苍耳愈伤组织诱导及继代培养研究

苍耳愈伤组织诱导及继代培养研究（精选7篇）

苍耳愈伤组织诱导及继代培养研究 第1篇

苍耳愈伤组织诱导及继代培养研究

以苍耳叶片、叶柄及茎段为外植体,在MS附加不同种类和浓度激素配比的培养基上,对苍耳愈伤组织进行诱导培养,并对生长迅速、性状好的愈伤组织进行了研究.结果表明:不同激素配比和不同培养方式对愈伤组织诱导率、生长量和性状有明显的影响.在光照培养下,当MS+6-BA 2 mg/L + NAA 0.5～1 mg/L时愈伤组织诱导率高且生长好.

作 者：白文苑 沈慧敏 BAI Wen-yuan SHEN Hui-min 作者单位：甘肃农业大学草业学院,甘肃,兰州,730070刊 名：甘肃农业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY年，卷(期)：41(1)分类号：Q813.1+2关键词：苍耳 愈伤组织 组织培养

苍耳愈伤组织诱导及继代培养研究 第2篇

以银杏的胚为材料诱导愈伤组织产生,研究愈伤组织生长量及其培养过程中过氧化物酶(POD)活性和ATP含量的`变化,结果表明,2,4-D与BA组合比NAA和KT有利于各种外植体愈伤组织的诱导,NAA与KT组合更利于愈伤的继代培养.未成熟胚子叶愈伤组织的生长曲线大致为“S”型,在含BA的培养基上,愈伤组织前期生长较快,而在后期(24～28 d)鲜重有所下降,POD活性和ATP含量在20 d时达到最大;在含KT培养基上,愈伤组织在24～28 d期间仍有增长,其POD活性和ATP含量在28 d时最大,且有继续上升的趋势.这表明POD活性和ATP含量与银杏愈伤组织的生长有一定的相关性.

作 者：温银元 王玉国 铁梅 作者单位：温银元,王玉国(山西农业大学,农学院,山西,太谷,030801)

铁梅(山西农业大学,林学院,山西,太谷,030801)

苍耳愈伤组织诱导及继代培养研究 第3篇

杜仲既是一种传统的中药材,也是一种重要的胶源植物。因为杜仲树生长缓慢,所以其药用成分及杜仲胶的生产受到了限制[1]。组织培养技术由于具有缩短育种时间,提高植物品质,保存物种,生产次生产物等优点,已经在很多植物中获得成功[2]。本研究采用正交试验优化6-BA、NAA、2,4-D和PVP 四种物质对杜仲愈伤组织诱导和增殖产生的影响,确立最佳的激素组合,为进一步稳定培养物的有效生长速率和提高其中含有效成分的量,建立稳定高产的杜仲次生代谢产物生产体系奠定实验基础。

1材料与方法

1.1材料

以渭南师范学院校园栽培一年生杜仲嫩枝条为试验材料。

1.2方法

1.2.1 杜仲愈伤组织的诱导

剪取一年生杜仲嫩叶,放入烧杯中加入适量洗衣粉,在自来水下冲洗2 h左右,再用蒸馏水冲洗5 min,于超净工作台内,先用75%酒精处理20 s,再用0.1%升汞处理12 min,然后用无菌水冲洗5～6次,将嫩叶剪成约0.50.5 cm大小作为外植体,每瓶接种3个外植体于不同的诱导培养基上。以MS+3 %蔗糖+0.7 %琼脂+脯氨酸500 mgL-1+水解酪蛋白300 mgL-1作为基本成分,pH6.0(单位下同)。诱导培养基的筛选采用正交设计L9(34)[3],设置3个因素分别为6-BA、NAA和PVP,每个因素设置3个水平数。6-BA的浓度分别为0、0.5 、1.0 mgL-1;NAA的浓度分别为0、0.2、0.5 mgL-1;PVP的浓度分别为0、1%、2%。在 22±1 ℃条件下、光照强度为1 500～2 000 lx、每天光照时间13 h,诱导愈伤组织形成,20 d后统计诱导率,并观察愈伤组织生长状态。

1.2.2 杜仲愈伤组织的增殖

将生长旺盛、质地相当、有光泽的愈伤组织块小心切下,分别接种于不同的增殖培养基上。每瓶接种4块愈伤组织,培养温度(25±1)℃、光照强度为1 500～2 000 lx、每天光照时间13 h。增殖培养基的筛选采用正交设计L9(34)[3],设置3个因素分别为6-BA、NAA、2,4-D,每个因素设置3个水平数。6-BA的浓度分别为0.5、1.0、1.5 mgL-1;NAA的浓度分别为0.1、0.5、1.0 mgL-1;2,4-D的浓度分别为0.5、1.0、1.5 mgL-1。20 d 后统计愈伤组织生长情况,以其相对生长量为增殖系数:(培养后重-培养前重)/培养前重,确定最适继代培养基配方。愈伤组织增殖每3周继代一次。

