磷酸化蛋白范文-盘古文库

磷酸化蛋白范文（精选7篇）

磷酸化蛋白第1篇

关键词：冷冻处理,猪精子,蛋白酪氨酸磷酸化 (PTP)

目前, 猪人工授精技术已经逐步得到广泛应用。然而, 输精后 (尤其是冷冻保存的精液) 的受胎率却很低, 这与精子的受精能力有很大关系[1]。哺乳动物精子在迅速冷却时失去活力, 称之为“冷休克”。普遍认为“冷休克”的精子与稀释的精液相比存在受精率下降的问题[2]。“冷休克”的精子受精率低的原因被认为是精子在冷却过程中受到了低温损伤[3], 这种损伤包括“获能样”变化。猪精子冷却时, 温度的变化可诱导细胞内脂质从液晶向凝胶转变, 使细胞膜的流体性提高[4], 主要的变化发生在 5～15 ℃之间[5]。因此, 将精子缓慢地冷却到 5 ℃可使细胞膜流动性增加, 这可能是由于精子形成“获能样”变化的原因。“获能样”状态的精子不需要发生获能变化就可以直接发生顶体反应[6], 但此精子在雌性生殖道内寿命很短, 这可能是导致精子受精率低的主要原因。现已证实冷却或冻融后存活的精子遭受“获能样”变化的损伤[7]。当精液温度从体温降低到接近于冰点时, 对精子具有非常严重的影响 (低温打击学说) , 而从低温恢复到体温的过程与降温对精子的打击相同, 这样精子的活力会受到温度的反复变化造成不可逆的下降。低温打击学说包含降温对细胞膜的损害和精子代谢功能的改变, 这种改变很可能是由于细胞膜的结构和组成发生重组而形成的[8]。蛋白酪氨酸磷酸化 (protein tyrosine phosphorylation, PTP) 是翻译后加工修饰过程。PTP对精子运动力的维持、精子获能、超激活运动以及顶体反应等生理过程十分重要, 这在小鼠、人和其他许多物种上均有报道[9]。

试验主要研究冷冻处理对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响, 为冷冻精子在受精过程中蛋白质动态变化的分子机制研究奠定基础。

1 材料

1.1 样本采集及处理

试验采用的猪精液由韩吉牧业有限公司提供。将当日采集的新鲜精液2 h内带回实验室。精液取回后, 静置30 min, 500 r/min离心5 min, 弃上清液, 选取活力较高的精子进行试验。

1.2 药品

葡萄糖、NaCl、卵黄、甘油、青霉素、链霉素、柠檬酸、PBS、三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 、一抗 (抗酪氨酸磷酸化单克隆抗体) 、二抗 (Rhodamine 标记羊抗兔IgG) 、MEDTA, 均购自Sigma公司。

2 方法

2.1 精液的冷冻程序

精液的预处理:精液采集完成后, 采用标准的实验室方法, 利用显微镜评价精液特性。只有精子活力大于75%, 顶体完整率超过80%的精子才能用于试验。在室温静止0.5 h后, 将精液置于运转的离心机内, 500g离心10 min, 弃全部精清, 按1∶1比例加入等量等温的常温保存液后重悬, 12～15层纱布包裹使其缓慢降至室温后, 平衡备用。

精液的浓缩:将精液放入离心机内, 800g离心10 min。

精液的冷冻:将经过离心后浓缩的精液用冷冻基础液按2∶1比例稀释[使甘油的最终浓度为3%, 调整精子密度为 (1.5～2.0) 109/mL], 将稀释后的精液轻轻混匀, 装管 (0.25, 0.5 mL细管) 。首先放入程序冷冻仪以1 ℃/min的速率从5 ℃缓慢降至-5 ℃, 迅速取出置于液氮上方3 cm处熏蒸10～20 min, 同时用超低温温度计测量温度, 于-120 ℃左右时投入到液氮中。

精液的解冻:将细管从液氮中取出, 迅速投入37 ℃的水浴中, 解冻45 s, 待其解冻后, 擦干细管上的水珠, 剪断封口粉的一端, 然后检测精液的质量。

精子质量参数的测定:精子活率、平均路径速度 (VAP) 、精子运动的线速度 (LIN) 、平均侧摆幅度 (ALH) 和平均鞭打频率 (BCF) 的测定采用计算机辅助精液分析法 (computerassisted semen analyzer, CASA) 进行检测。

2.2 间接免疫荧光法

冷冻解冻的精子, 调节精子密度至200/mL, 3.7%甲醛固定液 (甲醛与Tris-HCl的比例为8∶1, pH值为7.4) 固定30 min, 用PBS冲洗;一抗 (抗酪氨酸磷酸化单克隆抗体: PBS与0.1% Tween-20的比例为1∶50) 室温孵育1.5～2.0 h, 再用PBS冲洗;二抗 (Rhodamine 标记羊抗兔IgG: PBS与0.1% Tween-20的比例为1∶100) 孵育20～30 min, 再用PBS反复冲洗后盖上盖玻片, 无色指甲油封片;试验在避光条件下进行, 荧光显微镜下观察, 并根据发生酪氨酸磷酸化蛋白的分布统计精子数。

