病毒核酸范文

病毒核酸范文（精选8篇）

病毒核酸 第1篇

1 基因疫苗的免疫保护机理

DNA免疫可以诱导机体产生体液免疫和细胞免疫[2]。彭金美等分别以HA、t HA、tHA+NP和tHA+NP+IFN为免疫基因构建了4个禽流感病毒的重组质粒, 结果发现4个重组质粒免疫后在攻毒前都没有诱导产生可检测的HI抗体, 但是免疫后第2周免疫鸡外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞的百分比含量呈上升趋势, 免疫后第4周明显高于对照组。说明细胞免疫在DNA免疫中发挥了重要作用[3]。

在合适条件下接种DNA疫苗后, 质粒DNA被导入宿主细胞内, 抗原编码基因即在质粒所带强启动子的作用下表达抗原蛋白, 随后被降解成8–12氨基酸的短肽, 这些短肽含有不同的抗原表位, 或者分别MHC-Ⅰ类分子或者MHC-Ⅱ类分子结合, 然后被抗原提呈细胞递呈到细胞表面, 激活相应的T细胞和B细胞, 诱导细胞免疫和体液免疫应答。尽管基因疫苗接种后在动物体内产生的抗原蛋白量极为有限, 但可诱导全面的细胞和体液免疫应答, 这与活疫苗相类似, 而就目前的免疫学理论, 普遍认为等量的抗原蛋白直接免疫动物几乎不能诱发细胞免疫应答。Wolff等认为接种了DNA疫苗的宿主成了一个“临时工厂”, 能制造抗原并产生对感染的保护性免疫应答[2]。

1.1 体液免疫应答

研究表明禽流感病毒感染及其疫苗免疫反应中HI和中和抗体反应是两种重要的体液免疫反应[4]。研究表明鸡体内的HI抗体水平与病毒感染和排毒有关, 抗体水平高时, 能够保护鸡不发病, 不排毒[5]。HA DNA疫苗诱导的保护性免疫是抗体介导的免疫反应, 较高水平的HI抗体通常意味着可靠持久的保护。对相同毒株或者抗原相似的毒株的再次感染, HA抗体能够提供完全的保护作用, 对抗原漂移的变异株提供部分保护效果, 而对不同亚型的毒株几乎不能提供保护[6]。姜永萍等对疫苗质粒pCA Ggopti HA5以不同剂量和方法免疫SPF鸡, 免疫效果表明, pCAG Gopti HA5具有良好的免疫原性和免疫保护性。不仅诱导了高水平的HI抗体和中和抗体, 而且中和抗体水平远远高于HI抗体水平[7]。

1.2 细胞免疫反应

HA等能够刺激机体产生中和抗体和细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) 反应, 使机体可以抵抗感染和疾病[8]。虽然每种流感病毒蛋白 (包括HA) 均能够刺激机体产生CTL反应, 但是其主要的靶抗原是病毒内部蛋白NP。针对NP的CTL反应的重要特点包括A型流感病毒多种亚型之间的交叉保护反应[9], 并能够降低对抗原漂移的敏感性。H1亚型NP DNA疫苗能够有效交叉保护实验小鼠免受H3亚型病毒的感染[1]。由于识别来源于不同流感病毒亚型的保守内部蛋白如NP的多肽而表现交叉保护模式, 所以CTL在抵抗A型流感病毒方面具有至关重要的作用。

1.3 免疫记忆

DNA疫苗具有“抗原储藏器”作用, 在没有加强免疫接种的情况下, 能够连续不断的产生蛋白产物刺激免疫系统。Raz等皮内接种流感病毒核蛋白 (NP) 的DNA疫苗后, 对NP的体液和CTL应答至少维持17个月, 如果在第7月二次免疫, 抗体滴度可达到原来的10倍[10]。这说明基因免疫能产生免疫记忆效应。因此, 选择适当时机加强免疫可以提高免疫效果。

2 国内外禽流感病毒基因疫苗的研究现状

目前预防禽流感病毒最主要的措施是接种全病毒疫苗。由于流感病毒保护性抗原的易变性, 需要每年更换疫苗株。Kodihalli等认为HA DNA疫苗能够提供机体抵抗致死性H5N1的免疫保护, 该研究同时表明:当新病毒出现的时候, 质粒DNA的直接接种是可行的[11]。目前禽流感病毒基因疫苗的研究主要是针对HA、NA和NP基因开展的。

2.1 HA DNA疫苗

HA DNA疫苗一直是预防新型流感病毒感染的主要研究方向, HA为流感病毒的主要保护性抗原, 诱导机体产生抗体。HA DNA疫苗通过在体内表达病毒HA蛋白抗原, 能够模拟流感病毒的自然感染过程诱发机体的保护性免疫, 主要是抗体介导的免疫反应。姜永萍等在多株高致病力禽流感病毒H5亚型与Gs/GD/1/96 (H5N1) 的HA基因核苷酸序列高度同源的基础上, 构建疫苗质粒pCAGGoptiHA5。SPF鸡免疫效果表明, pCA GGopti HA5具有良好的免疫原性和免疫保护性。不仅诱导了高水平的HI抗体和中和抗体, 而且中和抗体水平远远高于HI抗体水平[12]。陈化兰等构建了A/Afri Star/Eng-Q/983/79 (H7N1) HA基因真核表达质粒, 免疫鸡试验结果表明HA DNA疫苗, 在极小的使用剂量下即可成功诱导免疫保护反应, 并有效阻断同源低致病性禽流感病毒在机体内的感染和排毒[13]。

2.2 NA DNA疫苗

NA DNA疫苗是流感病毒非常有前景的疫苗。NA蛋白是流感病毒的一个重要的外结构蛋白, 也是一个重要的抗原蛋白。HA和NA为病毒毒力相关的表面糖蛋白[14], HA抗体可以抑制病毒感染[15], 而NA抗体则预防流感的发生[16]。Chen等在对比编码PR8病毒HA、NA、M1、NP和NS1的DNA疫苗的保护效果时, 发现HA DNA免疫能诱导特异性IgG抗体中和病毒, 阻止流感病毒感染, 而NA DNA诱导的抗体能降低病毒的复制, 使病毒感染不表现症状[17]。