2结果与分析

2.1杜仲愈伤组织诱导条件的优化

叶片在诱导培养基上接种1周左右,最先在主叶脉处看到愈伤组织,2周左右整个叶缘几乎都长满了愈伤组织。通过正交试验(表1),直观分析发现适宜诱导的培养基为MS+0.5 mgL-16-BA+0.5 mgL-1NAA +2%PVP,影响顺序为6-BA>NAA>PVP。通过方差分析结果可知,6-BA对杜仲愈伤组织诱导作用极其显著,NAA影响作用较显著,而PVP各水平间的差异不显著,无统计学意义(表2)。在杜仲愈伤组织诱导过程中,不添加PVP对诱导率影响虽然不大,但没有添加PVP的组合中,叶片接种后开始褐化,而加有PVP的培养基叶片不容易出现褐化。

2.2正交设计中植物调节对杜仲愈伤组织增殖的影响

经过3种不同浓度的植物生长调节剂的正交试验,发现各种组合对杜仲愈伤组织增殖率影响差别较大,对实验结果直观分析(表3),发现以增殖系数为指标,3种植物生长调节对杜仲增殖的影响大小依次是6-BA>NAA>2,4-D,最适增殖的组合为MS+1.0 mgL-1 6-BA +0.5 mgL-1NAA + 1.0 mgL-12,4-D。通过方差分析(表4),发现6-BA和NAA各水平间的差异有统计学意义且差异极显著,而2,4-D各水平间的差异不显著,无统计学意义。采用这种激素组合对杜仲愈伤组织进行多次增殖培养,获得了质地疏松、淡黄绿色、分裂旺盛的优质愈伤组织。

3讨论

杜仲集“一林、一胶、两材、三效益”于一体,发展前景广阔。但在野生资源面临枯竭,人工种植无法满足市场对杜仲药源的需求情况下,采用组织培养快速繁殖、规模化生产已成为工业生产杜仲有效成分的新途径[4,5]。诱导和保持愈伤组织生长所需的植物生长调节剂种类与浓度是和外植体本身的生理状态以及其对激素类物质敏感性有关,因而生长素与细胞分裂素用量及比例,在培养各阶段是不同的。在诱导期,由于植物生长调节剂的作用,细胞代谢开始活化,启动植物细胞脱分化的进行。因此在愈伤组织诱导阶段,植物生长调节剂发挥了重要作用。正交试验结果表明,对杜仲愈伤组织诱导的影响顺序为6-BA>NAA>PVP,对增殖的影响顺序是6-BA>NAA>2,4-D。6-BA对杜仲愈伤组织的诱导影响显著。它使已经脱分化的细胞或细胞团保持有丝分裂,从而使细胞团能够进行继代培养[6],在杜仲细胞增殖培养过程中,6-BA的浓度变化对细胞增殖系数影响显著。因此,综合分析本试验的结果,杜仲叶片诱导愈伤组织最佳培养基为:MS+0.5 mgL-16-BA+0.5 mgL-1NAA +2%PVP。最佳增殖培养基为:MS+1.0 mgL-1 6-BA +0.5 mgL-1NAA +1.0 mgL-12,4-D。

摘要：以杜仲嫩叶为外植体,运用正交试验优选6-BA、NAA、2,4-D和PVP四种物质组合,进行杜仲愈伤组织诱导及增殖试验。结果表明:(1)这四种物质对杜仲愈伤组织诱导的影响顺序是6-BA>NAA>PVP,对增殖的影响顺序是6-BA>NAA>2,4-D。利用杜仲叶片诱导愈伤组织最佳培养基为MS+0.5 mg.L-16-BA+0.5 mg.L-1NAA+2%PVP。(2)增殖培养基中添加1.0 mg.L-16-BA+0.5 mg.L-1NAA+1.0 mg.L-12,4-D为最适增殖组合,能明显提高杜仲愈伤组织增殖系数。应用优化的杜仲愈伤组织诱导及增殖培养条件,能获得较大量的愈伤组织,使规模化生产杜仲有效成分成为可能。

