定量酶联免疫吸附法

定量酶联免疫吸附法（精选8篇）

定量酶联免疫吸附法 第1篇

1 对象与方法

1.1 对象

本研究收集2008年1月~2010年6月在我院进行孕前检查的108例女性,年龄21~32岁,抽取空腹静脉血5 ml,离心分离血清后置于-80℃冰箱保存,用于CMV-IgM抗体的检查。

1.2 试剂及检测方法

CMV-IgM试剂盒(ELISA)购于德国罗氏公司,严格按照试剂盒说明书步骤操作,采用美国宝特ELX808酶标仪进行检测,波长设为450 nm处检测OD值,每份标本重复检测3次,取其均数。实时荧光定量-PCR送中山大学达安基因公司检测,引物系列:sense 5'-GTG CAC AGT CCT AGG ATT AA-3',anti-sense 5'-GAG TAA CGA TTC GAA CCG TA-3',逆转录反应条件为37℃1 h,然后95℃3 min;实时荧光定量-PCR反应为93℃3 min,然后93℃30 s,55℃45 s,72℃45 s,共40个循环。主要仪器为ABI 3900台式高通量DNA合成仪,科大创新HC-3018R高速冷冻离心机,ABI 9700 PCR仪,ABI 7500全自动荧光定量PCR仪。

1.3 统计学方法

计量资料采用均数±标准差表示,所有数据均采用SPSS 15.0软件进行分析,组间比较采用oneway-ANOVA比较,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

两种检测方法CMV-IgM阳性率比较,实时荧光定量-PCR法阳性率高于ELISA法,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

与ELISA法比较,*P<0.05

ELISA法检测为阳性的62例妇女采用实时荧光定量-PCR检测也为阳性,其余18例实时荧光定量-PCR法检测为阳性的妇女ELISA法检测均为阴性。笔者分析发现,此18例标本血清CMV-IgM抗体拷贝数均明显较低(拷贝数<10-4/ml)。

3 讨论

本研究表明,采用实时荧光定量-PCR检测孕前筛查妇女外周血CMV-IgM抗体水平较传统的ELISA法敏感性及准确率高,对于孕前筛查可能具有较好的临床价值。

我国是CMV感染高发的国家,且多数人感染后无明显临床症状,表现为潜伏感染[2]。然而,孕妇近期感染CMV后,不仅会对孕妇产生严重影响,如流产、早产、死胎等[3],CMV还可通过胎盘屏障到达胎儿体内,导致胎儿畸形、发育迟缓和神经系统发育异常等[4]。检测孕前妇女外周血CMV-IgM抗体水平是评价CMV近期感染的重要检测指标[5],目前也为广大临床医师所重视。CMV-IgM抗体一般在病毒感染3~5 d后出现,可维持12~16周,具有出现早、消失快的特点[6]。病毒感染的早期或恢复期,血中CMV-IgM抗体水平较低。因此,采用敏感性高的检测手段对CMV感染的早期准确诊断具有重要的临床意义。既往多采用ELISA法,近年来随着实时荧光定量-PCR技术的普及,有研究报道实时荧光定量-PCR检测血清CMV-IgM抗体水平也具有较好的敏感性及准确率。

笔者选择108例孕前妇女,同时采用实时荧光定量-PCR和ELISA法检测外周血CMV-IgM水平,其中实时荧光定量-PCR阳性率为74%,而ELISA法为57%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。进一步分析发现,其中18例实时荧光定量-PCR阳性的妇女外周血CMV-IgM抗体水平均为低拷贝数(拷贝数<10-4/ml),提示对于病毒低拷贝数的人群,采用实时荧光定量-PCR法检测可在一定程度上提高诊断的敏感性及准确率。实时荧光定量-PCR具有快速、准确、敏感性高的特点,笔者认为利用其这些特点可以在一定程度上提高CMV感染检测的敏感性及准确率,但其费用较传统ELISA法高,这可能也在一定程度上限制了这种技术的临床运用。

总之,笔者认为,实时荧光定量-PCR对孕前妇女CMV-IgM抗体水平的检测较传统ELISA法具有较高的敏感性及准确率,值得临床推广使用。

参考文献

[1]方峰,董永绥.巨细胞病毒和巨细胞病毒感染的诊断[J].中华儿科杂志,1999,37(7):397-399.

[2]王德智.巨细胞病毒感染与妊娠[J].中国实用妇科与产科杂志,1995,11(3):132-134.

[3]方群,杜涛.先天巨细胞病毒感染胎儿的临床研究[J].中国优生与遗传杂志,2004,24(1):72-73,76.

[4]尚世强,陶然.儿童巨细胞病毒感染的诊断[J].实用儿科临床杂志,2006,21(22):1598-1600.

[5]消育权,叶小雅,邱秀群,等.993例女性巨细胞病毒抗体检测分析[J].现代医院,2009,9(5):79-80.