2.3 统计分析

采用SPSS 14.0统计软件对试验数据进行分析, P<0.05表示差异显著。

3 结果与分析

3.1 不同冷冻时间对精子质量参数的影响 (见表1)

注:同行数据肩标字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 字母相同表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表1可知:冷冻处理0 h各精子质量参数与其他冷冻时间相比差异显著 (P<0.05) , 但是各冷冻处理组之间精子质量参数差异不显著 (P>0.05) 。

3.2 冷冻解冻处理后精子间接免疫荧光结果 (见图1)

由图1可知:A表示未经任何处理的精子, 精子颈部有不明显荧光显色;B表示经冷冻处理6 h后解冻的精子, 可见精子尾部有明显荧光, 精子颈部荧光也较A明显;C表示经冷冻处理12 h后解冻的精子, 与B相比没有明显差异, 精子尾部和颈部荧光显色明显;D表示经冷冻处理24 h后解冻的精子, 精子颈部荧光显色明显, 尾部也有显色, 但与B和C相比染色程度较淡;E表示经冷冻处理48 h后解冻的精子, 精子颈部显色明显, 头部出现荧光显色, 尾部也有少许荧光显色。

3.3 荧光显微镜下冷冻解冻处理的精子显色部位变化曲线 (见图2)

由图2可知:冷冻处理的精子, 其显色位点大多集中在精子颈部;冷冻处理12小时时, 精子颈部荧光显色的精子数最多, 随着处理时间的增加, 精子颈部荧光显色的精子数逐渐降低。精子尾部发生荧光显色的精子数也是在处理12小时时最多。而在顶体部发生荧光显色的精子很少, 且没有发现大的差异。

4 讨论

试验选取了卵黄与甘油作为冷冻保护剂对猪精子进行冷冻处理, 试验结果表明, 这2种物质能够降低精子受低温的损伤。在试验过程中, 冷冻处理后的精子染色成功率显著比未经处理的精子低, 这也间接地证明了冷冻处理会对精子造成损伤。从染色的结果来看, 精子PTP位点主要集中在精子颈部, 这与之前的研究结果不同。Lewis B等[10]研究表明, 精子尾部是精子发生PTP的主要部位, 他们发现人、猴、仓鼠、大鼠、马以及小鼠的精子尾部皆有酪氨酸磷酸化分布。然而猪精子PTP位点主要出现在精子颈部, 这可能是由于物种不同造成的;而冷冻处理后的猪精子颈部的PTP位点更加明显。同时, 也发现冷冻处理后的精子尾部也出现了PTP位点, 这可能是因为解冻后的精子恢复了活性, 精子超激活运动恢复, 且超激活运动过程是精子发生PTP的过程, 所以出现这种结果。而冷冻处理后的精子经染色后, 在精子顶体部很难发现PTP位点。造成这种现象的可能性有三种:一是精子在冷冻过程中顶体膜遭到破坏, 造成顶体部蛋白损失;二是冷冻解冻处理后的精子未经过获能, 进而顶体部蛋白没有发生酪氨酸磷酸化反应, 这种结果的出现证明获能处理能够使精子酪氨酸磷酸化蛋白发生酪氨酸磷酸化反应, 也说明顶体部蛋白的酪氨酸磷酸化是精子获能的一个必要步骤;三是精子顶体部的酪氨酸磷酸化蛋白由于冷冻的原因而出现去磷酸化现象。这个结果与之前对精子PTP的研究结果相一致。

精子在冷冻过程中, 会产生一种“获能样”的精子, 这种状态的精子与体外获能的精子在许多地方大体一致。然而这种状态的精子并不能使精子真正的获能, 这也是冷冻后精子受精率低的原因之一。冷冻处理后的精子, 其PTP水平不高, 主要的酪氨酸磷酸化部位集中在精子颈部, 与未经处理的精子大体相同;而获能处理的精子, 其PTP水平明显, 精子的顶体部、颈部、尾部主段均出现PTP。而且现已经证明, 精子蛋白的酪氨酸磷酸化正是精子获能的一个重要依据。所以, 试验从精子PTP水平的角度再次证明了“获能样”精子并没有真正意义上的获能, 为探讨猪精子冷冻损伤的分子机理奠定了基础。

5 结论

冷冻处理对猪精子PTP水平的影响不明显, 位点主要集中在精子颈部, 尾部也有微弱的PTP位点出现, 顶体部几乎没有PTP位点出现。

参考文献

[1]BAUMBERJ, SABEURK, VOA, et al.Reactiveoxygen speciespro-mote tyrosine phosphorylation and capacitation in equine spermatozoa[J].Theriogenology, 2003, 60:1239-1247.

[2]WABERSKI D, WEITZE K, GLEUMES T, et al.Effect of timeof in-semination relative to ovulation on fertility with liquid and frozen se-men[J].Theriogenology, 1994, 42:831-840.

[3] BAILEY J, BILODEAU J, CORMIER N. Semen cryopreservation in domestic animals: a damaging and capacitating phenomenon[J]. J Androl, 2000, 21:1-7.

[4]DeLEEUW F E, CHEN H C, COLENBRANDER B, et al.Cold-in-duced ultrastructural changes in bull and boar sperm plasma mem-branes[J].Cryobiology, 1990, 27:171-183.