2.3 NP DNA疫苗

NP为流感病毒的内部蛋白, 氨基酸序列比较保守, 主要诱导机体产生细胞免疫反应。但是NP DNA疫苗的免疫效果不理想。Chen等发现流感病毒A/PR/8/34 (H1N1) 的NP DNA疫苗不能对BALB/c小鼠提供免疫保护作用[18]。Robinson等也报道了是HA DNA而不是NP DNA能够保护小鼠免受致死性病毒的攻击[19]。

3 核酸疫苗免疫效果的影响因素

3.1 联合免疫对免疫效果的影响

HA和NA为病毒毒力相关的表面糖蛋白[14], HA抗体可以抑制病毒感染[15], 而NA抗体则预防流感的发生[16]。不同质粒DNA疫苗的联合免疫可以提高免疫效果。Chen等利用流感病毒A PR/8/34 (H1N1) 的HA、NA分别构建真核表达载体, 然后对BALB/c小鼠免疫接种, 比较DNA疫苗的免疫保护效果。结果表明, HA DNA或者NA DNA疫苗诱导高水平的特异性抗体反应, 对致死性流感病毒的攻击能够提供好的免疫保护。同时还发现, 将HA DNA和NA DNA同时免疫接种能够增强小鼠抵抗病毒攻击的能力[18]。

3.2 接种方法及剂量对基因疫苗免疫效果的影响

目前疫苗常见接种途径主要包括肌肉、皮内、静脉、皮下、腹腔和鼻腔等多种途径, 对流感病毒DNA疫苗而言, 有效的接种途径包括电转化、基因枪介导的皮内接种和肌肉注射。Chen等比较基因枪与肌肉注射对DNA疫苗的影响效果, 结果显示HA DNA疫苗的肌肉注射BALB/c小鼠仅能诱导产生低水平的血清IgG抗体效价, 不能降低肺部的病毒浓度滴度[20]。Chen等通过基因枪接种在BALB/c检测多种NA DNA疫苗对流感病毒攻击的保护和交叉保护能力, 结果表明基因枪接种NA DNA疫苗比电转化DNA疫苗在诱导免疫反应方面的效果稍弱[21]。Meric通过肌肉注射与电转化方法对BALB/c小鼠免疫接种HA蛋白DNA疫苗, 结果表明, lug和10ug的DNA电转化后其细胞与抗体免疫应答都有显著增强, 但对较低的剂量无此效应[22]。

新冠病毒核酸检测样本采集培训试卷 第2篇

姓名：

1、核酸检测采样前（）小时尽量避免进食，以免引起呕吐。

A

1小时

B

2小时

C

3小时

D

4小时

2、采样前（）分钟请勿吸烟、喝酒和嚼口香糖，以免影响结果。

A

10分钟

B

20分钟

C

30分钟

D

40分钟

3、采样人员将拭子放入（）中湿润。

A

无菌生理盐水

B

病毒保存液

C

灭菌用水

D

5%葡萄糖

4、核酸标本采集时，操作必须严格按照（）防护要求。

A

一级

B

二级

C

三级

D

四级

5、口咽拭子采集方法：使用咽拭子适度擦拭（）

A

舌根

B

上颚

C

两侧扁桃体及咽后壁

D咽部

6、核酸标本采集不需要准备以下物品（）。

A

病毒采集管

B密封袋

C

手消毒液

D听诊器

7、采集两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少（）次。

A

1次

B

2次

C

3次

D

4次

8、核酸样本室温保存不超过（）小时。

A

1小时

B

2小时

C

3小时

D

4小时

9、核酸样本4摄氏度可以保存（）小时。

A

8小时

B

12小时

C

16小时

D

24小时

10、咽拭子正确使用方式（）

A

病毒核酸 第3篇

一、病毒核酸的结构特点

病毒的DNA多数为双链结构, 如腺病毒。也有单链DNA, 如微小病毒科的病毒。乳多孔病毒等是双链环状DNA, 后者可在酶作用下形成超螺旋结构, 也可从超螺旋结构转变为松弛环型DNA。病毒的线状DNA末端有末端重复序列 (terminal repeat, TR) , 在复制时能使DNA环化, 对病毒DNA复制有重要意义。RNA病毒多数为单链线状RNA, 少数呈双链结构。例如, 呼肠孤病毒 (reovirus) 有10个RNA片段。轮状病毒有11个片段, 都为双链RNA分子。流感病毒的8个片段为单链RNA分子。病毒基因组的核酸有正链和负链之分。如果病毒的单链RNA基因组直接作为m RNA, 则称为正链漱, 这些病毒称为正链RNA病毒。如果病毒RNA不能直接作为m RNA, 而以互补的RNA链作为m RNA, 这种病毒称为负链RNA病毒。正链RNA分子可以直接感染动物细胞, 合成病毒的外壳和核酸, 并组装成病毒体。负链RNA分子本身无感染性, 需要转录成m RNA才具有感染性[2]。负链RNA病毒的基因组在转录为m RNA (与基因组RNA互补的RNA) 的过程中, 需要依赖于RNA作为模板的RNA聚淦瓣 (RNW dependent RNA polymerase) 催化, 但此酶在细胞内不存在, 而是由病毒颗粒携带的。因此, 这种病毒的负链RNA分子感染细胞后不能完成m RNA合成过程, 不能复制病毒。只有负链RNA病毒颗粒感染细胞后才能复制出病毒。病毒DNA也有正、负链, 这与DNA单链作为转录模板有关。

