗中的研究

以蛋白质表达为指标, 采用蛋白质组相关分析技术及生物信息学等方法, 通过比较分析中药作用前后组织、细胞的蛋白质组, 能在分子水平了解中药的作用靶点及方式、代谢途径[14]。

张莺等[15]用平肝潜阳方治疗高血压病肝阳上亢证大鼠, 有12个表达差异的蛋白质斑点, 鉴定确认的8个。其中异柠檬酸脱氢酶、类固醇合成急性调节蛋白在模型组表达较正常组上调, 在治疗组重新下调至前水平, 实验发现模型组大鼠肾上腺铁蛋白轻链较正常组明显下调, 经治疗后又重新上调至高水平。由此推测平肝潜阳法可以作用于铁蛋白轻链, 使其水平提高, 从而发挥其抗氧化应激损伤的作用。

赵艳[16]用镇肝熄风汤治疗高血压脑出血患者20例, 选取高血压脑出血肝阳化风证20例随机分为两组, 分别予以镇肝熄风汤对证治疗及大定风珠非对证治疗, 结果显示, 研究共筛选出22个差异表达蛋白质点。高血压脑出血肝阳化风证, 经镇肝熄风汤对证治疗后与健康对照组比较2个蛋白表达下调, 1个蛋白缺失, 5个蛋白表达与健康人无明显差异。经质谱鉴定有8个蛋白。由此考虑镇肝熄风汤通过作用于ApoAI, 肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶A (cyPA) , 使其水平提高, 有效地介导胆固醇和磷脂从人主动脉平滑肌细胞的流出从而发挥降压降脂作用。

5 展 望

基于质谱技术的计算蛋白质组学研究 第2篇

蛋白质组是继人类基因组计划完成之后又一新兴的生命科学研究对象,蛋白质组学研究细胞或组织内所有表达的蛋白质. 生物质谱技术已为蛋白质组学研究产生了大规模的.质谱数据; 而如何从这些数据中提取和发现有关蛋白质组的重要生物学知识为计算蛋白质组学的研究提出了重大需求, 如蛋白质鉴定、翻译后修饰、定量分析, 以及疾病模式的发现等. 本文研究了如何应用计算技术来解决蛋白质组学研究中质谱信息处理的这几个关键问题.

作 者：孙瑞祥 付岩 李德泉 张京芬 王晓彪 盛泉虎 曾嵘 陈益强 贺思敏 高文 作者单位：孙瑞祥,陈益强,贺思敏(中国科学院计算技术研究所,北京,100080)

付岩,李德泉,张京芬,王晓彪,高文(中国科学院计算技术研究所,北京,100080;中国科学院研究生院,北京,100039)

盛泉虎,曾嵘(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海,31)

蛋白质组学技术 第3篇

关键词：蛋白质组学,分离分析,二维凝胶电泳,多维液相色谱,质谱,蛋白质芯片

0 引言

基因功能的研究随着人类基因组序列草图的完成, 成为生命科学的研究重点, 而蛋白质作为基因功能的表达者, 也成为目前研究的焦点, 蛋白组学 (proteomics) 由此产生。蛋白质组学的研究是着眼于整体性和全面性研究体系内的所有蛋白质组分的化学、物理、生物学性质与功能, 包括表达变化和翻译后加工等各方面的大规模信息[1,2], 这些蛋白质组学的研究离不开蛋白质的分离分析技术。因此, 相关的分离分析在蛋白组学研究中起着至关重要的作用。

蛋白质组学的蓬勃发展, 与高通量的分离分析技术的突破性进步密不可分。首先, 二维凝胶电泳 (two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE) 的出现可以同时实现上千种蛋白质的分离。二维凝胶电泳中使用的载体两性电解质形成的pH梯度被固相pH梯度取代, 使二维凝胶电泳的重复性得到改善[3,4]。随后, 电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离两种质谱软电离技术的出现推动了生物质谱的发展, 同时也使精确、快速测定多肽序列以及生物大分子的相对分子质量成为可能;多维色谱技术的出现和毛细管技术的运用促进了蛋白质组学非凝胶蛋白分离技术的实现;生物信息学的建立使得分析复杂的蛋白质图谱变得更容易[5], 这些技术的出现推动了蛋白质组学的快速发展。目前对于蛋白质组进行全面分离分析的技术体系按分离方法的不同可以分为两类:第一类是基于凝胶电泳分离的技术体系, 该体系通常是先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳实现蛋白质的一维或二维分离, 然后将蛋白质点或条带切下后进行胶内酶解处理, 并利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪测定;第二类技术体系主要基于液相色谱分离, 该体系首先进行整体蛋白质水平的预分离, 然后在肽段水平开展多维分离, 最后通过串联质谱鉴定。无论是蛋白质表达谱、修饰谱、定量蛋白质组研究, 其研究的路线都可归于上述两类[6]。本文着重介绍双向电泳技术、毛细管电泳及其与质谱联用、多维液相分离技术及其与质谱联用、蛋白质芯片等关键技术在蛋白质组学研究中的应用及最新进展。

1 二维凝胶电泳技术

1975年, O`Farrel和Klose分别提出了二维凝胶电泳 (two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE) 的概念。20世纪80年代, 固相pH梯度 (immobilized pH gradient, IPG) 出现并取代了载体两性电解质形成的pH梯度, 它的运用克服了载体两性电解质凝胶电泳操作复杂、pH值不稳定、聚焦时间长、阴性漂移等缺点, 使二维凝胶电泳技术在蛋白质组学研究中得到广泛运用[7]。2-DE技术作为经典的蛋白质分离技术, 优点是可以较快地得到整个蛋白质组样本变化的宏观信息, 也可以借助后续方法分析得到微观信息, 此外该技术具有很好的分辨率, 并具有高通量的优势。目前, 结合样品的预分离技术, 可以分辨5 000以上个蛋白 (常规可达2 000蛋白) 以及小于1ng的蛋白点。但2-DE技术尚存在一些问题:低丰度蛋白质由于电泳的灵敏度不够, 得不到检测;极酸及极碱性蛋白在电泳过程中易丢失, 得不到有效分离;高分子质量区域蛋白的分离无法完全自动化, 操作过程仍然比较繁琐等[8,9]。