[5] DROBNIS E Z, CROWE L M, BERGER T, et al.Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model[J]. J Exp Zool, 1993, 265: 432 -437.

[6]GILLAN L, SKOVGOLD K, WATSON P F, et al.Fate and function-al integrity of fresh and frozen-thawed ram spermatozoa followingintrauterine insemination[J].Fertility and Development, 1999, 11:309-315.

[7]WATSON P F.Recent developments and concepts in the cryopreser-vation of spermatozoa and the assessment of their post-thawingfunction[J].Fertility and Development, 1995, 7:871-891.

[8]GUTHRIE H D, WELCH G R.Impact of storage prior to cryopreser-vation on plasm membrane function and fertility of boar sperm[J].Theriogenology, 2006, 63:396-410.

[9]MITRA K, RANGARAJ N, SHIVAJI S.Novelty of the pyruvate met-abolic enzyme dihydrolipe amide dehydrogenase in spermatozoa:cor-relation of its localization, tyrosine phosphorylation and activity dur-ing sperm capacitation[J].Biol Chem, 2005, 280 (27) :25743-25753.

磷酸化蛋白第2篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

自2007年1月~2011年12月本院共收治MCI患者32例 (MCI组) , 其中男20例, 女12例;年龄51~80岁, 平均67.3岁。同期收治AD患者30例 (AD组) , 其中男19例, 女11例;年龄55~84岁, 平均71.4岁。此外, 以45例正常老年人作为参照 (对照组) , 其中男26例, 女19例;年龄50~81岁, 平均69.6岁。纳入的各组研究对象均伴有基础疾病, 如高血压、糖尿病、慢性呼吸系统疾病等, 差异无统计学意义, 各组间具有对比性。

1.2 诊断标准

MCI诊断标准[2]: (1) 主诉有记忆减退; (2) 有记忆减退的客观检查证据 (记忆下降的程度以低于年龄和教育程度匹配的对照1.5标准差以上为定量标准) ; (3) 一般认知功能和日常生活能力保留;简易精神状态检查表 (MMSE) 分数≥24; (4) 没有足够的损害以诊断为痴呆, 以临床痴呆评定量表 (clinical dementia rating, CDR) 评分0.5为准。AD诊断标准[3]: (1) 符合美国国立神经病、语言障碍和脑卒中研究所———老年性痴呆及相关性疾病协会的“很可能AD”的诊断标准; (2) 简易智能状态检查量表 (MMSE) 评分<24分; (3) Hachinski缺血指数量表评分<4分; (4) 根据临床表现, 详细的神经、精神检查, 经头颅CT或MRI检查和相关的实验室检查排除其他中枢神经系统以及其他系统和物质原因等所致痴呆患者。

1.3 检测方法和随访

按照上述诊断标准纳入各组的研究对象, 在入组后完成神经系统检查以及完善各项相关辅助检查, 如血常规、肝肾功能、电解质和空腹血糖等指标以及影像学检查。空腹采集受检者静脉血5 m L, 置于不抗凝聚丙烯管中30 min自然凝固后, 于4℃低温以3 000 r/min离心15 min后取血清, 置-80℃冰箱备测。实验前将标本置室温复溶混匀后使用。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测血清中磷酸化tau蛋白的水平, 试剂盒购于比利时Innogenetics NV公司, 检测方法严格按照操作规范与流程。

本研究随访MCI组患者进展为AD的概率:分别于确诊为MCI后的第1年末和第2年末统计进展为AD的病例数, 并计算出转化率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0进行统计学分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 两组间比较用t检验, 多样本均数的比较用单因素方差分析, P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

纳入该研究患者的一般资料 (性别、年龄以及伴发基础疾病等) 3组间无明显差异, 不具有统计学意义。在行腰椎穿刺术前, 各组间的血常规、肝肾功能、电解质和空腹血糖等指标差异无统计学意义。

2.2 血清中磷酸化tau蛋白含量检测

各组血清中的磷酸化tau蛋白水平经ELISA检测, 结果见附表。正常老年人血清中的磷酸化tau蛋白水平相对较低。与其相比, MCI组和AD组血清中的磷酸化tau蛋白水平显著升高, 且差异具有统计学意义 (均P<0.05) 。尽管AD组的磷酸化tau蛋白高于MCI组, 但差异不具有统计学意义 (P>0.05) 。见附表。

2.3 MCI患者进展为AD的转化率

在随访的32例MCI患者中, 第1年末有4例进展为AD, 比例为12.5%;第2年末新进展为AD患者7例, 累计11例, 比例为34.4%。

注:†与对照组比较, P<0.05

3 讨论

由于AD发病机制目前尚不明确, 临床上没有相应的特异性治疗, 治疗的主要原则为早发现、早诊断、早期药物干预, 以减轻症状并提高生活质量, 尽量延缓病情进展。AD脑内病理学的变化与临床症状在时间上分离, 即症状的出现晚于病理学的改变[4], 这就导致在出现症状后再进行干预, 效果往往不够理想。故能否早期诊断对病情的发展起决定性作用。