二、病毒核酸的生物学意义分析

1、对DNA复制的观察

DNA复制时, 严格遵守碱基配对的互补原则, 如果复制不发生差错, 子代与新代的遗传基础是相同的。DNA复制分三种类型:半保留型、保留型和滚环型。

(1) 半保留型Meselson和Stahl通过实验证明了DNA复制的半保留型。首先, 联结双链的氢键打开, 变成两条单链, 两条单链通过互补方式, 各自形成一条新链。这样, 子代的双链中就各有一条来自于亲代的旧链, 即亲代的一半保留下来, 故称半保留型。DNA复制时需要有DNA聚合酶 (复制酶) 存在, 由于聚合酶一般只有由5’到3 7端方向起作用, 而DNA双链又是反向平行的, 所以两条链复制的方向是相反的。

根据罔崎片段的存在, 证明DNA复制形成的二条新的互补链中, 有一条是不连续的, 先形成一些DNA片段 (被称为罔崎片段) , 这些片段再经连接酶的作用, +连接成完整的长链。

(2) 全保留型DNA亲代双链在复制子链过程中, 一面产生子链, 一面亲链又重新结合, 结果产生的两个DNA分子中, 一个仍是亲代原来的双链, 另一个是新生的子代双链[3]。

(3) 滚环型+X174噬菌体可能采取这种方式复制。首先环状DNA上在内切酶作用下, 在正链上作一切口。这样DNA聚合酶在开链的3’末端加上核苷酸, 形成单链尾巴。当聚合酶围绕环状负链模板移动时尾巴不断延长, 生成大于一个单元长度的DNA, 其长度可达亲体的4倍。

多起点性是真核细胞DNA复制的特点, 大多数病毒和细菌都是单一起点。病毒感染宿主细胞则在细胞中就会有病毒DNA和细胞DNA。不过, 病毒DNA (或RNA) 比较短, 形态比较一致, 以此可以加以区别[4]。

2、病毒核酸分子的形态观察

我们可以采用一系列核酸提取的方法, 将病毒体内的核酸分离出来, 如RNA可以采用梯度离心、凝胶电泳、层析、逆流分溶方法, DNA可以采用蔗糖梯度区带离心, 氯化铯密度梯度离心, 平衡密度梯度离心, 柱层析、电泳、化学溶剂等方法提取。对提纯的病毒核酸, 我们就可以采用有效的电镜技术进行病毒核酸形态学的观察。目前已经查明, 在动物、植物、细菌病毒中的核酸形态类型有如下几种:DNA中, 有线形双股DNA、线形双股单股分段DNA、闭合双股DNA、闭合环形双股DNA、线形单股DNA、线形环状DNA等。RNA中有线形双股分段RNA、线形单股 (+) RNA、线形单股分段RNA、线形单股 (-) RNA、线形单股分段 (-) RNA、线形二聚单股RNA等。

结论

总之, DNA合成的中心问题是DNA复制的单起点性或多起点性和合成起始的单向性或双向性。任何复制点, 只要不在末端, 都是两股拉开形成一个泡状结构。如果一条链内有两个泡状形成, 则说明复制的多起点性。

参考文献

[1]王翔军, 徐国强.临沂市手足口病肠道病毒核酸检测及流行病学特征分析[J].中华医院感染学杂志, 2013, 14:3443-3445.

[2]崔爱利1, 金俐2, 许文波1*.构建一种新型腮腺炎病毒核酸检测阳性对照品[J].病毒学报, 2013, 05:544-547.

[3]胡伟, 胡孝彬, 代琼, 陈江.慢性乙型肝炎病毒感染者血清乙型肝炎病毒核酸相关抗原检测的应用价值[J].实用医技杂志, 2013, 10:1055-1057.

病毒核酸 第4篇

一、工作目标 各行政村范围内在疫情暴发时5-7日内完成全员核酸检测，局部疫情在1日内完成疫点全员核酸检测，落实“早发现、早隔离、早诊断、早治疗”，及时釆取有效防控措施，最大限度降低传播风险、保障经济社会恢复正常秩序和人民生活健康安全。

二、工作原则 属地负责。乡疫情防控领导小组负责全乡全员核酸釆样检测工作，制定辖区全员核酸检测预案，组织开展采样检测活动。乡财政落实采样检测工作经费、物资保障。

乡级统筹。乡疫情防控领导小组统筹协调，各村按分工做好全乡采样检测工作保障，统一调配全乡釆样检测工作支援。

网格管理。按属地管理原则，以村为单位，按照“乡干部包村、村干部包组”方式，由乡疫情防控领导小组牵头负责，各村配合辖区内全员核酸检测工作具体实施。

分步实施。做好准备，及时响应，有序推进，加强流动人口、租住、留（寄）宿人员管理，确保划定区城内人员一个不漏。各村根据现场工作预案，按照群众发动、信息釆集、按日定人、按序实施的顺序推进釆样检测工作。

三、应对准备 (一)设置采样地点。

全乡以村（社区）为单位共设置9个采样点，XX村采样点设置在XX村卫生室、XX村采样点设置在XX村卫生室、XX村采样点设置在XX村委会、XX村采样点设置在XX村卫生室、XX村采样点设置在XX村卫生室、XX村采样点设置在XX村卫生室、XX村采样点设置在XX村卫生室、XX村采样点设置在XX村委会、XX社区采样点设置在XX社区居委会。各采样点按照《新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范》(联防联控机制医疗发[2020]352号）规范设置，合理设置等候区、采集区、缓冲区、临时隔离区。由各村（社区）负责布置，派驻采样人员负责指导。

1、等候区。设置在室外并划分人行通道及一米线，保障等候人员的防护安全。对老年人、儿童、孕妇和其他行动不便者优先采集。

2、采集区。根据采样点室内条件，选择采光、通风布局较合理房间，保证医护人员在相对舒适环境下工作。配备采集用消毒用品、拭子、病毒采集管，并为受检人员准备纸巾、呕吐袋和口罩备用。