定量酶联免疫吸附法 第2篇

关键词：酶联免疫吸附分析 综合性实验 教学

中图分类号：G421文献标识码：A文章编号：1674-098X（2013）05（a）-0149-02

食品分析是食品科学与工程专业重要的专业基础课程之一。食品分析实验课是食品分析教学的重要组成，是锻炼学生实验操作能力，分析解决问题能力的重要教学途径之一。酶联免疫吸附分析（ELISA）技术涉及有机化学、食品化学、生物化学和免疫学等综合知识内容，在食品分析学中开展ELISA综合性实验，不仅利于提高教学质量，而且能锻炼学生综合技能运用能力。

1 ELISA综合实验在教学中开展的意义

酶联免疫吸附分析技术是一种固相免疫分析方法，因其具有灵敏、快速、特异性强等特点，迅速发展，在食品安全检测领域应用越来越广泛，成为食品中小分子有害因子主要的快速筛查技术手段[1]。目前，对于食品中的农药、兽药残留，生物毒素，致病微生物等有害物质的分析，市面上已有商品化的ELISA试剂盒[2]。但本科教学极少开展ELISA教学，学生对其原理和操作了解较少，缺乏实验机会，相关知识的理解主要停留在理论教学水平。在食品专业开设ELISA实验课程，已成为一项非常必要的实验教学内容。有助于帮助学生学习对相关知识点的学习及掌握，提高学生对生物分析技术的认识，了解免疫分析技术在食品安全领域应用的优势及重要性，并锻炼学生动手能力，培养学生的综合素质。

2 ELISA实验的原理

ELISA技术是用酶标记的抗原或酶标记的抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色反应来对被测物进行定性或定量的一种免疫分析方法[3]。其原理是把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，在测定时，将受检样品（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成抗原抗体复合物，用洗涤的方法使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与样品中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质的含量[4-5]。目前ELISA 的分类方法众多，主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法。在食品安全检测领域，竞争法为主要类型[6]。检测原理示意图见图1。

3 实施过程及具体实验步骤

根据笔者的教学经验，该综合性实验约需教学时数，10～12学时，具体操作过程如下。

（1）带教老师讲述ELISA的原理，应用及注意事项。

（2）通过观看酶联免疫吸附实验操作视频，了解整个实验流程及操作要点。

（3）将学生分组，每组3人，开展ELISA综合实验。

（4）实验操作结束，带教老师与学生共同讨论分析实验结果。

具体的实验操作步骤如下：

以测定牛奶和鱼肉中的氯霉素为例，采用酶标抗原的直接竞争法，介绍本实验具体实验步骤。

（1）包板：将抗体用包被液稀释一定的倍数，加入96孔酶标板中，100 μL/孔。37 ℃孵育，过夜。

（2）封板：洗板两次，加入封闭液120 μL/孔，37 ℃孵育，3小時。

（3）样品前处理：封板时，分别对样品牛奶和鸡肉进行前处理。

（4）烘干：将封闭好的板倒掉封闭液，37℃烘干。

（5）加样：加标准品/样本50 ?L/孔，然后加入酶标记物50 ?L/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，37 ℃条件下反应30 min。

（6）显色：洗板4～5次，每次浸泡30s，拍干。每孔加入底物缓冲液50 ?L，再加底物液50 ?L，轻轻振荡混匀，37 ℃或室温环境避光显色10 min。

（7）测定：每孔加入终止液50 ?L，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处测定吸光度值。

（8）结果判定：以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ng/mL）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。

4 结语

ELISA实验是一个综合性实验，涉及到有机化学，食品化学，生物化学以及免疫学等方面的相关知识。因此，学生通过本实验，可以取得以下效果：（1）巩固理论知识，加强对相关知识的理解，并对该技术在食品安全检测领域的重要性有一定的认识。（2）结合视频及具体实验操作，了解整个实验的操作流程。（3）学生之间分组进行实验，加强相互协作及团队意识。

在食品科学与工程、食品营养、食品质量与安全、生物工程等专业的食品分析实验课中，我们为部分同学开设了ELISA综合实验，检测过的对象包括氯霉素、盐酸克伦特罗、三聚氰胺、和孔雀石绿等。本实验内容丰富充实，实验现象生动有趣，深受学生的欢迎。

参考文献

[1]何紫薇，郭琦.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].生物科技与医药卫生，2011（11）：71-72.

[2]李明尧.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].中国医药指南，2012，10（35）：380-381.

[3]王守法，阚春月，许学书.酶联免疫吸附试验在食品检测中的应用[J].食品科学，2009，30（23）：489-492.

[4]孙太凡.酶联免疫吸附分析技术在农药残留分析中的应用[J].安徽农业科学，2010，38（22）：11981-11983.

[5]Yu-Dong Shen， Xing-Fei Deng， Zhen-Lin Xu，et al. Simultaneous determination of malachite green，brilliant green and crystal violet in grass carp tissues by a broad-specificity indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytica Chimica Acta， 2011，707（1/2）：148-154.