神经元纤维缠结 (NFTs) 为AD的重要病理特征之一, NFTs的主要成分即为tau蛋白。在病理状态下, 与神经元轴突中的微管结合的tau蛋白过度磷酸化, 形成双股螺旋细丝, 使微管失去了在神经元中的物质转运功能, 沉积在细胞内形成NFTs[1]。有观点认为几乎所有MCI均有AD的神经病理特征, 同时最轻症AD也几乎总是有神经病理的改变[5]。早期的临床病理研究证实, AD患者的痴呆症状主要与脑内磷酸化tau蛋白含量有关。也有研究证实正常老年人的神经元纤维缠结明显少于AD患者[6]。故检测血清磷酸化tau蛋白表达水平显得尤为重要。本研究结果显示, 患者于MCI阶段已经出现血清中磷酸化tau蛋白水平较正常老年人明显增高, 且增高水平与AD患者无明显差异。所以无论患者处于MCI阶段或者AD阶段, 血清中磷酸化tau蛋白水平都可以作为一个诊断性指标辅助诊断或筛选MCI和AD, 尤其对于早期AD患者, 越早诊断疾病, 则越早采取干预措施, 患者收益也就越大。

有多项研究表明, MCI患者随年龄的增加其AD发病率也随之增加。有数据显示, 10%~15%的MCI患者在1年后发展为AD, 且约有三分之二的AD患者是由MCI转变而来[7]。本研究结果提示, 32例MCI患者中, 第1年末有4例进展为AD, 比例为12.5%, 与上述数据吻合;第2年末AD患者累计11例, 比例为34.4%, 呈现增高趋势。故积极利用血清中磷酸化tau蛋白水平辅助早期诊断AD具有重要临床意义。

血清中磷酸化tau蛋白水平亦在AD患者MCI期就出现升高, 显著高于正常老年人, 可用于AD的早期筛查或诊断, 亦利于早期干预MCI期患者进展为AD。此外, MCI患者逐渐进展为AD, 且随时间延长而转化率增加。

参考文献

[1]高欣, 高芳堃.轻度认知障碍的生物学标志[J].中国老年学杂志, 2009, 29 (11) :2834-2836.[1]GAO X, GAO FH.Biological marker of mild cognitive impairment[J].Chinese Journal of Gerontology, 2009, 29 (11) :2834-2836.Chinese

[2]ZETTERBERG H, PEDERSEN M, LIND K, et al.Intra-individual stability of CSF biomarkers for Alzheimer's disease overtwo years[J].J Alsheimers Dis, 2007, 12 (3) :255-260.

[3]赵荷剑, 李郭飞, 郭亚, 等.脑脊液Tau蛋白及β淀粉样蛋白水平对阿尔茨海默病和轻度认知障碍诊断的意义[J].中国实用神经疾病杂志, 2010, 13 (6) :26-28.[3]ZHAO HJ, LI GF, GUO Y, et al, Significance of Tau protein andβamyloid protein levels in cerebrospinal fluid to mild cognitive impairment and Alzheimer's disease[J].Chinese Journal of Practical Nervous Diseases, 2010, 13 (11) :26-28.Chinese

[4]庄海, 邹海强, 徐武华.阿尔茨海默病早期生物学诊断标志物研究进展[J].中华神经医学杂志, 2013, 12 (3) :314-317.[4]ZHUANG H, ZOU HQ, XU WH.Recent advance in early diagnostic biomarkers of Alzheimer's disease[J].Chin J Neuromed, 2013, 12 (3) :314-317.Chinese

[5]陈晓红, 王荫华.轻度认知功能损害———AD的极早期阶段[J], 中华神经科杂志, 2002, 35 (6) :274-376.[5]CHEN XH, WANG YH, Mild cognitive impairment——early stage of AD[J].Chin J Neurol, 2002, 35 (6) :374-376.Chinese

[6]章正, 罗焕敏.阿尔茨海默病发病机制中相关因素的研究进展[J].中华老年医学杂志, 2011, 30 (3) :256-259.[6]ZHANG Z, LUO HM.Alzheimer's disease research progress of relevant factors in the pathogenesis[J].Chin J Geriatr, 2011, 30 (3) :256-259.Chinese

磷酸化蛋白第3篇

1 材料与方法

1.1 慢性间歇低氧模型的建立及分组

采用随机数字表法将60只Wistar大鼠随机分成正常组(UC组)、CIH组。每日于相同时间,将CIH组大鼠置于有机玻璃饲养箱内,首先,给予氮气30 s(氧浓度低至5%),流速压力为0.15 MPa;其次,注入空气40 s(恢复氧浓度至21%),流速压力控制在0.8 MPa;再次,继续注入空气50 s(氧浓度维持在21%),流速压力0.8 MPa,使低氧箱内氧浓度在5%~21%间形成周期交替,每120 s为1个循环周期,造成间歇低氧条件。将UC组大鼠每日于相同时间置于与5%CIH组相同的有机玻璃饲养箱内,持续注入空气120 s,流速压力为0.8 MPa,氧气浓度维持在21%。两组大鼠生活条件及饲养条件相同。两组分别在建立模型的3、7、14、21和28 d随机选取6只大鼠处死备用。

1.2 方法

各组大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,开胸暴露心脏和双肺。室温肝素生理盐水经左升主动脉将心脏血液快速冲洗干净,取出双肺,再次用生理盐水冲洗2遍后,将左侧肺浸入4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋、切片,用于HE染色及免疫组织化学法染色;将右侧肺组织置入-80℃冰箱冷冻保存,用于逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测CHOP m RNA。