3、缓冲区。空间应相对密闭，可供采集人员更换个人防护装备，放置与采样规模相匹配的防护用品、采集用消毒用品、拭子和采集管，户外消杀设备。

4、临时隔离区。用于暂时隔离在采集过程中发现的疑似患者或高危人群。

(二)组建工作队伍。

全乡以村(社区)为单位共组建9支采样工作队伍，每支队伍中村(社区)工作人员不少于2人、采样人员按《XX县全员核酸检测网格管理分工安排表》配备。指定村(社区)工作人员中1人为组长，组长总负责采样点总体工作，村(社区)工作人员负责群众组织、采样信息登记、后勤保障、现场秩序等，采样人员负责核酸采样、送样和现场医废物处置等。有条件的可指派警务人员参与现场秩序维护。

四、具体流程 (一)启动响应。县疫情防控应急指挥部根据疫情爆发情况，启动全县全员核酸检测应急响应，明确以各乡镇为主体，在5-7日内完成全员核酸检测任务。

(二)迅速应对。我乡根据应急响应，启动工作预案，做好宣传发动、安全保障、派出人员、物资调配等。

(三)开展采样。各村（社区）要摸清常驻人口底数，按1天采集本行政村人数的1/5的人数进行分配，每个标本采集点至少安排2条标本采集通道，按每个通道1小时完成40人份左右的采样速度，分批次安排被检测人群。安排人员维持现场秩序，工作人员在标本采集前收集并登记受检者相关信息（内容应包括姓名、性别、身份证号、联系电话、采集地点、采集日期和时间等信息），登记表纸质版应随标本一并送至核酸检测机构，便于及时追溯受检者。如遇发热或疑似患者样本另外用红色贴纸标识并另外存放，以优先检测，按检测报告时限要求，及时反馈结果。

（四）标本转运。各釆样点标本采取完成后，按照村划分的原则进行标本转运，每个标本釆集点，每天至少转运1次。对于疑似样本做到及时转运。

病毒核酸 第5篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我站2011年7月~2014年12月的79089份无偿献血标本。用于核酸检测标本:带分离胶ED-TA-K2抗凝真空采血管 (5ml/管) ;用于酶免4项和ALT检测标本:EDTA-K2抗凝真空采血管 (5ml管) 。准确记录具体的采集样品编码、日期等基础信息, 所得到的标本通过离心处理后放至2℃~8℃冰箱内, 在72h内做ELISA法HBs Ag检测和HBV核酸检测。

1.2 仪器与试剂

Uranus AE200全自动酶免仪, HAMIL-TON STAR全自动加样仪, ABI7500荧光扩增仪, HBs Ag (ELISA) 检测试剂 (上海科华和珠海丽珠) , HBV/HCV/HIV三联核酸提取试剂和检测试剂 (上海科华) 。

1.3 检测方法

1.3.1 ELISA检测

在完成HBs Ag检测过程中给予所得到的每份献血标本2种ELISA试剂, 每批实验需具有空白对照组、室内质控、阳性, 阴性对照组。具体判定标准为:S/CO≥1 (阳性, 血液检测结果不符合标准) , S/CO<0.7 (阴性, 血液检测结果符合标准) , 0.7≤S/CO<1 (灰区, 血液检测结果不符合标准) 。

1.3.2 核酸检测

采用混样的方法检测核酸, 每份混样有8个标本且设定内对照及室内质控, 将混合测定呈阳性者予以拆分检测和将混合测定阴性判定为阴性, 当拆分测定呈阳性则判定为NAT阳性, 呈阴性则判定为NAT阴性。

2 结果

经血清学检测, 2种酶联免疫法吸附试剂检测无偿献血标本的HBs Ag均呈阴性的79050份无偿献血标本进行核酸检测, 核酸检测呈阳性者12份, 检出率为0.015%。其中乙肝“二对半”检测全阴性3份, HBs Ab单独阳性1份, HBc Ab阳性8份;HBs Ag单试剂阳性的19份标本, 核酸检测呈阴性18份, 阳性1份;HBs Ag双试剂阳性的20份标本, 核酸检测呈阳性18份, 阴性2份。因本次研究未对所有单试剂阳性标本和双试剂阳性标本进行核酸检测, 因此未做HBs Ag (ELISA) 检测单试剂漏检率和核酸检测漏检率的统计与分析。

3 讨论

核酸检测技术先后被亚洲及欧美等20多个国家和地区作为筛查献血者血液的方法, 作为高度敏感、特异的筛查输血传染因子的检测方法主要针对的是HIV、HCV和HBV, 我国通过核酸方法检测HBV正逐渐被推广应用。有相关研究表明[6,7], 在献血者血液筛查中应用核酸检测技术能有效提高输血安全。同时也有相关研究资料发现, 经核酸检测能够缩短HIV、HBV、HCV的ELISA“窗口期”, 大幅度降低病毒经输血传播的风险。本文研究结果显示, 两种酶联免疫法吸附试剂检测无偿献血标本的HBs Ag均呈阴性的79050份无偿献血标本, 经核酸检测呈阳性12份, 检出率为0.015%。其中乙肝“二对半”检测全阴性3份, HBs Ab单独阳性1份, HBc Ab阳性8份。由此可以看出, 乙肝“二对半”检测全阴性的3份标本是处于ELISA窗口期在核酸检查时被发现且有HBV感染现象;其余9份标本则属于HBV的隐匿性感染[8], 这进一步说明核酸检测对血液筛查具有重要的意义。另从HBs Ag单试剂阳性的19份标本, 核酸检测呈阴性者18份, 阳性者1份;HBs Ag双试剂阳性的20份标本, 核酸检测呈现阳性18份, 阴性2份的结果可以看出:使用HBV核酸检测方法和ELISA方法检测HBs Ag对无偿献血者进行血液筛查, 均存在单一方法或单试剂漏检情况, 尤其在病毒载量较低的情况下运用核酸筛查难以准确检测出。因此它不能完全替代ELISA, 只能作为其补充, 二者共同应用可提高检测准确性和血液安全性。此外, 在应用核酸检测时所使用的试剂要求具备高度特异性和灵敏性且实验环境比ELISA检测要求更为严格[9]。