定量酶联免疫吸附法 第3篇

关键词：丙型肝炎,ELISA,抗-HCV,RFQ-RT—PCR,HCV RNA

近几年来, ELISA联合RFQ-RT-PCR检测HCV在临床大量应用[1]。本文采用此方法平行检测152例怀疑为丙型肝炎患者血清HCV, 为探讨其临床诊断意义, 现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本

来源2010年3月1日至2011年2月28日, 采集本院门诊和住院l52份临床怀疑丙型肝炎的血清标本, 每天以ELISA法检测抗-HCV, 保留血清标本-70℃, RFQ-RT-PCR法检测HCV RNA。

1.2 方法

ELISA法试剂为上海科华公司产品, 操作严格按试剂盒说明书进行, 试剂盒由重庆远大生物工程有限公司提供, 酶标仪为安图2010。RFQ-RT—PCR法:HCV RNA试剂盒为PCR试剂是深圳凯杰公司产品, 操作严格按试剂盒说明书进行, 仪器为德国Roche公司Lightcycler实时荧光定量PCR扩增仪, 反应结束后, 由电脑自动分析计算HCV RNA定量结果, 结果以IU/mL表示, 结果判定:≥103IU/mL为阳性, <103 IU/mL为阴性。

1.3 统计学处理

采用EXCELL统计软件, 计数资料用χ2检验, P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 慢性丙型肝炎患者抗-HCV检测及HCV RNA定量检测结果

见表1。

3 讨论

丙型肝炎是一种严重危害人类健康的病毒性肝炎, 由于起病隐匿, 大多数感染者无明显的临床症状和体征, 需依赖实验室检查明确诊断[2,3,4]。临床上实验室诊断主要应用ELISA联合RFQ-RT-PCR检测HCV, 此方法具有较好的灵敏性及特异性。

本次检测 (表1) 结果显示, 152例可疑丙型肝炎患者抗-HCV阳性率为77.63% (118/152) , 抗-HCV+HCV RNA (联合) 检测HCV阳性率86.84% (132/152) , 漏诊率为9.21% (14/152) 。其原因是由于部分患者处于窗口期, 机体未产生相应抗体, 部分患者合并艾滋病或者患者机体的免疫功能低下不能产生相应的免疫应答, 而未产生抗体, 或者产生的抗体过少, 而检测不到抗体[5]。而有73.68% (112/152) 的患者HCV RNA含量高于检测下限, 抗-HCV+HCV RNA (联合) 检测HCV阳性率86.84% (132/152) , 漏诊率为13.16% (20/152) 。分析其原因是因为部分病例经过一段时间的抗病毒治疗, 病毒复制减弱或停止, 血清中已无HCV RNA存在或病毒载量极低, 定量PCR也无法检出[6]。而应用ELISA联合RFQ-RT-PCR检测HCV, 大大提高了HCV感染的检测准确性。为临床早期准确诊断丙型病毒肝炎、监测病情、观察疗效提供了有力的依据。

注:1 5 2例可疑丙型肝炎患者抗H C V阳性率为7 7.6 3% (118/152) , 73.68% (112/152) 的患者HCV RNA含量高于检测下限;两组经χ2检验没有统计学意义 (χ2=0.6 4 3 0 1, P>0.05) 。抗-HCV+HCV RNA (联合) 检测HCV阳性率86.84% (132/152) 。联合检测阳性率明显高于单独检测组 (χ2=4.41363, 8.30601, P<0.05)

参考文献

[1]丁柳, 周易, 宋兴勃, 等.HCV RNA载量与肝脏组织损伤的关系[J].中国实验诊断学, 2011, 15 (3) :481-483.

[2]许敏, 聂静敏, 胡凤玉, 等.两种实时荧光定量聚合酶链反应检测血清HCV-RNA的比较[J].中华传染病杂志, 2011, 2 (7) :410-412.

[3]林铁军.莆田市无偿献血人群HCV感染情况调查分析[J].临床输血与检验, 2009, 11 (1) :67-69.

[4]李金明, 熊德琴.实时荧光定量检测HCV RNA含量的临床价值[J].中国医药指南, 2009, 7 (18) :51-52.

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定量酶联免疫吸附法 第4篇

1 原理与方法

1.1 基本原理

游离的黄曲霉毒素和酶连接物竞争黄曲霉毒素抗体结合位点, 同时黄曲霉毒素抗体也与微孔板上固定的捕获抗体结合。结合的酶连接物将发色剂转化为蓝色。加入反应终止液后颜色由蓝色转变为黄色。在450 nm处测量, 吸光度值与黄曲霉毒素浓度成反比。方法原理标准曲线见图1。

1.2 操作方法

1.2.1 样品处理

采集代表性样品粉碎、混合, 称量并加入70%甲醇溶液, 振荡3分钟, 过滤得提取物;用蒸馏水或去离子水稀释待测。

1.2.2 检测操作

选用R-Biopharm黄曲霉毒素B1检测试剂盒, 采用竞争性酶联免疫法定量测定含量。经加样孵育显色终止完成点板。15分钟内于450nm处测量吸光度值并计算浓度。