随着蛋白质组学的发展, 双向凝胶电泳技术也在日趋改进, 主要在以下几个方面: (1) 对胶条pH范围和长度的改进。Gorg等[10]研究发现使用窄范围的重叠pH胶条分离蛋白时, 可使每个pH单位鉴定出的蛋白质数量明显增多。此外, Gorg等还提出了用pH值为9~12和10~12的胶条能更好地分离碱性蛋白质。 (2) 对样品进行预处理。分步提取法、选择性沉淀、亚细胞分离、亲和纯化等预分离方法在蛋白质样品预处理中得到广泛应用。 (3) 染色方法的改进:荧光染色代替银染法、考马斯亮蓝法以及负染法, 提高了灵敏度并得到更好的重现性。目前, 一种较新的蛋白显色方法———差异凝胶电泳 (Differential in-gel electrophoresis, DIGE) 已成为有较好应用前景的定量蛋白质组学研究方法。DIGE法是指用两种及两种以上的荧光染料标记多个样品, 样品混合后进行二维凝胶电泳, 电泳后的凝胶用特殊的光学系统显现出全部样品的图谱。差异凝胶电泳不足之处在于无法标记不含赖氨酸的蛋白质、试剂费用高、保质期短等[11]。Reiji等[12]通过2D-DIGE技术分析了肝癌细胞和正常细胞中蛋白质的差异表达, Fang等[13]运用此技术对不同外源植物生长激素诱导所引起的大米幼苗叶鞘中蛋白质的变化情况进行了研究。 (4) 自动化的技术体系的发展。由于蛋白质组样品很复杂, 要实现高通量的鉴定就必须有自动化的技术体系。部分公司 (如Proteome) 已开发出灌胶、电泳和染色的自动化仪器。但二维凝胶电泳技术仍无法完全实现高度自动化。

蛋白质组重叠群技术的运用提高了双向电泳的分辨率、增加了上样量、扩大了双向电泳的pH梯度范围和分子量范围、并且可以检测更多极酸和极碱性蛋白质[14], 加之Edmen微量测定技术以及质谱技术灵敏度的提高使得2-DE获得了广泛的应用, 在蛋白质组学研究中成为首选的分离方法。

2 毛细管电泳及相关技术

毛细管电泳 (capillary electrophoresis, CE) 技术指以高压电场为驱动力、以毛细管为分离通道, 依据试样中各组分间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类分离技术。在CE中, 由于没有分子纵向扩散和质量转移, 所以其峰形比液相色谱更敏锐, 灵敏度也更好, 加之其具备样品用量少、溶剂用量少和自动化程度高的优点, 被认为是一种高速、高效的分离技术[15]。质谱作为检测器的突出特点是能够提供分子量信息和结构信息, 具有非常强的定性能力。因此毛细管电泳与质谱的联用在复杂蛋白质成分的分离分析中发挥着重要作用。以下主要介绍毛细管等电聚焦和毛细管电色谱与质谱联用技术。

2.1 毛细管等电聚焦与质谱联用

毛细管等电聚焦 (capillary isoelectric focusing, ClEF) 依据蛋白质等电点的不同而在毛细管内形成pH梯度来实现分离, 可达到分辨等电点仅相差0.004pH的样品[16], 而质谱仪检测可以得到分子量信息, 因此CIEF-MS联用可能得到类似2-DE的结果, 亦即所谓虚拟二维图 (Virtual 2D map) 。CIEF-MS在操作上比2-DE方便、快捷, 质量检测精度更高, 还能识别蛋白质的翻译后加工与修饰[17,18]。Henricus等[19]运用毛细管等电聚焦和质谱联用技术分析了大肠杆菌的周质细胞蛋白质, 并通过SEQUST软件分析得到了159个蛋白质。

2.2 毛细管等电色谱与质谱联用

毛细管电色谱 (capillary electrochromatography, CEC) 是毛细管电泳和液相色谱技术的融合。CEC通过电渗流来推动流动相, 不仅克服了高效液相色谱中压力流速不均引起的峰扩展, 而且由于柱内无压降, 使峰扩展只与溶质扩散系数有关。因此, CEC的理论塔板数远远高于高效液相色谱。同时, 高效液相色谱的固定相的引入使CEC具备了HPLC固定相所具有的选择性, 使其不仅能分离带电物质而且能分离中性化合物。毛细管电色谱分析速度快、柱效高、成本低等优点使毛细管电色谱-质谱联用技术在多肽分析中得到了越来越广泛的运用[19~22]。Liu等[23]设计的在线联用多维毛细管色谱, 第一向采用强阳离子毛细管色谱柱, 第二向采用十个并列的反相毛细管色谱柱, 最终通过MALDI质谱研究了肝癌组织中水溶性蛋白质组, 共检测到1 202个蛋白质, 实现了对复杂蛋白样品的快速分离。目前CEC主要以电驱动流动相为分离模式, 操作中易产生气泡, 使其应用范围受到了一定的限制, 加压毛细管电色谱的出现解决了这一问题。赵良娟等[24]以115μm无孔硅胶颗粒为固定相, 采用电压和压力联合驱动流动相, 用反相梯度加压毛细管电色谱 (p-CEC) 在7.5 min内实现了核糖核酸酶A、细胞色素C、溶菌酶和肌红蛋白4种蛋白质的快速、高效分离, 结果表明, 梯度p-CEC用于蛋白质的快速高效分离具有很大潜力。

3 多维液相色谱及其与质谱联用技术

随着蛋白质研究的不断深入, 学者们提出了新的基于非凝胶分离系统的分离思路与技术来克服2-DE的局限性。多维液相色谱 (multidimensional liquid chromatography, MDLC) 与串联质谱联用 (MDLC-MS/MS) 分析鉴定蛋白质混合物是近年来发展迅速的非凝胶新方法。由于细胞组成的复杂性, 采用一维电泳或液相色谱的分离模式分离全部蛋白质不可能实现理想的分离效果, 而多维液相色谱技术便于组合不同的色谱模式, 可以实现对样品中分子尺寸、大小差异较大的蛋白质、低丰度的蛋白质以及疏水性蛋白质等的分析;多维液相色谱具有易与质谱联用、分析速度快、高灵敏度、高自动化等优点[25~27]。因此, 二维液相色谱作为2-DE技术的重要补充, 在蛋白质组的研究中发挥着重要作用。由于反相液相色谱具有高效的分离能力以及便于后续处理, 常被作为二维分离体系中的最后一维。常采用的二维分离模式有:色谱聚焦-反相液相色谱、离子交换色谱-反相液相色谱、亲和色谱-反相液相色谱、分子排阻色谱-反相液相色谱等。