综上所述, 应用核酸检测对献血者血液进行乙型肝炎病毒筛查, 不仅具有较高的敏感性, 能有效缩短ELISA方法检测HBs Ag的窗口期, 而且能有效降低隐匿性乙型肝炎病毒的输血传染风险, 但两者不能相互取代, 使用两种方法共同对无偿献血者进行血液筛查, 相互补充, 能够进一步提高血液的安全性。

摘要：选取采用两种酶联免疫法吸附试剂检测无偿献血标本的乙肝表面抗原 (HBs Ag) 均呈阴性的79050份进行核酸检测, 核酸检测结果呈阳性的标本进行乙肝“二对半”检测。此外, 选取HBs Ag单试剂阳性标本19份、双试剂阳性标本20份, 进行核酸检测。HBs Ag双试剂检测均呈阴性的79050份标本, 核酸检测呈阳性12份, 检出率为0.015%, 其中乙肝“二对半”检测全阴性3份, HBs Ab单独阳性1份, HBc Ab阳性8份;HBs Ag单试剂阳性19份标本, 核酸检测呈阴性18份, 阳性1份;HBs Ag双试剂阳性20份标本, 核酸检测呈现阳性18份, 阴性2份。应用核酸检测献血者乙型肝炎病毒有较高的敏感性, 能有效降低隐匿性乙型肝炎病毒的输血传染、缩短HBs Ag检测的窗口期, 一定程度上弥补了ELISA的局限性;另从HBs Ag单试剂阳性标本19份, 核酸检测呈现阴性18份, 阳性者的1份;HBs Ag双试剂阳性20份标本, 核酸检测呈阳性18份, 阴性2份的结果可以看出, 使用HBV核酸检测方法和ELISA方法检测HBs Ag对无偿献血者进行血液筛查, 均存在单一方法或单试剂漏检情况, 因此不能相互取代, 使用两种方法共同对无偿献血者进行血液筛查, 相互补充, 能够进一步提高血液的安全性。

关键词：献血者,乙肝炎病毒,核酸检测

参考文献

[1]何亚琴, 徐立, 杨爱龙, 等.核酸检测在筛查献血者乙型肝炎病毒中的应用[J].中国输血杂志, 2013, 26 (3) :147-149.

[2]黄宏亮, 徐志华, 贾红志, 等.核酸检测技术在江苏省盐城地区献血者筛查中的应用[J].国际输血及血液学杂志, 2014, 37 (1) :20-22.

[3]赵桂红, 陈晓欢, 邓雪莲, 等.献血者HBs Ag ELISA检测与HBV DNA检测的比较分析[J].国际检验医学杂志, 2012, 33 (19) :2388-2389.

[4]曹晓, 曹庆宝, 李杰, 等.核酸检测技术在唐山地区献血者血液筛查中的应用[J].检验医学与临床, 2014, 35 (5) :634-635, 637.

[5]褚小慧.荧光定量PCR检测HBV DNA与ELISA检测乙肝病毒血清标志物结果的关系探析[J].现代诊断与治疗, 2013, 23 (16) :3794-3795.

[6]王杏芳.两种检测法对乙肝表面抗原弱阳性及少见模式标本的对比分析[J].现代诊断与治疗, 2013, 23 (17) :3953-3954.

[7]蔡丽娜, 陈宝安.核酸扩增技术 (NAT) 在献血者血液初筛中的应用现状[J].中国实验血液学杂志, 2014, 22 (4) :1171-1177.

[8]刘丽, 王明民, 赵林.隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究进展[J].疑难病杂志, 201331 (7) :123-125.

病毒核酸 第6篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

资料来源于2014年6月-2016年6月天津市第四中心医院送至我中心检测的1 553份疑似流感患者的咽拭子。

1.2 方法采集时用带有聚丙烯纤维头的试子擦拭

双侧咽扁桃体和咽后壁,然后将试子头浸入无菌病毒采样液中,尾部弃去。在4℃条件下24h内送至全国流感监测网络实验室;未能24h内送至实验室进行检测的,应置于-70℃或以下保存。试剂和仪器采用AB公司的7500Fast型Real-time PCR仪以及该公司的Ag Path-IDTM One-Step RT-PCR Reagent Kit试剂。RNA提取采用上海之江核酸自动提取仪EX2400及其配套的试剂盒进行病毒核酸提取。

1.3 实验步骤

流感病毒核酸提取——上海之江核酸自动提取仪EX2400及其配套的试剂盒。(1)标本于旋涡振荡器充分震荡10 min;(2)取出一块预装板,撕开铝膜,分别加6μl RNA助沉剂及300μl标本于预装板对应的A1-A12孔;(3)将预装板放入核酸自动提取仪的卡槽内,安装好磁套,运行程序;(4)运行结束后,弃掉磁套,于核酸自动提取仪内取出预装板,将E1-E12对应孔中的液体转移至无RNAse管中,直接用于检测或-20℃保存备用;(5)Real-time PCR反应体系的配制,见表1。

在提取间,向配制好的反应体系(20μl)中加入5μl流感病毒核酸提取液,进行PCR扩增反应。若Ct值<35,且扩增曲线呈S形,则结果为阳性;若无Ct值,则结果为阴性。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,计数资料用n(%)表示,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2014年6月-2016年6月天津市第四中心医院送至我中心检测的1 553份流感样病例咽拭子中,共检出阳性标本299份,检测阳性率为19.25%;甲型病毒183份,占61.20%,其中季节性甲3型病毒161份,占53.85%,新甲1型病毒22份,占7.36%;乙型病毒116份,占38.80%,其中BV型41份,占13.71%,BY型75份,占25.08%;各类型流感病毒阳性率之间差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