2 结果与讨论

2.1 仪器的质控

2.1.1 移液器

ELISA加样量小 (5~100μL) , 移液器准确性直接影响实验结果, 一般误差应在±10%以内;注意保养, 定期校正。

2.1.2 酶标仪

经常维护其光学部分, 防止滤光片霉变, 定期检测校正。使用前确定酶标仪是否可正常使用并预热。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001, 准确性为±1%, 重复性达0.5%。

2.2 操作过程的影响因素

将所有试剂和酶标板回温到室温 (20~25℃) 后再应用, 否则 (OD) 值整体偏低。剩余板条放回铝箔袋中, 保留干燥剂, 封口低温保存, 否则可能导致再使用时吸光度过低。

加样时枪头避免接触孔内试剂, 避免产生气泡、样液溅到孔壁或溅出微孔造成不必要的非特异性吸附或损失。混匀反应液:平握酶标板框, 用另一只手的手指轻轻地敲打酶标板的边框, 产生的微振使孔中的反应液混合均匀, 或将酶标板水平放置在实验台上, 手握板框, 慢慢地做圆周运动。

孵育过程中保持酶标板水平放置, 建议盖上酶标板。

洗板应确保每孔所加洗涤液量的均一, 过多易溢出会造成污染;过少则达不到洗涤的效果, 造成花板。洗板甩出酶标板孔中液体时要快而干脆, 不可让孔中液体流到其他孔中或滞留在板中。使用吸水纸拍干并及时更换避免交叉污染。不可让反应的板孔干燥空置时间过长。

显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。温度和时间力求准确。底物液受光照变色, 应避光在暗处进行。

表1回收率和相对标准偏差

测量室温宜在15~30℃, 仪器预热15~30分钟, 测读更稳定。选取450nm单波长条件进行板孔的吸光度值测量。测量的酶标板孔底不得用手触摸, 不得附着液体和油污等。

2.3 影响因素

2.3.1 p H值

样品p H值对结果图1酶联免疫吸附法原理标准曲线

有影响:当p H<4时结果显假阳性;当p H>8时结果偏为假阴性。研究表明, p H值低时酶的活性受到抑制, 导致显色时颜色偏浅, 结果出现假阳性;p H值高时, 酶的活性受到一定的激活作用, 出现假阴性。

2.3.2 蛋白质和脂肪含量

样品中蛋白质和脂肪含量过高可引起高背景干扰, 会造成假阳性结果。

2.3.3 金属离子含量

金属离子含量过高影响抗原抗体的结合反应, 会造成假阳性。实验表明, 当Fe3+浓度超过0.1mg/m L时, 对酶的影响显著增强, 0.2mg/m L以上时呈假阳性, 因此, 最终待测样品提取液中Fe3+含量的不应超过0.1mg/m L。Cu2+对ELISA测定也有一定影响:浓度小于1.0 mg/m L时, 影响在可接受的范围之内;大于5.0 mg/m L时, 影响趋于稳定。

2.4 方法分析

与高效液相色谱法对比, 相关性良好:ELISA法和HPLC法相对误差平均值为4.85%。同时做加标回收试验, 见表1。采用ELISA方法测定黄曲霉毒素B1, 结合分析测试中测量不确定度及评定的方法程序, 对测定过程中重复测量、工作曲线拟合、电子天平、酶标仪等引入的不确定度分量进行评定, [3]计算出黄曲霉毒素B1的合成不确定度为8.5710-2, 有效自由度为5, 扩展不确定度为0.22。结果表示为 (9.69±0.22) μg/kg。ELISA法比HPLC法操作简便快捷, 回收率较理想。

3 结论

通过对酶联免疫吸附法测定粮食中AFB1中相关因素的研究探讨, 及对各种干扰情况的了解, 使分析方法标准化, 结果更准确, 确保能有效完成粮食样本中的黄曲霉毒素的检测。

参考文献

[1]王海花, 汪德刚, 张晓峰.黄曲霉毒素检测技术的研究进展[J].食品研究与开发, 2006, 27 (4) :176-178.

[2]Wogan GN.Aflatoxin as a human carcinogen[J].Hepatolo-gy, 1999, 30 (2) :573-575.