液相色谱与质谱在线联用技术的关键是解决二者之间的接口问题。目前, 常用的液相色谱-质谱联用以大气压电离源 (API) 为接口, 首先对提取的蛋白质溶液进行酶切, 然后再对肽混合物进行多维毛细管液相色谱分离, 串联质谱分析, 数据库检索, 进而确定蛋白质的种类, 这种鉴定方法又称为多维蛋白质鉴定技术 (multidimensional protein identification technology, MudPIT[28,29]) 。Richard等[30]采用MudPIT方法, 仅用15mL的人尿液样品就检测到87个蛋白质, 实现了高通量、高灵敏度的检测。Tyan等[31]利用2D-LC和电喷雾串联质谱对43例肺腺癌患者胸水进行研究, 共检出1 415种蛋白, 其中某些蛋白是未在血浆中检出过的, 可能为胸水所特有。曹锐等[32]采用蔗糖密度梯度离心法分离和富集小鼠肝脏质膜蛋白质, 然后利用自动在线纳流多维液相色谱-串联质谱联用的方法分离和鉴定之, 以强阳离子交换柱为第一相, 反相柱为第二相, 分离后的肽段直接进入质谱仪离子源进行一级和二级质谱分析。质谱仪采得的数据经计算机处理后用Mascot软件进行蛋白质数据库搜寻, 共鉴定出126种蛋白质, 其中41种为膜蛋白, 为质膜蛋白质数据库提供了有价值的基础性研究资料。

多维液相色谱和质谱联用技术也适用于蛋白质的动态研究。王晖等[33]基于碱性磷酸酶的去磷酸化作用, 发展了一种可改善多磷酸化肽电喷雾质谱检测效果的技术。将一酪蛋白酶解产物用TiO2柱富集后, 用碱性磷酸酶进行处理, 并经微柱液相色谱分离后采用串联质谱进行鉴定, 得到了磷酸化位点。FTICR-MS也被广泛应用在蛋白质的研究中。Joel等[34]通过运用高灵敏度、高分辨率的微毛细管液相色谱和FTICR质谱联用鉴定了正常和患肺癌小鼠支气管肺泡灌洗液中蛋白质的变化, 通过SE-QUEST软件检索分析, 从样品中鉴定出959个蛋白质。Hyeyeung等[35]采用微色谱聚焦技术 (用弱阴离子交换剂填充毛细管柱) 对样品进行第一维分离, 然后通过nanoRPLC-MS/MS分析, 从10μg的卵巢癌样品中分析鉴定出700~800个蛋白质, 实现了对微量样品的分离鉴定, 也为蛋白质翻译后修饰的研究提供了很大的帮助。

4 细胞培养稳定同位素标记技术

细胞培养稳定同位素标记技术 (Stable isotope labeling with amino acid in cell culture, SILAC) 是体内同位素标记的主要形式之一, 作为目前定量分析误差最小的比较蛋白质组学研究策略得到广泛的应用[36]。其原理是将不同来源或不同状态的细胞分别培养于含稳定同位素 (13C、15N) 标记的必需氨基酸的培养基中, 经过多次细胞倍增后, 稳定同位素按照序列特异的方式, 完全渗入到新合成的蛋白质中。通过比较标记前后同一肽段的质谱峰值变化, 可以实现对蛋白质的精确定量。用于标记的氨基酸主要有亮氨酸 (Leu) 、赖氨酸 (Lys) 、酪氨酸 (Tyr) 、精氨酸 (Arg) 等。细胞培养稳定同位素标记技术具有样本需求量少、简单、直接、高效及定量准确等特点, 不仅可以定性和定量地分析差异表达的蛋白质, 还可以用于蛋白质翻译后修饰和蛋白质相互作用的分析[37,38]。Su等[39]用SILAC技术, 通过与AU-PAGE和质谱技术相结合, 研究了正常淋巴细胞中组蛋白H4脱乙酰化酶和加入酶抑制剂缩酚酸肽后酶蛋白组的变化;Lundgren等[40]采用SILAC技术, 通过多级提取的方式对细胞凋亡过程中的细胞核蛋白质组进行了研究, 共鉴定和定量了1 174个蛋白质, 除了大量已知的与细胞凋亡相关的蛋白质, 鉴定结果中还有大量与细胞凋亡相关的未知新蛋白。

作为一种体内代谢标记技术, SILAC技术局限于细胞培养体系的研究, 并且在分析未知序列的肽段时, 由于未知其中被标记的准确原子数, 无法寻找对应的一对峰进行分析。此外, 同位素使用量大、价格高也是限制其广泛应用的因素[41]。Ishihama[42]等发展了另一种基于细胞培养的同位素标记 (Culture-derived isotope tags, CDIT) 新技术, 利用这一方法共定量了1 000个鼠脑蛋白质, 其中组织和细胞系中有97%~98%的蛋白质完全重合。CDIT的产生为SILAC技术在组织和体液蛋白质组学中的应用拓展了新的方向。

5 SELDI蛋白芯片技术

表面增强激光解吸/电离 (surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI) 蛋白芯片是根据层析原理, 结合SELDI质谱技术发展而来, 是继基因芯片之后出现的新一代生物芯片技术。SELDI芯片技术的优点有:集分离、纯化、检测和分析为一体;具有灵敏、快速和高通量等特点[43]。SELDI芯片技术广泛应用于筛选疾病相关蛋白, 可用于重大疾病的早期诊断。Wang等运用此法[44]对正常女性和患有子宫内膜异位女性的血清蛋白质进行比较, 发现了五个潜在的生物标记位点, 建立了相应的诊断模式, 这些生物标记的灵敏度和特异性都高达90%以上。Berit等[45]运用此技术研究了模式植物拟南芥三种表皮细胞中蛋白质组的差异表达, 对酶蛋白质Rubisco的研究说明了基底细胞和毛状体细胞的功能相关性, 这也为SELDI技术在植物蛋白组学研究中的应用提供了帮助。

6 生物信息学在蛋白组学研究中的应用

随着生命科学的发展, 生物信息学数据库的建立和应用软件的开发日益成熟, 并广泛应用于包括蛋白质组学在内的生物研究各领域。通过进入相应的数据库检索, 获得所需的蛋白质鉴定资料, 将生物信息学的实验思路引入蛋白质组学的实验方案, 试验人员可以通过互联网上的信息设计实验方案, 避免了很多重复性的劳动, 为蛋白质组学的发展提供了可靠的信息资源。

7 结论

蛋白质组学研究中的无标记定量方法 第4篇

蛋白质组学研究中的无标记定量方法

蛋白质定量是探索疾病发生发展状况和寻找新药靶标的重要手段.该领域最常用的技术是比较染色后的二维凝胶上蛋白点的光密度值或综合同位素标记后的`质谱峰强度方法.但此二者的样品处理方法都比较麻烦,不利于进行大规模蛋白质组的定量研究.最近几年出现了利用质谱数据进行无标记定量的方法,根据数据类型这些方法可以分为2类:基于鉴定蛋白的肽段数的方法和基于质谱峰强度的方法,在高通量大规模蛋白组定量研究中有很大优势.本综述主要介绍了这2类无标记定量方法的模型及优缺点,并比较了2类方法的灵敏度和准确度.肽段计数方法在检测蛋白丰度变化时更灵敏,而峰面积强度在评估蛋白比率时更准确.