流感病毒是一种RNA病毒,它可造成人类及动物患流行性感冒,属于正粘病毒科,可分成甲、乙、丙3型[1],这3型病毒具有相似的生化和生物学特征。世界卫生组织(WHO)以及各国政府都非常重视对流感的预防和控制,是WHO实行的第一个全球性监测传染病[2]。流感传染性强,可迅速传播,潜伏期短,因此加强对流感的检测和预防是尤为重要的。

流感病毒致病能力强,容易发生变异,如果人群对变异毒株的免疫力低下,容易发生暴发流行,因此流感对人类的危害不可小觑,一场流感的暴发流行可降低人群的平均寿命水平[3],所以提高对流感病病毒核酸检测的准确性,加强对流感的预防控制尤为重要。为此本中心采用Real-time PCR的方法对流感病毒核酸进行检测,取得了良好的效果。

Real-time PCR技术的具有敏感性较高,重复性较好,直观性好,易操作等优点,由于其采用闭管检测的方法,可以将实验过程中对实验室的污染降到最低;采用磁珠法提取核酸,操作方便,而且能够提高核酸提取效率。在核酸检测中,设计灵敏、特异的引物和探针是实验成功的关键因素之一[4]。

经实验得出,2014年6月-2016年6月在1 553份疑似流感患者咽拭子中共检出阳性标本299份,检测阳性率为19.25%,其中季节性甲3亚型阳性率最高,各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义。每年7~11月流感病毒阳性例数呈上升趋势,在12月达到高峰期,其中以季节性甲3亚型流感病毒为主要流行株,次年1~5月流感病毒阳性例数呈下降趋势,其中以BY型流感病毒为主要流行株。由此可见,Real-time PCR法在流感病毒核酸检测方面具有很好的优势。

在实验操作的过程中,有以下几个注意事项:(1)对实验区域要进行严格划分,在不同区域使用专属的实验器材;(2)从样品中提取的核酸最好立即检测,不能及时进行实验的应将其冷冻保存,以防止降解;(3)移液器要经常进行校准,在操作过程中,动作要熟练,防止遗漏;(4)要特别注意实验过程中会造成污染的环节,实验结束后,用紫外线灯对周围环境进行消毒;(5)PCR管上不可用记号笔标记,应使用平盖或光膜覆盖,使用后应直接废弃,不可以在实验区域开启平盖或光膜;(6)应注意加样顺序,先加无模板对照,后加阴性对照,再加样品,最后加阳性对照。

综上所述,对于流感病毒核酸的检测,Realtime PCR是一种有效的检测方法,其具有较高的特异性与重复性,可对流感病毒进行快速准确的检测,为分析流感的流行趋势,科学防控流感提供了重要依据。

摘要：目的 探讨在流感病毒核酸检测中,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)这种检测方法的应用效果,通过对哨点医院2014年6月-2016年6月所采集的1 553份流感样病例咽拭子的分析,了解流感病毒的流行趋势,为预防流感提供科学依据。方法 选取2014年6月-2016年6月天津市第四中心医院送至北辰区疾病预防控制中心检测的1 553份流感样病例咽拭子,采用Real-time PCR的方法进行核酸检测,分析所选取标本的阳性率以及阳性标本的类型,了解流感病毒的流行趋势。结果 在2014年6月-2016年6月送至该中心检测的1 553份咽拭子中,共检出阳性标本299份,检测阳性率为19.25%;甲型病毒183份,占61.20%;乙型病毒116份,占38.80%,各类型流感病毒阳性率之间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 Real-time PCR可以快速有效地对流感病毒核酸进行检测,为分析流行趋势、预防流感提供科学有效的依据。

关键词：实时荧光定量PCR,流感病毒,核酸,检测

参考文献

[1]赵娣伟.流行性感冒病毒检测方法的研究进展[J].职业与健康,2014,30(11):1553-1555.

[2]朱琳,陈东,袁丹,等.岳阳市2009-2012年流行性感冒监测结果分析[J].中国卫生检验杂志,2014,24(8):1172-1175.

[3]周雪花.实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用[J].中国卫生产业,2014,10(30):178-179.

病毒核酸 第7篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2010年4月~2011年1月的宫颈脱落细胞标本395例。

1.2 采集方法

将宫颈刷置于宫颈口, 轻轻搓动宫颈刷顺时针旋转5圈后, 放入标有患者编号的细胞保存液管中, 送检。

1.3 试验方法

1.3.1 HPV-DNA分离提取

取保存有宫颈细胞的细胞保存液0.5 ml, 以14 000 rpm离心10 min, 弃上清液后, 利用凯普生物化学科技公司提供的基因组抽提试剂提取DNA, 严格按照说明书操作。

1.3.2 PCR扩增

扩增仪由上海宏石医疗科技有限公司生产的SLAN荧光定量PCR仪, 试剂由潮州凯普生物化学有限公司提供。分别设阴性对照和阳性对照各1份。

1.3.3 杂交

试剂由凯普生物化学有限公司提供, Hy Bri Max医用核酸分子快速杂交仪由凯普生物科技有限公司提供。

2 结果

2.1 患者年龄分布

2010年4月~2011年1月笔者检测了395例HPV感染患者, 其中, 20~29岁18例, 占4.8%;30~39岁185例, 占46.8%;40~49岁175例, 占44.3%;50~59岁16例, 占4.1%;60岁以上1例。以30~49岁为最多。

2.2 HPV-DNA分型情况

395例患者中, 检出HPV感染179例, 阳性率为45.3%。单一类型感染145例, 占总感染的81.0%;二种类型感染27例, 占总感染的15.1%;三种类型及以上感染7例, 占总感染的3.9%。见表1、2。