定量酶联免疫吸附法 第5篇

关键词：化学发光法,酶联免疫吸附法,人类免疫缺陷病毒

获得性免疫缺乏综合征简称艾滋病(AIDS),是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起的一种严重传染性疾病。酶联免疫吸附法(Elisa)最早应用于艾滋病毒的筛查,1985年研制成功的第一代HIV Elisa试剂[2]敏感性和特异性欠佳,至今已发展至第四代。Gag基因编码HIV病毒核心蛋白包括p17、p24、p15[3,4,5,6,7],P24在血清转换的很短时期内就可以被第四代试剂检测出来,因此第四代HIV Elisa试剂将检测的“窗口期”从三代的22天左右减少到16天左右[8]。

化学发光法(CLIA)的主要原理[9]是将酶免疫发光物质标记在抗原或抗体上,加入氧化剂或酶底物而发光,通过标准曲线测定发光强度来确定待测物的含量。本实验将化学发光法和酶联免疫吸附法两种检测方法进行对比评价。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集

本院2014年3月至2015年9月期间所有术前检查病人共计35420例,年龄10~89岁,其中男性24003例,女性11417例。

1.2 试剂

HIV抗原抗体联合检测试剂盒(上海恒远科技有限公司),化学发光酶免试剂(北京科美东雅生物技术有限公司),人类免疫缺陷病毒(HIV1+2型+p24)抗体免疫印迹试剂盒(简称WB,新加坡Genelabs)。

1.3 方法

1.3.1 Elisa法检测HIV病毒

Elisa检验血清HIV抗体采用双抗原夹心法。包被:将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/m L,在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1m L,4℃过夜。第二天,弃孔内溶液,缓冲液洗涤;加样:加待检样品于上述反应孔中,置37℃孵育1h(同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔);加酶标抗体:在各反应孔酶标抗体37℃孵育1h,缓冲液洗涤;加底物液显色:向各反应孔中加TMB底物溶液,37℃10min;终止反应:于各反应孔中加入硫酸。

1.3.2 CLIA法检测HIV病毒

CLIA法检验模式为双抗原夹心一步法免疫分析,借助于HIV(1+2)抗原制作出固相抗原,并将HIV(1+2)抗原采用辣根过氧化物酶进行标记,由此和待测样品中的HIV抗体两者就可以形成双抗原夹心,洗涤之后,将化学发光底物液加入其中,测定其发光值。

1.3.3 免疫印迹检测法(WB)检测HIV病毒

HIV进行培养、浓缩、纯化;HIV抗原在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照分子量大小而分离;将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上,将其切割成包含全部病毒蛋白的按照分子量大小排列的条膜;在反应槽中加待测样品与条膜孵育,洗涤;加辣根酶标记的二抗;加显色试剂。

1.4 判断标准

化学发光法:S/CO≥1.00为阳性,<1.00为阴性;Elisa法按照说明书。

1.5 确认实验

将Elisa法或CLIA法筛选的阳性病例35例进行复检,复检仍为阳性病例用免疫印迹法进行确认。WB试验阳性的判为HIV感染;若为阴性,判为未感染HIV;若WB试验为可疑,4周后随访复查,复查为阳性判为HIV感染,否则判为未感HIV。

1.6 统计学处理

使用SPSS11.0软件系统,计数资料进行χ2检验或Fisher’s确切概率法检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CLIA法与Elisa法检测结果

35420例术前检查病人中,用CLIA法筛检出抗-HIV抗体阳性39例,阳性率为0.110%;Elisa法筛检出抗-HIV抗体阳性29例,阳性率为0.082%。与Elisa法相比,CLIA法阳性率比较高,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 WB确认实验

从表1中可以看出,WB和CLIA均阳性为33例,CLIA真阳性率为0.093%;WB和Elisa均阳性为25例,Elisa真阳性率为0.071%。比较CLIA和Elisa两种方法,CLIA的真阳性率、假阳性率都升高。

2.3 CLIA检测不同S/CO值与W B对比结果

从表2结果可见,CLIA检测S/CO值>500时,WB确认实验均为HIV阳性;CLIA检测结果S/CO值≤500时,WB确认实验有可能为阴性;S/CO值越低,W B检测结果为阴性的可能性越大。

3 讨论

据报道[10]全球约有3亿多人携带艾滋病毒,而我国在1985年发现首例艾滋病患者,到2014年二十年时间,患病人数已经达到10.4万例,患者分布也从单一省份扩增到全国20多个省。性传播、经血传播和母婴垂直传播[11,12,13]是人类感染HIV病毒的三条途径,而血液传播是主要途径。因此早期筛查血液HIV病毒,对HIV患者的早诊断具有重要价值。

1998年Elisa第四代试剂问世,第四代Elisa试剂可以同时检测p24抗原和HIV 1+2抗体,有效缩短了“窗口期”,因此得到广泛应用。但是由于一项检测同时与病毒、抗体结合,增加了相互干扰的机会,从而降低了第四代Elisa试剂的灵敏度和特异性[14,15]。而化学发光法[16,17]作为新型的免疫学检测技术,因其灵敏度高较高。

从本实验结果来看,化学发光法的真阳性率高于Elisa法,说明化学法试剂能在HIV病毒抗体效价较低时发挥作用,检测患者HIV阳性,因此更有效避免临床漏诊现象。但是我们发现化学发光法的假阳性率也有所增加。通过对比S/CO不同区间,化学发光法的假阳性率发生在S/CO≤500并且随着S/CO值降低,假阳性率升高明显。因此在用化学发光法筛查血液HIV病毒,在S/CO值比较低时,应注意对此病例的复检,同时加做WB,避免假阳性的情况出现。