1.3 病理形态观察

4%多聚甲醛固定肺组织,常规石蜡包埋、切片,经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,光镜下观察病理形态变化。

1.4 免疫组织化学法检测各组肺组织p-PERK、CHOP蛋白的表达

分别于3、7、14、21和28 d的两组大鼠中随机抽取2张切片,经3%过氧化氢溶液浸润10 min去除内源性过氧化物酶,按照免疫组织化学法试剂盒说明书进行操作。运用Motic医学图像分析系统对结果进行分析,以每张切片的积分光密度值(integral optical density,IOD)代表蛋白相对表达水平,每张切片在×200镜下随机选取5个视野,检测IOD值,取平均值作为样本。

1.5 RT-PCR法检测CHOP m RNA的表达

CHOP基因引物序列的设计与合成由上海生物工程有限公司完成。于冰上取冻存的右侧肺组织,每份样本约30 mg,严格按照RNA提取试剂盒(日本Ta Ka Ra公司)提取m RNA,并检测其浓度,将提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳判断所提取的RNA有无降解,根据逆转录试剂盒(日本Ta Ka Ra公司)合成c DNA,再按照扩增试剂盒(Ta Ka Ra)操作步骤进行扩增,CHOP c DNA正反向引物各取0.4μl(其中正向引物为:5'-CTTCTCTGGCTTGGCTGACT-3',反向引物为:5'-TCCCTTGGTCTTCCTCCTCT-3'),之后一次添加产物片段,c DNA模板2.0μl、ROX1 0.4μl以及荧光(避光)10μl,将以上混合物按照以下条件进行扩增:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60℃退火31 s,共40个循环。分别得到扩增曲线、熔解曲线及待测样本表达量,应用Rotor-Gene 3000分析软件判断熔解曲线特异性及扩增曲线是否为阳性;采用2-△△ct相对定量分析法计算两组CHOP m RNA的相对含量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较用单因素方差分析,若方差齐则用两两比较t检验,用Pearson相关性分析法分析p-PERK与CHOP表达的关系,P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠肺组织病理形态的变化

CIH组大鼠肺组织水肿,肺泡间隔增宽,部分肺泡融合成较大的含气囊腔,肺泡腔可见出血和蛋白渗出物,毛细血管床可见炎症细胞浸润;与CIH组比较,UC组无明显病理变化。实验结果说明慢性低氧环境可造成大鼠肺组织损伤。见图1。

2.2 免疫组织化学法检测两组大鼠肺组织p-PERK、CHOP蛋白表达的变化

光学显微镜下观察阳性细胞,阳性细胞胞浆呈棕黄色或浅黄色。UC组仅见少量散在阳性表达,CIH组阳性细胞表达明显增多,主要集中在肺泡上皮细胞。UC组各时间亚组p-PERK、CHOP蛋白的表达未见明显差异;与UC组比较,CIH组各时间点p-PERK、CHOP蛋白表达IOD值均高于UC组(P<0.05)。pPERK、CHOP蛋白表达IOD值均随间歇低氧时间延长呈逐渐上升趋势,其中p-PERK蛋白表达28 d最高,而CHOP蛋白表达21 d最高,21与28 d比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果说明,慢性间歇低氧环境可使大鼠肺组织p-PERK、CHOP蛋白表达升高。见图2、3和表1、2。

A:UC组肺组织;B:CIH组3 d肺组织;C:CIH组7 d肺组织;D:CIH组14 d肺组织;E:CIH组21 d肺组织;F:CIH组28 d肺组织

2.3 RT-PCR法检测CHOP m RNA表达的变化

UC组各时间亚组CHOP m RNA的表达未见明显变化;与UC组比较,CIH组各时间点CHOP m RNA的表达增强(P<0.05),且CHOP m RNA的表达随慢性间歇低氧时间的延长呈逐渐增强趋势,于21 d表达最高,21与28 d比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结果说明慢性间歇低氧可使大鼠肺组织CHOP m RNA的表达升高。见图4和表3。

A:UC组;B:CIH组3 d;C:CIH组7 d;D:CIH组14 d;E:CIH组21 d;F:CIH组28 d

(n=6,±s)

A:CHOP m RNA熔解曲线;B:GADPH熔解曲线;C:CHOP m RNA扩增曲线;D:GADPH扩增曲线

(n=6,±s)

2.4 大鼠肺组织p-PERK蛋白与CHOP表达的相关性分析

模型组大鼠肺组织p-PERK与CHOP蛋白表达IOD值呈正相关(r=0.937,P=0.000)。

3 讨论

OSAHS是呼吸科常见的睡眠障碍性疾病,有近4%的人受其影响,有着较高的发病率及死亡率。研究证实,OSAHS增加了神经认知性疾病、代谢性疾病及心血管疾病的发生风险[6,7]。关于OSAHS对肺组织影响的研究甚少,CIH为OSAHS独特的病生理改变,通过建立CIH模型,模拟OSAHS患者睡眠过程中的低氧状态,探讨OSAHS对肺组织的影响,实验结果显示,CIH组大鼠肺泡壁间隔增宽,部分肺泡结构破坏、融合,间质充血、水肿,同时伴有少量炎症细胞浸润,说明CIH这种独特的低氧模式可引起大鼠肺组织损伤。