作 者：薛晓芳 吴松锋 朱云平贺福初 XUE Xiao-Fang WU Song-Feng ZHU Yun-Ping HE Fu-Chu 作者单位：军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850刊 名：中国生物化学与分子生物学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY年，卷(期)：200622(6)分类号：Q5关键词：无标记蛋白定量 质谱数 峰强度

蛋白质组学技术 第5篇

银屑病的组织病理学为表面增生和棘层肥厚。目前银屑病发病机制仍不完全明了[2,3,4]。本研究通过建立寻常型银屑病皮损和非皮损组织的蛋白质组2- DE方法,为研究影响银屑病的表皮细胞增生差异蛋白质组学奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、丙烯酰胺、N,N- 甲叉双丙烯酰胺、溴酚蓝、EDTA购自Merck公司,碘代乙酰铵、考马斯亮蓝R- 250购自Sigma公司,过硫酸铵、1.5 molL-1 Tris- HCl由Bio- Rad公司生产,RNA酶A、DNA酶Ⅰ购自Roche公司,线性IPG(24 cm,pH 3～11)胶条购自GE Amersham公司,Milli- Q超纯水系统由Millinore公司生产,Ettan IPGphor双电泳仪、Image scanner由安玛西亚公司生产,脱色摇床由上海精科公司生产,PROTEAN- II- Xi- Cell垂直电泳系统由Bio- Rad公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 银屑病皮损和非皮损组织样品蛋白质的提取

选组织病理学诊断明确的寻常型银屑病病例,取皮损组织和皮损周围的非皮损组织样品,称重,生理盐水冲洗,剪碎至1 mm3 大小, 于液氮下研磨至粉末状,把粉末收集于预冷的EP管中,按体积比1 ∶4加入裂解缓冲液[含尿素、Tris、Pheylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)、DNA酶Ⅰ、RNA酶A 及IEF buffer等],室温静置30 min,4 ℃ 15 000g离心60 min,吸取上清即为组织总蛋白质。Bradford法测定蛋白浓度。及时进行2- DE,或将样品分装保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 2- DE

本实验共采用8个样品,重复3 次。

1.2.2.1 第1相等电聚焦(IEF)

取蛋白提取液(含蛋白质1.2 mg),与上样缓冲液充分混合,放入IPG 胶条,1 h后加2～3 ml矿物油密封,设置聚焦参数,进行IEF(最高电流50 μA胶-1,温度20 ℃)。电泳完毕取出胶条,进行SDS- PAGE电泳,或储存于-80 ℃。

1.2.2.2 IPG 胶条平衡

平衡缓冲液有利于蛋白从第1相到第2相的转移,包括6 molL-1尿素和30%甘油。第1步平衡在平衡液中加入DTT,第2步平衡步骤中加入碘乙酰胺。

1.2.2.3 第2相SDS-

PAGE电泳 将平衡完毕的胶条用电泳 buffer冲洗数次,放在垂直板SDS- PAGE凝胶位于玻璃板之间的凝胶面上,使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。安装电泳装置,接好正负电极,开始电泳,电泳条件为:16 ℃ 5 W胶-1 30 min、10 W胶-1恒功率直至溴酚蓝达胶底线。停止电泳,凝胶用R- 250考马斯亮蓝胶体染色、脱色后进行凝胶扫描和分析。分析软件为Image master 5.0,对图像进行强度效正、点检测、背景消减、匹配。选取不同染色深度和大小的20个点进行质谱检测。

1.2.3 质谱的选择和结果分析

对差异蛋白点进行胶内酶切后应用基质辅助激光解吸质谱(MALDI- TOFMS)进行蛋白质鉴定。仪器为ABI公司的VOYAGER Biospectrometry MALDI- TOF质谱仪,激光强度依据不同样品信号调节。参数设置:正离子模式、手动采集、每次累计100 shot,采集范围(质荷比 m/z):900～3 500。用基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内标校正质谱峰,获得差异蛋白点肽质量指纹图谱PMF,MASCOT蛋白质数据库检索。

2 结 果

银屑病皮损和非皮损组织蛋白质的2- DE图结果见图1、2,典型质谱图见图3。

3 讨 论

2- DE是蛋白质组学研究技术体系中的核心技术。有学者认为,疾病发生发展过程中起重要作用的调节蛋白,即与疾病密切相关的靶蛋白,往往存在于低丰度表达的蛋白中,这些蛋白质在电泳凝胶显示的斑点中不象结构蛋白那么丰富和饱满。因此凝胶蛋白点的分辨率和胶上蛋白质的提取率对后续质谱蛋白的鉴定、检出率起着举足轻重的作用[5,6,7]。一张优质的电泳图可以更好地分离蛋白,获得组织、器官的全蛋白信息。而蛋白样品制备程序、等电聚焦的参数设置和染色技术就是影响2- DE图谱质量的重要因素[8,9,10,11,12,13,14,15]。