定量酶联免疫吸附法 第6篇

1资料与方法

1.1 一般资料

以2011年5月至2012年1月期间来我院就诊的74例乙肝患者为研究对象。年龄17～51岁, 平均年龄39.4岁, 其中男49例, 女25例。清晨空腹抽取患者静脉血3 ml, 分离血清后分装, 一部分立即检测, 另一部分保存于-80℃冰箱备用。

1.2 方法

对74例患者同时应用两种检测方法检测血清学标志物。ELISA试剂盒由英科新创 (厦门) 科技有限公司提供, TRIFA试剂盒由上海新波生物技术有限公司提供。两种检测方法严格按照试剂盒及相关仪器的操作说明书进行。

1.3 统计学方法

本资料涉及计数资料, 统计分析方法为卡方检验, 统计分析软件为SPSS 10.0, 以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

本组研究结果显示, TRFIA法检测患者血清中的HBsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb和HbcAb的阳性率分别为68.9%、23.0%、12.2%、75.7%和95.9%。统计分析结果显示, TRFIA法对乙肝患者血清标志物检测的阳性率明显高于ELISA法 (P<0.05) 。详见表1。

注:*与ELISA相比, P<0.05 (χ2检验)

3讨论

乙肝血清表面标志物是检测是否携带乙肝病毒最为可靠和最为直接的证据。目前, 由于ELISA检测法具有操作简单、价格低廉等特点, 其一直是我国大部分医院最常用的检测乙肝病毒的方法之一。然而, ELISA只能对检测结果进行定性分析, 而对于血清学标志物的浓度却无法动态监测, 尤其是低水平浓度的乙肝病毒感染, 其检出率更低。此外, ELISA检测法会受到多种因素的干扰, 比如说检验师的操作手法、前带现象以及结果易污染等因素的干扰, 往往会出现假阳性或假阴性的结果, 导致漏诊情况的发生[2]。TRFIA检测法是集酶标记和同位素标记技术于一身的一种新的非放射性免疫定量检测方法。由于TRFIA检测法不仅具有灵敏度高、特异性强的有点, 而且它对结果的重复性也很好。临床上, TRFIA已经广泛应用与多种指标的检测[3]。本研究通过比较两种不同的检测方法对乙肝血清学标志物的检测结果发现, 与ELISA检测法相比, TRFIA对乙肝血清学标志物检测的阳性率明显较高 (P<0.05) 。由此进一步证实了TRFIA检测法的优越性。

综上所述, 时间分辨荧光免疫法 (TRFIA) 作为一种新的非放射免疫定量检测方法, 在检测乙肝血清学标志物中不仅具有较高的灵敏度, 一定程度上减少了乙肝病毒感染的误诊率和漏诊率, 而且可以通过定量的方法评估患者的病情及传染性, 进而为临床疾病的诊断和治疗提供了极为可靠的参考依据, 临床上值得进一步推广应用。

参考文献

[1]王跃国, 王惠民, 毛利萍, 等.MEIA法测定乙肝病毒表面抗原的评价及临床应用.现代检验医学杂志, 2004, 19 (2) :21-23.

[2]刘中国, 徐峰, 王卫, 等.时间分辨荧光免疫分析检测乙肝病毒血清标志物的临床评价.实用医院临床杂志, 2004, 1 (2) :84.

定量酶联免疫吸附法 第7篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

由2012年5月1日开始进行检测试验，对照组选用深圳爱康AE-100全自动酶免仪(深圳迈瑞BS-350全自动生化分析仪、深圳爱康全自动血型检测分析仪)作为研究仪器。试剂盒选用北京万泰公司提供的合格试剂，批号为BX20120807。于卫生部的临检中心购得1ng HBs Ag定值质控血清，血清批号为201208001。

1.2 检测方法

将检测环境温度设置为25℃左右，将所用检测仪器以及8名工作人员分别进行随机编号，仪器用代码J-1表示，实验人员标号为R1～R8，使用全自动酶免仪(全自动生化分析仪、全自动血型检测分析仪)对定值质控血清平行进行30孔检测，同时8名工作人员对血清进行30孔检测(检测均遵循试剂盒使用说明书要求)，并根据实际结果标准判定临界值说明判定检测结果的阴阳性。

1.3 统计学方法

将以上酶标读数的均数通过应用q检验(n=30)以及方差分析处理，将人工检测处的总体均数和机测获得的总体均数通过u检验获得两者的变异系数，根据相关文献计算进行出可疑区域的界定值。

2 结果

经过q检验可知，人工检测总体均数为0.2286，操作个体均数结果之间基本上无显著的区别，其中有2名实验人员的结果与其他人所测结果之间出现偏差，差异较为明显(P<0.05)。经方差分析计算操作个体检测均数，F=13.24,P<0.01，变异系数为5.2%～16.9%。而经全自动酶免检测仪检测出的结果变异系数为10.47%，总体均数为0.2145。通过M检验，可知实验组和对照组总体均数之间差异不明显(P>0.05)，无统计学意义。8名操作个体计算得出的D值范围、可疑区域的界定范围、变异系数见表1。