内质网是细胞代谢和蛋白折叠、修饰及转运的中心场所,当细胞遭受缺氧、能量耗竭、钙超载等外界刺激时,可诱导ERS的发生[8,9,10]。ERS参与多种疾病的发生、发展过程,如神经退行性疾病、多发性硬化症及糖尿病等[11,12],目前其机制研究认为,ERS状态下,大量未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔内堆积,激活下游信号通路,引起一系列的偶联反应来应对内质网应激反应,该反应统称为未折叠蛋白反应(unfold protein response,UPR)[13]。ERS持续存在时,UPR不能缓解内质网应激状态,UPR中一些促凋亡信号通路被激活,分别为PERK、活化转录因子6、人X盒结合蛋白13条信号通路,该3条信号通路均可激活CHOP蛋白,从而诱导细胞凋亡[14,15,16]。然而目前关于ERS对CIH大鼠肺组织的影响研究较少。

PERK通路是UPR中最先被激活也是最主要的信号通路。PERK可诱导胰岛B细胞凋亡、加重神经元损伤、加重缺血再灌注损伤等[17,18]。免疫组织化学法结果提示随间歇低氧时间的延长,p-PERK、CHOP蛋白在肺组织的表达均呈现逐渐升高趋势,且两者的升高趋势一致,分别在28 d组和21 d组表达最多,21与28 d组比较表达无明显变化;同时RT-PCR结果显示CHOP m RNA表达随间歇低氧时间的延长表达逐渐升高,在21 d组表达最高,与28 d组比较表达无明显变化。实验结果说明,CIH这种特殊的低氧模式可能诱导ERS的发生,而p-PERK、CHOP蛋白的表达趋势呈正相关,进一步说明CIH大鼠肺组织损伤可能与ERS激活PERK通路,诱导CHOP蛋白高表达,从而介导细胞凋亡有相关性。

磷酸化蛋白第4篇

AD是慢性进行性认知障碍为主要表现的中枢神经退行性疾病,其典型病理变化是Tau蛋白( Tau proteins) 过度磷酸化导致的( neurofibrillary tangles,NFT) 和神经元丢失及 β 淀粉样蛋白( amyloid β-protein,Aβ)[4]积聚,临床特征为记忆减退、认知障碍和人格改变。

Tau蛋白[5]是神经元胞浆内的微管相关蛋白,其正常Tau蛋白的生物学活性主要体现在与管蛋白的结合形成微管及与已经形成的微管结合以维持其稳定性,并参与维持细胞形态、轴突信息传递[6]、细胞分裂等生理活动。正常成熟脑内Tau蛋白磷酸化位点较少,平均每分子含2~3 个磷酸基团。在AD患者神经系统中,Tau蛋白发生过度磷酸化,不仅失去其生物学功能而且易聚集成PHF结构,还能成为毒性分子,猎取正常的微管相关蛋白,使微管结构崩解,神经元退化。因此,Tau蛋白的过度磷酸化被认为是AD致病过程中的关键因素,称为“ 阿茨海默病样( alzheimer- like,AD- like) 改变”[7]。

Tau蛋白的磷酸化程度取决于蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的活性[8],糖原合成激酶- 3β( glycogen synthase kinase- 3β,GSK- 3β)[9]、周期蛋白依赖性激酶和丝裂原激活蛋白激酶均能使Tau蛋白过度磷酸化。其中,GSK- 3β 既是Tau蛋白的重要磷酸激酶,又在胰岛素信号转导途径位于磷脂酰肌醇- 3 激酶( phosphatidylinositol 3- kinase,PI- 3K) 的下游。神经元主要靠葡萄糖来提供能量[10],外周胰岛素水平下降或胰岛素受体敲除后,胰岛素信号传导途径下调,导致下游中PI- 3K活性下降,而PI- 3K可通过自身活性下降来导致下游的Tau蛋白磷酸化的主要激酶GSK- 3β 由非活化型转变为活化型,由此出现Tau蛋白AD样改变。

本研究以2 型糖尿病患者为研究对象,首先观察2 型糖尿病大鼠Tau蛋白磷酸化程度,然后从胰岛素抵抗导致胰岛素转导信号下调及葡萄糖代谢受损等两个方面对Tau蛋白过度磷酸化机制进行探讨,进而使用马来酸罗格列酮[11]治疗2 型糖尿病患者,检测海马Tau蛋白的磷酸化程度,并探究其逆转Tau蛋白的过度磷酸化的机制,揭示2 型糖尿病作为AD发病的风险因子的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂及仪器

马来酸罗格列酮(Rosigli-tazone Maleate,葛兰素史克天津有限公司),链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ,美国,Sigma公司),Rg-1单体(Rg-1,纯度>98%,芜湖甙而塔医疗科技有限公司),氯化锂(Lithium,纯度>97%,上海实验试剂有限公司),纯品L-谷氨酸(L-Glutamic acid,美国Sigma公司),兔抗人p-AT8Ser202单克隆抗体(美国Gene Tex公司),Morris水迷宫视频分析系统(北京军事医学科学院),HPLC色谱系统(美国Waters公司),蛋白电泳系统(美国Bio-rad公司),金盘多媒体图像处理系统(成都金盘电子科大多媒体技术有限公司),SM600全自动酶标仪(上海永创医疗器械有限公司)。