本研究以银屑病皮损组织为研究对象进行2- DE蛋白质组学的研究。皮肤属于复合鳞状上皮,分为表皮真皮和皮下组织,由于其组织成分的复杂性及个体差异,要稳定地展示组织的总蛋白有一定的难度。本实验对银屑病患者组织蛋白样品制备及2- DE过程进行了反复摸索、实践,从2- DE图谱的结果分析来看,蛋白点的重复性、清晰度以及病变组织和非病变组织斑点的匹配率都比较理想,为后续研究奠定了基础。我们主要从以下两个方面进行实验条件优化:(1) 蛋白样品制备方面。要获得并展示组织所表达的总体蛋白,寻找银屑病的标签蛋白,蛋白样品制备是实验成败的关键的第一步。样品制备应尽可能地提高样品蛋白的溶解度,最小限度减少蛋白水解,并去除样品中的核酸。细胞破碎时,蛋白水解酶就会被释放出来或被激活而发挥作用,最终影响实验结果。为此,在整个抽提蛋白过程中,需要保持在冰上操作,以抑制蛋白酶活性,同时,裂解液中加入蛋白酶抑制剂(PMSF),它能不可逆抑制丝氨酸水解酶和半胱氨酸水解酶,从而防止蛋白质的降解,保证蛋白样品的完整性。核酸的去除可采用超声或核酸酶处理,超声处理的弊端是可能产生泡沫。本实验通过在样本中加入核酸内切酶(RNA酶A、DNA酶Ⅰ)降解核酸,结合超高速离心(15 000g,60 min)最终去除核酸。(2) 蛋白染色方面。凝胶蛋白质点的检测方法包括考马斯亮蓝染色法、银染法、荧光染色法及放射性同位素标记法等。这几种检测方法的灵敏度各不相同,目前最常用的是银染法和考染法。银染的灵敏度很高,可检测1 ng蛋白质点-1,但银染操作复杂,染色条件难以控制,多在标本量有限时使用。理想的考马斯亮蓝染色法灵敏度可达到200 ng,考马斯亮蓝染色操作步骤简单,染色条件容易掌握,故作者选择胶体考染对凝胶进行染色,通过实行分步、多次的脱色过程,极大地提高了胶上蛋白质点的分辨率,质谱检测的效果也明显清晰。

总之,2- DE技术可以高效率地分离、显示细胞或组织中的蛋白质,结合考马斯亮蓝染色技术,可以提高蛋白分子在凝胶中的分辨率及后续研究中使用质谱的检出率。我们有理由相信,2- DE作为一种新兴的研究技术,以其高效率、在整体背景中研究蛋白质组的真实表达水平等的优势,将为银屑病发病机制和开创新治疗方法的研究提供新的思路。

摘要：目的:分析银屑病皮损组织中的蛋白质表达。方法:对研究蛋白质组学的关键技术二维凝胶电泳(2-DE)过程进行改良。结果:建立了寻常型银屑病皮损和非皮损组织的蛋白质组2-DE方法。结论:本实验为研究影响银屑病的表皮细胞增生差异蛋白质组学奠定了技术基础。

蛋白质组学技术 第6篇

关键词：热激蛋白,抗旱,蛋白质组学

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蛋白质组学技术 第7篇

1 大肠癌发展和肝转移的差异蛋白质组分析对象的选择

大肠癌发展和转移研究可以选择以下模型进行: (1) 细胞模型。将具有不同转移和侵袭能力的细胞株作为研究对象, 通过体内筛选实验和体外筛选实验获得。 (2) 临床模型。采用大肠癌患者的原发部位病灶和转移病灶的癌组织进行蛋白质组分析, 并以同一患者癌灶远处正常黏膜组织作为对照, 以寻找出大肠癌发展与转移相关的蛋白。

2 大肠癌发展和肝转移的差异蛋白质组分析的主要技术

目前, 差异蛋白质组学技术已被应用在肿瘤标志物的筛选、鉴定、分类和治疗及其发生机制等诸多方面。重要的技术方法有:

2.1 双向凝胶电泳 (two-dimensional elec-trophoresis, 2-DE)

2-DE技术是差异蛋白质组学研究的最早核心技术之一, 但对低拷贝蛋白及难溶蛋白检测效果查, 而且pH值过低和过大的蛋白在整个电泳过程中极易丢失, 相对分子质量>200×103或<10×103的蛋白也分离效果不佳, 因此使用受到局限。

2.2 表面增强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术

20世纪80年代末美、日科学家分别开发出电喷雾和基质辅助激光解析电离技术, 拓宽了质谱在蛋白质分析方面的应用。质谱虽然具有较高的分辨率及敏感度, 但检测前必须对样品纯化处理, 因而阻碍了对蛋白质的高通量分析。此外, 质谱分析仪利用电场和磁场把目标蛋白质离子分离开, 最后根据蛋白质离子的质荷比值确定未知蛋白质, 因而该技术不能对蛋白质氨基端与N、C端的氨基酸序列鉴定。目前常用于鉴定蛋白质的MS技术有电喷雾质谱 (ESI-MS) 、表面增强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术 (MALDI-TOF-MS) 、串联质谱 (MS/MS) 、表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱 (SELDI-TOF-MS) 等技术, 其中表面增强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术具有较大的优势。

2.3 激光捕获微切割技术 (laser capture micro-dissection, LCM) 与蛋白芯片技术 (protein chip)

选择具有高对比性、特异性差异显著的对比标本是差异蛋白组学的关键。激光捕获微切割技术 (LCM) 一个重要的策略就是减少干扰因素或个体差异, 提高样本的均一性, 在组织水平上制备蛋白质样品的突破, 该技术于1996年发明[4], 是目前较为理想的细胞靶蛋白提取和制备工具。激光捕获微切割技术具有不破坏组织结构基础上对样品蛋白的高保真性, 避免肿瘤等样品组织异质性对蛋白检测和分析的影响, 因而提高了结果的可靠性。差异蛋白质芯片技术则无需进行蛋白质预分离, 利用不同抗体探组构成的芯片进行高通量检测, 其可在同一时间检测成千上万种不同蛋白质, 具有高效率、而且结果同一性好的特点。激光捕获微切割技术与蛋白质芯片技术联合应用, 仅仅需要少量细胞能就可以分析整个细胞的蛋白质谱或蛋白质指纹, 从而可以获取与评估病理标本上大部分蛋白质异常变化信息[5,6,7,8]。

2.4 生物信息学及差异蛋白数据库的建立

随着各种差异蛋白组学技术的应用和差异功能基因组研究的深入, 产生和积累了海量的生物信息, 因此需要机构多种、存储庞大信息的数据库作为支持, 建立合适的数据库, 研制合适的分析软件就成了差异蛋白质组学研究不可或缺的工具和手段。由于研究目的不尽相同, 目前已经建立了各种类型的蛋白质数据库, 如2-DE蛋白图谱数据库、蛋白质-氨基酸序列数据库、蛋白质结构域与指纹数据库。

3 差异蛋白质组学技术存在的局限性与发展方向

由于蛋白质组技术的快速发展, 越来越多的大肠癌转移相关的差异蛋白质靶点被发现, 这些都说明蛋白质组分析技术在大肠癌发展和转移机制研究中的价值和重要性。但同时也应该清楚理解蛋白质组技术在样品制备和鉴定上的缺陷, 在重复性、高通量性、自动化的不足, 对低丰度蛋白、碱性蛋白、高分子量蛋白分离和对蛋白翻译后修饰的鉴定技术均有待进一步的完善。同时大肠癌发展和肝转移涉及多个基因和蛋白的相互协同或拮抗作用, 也给研究工作带来了难题和挑战, 所以到目前还没有一种潜在蛋白标志被临床用于诊断和治疗。这就迫切要求发展更加完善得鉴别差异蛋白的技术, 建立高效的蛋白数据库并推广其在大肠癌肝转移的早期诊断、分类、判断预后、选择药物靶标以及治疗中的应用。不过相信随着技术的迅猛发展, 研究的进一步深入, 蛋白质组技会为干预大肠癌的发展及转移这一过程的发生、发展提供有效的手段和理论基础。