关键词：杜仲,愈伤组织,诱导,增殖

参考文献

[1]杨振堂,臧埔,胡桂珍,等.杜仲组织培养中培养基与含胶量关系的研究.特产研究,1999;1:1—5

[2]唐亮,金晓玲.杜仲组织培养的研究进展.贵州农业科学,2010;38(3):15—18

[3]方开泰,马长兴.正交与均匀试验设计.北京:科学出版社,2001

[4]王亚琴,张康健.杜仲次生代谢物的研究进展.中草药,2004;35(7):836—839

[5]李琰,董娟娥,姜在民,等.杜仲愈伤组织中次生代谢产物积累动态研究.西北植物学报,2004;24(11):2033—2037

苍耳愈伤组织诱导及继代培养研究 第4篇

关键词：大豆；愈伤组织；激素；继代培养

中图分类号： S565.104 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0040-02

收稿日期：2013-08-19

基金项目：吉林省科技发展计划（编号：201101111）；吉林省教育厅科学技术研究项目（编号：2011-41）；吉林省科技厅项目（编号：20120215）；吉林省科技成果转化补助项目（编号：20095044）；吉林农业大学科研启动基金（编号：201242）。

作者简介：刘思言（1979—），女，吉林四平人，硕士，讲师，主要从事作物生物技术研究。E-mail：siyan_2001@163.com。

通信作者：王丕武，教授，博士生导师。E-mail：peiwuw@yahoo.com.cn。大豆是全世界重要的粮食和经济作物，也是人类主要的食用蛋白和工业原料来源，与人们的日常生活息息相关[1-2]。大豆的组织培养技术起步较晚，直到20世纪80年代的中后期大豆组织培养技术才取得了突破性的进展，大豆的原生质体培养、子叶节培养和胚尖培养相继取得了成功[3-13]。但大豆愈伤组织诱导的研究相对较少，而愈伤组织诱导具有外植体来源广泛，扩繁量大等优点[14]。尤其是随着近些年来大豆遗传转化的研究越来越多，能通过愈伤组织诱导建立一个高效的遗传转化受体系统更具有重要的意义。本试验以TDZ、NAA、6-BA、2，4-D为供试激素作为生长调节剂，以吉农28、吉农27、吉农17 3种基因型为材料，进行大豆愈伤组织的诱导和继代培养，以期找到最适合诱导和继代培养大豆愈伤组织的培养基，为建立一个高效的大豆愈伤组织遗传转化受体系统奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

吉农28、 吉农27、 吉农17的种子均由吉林农业大学生物技术中心提供。

1.2试验方法

1.2.1种子的萌发挑取成熟饱满的大豆种子，先用75%的乙醇消毒30 s，再用0.1%的升汞溶液消毒10 min，无菌水冲洗3～5次，接种到MS基础培养基上，培养7 d后取胚轴，14 d后取真叶作为外植体材料。

1.2.2愈伤组织的诱导以无菌实生苗的胚轴、真叶为外植体，分别接种于添加不同浓度激素的MS愈伤组织诱导培养基中，采用四因素三水平的L9（34）正交设计（表1），将各处理放置于黑暗条件下培养7 d，然后置于恒温的黑暗12 h，光照12 h的培养箱中，于20 d后统计其愈伤组织诱导情况。

伤组织的诱导多以一定浓度的2，4-D和6-BA配合使用，朱学艺等[15]在培养基中添加6-BA后，愈伤组织出愈率低，形成的愈伤组织结构紧密，呈小颗粒状；NAA和6-BA结合使用诱导出的大豆愈伤组织也呈现质地坚硬的特点，愈伤组织量也相对较少[16]。TDZ是一种苯基脲衍生物，具有类细胞分裂素活性，已被广泛用于大豆组织培养，在孙明杰[24]等的研究中使用低浓度TDZ和6-BA配比，通过愈伤组织途径获得再生植株，提高了植株再生效率。本研究以3种不同基因型大豆的真叶及胚轴为外植体，不同的激素配比进行大豆愈伤组织诱导和继代研究，结果表明，在愈伤组织诱导阶段：以真叶为外植体时，最佳的组合为吉农28+1.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭；当以胚轴作为外植体时，诱导愈伤组织最佳组合为吉农17+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭。在愈伤组织继代培养阶段：以真叶作为外植体时，最佳的组合为吉农17+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D；以胚轴为外植体时，最佳的组合为吉农17+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 2，4-D。

参考文献：

[1]Wang H J，Murphy P A. Isoflavone content in commercial soybean foods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42：1666-1673.

[2]杨超. 大豆植株再生和遗传转化技术体系的研究[D]. 南京：南京农业大学，2009.

[3]Cheng T Y，Saka H，Voqui-Dinh T H. Plant regeneration from soybean cotyledonary node segments in culture[J]. Plant Science Letters，1980，19：91-99.

[4]肖文言，王连铮. 大豆幼荚子叶原生质体培养及植株再生[J]. 作物学报，1994，20（6）：665-669，769.

[5]王升吉，吴元华，王洪岩，等. 大豆不同外植体组织培养及再生研究[J]. 沈阳农业大学学报，1999，30（3）：255-259.