3 讨论

经以上研究，通过方差分析结果及q检验可知，在进行酶联免疫吸附实验检测HBs Ag中实验操作时，个体之间存在一定的差异较大，可对实验结果造成一定影响。本次试验在同一时间并且样本及使用试剂均一致，并使用同种仪器，尽量减少了因环境、仪器、试剂、设备等客观因素的干扰，以上结果的差异主要来源于实验人员操作过程中的不规范行为，对此，应通过相关规程如SOP纠正并执行[3];此外可通过仪器的校准和检测减少仪器之间的误差，从而获得最佳的检测结果。

酶联免疫吸附实验检测时样本D值常在临界值的附近，这时可能会导致检测结果出现错误，判断出假阳性或假阴性结果，为减少实验误差造成的错误判断，在接近临界值区域的一些检测值的可靠性有待观察，此时得出的酶标读数如在临界值区域附近则需再次检测。若检测结果仍不能确定，可通过核酸检测其性质。比较各样本检测数据，经统计分析，可疑区域范围在63.2%～128.9%，变异系数为5.2%～16.9%,F=13.24,P<0.01。各样本之间检测结果存在一定差异，难以得出统一的可疑区域界限。为避免物力人力的浪费，减少误差，将各操作个体区分界定有重要的意义。

摘要：目的 对酶联免疫吸附实验检测HBs Ag实验操作个体差异及可疑区域的界定进行探讨。经实验研究出准确的数据作为可疑区域的界定标准,为临床检验提供依据。为界定酶联免疫吸附实验检测HBs Ag的可疑区域提供实验数据。方法 自2012年5月1日,选取8名工作人员对样本进行30次重复性数据检测做为研究组,同时应用深圳爱康AE-100、深圳迈瑞BS-350,深圳爱康全自动血型检测分析仪对同一样本检测30次取得相关数据作为对照组,应用u检验、方差分析、q检验等统计学方法处理数据。结果 比较各样本检测数据,经统计分析,可疑区域范围的最大值在63.2%128.9%之间,变异系数为5.2%16.9%,F=13.24,P<0.01。结论 各样本之间检测结果存在差异,不能确定统一的区域界限。

关键词：酶联免疫吸附实验检测,HBs Ag,个体差异,可疑区域

参考文献

[1] 岳挺,赵美芳.酶免法检测丙肝病毒核心抗原在献血者筛查中的应用分析[J].中国保健营养(中旬刊),2013,3(3):595.

[2] 李红新,李俊武,聂希会,等.酶免法检测乙肝表面抗原实验精密度研究[J].医学检验与临床,2012,21(4):58-59.

定量酶联免疫吸附法 第8篇

1 仪器设备

1.1 移液器

因ELISA法加样量小 (一般为50～100μL) , 其准确性直接影响到实验结果, 因此, 移液器需定期校准, 一般用称量法来检查。如若使用频率比较高, 还可增加运行中的检查, 以确保加样的准确。

1.2 水浴箱温度

必须严格控制, 应在水浴箱中放置一检定合格的温度计来实时校准、监控。

1.3 酶标仪

经常维护光学部分和更换干燥剂, 防止滤光片霉变;定期检定或自校, 使仪器保持良好的工作性能。

1.4 洗板机

清洁托盘底部和轨道表面, 保持滑道顺畅和洗头对位正确;日常关机前和长期不用时, 应用蒸馏水清洗管道, 防止蛋白类物质沉积堵孔。

2 试剂

2.1 乙肝两对半试剂

不同厂家出产的试剂, 灵敏度与特异性存在一定的差别。试剂盒的选择根据同行的反馈、横向了解以及本实验室过往的使用情况, 对试剂在灵敏度、特异性、精密度、稳定性等方面进行综合评价, 选择合适的试剂。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。

2.2 需用合格试剂

试剂必须为国家食品药品监督管理局注册批准、批批检验合格, 在有效期内的试剂。

3 标本

3.1 溶血标本

标本严重溶血及混有红细胞的血清, 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净, 残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性, 催化底物显色造成假阳性, 禁用严重溶血标本。3.2塑料试管能吸附抗原物质样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空采血管。并使用非抗凝标本, 肝素抗凝血浆会增加OD值, 可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关。EDTA钠或钾盐、酶抑制剂 (如NaN3) 可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。

3.3 标本凝固不全

在工作中, 有时为了快速检测, 常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清, 使血清中仍残留部分纤维蛋白原。在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内, 使酶标记物不易洗掉, 易造成假阳 (阴) 性结果。因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清, 或标本采集时用带分离胶的采血管或用促凝管。

3.4标本保存不当

标本添加剂如抗凝剂、酶抑制剂和防腐剂等均可对检测结果产生一定影响, 因此标本应及时分离, 及时检测, 如条件不允许, 将标本置于4℃冰箱保存, 5d内检测或1周后检测需低温冻存 (-20℃) , 但不可反复冻融, 并在检测前要轻轻混匀, 不可强烈振荡。