摘要：大肠癌最主要的死亡原因是肿瘤转移, 因而早期预测和诊断大肠癌转移对于提高大肠癌患者疗效、生存率和改善预后有重要意义。大肠癌差异蛋白质组研究利用蛋白质组研究技术, 对正常大肠黏膜组织、大肠癌原发病灶、大肠癌周围正常组织、大肠癌远处转移病灶、大肠癌患者血浆或血液、组织液和尿液等代谢产物进行蛋白分子的定性和定量分析, 并与正常人蛋白代谢谱进行对照分析, 找寻和发现大肠癌中特有的差异蛋白, 可以筛选和寻找潜在的大肠癌治疗靶点, 对大肠癌进行早期诊断和治疗, 防治大肠癌的发展与转移。

关键词：大肠癌,转移,蛋白质组学,差异表达

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蛋白质组学技术 第8篇

关键词：代谢组学,蛋白质组学,缺血再灌注损伤,脊髓

脊髓缺血再灌注损伤是脊柱脊髓外科领域研究的热点,以往的研究主要集中在阐述机制、解释空间构造方面。我们建立蛋白组学和代谢组学联合研究平台,试图从新的角度阐释脊髓缺血再灌注损伤时间规律。

1 蛋白组学方法

1.1 仪器

Amersham公司IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT Twelve电泳系统、蛋白核酸分析仪、超声破碎仪。Beckman冷冻离心机,PROTEAN IEF cell型等电聚焦仪、PROTEAN-11(R)ⅪCell型垂直电泳槽、凝胶成像系统为Bio-Rad产品,Thermo冷凝水循环仪质谱仪,Applied Biosystems产品ABI-4800型反射式基质辅助激光解吸附飞行时间串联质谱,Typhoon9410扫描仪及图像分析软件De Cyder v.5.02(Amersham Bioscience)。

1.2 试剂

Cy2、Cy3、Cy5荧光染料购自Amersham公司;DMF购于SIGMA公司;裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS)、水化液(8 mol/L尿素、2%CHAPS)、平衡母液(6 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、2%SDS)、RCDC定量试剂盒、10×电泳缓冲液(250 mmol/L Tris、1.92 mol/L glycine、1%SDS)、Bradford定量试剂盒、30%丙烯酰胺(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1)、1.5 mol/L Tris-HCl(p H 8.8)、10%SDS均是Bio-Rad公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备和脊髓标本采集

清洁级健康成年新西兰大白兔由吉林大学实验动物中心提供,雌雄不限,体重2.5~3.0 kg。随机将实验动物分3组:假手术组(I0R0)、缺血30 min组(I30R0)、缺血再灌组(I30R6、12、24、48),每组6只。将其用10%的水合氯醛麻醉,开腹后用血管夹在左肾动脉分叉下阻断腹主动脉,使脊髓腰骶段缺血。假手术组和缺血30min组于术后麻醉下取脊髓L4~5节段,缺血再灌注组缺血30 min后去除血管夹闭创,模拟再灌注。再灌注6、12、24、48 h麻醉下活体取脊髓L4~5节段。液氮速冻-70℃冰箱保存。

1.3.2 样品制备

液氮研磨组织粉末,按1∶10(W/V)加入lysis buffer。加蛋白酶抑制剂(Cocktail)20μl/ml。先取一部分lysis溶解样品粉末,转入Dounce匀浆器中。用剩余buffer清洗容器,再转入Dounce匀浆器中匀浆。将样品放入冰水混合物烧杯里超声,21%振幅。累计超声60 s,超0.2 s,停1 s(pulse on 0.2,off 2),室温提取30 min。离心,40 000 g×1 h/s,4℃离心,取上清,测量出蛋白浓度后,分装保存在-80℃冰箱。

1.3.3 实验方法

标本提取、标记及电泳过程详见文献[1]。

1.3.4 图像扫描及分析

电泳结束后,扫描仪在488/520 nm,532/580 nm,633/670 nm波长分别对Cy2、Cy3、Cy5荧光染料标记的图像进行扫描。用De Cyder v.5.02图像分析软件观察各蛋白点在缺血和再灌注各时间点的变化,取正常组与缺血再灌注24 h组比较筛选差异点标记描述。

1.3.5 差异点的质谱鉴定

应用胶内酶切法切取差异点。质谱分析采用反射式扫描方式,扫描范围:700~4 000 Da;激光能量:一级质量分析器5000 v,二级质量分析器5 500 v。

1.3.6 数据库检索

数据库应用兔形目数据库和NCBI全库。兔形目数据库取蛋白质评分>52分,NCBI全库取蛋白质评分>67分,置信水平在95%以上。

1.4 结果

选取实验动物I30R24组相对于对照组I0R0组,2倍的差异结果作为入选对象,通过荧光标记比较结果,共选取了49个差异点,通过MALDI-TOF-TOF/MS分析酶解后肽碎片的一级和二级离子序列。最后基于MASCOT算法的检索平台,分别以NCBI的兔蛋白库和物种全蛋白库分别检索,最终获得了21个蛋白质。根据灌流过程中蛋白质表达量的变化,实验中所设定的取样组(0、6、12、24和48 h)绘制变化曲线,见图1。

1.5 Western-blot验证分析

选取了24 h下调蛋白质α-tubulin进行验证结果分析,电泳上样次序根据缺血后灌注的时间顺序,与蛋白质分析曲线序列完全一致。

2 代谢组学方法

2.1 材料与方法

2.1.1 主要仪器与装置试剂

气相色谱-飞行时间质谱仪(GC-TOF-MS):美国Waters公司产品;DB-5MS柱(30 mm×0.25 mm,0.25μm)安捷伦科技有限公司产品;离心机为德国Eppendorf公司产品;电子分析天平(BS124S)为德国Startorius公司产品,Masslynx 4.0数据处理系统,英国Micromass公司产品;Nist 02数据库。

2.1.2 主要试剂

核糖醇(内标):由中国药品生物制品检定所提供;甲醇、正己烷(色谱纯):Merck公司产品;其他标准试剂均为国产。分析纯实验用水为Milli-Q超纯水系统(美国Milipore公司)纯化的纯净水。