[6]Yoshida T. Adventitious shoot formation from hypocotyls sections of mature soybean seeds[J]. Breeding Science，2002，52：1-8.

[7]邱承祥，武天龙. 6-BA对大豆茎尖诱导再生植株的研究[J]. 大豆科学，2003，22（1）：32-35.

[8]Wang P，Wang G，Jing J I，et al. A novel systerm for proliferation，maintenance and plantlet germination from somatic embryo of soybean[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（2）：154-158.

[9]林樹柱，曹越平，卫志明，等. 6-BA诱导大豆子叶节和茎尖出芽的研究[J]. 上海交通大学学报：农业科学版，2005，23（2）：138-142.

[10]李海燕，武小霞，刘淼，等. 大豆子叶节、胚尖再生植株的研究[J]. 大豆科学，2007，26（5）：709-712.

[11]孙文丽，刘昱辉，吴元华，等. 大豆胚尖再生体系的建立及转基因初步研究[J]. 湖北农业科学，2008，47（6）：615-618.

[12]张东旭，张洁，商蕾，等. 大豆胚尖再生体系的研究[J]. 河北农业大学学报，2008，31（4）：7-13.

[13]武小霞，李静，姜成涛，等. 大豆子叶节再生中植物生长调节剂浓度及基因型筛选[J]. 中国油料作物学报，2011，33（2）：123-129.

[14]谢从华，柳俊. 植物细胞工程[M]. 北京：高等教育出版社，2004：236.

[15]朱学艺，梁晓芳，李红芳. 激素对大豆悬浮细胞系愈伤组织诱导的影响[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2008，47（4）：562-566.

[16]李大玮，Schmid J，Keller E R. 植物生长调节剂的使用和大豆愈伤组织的诱导及保持[J]. 遗传，1989，11（2）：1-4，49.

苍耳愈伤组织诱导及继代培养研究 第5篇

目前,对三叶青的研究主要集中在其药理作用上,而关于三叶青的组织培养研究尚少见报道[3,4],且都是以带腋芽的茎段为外植体,繁殖系数较低。另外,培养基的组分都是以单因素水平来设计的,无法准确了解多因素的相互作用。本研究以不带腋芽的茎段为外植体,选择不同的培养基和激素配比进行正交试验,以筛选出愈伤组织诱导和芽分化的较佳培养基,从而为三叶青的快速繁殖提供新途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料采自浙江省丽水市,经安徽师范大学生命科学学院周守标教授鉴定为三叶青,外植体取不带腋芽的幼嫩茎段。

1.2 试验设计

愈伤组织诱导采用正交试验设计,设3个因素,每个因素3个水平,共9个处理,即培养基(White、B5、MS)、6-BA(1、2、4 mg/L)、IBA(0、0.2、0.5 mg/L)。愈伤组织分化试验也采用正交试验设计,设3个因素,每个因素3个水平。共9个处理,即培养基(White、B5、MS)、6-BA(2、3、4 mg/L)、NAA(0.5、1.0、2.0 mg/L)。

1.3 试验方法

取新鲜采集的幼嫩茎段,用自来水冲洗2 h,然后在无菌超净台上用8%Na Cl O消毒5 min后,无菌去离子水清洗6次,再用0.1%Hg Cl2消毒5 min,取出,用无菌去离子水清洗8次,用无菌吸水纸吸干水分,剪成1.5~2.0 cm2小块,接种到各愈伤组织诱导培养基上。接种20 d后观察统计愈伤组织诱导率及生长状况,愈伤组织经原诱导培养基继代培养2次后转入分化培养基诱导不定芽,40 d后统计分化率。以上各培养基均分别加入3%的蔗糖和0.8%的琼脂,p H值为5.8,(26±2)℃培养,光照强度2 000 lx,光照周期12 h/d,每个处理接种10瓶,每瓶接种3个外植体,重复3次。本研究中正交设计及所有数据的统计分析均使用正交设计助手ⅡV3.1软件。

2 结果与分析

2.1 不同培养基类型与激素水平对愈伤组织诱导率及生长状况的影响

将外植体接种到不同诱导培养基上,诱导率和生长差异很大。从表1可以看出,White培养基的各处理组合产生的愈伤组织诱导率及生长速度均显著低于其他2种培养基,同种培养基的各组合中6-BA浓度越大,生长速度越快,但同时褐化也加重。方差分析结果见表2。从表2可以看出,不同激素浓度对诱导率影响的极差R顺序为:培养基类型>6-BA>IBA,其中培养基类型对诱导率有显著影响(P<0.05),促进愈伤组织产生的最佳处理组合是MS+6-BA 2 mg/L+IBA0.2 mg/L。通过试验验证,得知此培养基对愈伤组织诱导效果较好,接种后5 d左右,切口两端开始膨大成哑铃形,周边逐渐长出少量淡绿色的颗粒状愈伤组织,质地紧密,增殖速度快,几乎无褐化,20 d后诱导率为96.7%(图1)。因此,诱导愈伤组织适宜的培养基组合为MS+6-BA 2 mg/L+IBA0.2 mg/L。