1.1.2实验动物

备选24周健康雄性SD(SpragueDawley)大鼠,体重250~300 g,由天津医科大学实验动物科学部提供。将实验大鼠置通风良好处,12 h明暗交替,自由饮水摄食,每日触摸2 min,使大鼠适应实验室环境和操作。

1.2 实验方法

实验按美国医学研究协会《实验动物处理原则》及美国科学学会和国家卫生研究院《实验动物使用和处理指南》进行。

1.2.1实验动物分组和干预

实验设计采用3×2析因设计,即按随机单位组设2个干预因素,即2型糖尿病造模手段(3水平:普食喂养、高脂高糖高蛋白饮食、高脂高糖高蛋白饮食并腹腔注射小剂量链脲佐菌素)和药物干预(2水平:无处置、罗格列酮片按照3.0 mg/kg/d灌胃4周)。

1.2.2实验动物干预措施

将48只大鼠随机分6个实验组,每组8只:Ⅰ组(普食喂养);Ⅱ组(普食喂养+罗格列酮片按照3.0 mg(/kg·d)灌胃4周);Ⅲ组(高脂高糖高蛋白饮食);Ⅳ组(高脂高糖高蛋白饮食+罗格列酮片按照3.0 mg(/kg·d)灌胃4周);Ⅴ组(高脂高糖高蛋白饮食并腹腔注射小剂量链脲佐菌素);Ⅵ组(高脂高糖高蛋白饮食并腹腔注射小剂量链脲佐菌素+罗格列酮片按照3.0 mg/kg/d灌胃4周)。造模过程结束后测试实验大鼠的空腹血糖。

1.2.3大鼠胰岛素抵抗模型和2型糖尿病模型制作

本研究将胰岛素抵抗和葡萄糖水平增高分别进行研究,因此造以下两种模型:一种为胰岛素抵抗大鼠模型,这种模型仅具备胰岛素抵抗特征,但血糖水平正常;另一种模型为2型糖尿病模型,这种模型具备胰岛素抵抗及血糖水平升高特征。适应性饲养1周后,建立大鼠2型糖尿病模型和胰岛素抵抗模型:雄性SD大鼠48只,其中32只大鼠高脂高糖高蛋白饮食(热卡百分比为碳水化合物26.0%,蛋白质15.2%,脂肪58.8%),另外16只大鼠设为对照组,接受正常饮食。8周后,随机从高脂高糖高蛋白饮食组中取16只,按照20~25 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ;Sigma公司,粉剂溶于0.1 mol/Lp H 4.3柠檬酸钠缓冲液中,每只大鼠注射1.5 ml),72 h后尾静脉取血,血糖仪(美国强生公司)测血糖≥16.7 mmol/L、尿糖持续阳性为造模成功,为2型糖尿病模型;余16只高脂高糖高蛋白饮食大鼠为胰岛素抵抗模型,胰岛素抵抗模型组和对照组实验大鼠腹腔注射柠檬酸缓冲液1.5 ml。实验动物数量说明:16只大鼠接受2型糖尿病模型造模,其中造模成功者14只;随即另选取2只大鼠进行2型糖尿病模型造模,2只造模均成功,补入相应实验组。

1.2.4大鼠胰岛素抵抗模型和2型糖尿病模型制作

大鼠胰岛素抵抗模型和2型糖尿病模型的制作完成后,进行模型质量检测,即使用葡萄糖氧化酶法检测血浆血糖、放射免疫法检测血浆胰岛素、胰岛素抵抗指标以稳态模型的胰岛素抵抗指数HOMA-IR(homeostasis model assessment-IR,HOMA-IR)=空腹胰岛素(fasting insulin,FINs,IU/L)×空腹血糖(fasting blood-glucose,FPG,mmol/L)/22.5表示[12],排除模型制作失败的大鼠。

1.2.5罗格列酮处置

动物模型制作成功并经过检测后,罗格列酮处理组用罗格列酮片按照3.0 mg/kg/d灌胃4周(罗格列酮片由葛兰素史克天津有限公司提供),72 h后,断颈处死大鼠。实验过程中自由饮水、进食,均未经任何降糖药物处理。

1.2.6 Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)视频分析系统检测大鼠的认知[13]

实验干预措施结束24 h内开始Morris水迷宫检测。Morris水迷宫被均分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限。水迷宫内盛自来水,加墨汁浑浊,检测前将平台置于Ⅰ象限水面下2 cm。所有实验在9 Am~3 Pm进行,室内安静,物品放置及灯光状态一致,水温(24±1)℃。Morris 1.0软件跟踪记录分析相关数据。1~6 d行定位航行实验:按逆时针方向分别从Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限将大鼠面向池壁放入水中,观察并计时120 s,检测前将平台置于Ⅰ象限正中水面下2 cm。摄像系统记录大鼠寻找并爬上平台的时间为逃避潜伏期(escape latency,EL),若120 s内还未找到平台,则引导其至平台,停留30 s,逃避潜伏期记为120 s。检测结束后以1~6 d逃避潜伏期的平均值作为学习成绩,其越短显示学习能力越好。