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一, 全球范围内其发病率在女性恶性肿瘤中排第二位。据世界范围内统计, 每年约有49.3万的宫颈癌新发病例, 其中, 有27.4万妇女死于该病, 并且83%的宫颈癌发生在发展中国家[1,2], 而我国宫颈癌患病率和死亡率均占世界的1/3。同时也是我国妇女发病率最高的恶性肿瘤之一, 严重威胁着广大妇女的生殖及生命健康, 我国的宫颈癌发病率呈总体下降趋势但年轻患者发病率呈增加的趋势。而高危型HPV持续感染是宫颈癌发生、发展的必要条件[3], HPV感染与宫颈上皮肉瘤样病变 (CIN) 和宫颈癌 (ICC) 的发生、发展密切相关, 它影响着CIN和ICC的病理分类和临床治疗[4]。HPV含量与宫颈癌病变程度正相关[5]。宫颈癌亦因而成为目前唯一一种原因明确的可以预防和治愈的恶性肿瘤[6,7]。

及时正确的宫颈病变诊断和治疗对宫颈病变的转归及预后有重要影响, 选择灵敏度高、特异性强的HPV的分型检测方法, 是实现早期筛查的保证。本实验采用的实时荧光定量PCR技术, 结合了PCR的高灵敏性和探针杂交的高特异性, 利用杂交导流的原理, 在已经固定好核酸探针的低密度基因芯片膜上可快速准确区分占中国人群HPV感染95%的21种类型, 并在数小时内获得结果, 是临床诊断和普查的理想方法。在本实验中, HPV16及HPV58感染率最高, 分别占31.0%和19.3%, 这与曾维英等[8]的报道相近, HPV 16/18型阳性率达28.1%, 这可能与地区性分布有关。而在各年龄组中又以30~49岁感染率最高, 占感染人群的91.1%, 提示该年龄段人群应密切关注HPV的感染情况, 并定期筛查。

摘要：目的:分析本院就诊的女性人乳头状瘤病毒 (HPV) 感染的型别分布。方法:采用核酸分子快速导流杂交分型技术对395例女性进行HPV分型检测。结果:HPV阳性率为45.3%, 在被检测到的21个HPV亚型中单一型感染占81%, 以HPV16亚型最多, 占31%;混合型感染占总阳性感染的19%。HPV感染主要分布在30～49岁年龄段。三重感染及以上占3.9%。结论:运用导流杂交技术检测HPV感染具有较好的临床应用价值。及早发现高危人群, 最大限度地降低子宫颈癌对妇女生命和健康的威胁。

关键词：人乳头状瘤病毒,核酸杂交,宫颈癌

参考文献

[1]余雷, 杨建勇.宫颈癌的介入治疗进展[J].微创医学, 2010, (4) :373-375.

[2]赵虎, 张庆.局部晚期宫颈癌新辅助化疗48例临床分析[J].中国医药科学, 2011, 1 (5) :55-56.

[3]李淑敏, 章文华, 吴令英.人乳头癌病毒负荷量与子宫颈癌及癌前病变关系的初步研究[J].中华妇产科杂志, 2004, 34 (6) :400.

[4]张菊, 高艳娥, 赵锦荣.HPV检测在宫颈癌预警和筛查中的研究[J].国外医学:妇产科学分册, 2003, 30 (5) :319-322.

[5]梁彩虹, 杨光.宫颈癌病理组织中HPV基因型别分析[J].江西医学检验, 2007, 25 (4) :299-301.

[6]陶萍萍.女性生殖道人乳头瘤病毒基因型研究进展[J].中国实用妇科与产科杂志, 2005, 21 (8) :507-509.

[7]梁雯.宫颈病变与人乳头瘤病毒基因型的检测[J].广西医学, 2007, 29 (2) :265-266.

病毒核酸 第8篇

2000 年,I. W. Walker等[2]首次建立竞争ELISA方法检测PCV2 抗体,结果表明,抗体阳性率与间接免疫荧光相比高出2% ,可以用于PCV2 抗体的大规模检测。朗洪武等[3]采集22 个猪群的血清,用PCV2克隆化特异性表达抗原包被反应板,采用ELISA方法检测PMWS,具有可重复性、特异性和敏感性高等特点。Y. Mc Neilly等人使用PCV2 特异性单克隆抗体建立抗原捕获ELISA方法,结果在临床检测中能很好地诊断PCV2 引起的PMWS亚临床感染,是临床诊断PWMS的有效方法之一。

为了鉴定PCV2 核酸疫苗的免疫效果,试验在对辽宁分离株ORF2 基因进行克隆,以p IRES为真核表达载体,以PCV2 的ORF2 基因为目的基因,在构建一个表达质粒的基础上进行小鼠免疫试验,采用间接ELISA方法和T淋巴细胞亚类计数法对p IRES -ORF2 核酸疫苗进行免疫效果评估,以期探索PCV2核酸疫苗的免疫效果。

1 材料与方法

1. 1 主要试剂

辣根过氧化物酶( HRP) 标记的山羊抗鼠Ig G,购自Axygen公司; 藻红蛋白( PE) 标记的抗鼠CD4+、CD8+抗体、异硫氰酸荧光素( FITC) 标记的抗鼠CD3+抗体,购自e Bioscience公司; RNA酶和三羟甲基氨基甲烷( Tris) ,购自GIBCO公司; 二胺四乙酸( EDTA) 、十二烷基硫酸钠( SDS) ,购自Invitrogen公司; 聚乙二醇8000( PEG8000) ,华美生物工程公司产品。

1. 2 质粒来源及制备

含有PCV2 目的基因ORF2 的质粒p IRES -ORF2,由作者构建。 采用碱裂解法大量制备质粒DNA,并进行PEG8000 纯化,沉淀溶于灭菌的磷酸盐缓冲液( PBS) 中,用紫外分光光度法进行DNA定量,终浓度调至1 μg /μL。

1. 3 试验动物与分组

Balb / c小鼠36 只,雌性,6 ~ 8 周龄,体重为16 ~20 g,购自白求恩医科大学试验动物研究中心。将36只小鼠随机分为3 组,每组12 只。A组为p IRES -ORF2 疫苗免疫组,B组为PCV2 灭活苗免疫组,C组为p IRES对照组。p IRES - ORF2 疫苗免疫组和p IRES对照组小鼠分别于后肢腿部股四头肌注射浓度为1 μg /μL的质粒p IRES - ORF2,100 μg /只,间隔2 周后再次注射,共免疫3 次。PCV2 灭活苗免疫组肌肉注射PCV2 灭活苗,0. 1 m L/只,间隔2 周后进行第2 次免疫,共免疫2 次。免疫后每周小鼠尾部采血1 次,分离血清,备用。