2.2 不同培养基类型与激素水平对愈伤组织分化率及丛生芽生长状况的影响

愈伤组织继代培养2次后转入分化培养基中,14 d左右少部分愈伤组织上出现绿色芽点,继而形成不定芽。正交试验方案及40 d后统计结果见表3,各处理愈伤分化率差异较大,正交试验方差分析结果见表4。从表4可以看出,不同激素浓度对诱导率影响的极差R顺序为:NAA>培养基类型>6-BA,促进愈伤组织产生的最佳处理组合是B5+6-BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L,即为表3中的4号培养基,在此培养基上,不定芽分化率最高,达到66.7%,而且丛生芽生长密集(图2),芽长势良好,利于后期分割到单芽生长成不定苗(图3)。因此,愈伤组织芽分化的适宜培养基组合为B5+6-BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L。

注:F0.05=19,df=2。

注:F0.05=19,df=2。

3 结论与讨论

试验结果表明,培养基类型对三叶青愈伤组织诱导率及生长状况均有显著的影响。以高盐的MS培养基诱导率高,增殖速度快,低无机盐的White培养基上的外植体逐渐干枯,切口处形成的愈伤组织也逐渐失去光泽,这可能是由于三叶青的愈伤组织生长需要较高的无机盐浓度。大量的研究表明[5,6,7,8],培养基类型和激素水平是影响诱导率和分化率的重要因素。在诱导愈伤组织时常因植物的种类、外植体本身的生理状态等的不同而选用不同的培养基类型,这主要是因为不同外植体自身所含的营养成分不同,在组织培养中所要求的培养基也不同。在甘蓝等多种植物的组织培养中均发现MS培养基适于诱导愈伤组织和不定芽[5]。而本研究中三叶青愈伤组织的分化以高硝酸钾的B5培养基为最好,可能是因为不同外植体以及同一外植体的不同生长阶段所需求的营养成分不同所致,因此MS-B5交替继代方式有利于三叶青愈伤组织的继代与分化。在苜蓿花药愈伤组织继代和分化中也发现N6-MS培养基交替继代方式有利于愈伤组织胚性的保持,并使植株再生能力的下降有所减慢[6]。

本试验不同阶段培养基中外源性激素的种类和浓度配比事先均做过系统考察,正交试验激素质量浓度是在单因素试验的基础上选取效果较好的激素质量浓度进行设计的。前期试验结果表明IBA是最有利于三叶青愈伤组织诱导的外源性生长素,诱导率高且愈伤的褐化最轻;而在分化培养基中加入浓度大于1 mg/L的IBA,外植体上有不定根的发生,从而抑制芽的分化。因此,选择NAA作为分化培养的外源性生长素。

在植物组织培养中,植物的愈伤组织诱导和器官分化主要决定于植物体内细胞分裂素和生长素激素的比例,6-BA可以有效地诱导愈伤的产生与芽的萌发,本试验中当6-BA浓度超过4.0 mg/L时愈伤组织褐化明显加重,影响愈伤组织的继代培养,仅采用浓度1~4 mg/L的6-BA也能诱导愈伤组织的产生,但同时添加少量IBA的培养基中愈伤组织诱导率明显高于未添加IBA的培养基,说明少量的IBA对促进愈伤组织的形成有协同作用,尤以IBA 0.2 mg/L效果为佳。

不定芽的分化中选择6-BA和NAA浓度组合作为主要的研究因素。单独使用6-BA诱导不定芽分化,外植体上仅有愈伤组织的形成,没有不定芽的出现;而将6-BA与生长素NAA配合起来用,可以取得较好的不定芽分化效果,6-BA/NAA的浓度比值在一定范围内,随着比值的增高,不定芽分化率增加。6-BA浓度在1~4 mg/L范围内,不定芽分化率随其浓度的提高呈上升趋势。这一规律与辣椒的不定芽分化时相同[7]。本试验中愈伤组织在激素组合为6-BA 2 mg/L+NAA1.0 mg/L时分化率最高,且不定芽分化的数量也最多,呈深绿色,长势也最强。另外,本试验还发现随着三叶青愈伤组织培养时间的延长和继代次数的增加,愈伤组织芽分化率基本呈逐渐增大的趋势,但继代次数超过3次以后,虽然芽分化率有所提高,但伴随着芽的褐化死亡。因此,选择继代2次的愈伤组织进行不定芽的分化培养。关于丛生芽的生根培养尚在进一步研究中。