第7 天空间行探索实验:撤除平台,将大鼠从距原平台最远Ⅲ象限面向池壁放入水中,摄像系统记录大鼠在60 s内各象限游泳时间,以原平台象限Ⅰ象限游泳时间即空间探索时间( space exploration time,SET) 作为记忆成绩,其越长显示记忆能力越好。

1.2.7取材

在Morris水迷宫测试结束后24 h内取实验大鼠的海马组织,腹腔注射1.5 g/kg 20%氨基甲酸乙酯麻醉后,快速断头开颅取全脑组织;在去DEPC冰面上吸除血迹,分离双侧海马。左侧海马用锡箔纸标记包裹后置于液氮中过夜,置入-80℃冰箱超低温保存,备做Western blot检测;右侧海马称重,加入1 ml甲醇-水离心液,低温匀浆,取部分匀浆液4℃,10 000×g,离心15 min,取上清液,滤膜过滤后置入-80℃冰箱冷冻保存待测血糖(Glu)的含量(以μg/g计)。

1.2.8高效液相色谱法(high performance liquidchromatography,HPLC)检测Glu在海马中含量

检测样品:处理好的为大鼠右侧海马组织匀浆上清液。色谱条件:18-ODS色谱柱柱温35℃。流动相A:0.1 mol/L醋酸钾。流动相B:甲醇,进行二元梯度洗脱,梯度洗脱程序:(T,B%)(0,45%)(1,65%)(6,75%)(20,45%)。流动相经0.45 m微孔滤膜过滤,超声脱气。流速1.0 ml/min、激发波长250 nm,发射波长410 nm,以Glu峰面积定量。氨基酸标准液的配制:Glu标准品配成100μmol/L的标准溶液,测前稀释。衍生及分析:取100μl标准液或者组织样品液于EP管中,加入100μl衍生化试剂反应2min后进样20μl。Glu标准曲线的建立:配制浓度分别为0.150、0.300、0.735、1.470、2.940、3.675和5.880 mg/L的Glu标准溶液,衍生化处理后测定,应用外标法进行定量分析。海马中Glu含量的测定:对海马组织匀浆上清液解冻,加入冰冻的甲酸(1 mol/L,2 ml),冰浴下匀浆。将匀浆液于4℃7 000 r/min离心30 min。取上清液置于20℃冰箱保存。每1 ml脑组织匀浆上清液加0.75 ml 4%的碳酸氢钠溶液混匀,4℃3 000 r/min离心5 min,取上清液过0.45μm滤膜,分装。然后取该分装液24μl,进样瓶中加入衍生试剂12μl,四硼酸钠缓冲液(p H=9.18)960μl,混匀,温度控制在20℃下静置3 min后进样,梯度洗脱,测定Glu含量。

1.2.9酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262的表达

取左侧海马,匀浆,取0.2 g,1 000×g离心20 min,取上清液即可检测。标本应清澈透明,悬浮物应离心去除。标本收集后若不及时检测,请按一次使用量分装,置于-20℃-80℃冰箱冷冻保存待测。采用双抗体夹心ELISA法。将抗体包被于酶标板上,实验时标本或标准品中的Tau蛋白会与包被抗体结合,游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗Tau蛋白抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素,抗Tau蛋白抗体与结合在包被抗体结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物,洗去游离成分,加入显色底物。用酶标仪在450 nm波长处测光密度(optical density,OD)值,Tau蛋白浓度与OD450值间呈正比,通过绘制标准曲线求出标本中Tau蛋白浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差( ±s) 表示,对各组样本行方差齐性检验,经检验方差齐,将各组样本进行析因设计单因素方差分析各处理因素主效应和交互效应;用单因素方差分析方法分析各处理因素单独效应;行LSD检验和SNK- q检验两两比较,P <0.05。

2 结果

2.1 实验大鼠的认知能力:逃避潜伏期(EL)和空间探索时间(SET)

血糖水平增高和胰岛素抵抗可造成认知障碍,即延长逃避潜伏期( F =56.414,P =0.009) 并缩短空间探索时间( F =37.705,P =0.004)( 见表1、2) ;马来酸罗格列酮可减轻胰岛素抵抗和葡萄糖水平增高造成的认知障碍程度( 逃避潜伏期F =119.820,P =0.011)( 空间探索时间F =63.363,P =0.001)( 见表1、2) 。

2.2 HPLC法检测神经递质Glu在海马中含量

血糖水平增高和胰岛素抵抗可明显增加海马中Glu浓度( F =67.945,P =0.003) ;马来酸罗格列酮可减少血糖水平增高和胰岛素抵抗导致的海马Glu浓度的上调幅度( F =33.012,P =0.015)( 见表3) 。

2.3酶联免疫吸附剂测定检测Tau-5 、p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202在大鼠海马中的表达

从表4~5 可见, 血糖水平增高和胰岛素抵抗Tau蛋白的磷酸化程度(p-PHF1Ser396/404:F=63.061,P=0.001)、(p-AT8Ser199/202:F=74.503,P=0.002);马来酸罗格列酮下调Tau-5增加的幅度(F=29.124,P=0.026)和Tau蛋白的磷酸化的程度(p-PHF1Ser396/404:F=9.264,P=0.012)、(p-AT8Ser199/202:F=14.752,P=0.004)。

(s,n=8,±s)