2.1.3 实验动物与处理

同蛋白质组学研究组实验新西兰兔,随机分为3组:第1组为正常假手术组(I0R0,K),第2组为脊髓缺血30 min(I30R0,M),第3组缺血30 min,再灌注24 h组(I30R24,H)。复制动物模型同前。分别于假手术后,缺血30 min及再灌注24 h采集门静脉血,用1%肝素钠抗凝,3 000×g离心10 min后,取血浆-20℃保存待测。

2.1.4 实验条件

2.1.4.1 色谱条件:色谱柱:DB-5MS(30.00 mm×0.25 mm,0.25μm);升温程序:柱初温50℃,以30℃/min升温至160℃,保持1 min,以4℃/min升温至240℃,保持1 min;以30℃/min升温至280℃,保持3 min;进样温度260℃;载气为超纯氦(99.9996%),柱流量(恒流):1 ml/min;进样量0.3 ml。

2.1.4.2 质谱条件:电子轰击(EI)离子源,电子能量70 e V,传输线温度250℃,离子源温度220℃,电离方式EI+,检测质荷比范围:50~800 m/z。

2.1.4.3 多维统计分析结果:试验中采用非监督的主成分分析(PCA)对K、M和H组的血清代谢物进行分析,建立二维PCA数学模型OPLS-DA模型的载荷图。

2.2 结果

采用气相色谱联合质谱分析(GC-MS)的方法分析测定血清中代谢物并用PCA、OPLS-DA等多维统计方法区分假手术组和不同时段(30 min,24 h)缺血再灌注损伤组。结果发现了51种差异代谢物物质组成的代谢标志物组(其中一个为内标物)。代谢产物的成分及对比差异详见表1、2。

代谢产物主要分为糖类、氨基酸、脂类等。K组和H组对照,代谢产物偏高主要集中在半乳糖、未知糖、甘油、硬脂酸、6-脱氧吡喃甘露糖、软脂酸、尿素、肌醇;M和H组对照,代谢产物偏高主要集中在:葡萄糖、半乳糖、软脂酸、尿素、甲氧基丙二酸、甘氨酸、硬脂酸、5-氧基脯氨酸。

3 讨论

建立和完善蛋白质组学和代谢组学技术平台,可从蛋白组、代谢组两个水平检测目的样品的非期望效应,非选择性、无偏倚的方式筛选出被研究对象在细胞或组织水平的病理生理或代谢水平的潜在变化[2]。

DIGE在差异蛋白质分析方面稳定、可靠。在数据库检索上,借鉴Vissers等[3]的经验,采用兔形目数据库和NCBI全库进行互补分析的策略。分时段采样的蛋白质差异表达的结果上获得若干组动态的变化曲线,变化趋势显示,损伤的24 h是主要改变关键点,在此前后蛋白质的表达水平基本一致。

重点神经蛋白质如神经纤维蛋白M(neurofilament M,NFM),在上调和下调模式中均出现,其在应激后受雌二醇的诱导表达以恢复神经细胞的功能[4],损伤前期该蛋白质表达下降,而后保护性地上升以恢复神经元的功能,因此推测,保护性机制发生于再灌注24 h。另一个神经蛋白是span2,该蛋白参与神经元膜的稳定性的保持,Indraswari等以脑缺血小鼠为模型发现spna2的m RNA表达上调,参与缺血保护[5]。在结果中其蛋白质表达水平在24 h明显下调,表明该蛋白在缺血损伤前期发挥不同的作用。

胶质纤维酸性蛋白(GFAP)24 h表达量下降,之后表达水平恢复。胶质纤维酸性蛋白被认为是脊髓损伤的标志性蛋白。

根据实验结果构建的数学模型显示,蛋白表达量变化总体趋势呈现24 h“瀑布式”下降,而其余时间点变量很小的特征,Woolf等也通过免疫组化分析周围神经损伤时观察到,糖原磷酸化酶(PYGM)在24 h表达有一个瞬时降低[6],因此推测在脊髓损伤中,糖代谢的酶表达水平的降低可以在一定程度上降低葡萄糖的消耗,使体内的葡萄糖维持在较高水平,从而保护急性应激中受损的神经。

保守的热休克蛋白(HSP)是细胞对缺血、缺氧等应激反应敏感而可靠的标记,对应激细胞起保护作用[7]。最近有实验证实,脊髓损伤组大鼠在脊髓损伤后2 h即有HSP70开始表达,并随着时间增加,表达24 h达到峰值,维持至72 h后表达渐少,低于6 h水平[8],与HSP相关的辅助因子热激活蛋白70识别蛋白A(HSC70)在24 h下降达到低谷而后升高,此过程表明初期应激后机体内在损伤保护机制启动,与HSP70联动,其诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关[9]。

琥珀酸脱氢酶、烯醇酶等参与碳水化合物代谢和能量代谢的酶类在24 h时间点上也呈现下降的特征,但是目前仍缺少其在神经损伤研究中的作用机制证据。

代谢组学方面,由于所检测的许多内源性小分子化合物直接参与了体内各种代谢、循环,其水平高低在一定程度上反映了机体生化代谢的功能和状态,通过代谢网络分析还能了解体内生化代谢状态,沟通生化代谢与疾病关系[10]。气质联用(GC-TOF/MS)在扫描模式下不但具备了广谱测定、强大的分离和分析复杂混合物的能力,还拥有很高的灵敏度、良好的重现性和线性响应[11,12]可以同时测定定性几百个化学性质不同的化合物。其庞大的化合物谱图库也极大地方便了未知化合物的鉴定。

代谢产物分析方面,高能磷酸化合物,如磷酸肌酸(P2Cr)、三磷酸腺苷(ATP)的耗竭及葡萄糖、糖原的耗竭被认为是缺血性损伤最敏感和最可靠的代谢指标。葡萄糖在细胞内转换为丙酮酸后,缺氧时氧化磷酸酶活力下降,糖酵解产生的H+与丙酮酸结合形成乳酸,其作为疲劳物质,量的升高可以在某种程度上反映细胞缺血缺氧的状态。本试验中假手术组(K)、术后30 min组(M)、术后24 h组(H)比较:在假手术组与术后24 h组比较中(表1),出现明显高峰的产物,假手术组为葡萄糖,术后24 h组为乳酸,说明葡萄糖消耗明显。而术后30 min组与术后24 h组比较(表2),术后24 h出现半乳糖与未知名称的糖明显较术后30 min组高。半乳糖也可以通过半乳糖激酶等作用下进入酵解途径。其他糖类如6-脱氧吡喃甘露糖也可通过变位酶转变成磷酸己糖而半乳糖激酶等作用下进入酵解途径。其他糖类如6-脱氧吡喃甘露糖也可通过变位酶转变成磷酸己糖而进入酵解途径,由此可推断在术后24 h中,糖代谢已经达到峰值,趋向于向正常方向回归正常代谢变化。此外甘油是细胞膜的组成部分,研究表明甘油的浓度变化可能反映细胞膜损伤的程度[13]。

蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 第9篇

蛋白质组 (Proteome) 是1994年澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams提出的[3]。蛋白质组是指一个组织、细胞或者基因组在一个时期内所表达出的所有蛋白质, 蛋白质组学就是对这些蛋白质进行研究的学科[4]。其可以进行高通量的研究和比较正常细胞与癌细胞之间的差异蛋白质, 并对不同时期的癌细胞中所表达蛋白质的种类进行定性和定量分析, 不仅有助于阐释肿瘤的发病机制, 还能筛选和鉴定药物作用靶点, 在疾病的诊断、治疗和新药开发等方面, 都有着广阔的应用前景[5]。

1 蛋白质组学研究的主要技术

1.1 2-DE双向凝胶电泳技术 (two-dimensional gelelectrophoresis, 2-DE)

2-DE双向凝胶电泳技术是现在蛋白质分离研究最经典、最成熟的技术, 该技术是上世纪80年代发展起来的, 主要利用蛋白质的等电点和分子量对蛋白质进行高通量的分离。2-DE双向电泳主要包括:样品制备、等电聚焦、SDS凝胶电泳和染色, 图像的扫描和分析, 以此可以对不同样本的蛋白质进行分析。但是该技术也有一定的缺点, 如对不可溶性蛋白质、极酸极碱性蛋白质和高分子量的蛋白质不易分离。现在可以运用高效液相色谱技术来弥补这些缺点, 并对低丰度蛋白进行检测[6,7,8]。

1.2 蛋白质鉴定技术

蛋白质传统的检测方法有Edman降解测序和氨基酸测序, 随着技术的发展, 质谱技术已经大规模地应用在蛋白质的检测之中, 现在常用的技术有: (1) 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALD I-TOF-MS) 技术; (2) 电喷雾串联质谱 (ESI/MS/MS) 技术等。现在运用较多是MALDI-TOF-MS, 该技术可以在不破坏蛋白质样品结构的情况下对样品进行大量、精确的分析[9]。

2 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用

2.1 在药物靶点找寻方面的应用

通过研究癌细胞在用药前后蛋白质的表达情况, 分析药物作用的靶点, 探究细胞内的信号传导, 大致分析其药物作用机制。

卵巢癌 (ovarian cancer) 是一种常见的妇科癌症。赵群等[10]用二维差异凝胶电泳和MALDI-TOF/TOF串联质谱差异蛋白质组学研究103例卵巢上皮癌, 63例卵巢良性肿瘤, 3例盆腔良性病变和60例健康对照血清, 发现41个有显著性差异的蛋白质点, 成功鉴定其中的28个。上调和下调最显著的分别为结合珠蛋白和转铁蛋白, 成为卵巢上皮癌的血清标志物;CA125+结合珠蛋白+转铁蛋白联合诊断卵巢上皮癌的敏感度和特异度高于三者的单独检测, 提高了CA125阴性卵巢上皮癌的检出率, 有助于卵巢上皮癌的诊断。结直肠癌是消化道常见癌症, Akiko[11]等用差异蛋白组学研究了结直肠癌细胞DLD-1和用5-氟尿嘧啶处理过的DLD-1细胞, 结果发现有17个蛋白点上调, 19个下调, 有7种抗凋亡的蛋白, 如HSPB1、内质网过渡三磷酸腺苷 (ATP) 酶等上调, 4种凋亡蛋白如丝切蛋白1、丙酮酯酶激酶M2等下调。其中HSPB1和其磷酸化结构增强表达, 这个蛋白有成为今后药物研发靶点的可能。Victoria[12]等运用差异蛋白组学研究了新辅助化疗用于治疗雌激素受体阳性乳腺癌, 发生抗药性的原因。化疗有效的细胞蛋白组与有抗药性的细胞蛋白组进行对比发现, 有132个蛋白点有显著的变化, 57个蛋白点可以重复。经过实验证明, 14-3-3蛋白家族及其亚型与耐药性有密切的相关性, 现在仍需临床试验证明, 但该蛋白可以作为抗乳腺癌药物潜在靶点。

2.2 在癌症早期诊断中的应用

癌症早期诊断的意义超过了任何一种癌症的治疗方法, 它对延长患者生命和癌症的治疗都有着很大的帮助, 蛋白质组学为癌症的早期诊断提供了可靠的方法。对正常细胞和肿瘤细胞的蛋白组进行比较, 从中发现特异性的肿瘤标记蛋白, 可以作为肿瘤早期诊断的标准。

世界范围内, 男性患膀胱癌在有实体肿瘤的癌症中排第4位。Lei[13]等运用2D电泳技术对正常膀胱癌细胞和膀胱癌细胞进行比较, 发现有14中蛋白发生表达差异, 如β2微球蛋白、apoA1、前列腺素合成酶D2、Ⅱ型细胞骨架1等。其中apoA1由于其被证实膀胱癌患者的尿液中也有发现, 故可以作为膀胱癌早期诊断的蛋白质。

我国是胃癌高发的国家, 每年有约有35万人死于胃癌。Megan A[14]对胃癌小鼠模型中正常型与肿瘤型进行了2D-DIGE分析, 其中有28个基因与人类同源, 8个蛋白被用于患者血清对照组。显著增加的有载脂蛋白E和结合珠蛋白, 而afamin和从生蛋白显著减少, 用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 进行检验后发现, 这4种蛋白对于胃癌早期诊断的敏感性要远远好于现有临床检测胃癌标志物CA72-4。

根据一些组织的调查, 肺癌的发病率居于所有癌症的首位, 病死率也很高。Yao[15]对非小细胞肺癌细胞进行了差异蛋白组学研究, 发现了35种蛋白发生变化, 其中4个蛋白质可以进一步实验, SMOX、NOLC1、HMMR、MALAT1这4种蛋白质参与了多种细胞活动, 如细胞的增殖、凋亡。NOLC1、MALAT1已在诊断疾病中有着相当的灵敏度, 对于今后肺癌的早期诊断有很大帮助。

3 展望