摘要：以三叶青不带腋芽的茎段为外植体,采用正交试验的方法研究了不同培养基和激素水平对三叶青愈伤组织诱导及不定芽分化的影响。结果表明,以培养基MS+6-BA 2 mg/L+IBA 0.2 mg/L最有利于愈伤组织的诱导,20 d后诱导率为96.7%;以培养基B5+6-BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L最有利于不定芽的分化,40 d后分化率为66.7%。

关键词：三叶青,愈伤组织,诱导,分化,培养基,筛选

参考文献

[1]魏克民,丁刚强,浦锦宝.中草药三叶青抗肿瘤作用机制实验研究和临床应用[J].医学研究杂志,2007,36(11):41-43.

[2]倪克锋,丁志山,黄挺,等.三叶青黄酮对H-22荷瘤小鼠瘤体的抑制作用及其机理研究[J].浙江中医药大学学报,2008,32(6):732-734.

[3]钟毓倩.三叶青的组织培养与快速繁殖研究[J].浙江中医杂志,2007,42(6):363.

[4]钱丽华.三叶青的离体快速繁殖[J].植物生理学通讯,2008,44(1):121-122.

[5]李明银,黄丽梅.观赏型羽衣甘蓝组织培养影响因素的研究[J].北方园艺,2009(11):99-101.

[6]李增红,张博,陈爱萍,等.不同培养基对苜蓿花药愈伤组织继代和分化的影响[J].新疆农业科学,2008,45(5):950-955.

[7]于娅,孙翔.辣椒再生体系不定芽发生因素的优化研究[J].北方园艺,2011(5):155-158.

苍耳愈伤组织诱导及继代培养研究 第6篇

研究表明,以种子作为羊草愈伤组织诱导的外植体具有操作简便、污染率低、不受季节性限制的优点,但是由于羊草种子存在较严重的休眠生理现象[8],导致羊草胚性愈伤组织诱导率很低,而变温培养可以适度打破种子休眠提高发芽率[9,10,11],因此本研究采用羊草种子作为外植体,16℃/26℃变温培养,以26℃恒温培养作为对照,探讨变温培养对羊草胚性愈伤组织诱导率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

外植体:羊草种子。2004年7月采自中国大安碱地生态试验站,千粒重约2.5g,变温培养发芽率可达89.3%[12]。

1.1.2 试剂

浓H2SO4(98%)、HgCl2、MS培养基的母液试剂以及2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)均为国产分析纯(北京北化精细化学品有限责任公司)、琼脂购自美国Biosharp公司。

1.1.3 仪器

纯水系统(日本EYELA)、高压灭菌器(日本三洋公司)、超净工作台、光照培养箱(哈东联公司)。

1.1.4 培养基

MS培养基参照植物生物技术[8]配制:

诱导培养基:MS+2.0mg/L 2,4-D,培养基加3.0%蔗糖、0.8%琼脂、pH 5.8～6.0。

继代培养基:MS+0.5mg/L 2,4-D,培养基加3.0%蔗糖、0.8%琼脂、pH 5.8～6.0。

1.2 方法

1.2.1 材料灭菌

羊草种子经98%浓硫酸浸泡5min去除种皮[9]后以流水冲洗,选取成熟、饱满、去稃彻底且完整的种子进行75%乙醇表面消毒30s,再以0.1%升汞消毒10min,最后用无菌水冲洗3次,作为外植体。

1.2.2 愈伤组织诱导及继代

用无菌滤纸吸干种子表面的水分,接种于诱导培养基,每皿接种20粒,封口后分别置于26℃恒温培养箱和16℃/26℃变温培养箱中诱导愈伤组织,3w后统计诱导率。光照条件:愈伤组织诱导采用暗培养,愈伤组织继代采用15molm-2s-1光强光照12h/24h。

实验设3次重复,每次重复接种400个外植体。

1.2.3 计算诱导率

诱导率计算公式:诱导率(%)=(愈伤组织数/接种外植体数)100%。

2 结果与分析

2.1 胚性愈伤组织的形成及植株再生

羊草种子外植体经诱导培养大约1w后开始出现愈伤组织(图a),多数外植体同时长出苗,初次形成的愈伤组织多呈白色、质地松弛柔软,经继代培养3w后,愈伤组织可直接分化出不定芽(图b),继续培养15d左右部分愈伤组织可分化出根,无菌水清洗愈伤组织表面的培养基后移栽至经高压灭菌的黑土中可正常生长(图c)。