1. 4 ELISA抗体检测

以重组PCV2 衣壳蛋白为抗原,用96 孔酶标板于4 ℃包被过夜; 弃液体,加入含3% 牛血清白蛋白( BSA) 的磷酸盐吐温缓冲液( PBST) 于37 ℃ 封闭2 h; 弃去液体,PBST洗板3 次; 对待检血清做100 倍稀释,每孔加100 μL,设空白对照孔,37 ℃ 作用2 h;弃去液体,洗板5 次; 每孔加用PBST稀释的HRP标记的山羊抗鼠Ig G 100 μL,37 ℃作用1 h; 弃去液体,洗板; 每孔加显色液,避光显色15 min; 加入终止液,以空白孔调零,测定每孔的OD492值。

1. 5 小鼠脾T淋巴细胞的制备

断颈处死小鼠,浸泡于75% 乙醇中消毒体表,于无菌条件下剪开小鼠左侧腹部取出脾脏。将脾脏置于无菌平皿的不锈钢网筛上,用玻璃注射器内芯研磨,研磨至匀浆后用载玻片毛面相对研磨; 加入4 m L无钙镁Hank’s液,通过滤膜过滤到10 m L离心管中,2 000 r/min离心10 min; 弃上清液,加入3 m L红细胞裂解液悬浮细胞,室温放置10 min; 2 000 r/min离心10 min,弃上清液;加入4 m L无钙镁Hank’s洗涤,2 000 r/min离心10 min; 加入1 m L 5% 1640,转移到1. 5 m L离心管中,取出20 μL稀释至200 μL,进行细胞计数,调整细胞数为1 107/ m L。

1. 6 T淋巴细胞亚类( CD3+CD4+、CD3+CD8+) 计数

取至少2 106个淋巴细胞加入1. 5 m L离心管中,再加1 m L荧光洗液,1 500 r/min离心3 ~ 5 min;弃上清液,用200 μL荧光洗液重悬淋巴细胞。将重悬后的淋巴细胞平均分为2 管,分别加入荧光标记的CD3+和CD4+、CD3+和CD8+单克隆抗体,混匀后于44 ℃ 避光放置30 min; 用荧光洗液洗2 次,每次1 m L,1 500 r / min离心5 min; 弃上清液,管底淋巴细胞用500 μL荧光保存液重悬,上流式细胞仪检测5 000 ~ 10 000 个淋巴细胞中CD3+、CD4+、CD8+荧光阳性细胞数。

2 结果与分析

2. 1 ELISA抗体检测结果

分别在小鼠接种质粒p IRES - ORF2 后的第0,1,2,3,4,5 周采血,分离血清,应用间接ELISA方法检测PCV2 抗体,结果见表1 和图1。

由表1 和图1 可知: p IRES - ORF2 疫苗免疫组免疫后第1 周开始产生特异性PCV2 抗体,并且抗体水平逐渐提高,在首免后第5 周抗体水平最高,经统计学分析,抗体水平明显高于p IRES对照组( P <0. 05) 。PCV2 灭活苗免疫组从首免疫后第1 周开始出现特异性PCV2 抗体,且抗体水平不断上升,从第3周开始ELISA抗体水平明显高于p IRES - ORF2 疫苗免疫组。

2. 2 T淋巴细胞亚类计数检测结果( 见表2、图2)

注: 同列数据肩标字母相同表示差异不显著( P > 0. 05) ,字母不同表示差异显著( P < 0. 05) 。

由表2、图2 可知,p IRES - ORF2 疫苗免疫组小鼠脾T淋巴细胞CD3+CD8+亚类明显高于PCV2 灭活苗免疫组和p IRES对照组( P < 0. 05) ;p IRES -ORF2 疫苗免疫组T淋巴细胞CD3+CD4+亚类明显高于p IRES对照组( P < 0. 05) ,但与PCV2 灭活苗免疫组相比差异不明显( P > 0. 05) 。表明p IRES -ORF2 疫苗能刺激小鼠CD3+CD8+、CD3+CD4+T淋巴细胞增殖,既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫,并且在细胞免疫方面核酸疫苗更具有优势。

3 讨论

本研究在成功将辽宁地区PCV2 ORF2 基因插入真核表达质粒p IRES构建真核表达载体p IRES -ORF2 的基础上,进行了小鼠免疫试验。ELISA抗体检测结果表明,p IRES - ORF2 疫苗免疫组小鼠从免疫后1 ~ 2 周开始出现特异性PCV2 抗体,且抗体水平不断上升,明显高于p IRES对照组。可见p IRES -ORF2 疫苗能诱导小鼠产生特异性PCV2 体液免疫反应。T淋巴细胞亚类计数结果表明,p IRES - ORF2 疫苗免疫组小鼠脾细胞CD3+CD8+T淋巴细胞亚类计数显著高于PCV2 灭活苗免疫组和p IRES对照组,CD3+CD4+T淋巴细胞亚类计数显著高于p IRES对照组( P < 0. 05) ,但与PCV2 灭活苗相比差异不显著( P > 0. 05) 。由此可见,本次试验所构建的p IRES -ORF2 疫苗与常规的灭活苗相比在细胞免疫方面更具有优势。

近年来,临床PCV2 阳性感染率居高不下,对全球养猪业构成巨大威胁。由于PCV2 生物学特性特殊,制备PCV2 传统灭活疫苗和弱毒疫苗难度大,并且疫苗免疫是防制该病的有效手段。因此,核酸疫苗的研制对于预防PCV2 感染具有积极的意义和广阔的应用前景。