3.5 标本中的干扰物质

常见的有类风湿因子 (RF) 、嗜异性抗体 (Id) 、补体、人抗动物抗体 (HAAA) 、药物及其导致的代谢产物和交叉反应物质等。RF、Id和HAAA等的干扰机制相似, 均为固相抗体和标记抗体之间的桥联抗原, 在夹心法中易产生假阳性。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性, 高浓度的甲胎蛋白 (如孕妇) 在储存过程中可能形成二聚体, 会导致本底过深影响检测结果。

4 操作过程的影响

4.1 试剂的准备

冰箱中取出的试剂应平衡至室温方可使用;洗涤液试验前30 min配制, 所用蒸馏水应为新鲜制备的。

4.2吸量

吸量的准确性直接影响检测结果。因此, 加样器也要经常清洗, 定期校准。加样干洗头预先在所加物中润吸2次, 加入至酶标板杯2/3以下处, 避免加在孔壁上部, 切不可产生气泡, 每次加样应更换吸嘴, 以免发生交叉污染。

4.3 温育

抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求, 酶标板周围与内部孔升降温速率不同, 造成周边与内部孔结果差异;干浴与水浴存在明显的差异, 尽可能使用水浴, 并要求固相板放入水中, 减少受热不均, 贴密封膜, 防止污物浸入。

4.4加样次序

有时我们在加样过程中, 常常会遇到个别标本未离心等情况, 为了节约时间, 往往这时我们会先加酶结合物, 然后等标本分离好后再加标本, 这样, 会造成HBeAb和HBcAb的假阴性, 因为HBeAb和HBcAb都是竞争抑制法, 先加入酶标记的抗体, 首先与固相载体上的抗原结合, 待加入显色剂后, 因酶的存在而显色, 故呈阴性。

4.5 洗涤

ELISA的洗板过程, 也是影响结果的因素之一, 洗液冲力过大会造成酶结合物丢失, 本底偏浅, 吸光度值偏低。操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况, 洗板机不用时应用去离子水清洗几遍, 否则, 血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔处于阻塞状态, 造成游离酶未洗, 导致“花板”造成假阳性或假阴性。

4.6 HOOK效应影响

当标本中抗原含量过高时, 过量抗原就会与固相抗体和酶标抗体结合产生HOOK效应, 在夹心法中会产生假阴性或使结果偏低。采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减少H0OK反应的发生。因此, 有必要对实验的原理或方法进行改进, 用“二步法”代替“一步法”有利于提高检出率, 可减少钩状效应现象;对产生后滞现象的高浓度标本 (或可疑结果标本) 需做一定稀释后检测;在ELISA定量实验时必须严格按照试剂盒提供的数据处理模式对实测数据处理。

5 环境因素

试验环境中温度、湿度等对操作过程和仪器工作状态产生一定的影响, 继而影响试验结果的准确性和复现性。因此, 有必要对实验室检测环境操作条件的温度、湿度实施严格有效控制, 一般采取空调措施, 形成适合试验的微小气候, 温度控制在20℃左右, 相对湿度控制在60%以下。还有, 避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒剂环境因素下试验。

6 质量控制

6.1 实验室室内质量控制[2]

主要监测试验结果的精密度, 是自我控制的一种方法。每块酶标板应设阴、阳性对照血清和室内质控血清, 质控血清的S/CO值必须在质控图的2S范围内, 更换不同批次的质控血清时, 质控图也要及时更换。

6.2 实验室室间质量控制

是在室内质量控制基础上进行的, 主要是控制试验结果的准确度, 实验室每年都要积极参加上级机构组织的室间质量控制。通过室间比对, 可发现室内质量控制中不易发现的不准确性, 并就存在的差异进行综合分析, 查找原因, 在提示准确性差时, 应考虑改进仪器或更换试剂。

总之, 在日常检测工作中, 检验人员一定要有高度的责任心, 要认真分析、研究影响检测结果的诸多因素, 积极采取全面的质量控制措施, 减少或设法消除误差;要注意假阴性、假阳性结果的出现, 对可疑标本一定要进行复检, 才能为临床提供正确可靠的检测结果。以有利于患者的早发现、早诊断、早治疗。

摘要：目的探讨酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测定乙肝标志物的影响因素。方法用ELJSA对乙肝病毒血清标志物进行检测。结果影响因素包括:仪器设备, 试剂, 标本, 操作过程, 环境, 质量控制等方面的诸多因素。结论在日常检测工作中, 只要检验人员具有高度的责任心, 对影响检测结果的诸多因素, 积极采取全面的质量控制措施, 减少或设法消除误差, 就可以预防假阴性、假阳性结果的出现, 为临床提供准确可靠的检测结果。

关键词：ELISA,影响因素,乙肝标志物

参考文献

[1]宋炳荣, 杜彩霞, 崔娜, 等。ELISA一步法检测乙型肝炎病毒标志物影响因素的实验研究。