图版及说明

a 羊草种子在诱导培养基上诱导出的愈伤组织;

b 愈伤组织在继代培养基上分化出根和苗;

c 再生植株在花盆中正常生长(c1和c2为不同植株)。

2.2 温度对诱导率的影响

外植体经诱导培养3w后,基本达到饱和,此后即使继续培养,也几乎不再形成愈伤组织,且由于营养消耗,愈伤组织基本定型。26℃恒温培养平均诱导率为23.3%,16℃/26℃变温培养的平均诱导率为47.6%,变温培养诱导率比恒温培养高出约1倍,经单因素方差分析(ANOVA)两者存在极显著差异(表1)。

**表示在0.01水平存在显著差异。

3 讨论

3.1 羊草胚性愈伤组织诱导率与种子休眠的关系

禾本科植物由于愈伤组织的脱分化比较困难,所以诱导率普遍偏低,以往以羊草种子作为外植体进行愈伤组织诱导的报道中诱导率为20%～25.33%[10,11,13]。研究认为羊草种子发芽率是限制其愈伤组织诱导率的主导因素[10],而休眠又是限制发芽率的主导因素,所以打破种子休眠、提高发芽率就成为提高愈伤组织诱导率的关键。打破羊草种子休眠、提高发芽率有多种方法,包括变温或低温处理、采用不同发芽床、磁场处理等物理方法,以及PEG处理、稀土浸种处理、外源激素处理等化学方法[1]。曲同宝等[11]在进行诱导之前采用100mg/L GA(赤霉素)溶液浸泡种子24h,可使羊草种子愈伤组织诱导率提高到25.33%。本研究中采用16℃/26℃变温培养,可使愈伤组织诱导率达到48.3%,而不经打破休眠恒温培养的诱导率仅为23.3%,变温培养使愈伤组织诱导率提高约1倍,可见羊草胚性愈伤组织的诱导率与种子休眠有直接关系。目前采用变温方法培养羊草愈伤组织还未见报道。

3.2 羊草胚性愈伤组织的分化

本研究中在MS+0.5mg/L 2,4-D培养基中即可直接分化成完整植株,移栽至花盆中即可正常生长,崔秋华等[10]、曲同宝等[11]和魏琪等[13]诱导出胚性愈伤组织后,在分别添加NAA或6-BA的培养基上也获得了再生植株,这与刘公社等[14]以羊草成熟胚作为外植体诱导的愈伤组织不能分化出再生植株的报道不同,可能是由于外植体基因型以及羊草种子收获时间不同而引起的。禾本科牧草愈伤组织再分化一般不需要添加外源细胞分裂素,本研究中在含有较低浓度2,4-D的继代培养基中羊草愈伤组织即可直接再分化出苗和根,同时也说明以羊草成熟种子作为外植体获得的愈伤组织是可以分化出再生植株的。

综合以往文献报道与本实验结果,我们认为羊草愈伤组织诱导率是受羊草的基因型、种子采集时间、种子发芽率以及诱导培养基中2,4-D浓度等多种因素共同控制的综合表现。目前采用变温方法培养羊草愈伤组织还未见报道。

摘要：目的:通过变温处理研究羊草种子休眠与愈伤组织诱导的关系。方法:以成熟羊草种子作为外植体,MS+2.0mg/L2,4-D为诱导培养基,分别采用26℃恒温和16℃/26℃变温(各12h)的方式培养,3w后统计诱导率。结果:恒温和变温培养均能诱导出愈伤组织细胞,变温培养羊草愈伤组织诱导率达到48.25%,较之恒温培养高出约1倍。结论:变温培养有助于羊草胚性愈伤组织的诱导。

安祖花愈伤组织诱导的研究 第7篇

1材料与方法

1.1试验材料

取来自荷兰进口的生长健壮、无病虫害的盆栽亚历桑娜红掌 (以下简称:红) 和友谊彩掌 (以下简称:彩) 为试验材料。

1.2试验方法

1.2.1取材和灭菌。剪取两种安祖花中生长旺盛、无病虫害的不同时期的叶片 (带有一段叶柄) 及茎尖、茎段作为外植体。将外植体用自来水冲洗几小时后, 在超净工作台上用70%的酒精处理30s, 用0.1%的Hgcl2浸泡, 然后用无菌水冲洗3~5次。将外植体边缘切去3~4mm, 以备接种。

1.2.2不同外植体的消毒时间试验。将不同外植体分别置于0.1%的Hgcl2中浸泡6~15min, 然后切成小的切块或切段, 接种于MS+BA2.0+NAA0.1 (单位:mg.L-1) 上。

1.2.3不同外植体愈伤组织诱导试验。将已消毒的茎尖、茎段都切为0.5cm长, 将叶片切为0.8×0.8cm2, 将叶柄切为0.8cm长, 接种于MS+BA2.0+NAA0.1上, 每瓶接种4个, 每个处理5瓶, 培养45天后, 统计结果。

1.2.4不同发育阶段叶片愈伤组织的诱导试验。a、叶片未展开的幼叶;b、叶片刚展开呈猪肝色的新叶;c、成熟叶片;d、老叶;将四个不同阶段的两种安祖花叶片接种在MS+BA2.0+NAA0.1培养基上。

1.2.5不同基本培养基和不同激素诱导愈伤组织试验。分别将1/2MS和MS作为基本培养基, 分别用不同浓度的BA和KT进行试验。将1/2MS作为基本培养基, BA与NAA进行不同浓度的配比试验, 选红掌的嫩叶接种。

1.2.6培养条件。继代培养基为MS+BA2.0+NAA0.2;生根培养基为1/2MS+NAA0.5。

以上培养基中均加入琼脂6.5g.L-1, 蔗糖30g.L-1, p H值为5.8, 培养室温度为24±1℃, 光照强度2 000~2 500lux, 光照周期14~16h.day-1。

2结果与分析

2.1不同消毒时间对外植体灭菌的影响

两种安祖茎尖和茎段最佳消毒时间是12~15min, 污染率为30%;叶片和叶柄最佳消毒时间是10~12min, 污染率只有10%。两种安祖花的污染差异不大, 污染率相同。

2.2安祖花愈伤组织的诱导状况

2.2.1不同外植体的愈伤组织诱导效果。由表2可以看出:两种安祖花诱导率最高的都是茎尖, 其次为茎段和叶片, 叶柄最低。同时, 亚历桑娜红掌的几种外植体愈伤组织的发生频率都要比友谊彩掌的发生频率高。

2.2.2不同发育阶段的叶片愈伤组织的诱导效果。由表3可知, 新展开的叶片愈伤组织的诱导率最高, 成熟叶片次之, 未展开叶较差, 老叶根本没有长出愈伤组织。同时, 经过观察得知, 新展开的叶片和成熟叶片不仅产生愈伤组织能力强, 所形成的愈伤组织活力强, 生长较快。

2.2.3不同基本培养基和不同细胞分裂素诱导叶片愈伤组织的影响。从表4可知, 叶片愈伤组织诱导效果最好的是 (3) , 诱导率高达60%, 其次是 (1) , 诱导率为50%。在相同条件下, 1/2MS基本培养基均比MS基本培养基的诱导率高, 最多可高出12.5%;BA的诱导率均比KT的诱导率高, 最多可高出25%。

2.2.4不同浓度的6-BA和NAA对亚历桑娜红掌愈伤组织的诱导影响。从表5中可看出, 培养基1/2MS+BA2.0+NAA0.2产生的愈伤组织最多, 即当细胞分裂素/生长素的比值为10时产生的愈伤组织最多。

随BA浓度的增大, 质地逐渐变紧密、坚硬。随NAA浓度的增加愈伤组织趋于疏松。根据前人的研究, 黄绿色的愈伤组织是结构稍致密的生长较快的愈伤组织, 在以后的继代培养中均可分化出不定芽。

将愈伤组织接种在继代培养基上, 待不定芽长到2cm左右, 转入生根培养基诱导生根。

3结论与讨论

10~12min是安祖花叶片和叶柄的最佳消毒时间, 污染率仅为10%。12~15min是安祖花茎尖和茎段的最佳消毒时间, 污染率为30%。幼嫩刚展开的叶片是安祖初代培养的最佳外植体。诱导安祖花出愈的较优培养基为1/2MS+BA2.0+NAA0.2。

本文没有选用2, 4-D来诱导安祖花的愈伤组织, 是由于2, 4-D易于使植物快速产生愈伤组织, 但不利于植物外植体再分化出芽。会给研究者造成其利于外植体脱分化的假象, 而对安祖诱导出芽, 形成完整植株才是进行安祖组织培养的最终目的。

摘要：本试验以盆栽亚利桑娜红掌和友谊彩掌为试验材料, 对安祖愈伤组织的诱导进行研究。得出安祖茎尖和茎段的最佳消毒时间是1215min, 叶片和叶柄的最佳消毒时间是10-12min;幼嫩叶片是适合安祖初代培养的外植体;基本培养基1/2MS基优于MS、细胞分裂素BA优于KT;1/2MS+BA2.0+NAA0.2对诱导安祖产生愈伤组织的效果最好。

关键词：红掌,彩掌,安祖,组织培养,愈伤组织

参考文献

[1]毛静琴, 丁全发, 刘英翠, 等.灯台花组织培养与快速繁殖技术研究[J].河北林果研究, 2000, 15 (3) :240-242.

[2]穆鼎.鲜切花周年生产[M].北京:中国农业科技出版社, 1996:183-192.