ISSR反应范文

ISSR反应范文（精选7篇）

ISSR反应 第1篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供试亚麻品种有:原2003-84、K-6542、SXY8,均由黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供。

1.1.2 酶与试剂

rTaq DNA聚合酶、dNTP、DNA提取试剂盒,100 bp ladder、琼脂糖及常规试剂购于Tiangen生化科技有限公司。

1.1.3 PCR引物

60条ISSR引物委托上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 亚麻总DNA提取与检测

亚麻总DNA提取参照Tiangen DNA提取试剂盒试验步骤。分别取0.6 g 3个亚麻品系的叶片提取总DNA,提取的DNA分装贮于-20℃;亚麻总DNA的浓度检测采用琼脂糖凝胶电泳法,琼脂糖凝胶电泳方法参照文献[6],取1 μL提取的各基因组 DNA在0.8%Agarose上进行电泳,用标准分子量λDNA/Hind Ⅲ 进行比较,进而检测所提取各基因组DNA的浓度和完整性。

1.2.2 ISSR反应条件

为确定最佳的PCR反应体系,设置4个Taq酶浓度:0.5、1.0、1.5、2.0 UmL-1;4个dNTP浓度:0.15、0.20、0.25、0.30 mmolL-1。选用U853引物,其浓度设4个:0.3、0.4、0.5、0.6 μmolL-1;退火温度设3个:50、55、60℃。根据扩增结果,选择出最佳的PCR反应体系。PCR扩增程序为:94℃ 4 min;94℃ 40 s,50、55、60℃ 1 min,72℃ 90 s,40个循环;72℃ 10 min。

2 结果与分析

2.1 PCR反应优化

2.1.1 不同Taq酶浓度对扩增结果的影响

Taq酶浓度共用4个梯度,从图1中可以看出1.0 UmL-1时能扩增出条带,但不清晰,当增加到1.5 UmL-1时扩增效果较好,因此确定1.5 UmL-1是最佳浓度。

2.1.2 不同引物浓度对扩增结果的影响

引物浓度设4个梯度,图2中显示0.3 μmolL-1 时未扩出条带,0.4 μmolL-1扩的条带不清晰,0.5和0.6 μmolL-1扩增的效果好,但二者没有明显区别,因此确定0.5 μmolL-1是最佳浓度。

2.1.3 不同dNTP浓度对扩增结果的影响

dNTP浓度设了4个梯度,图3中dNTP浓度为0.15 mmolL-1时扩增条带少,而且条带模糊,而0.25 mmolL-1扩增的条带数目多而且清晰,因此0.25 mmolL-1是最佳浓度。

2.1.4 不同退火温度对扩增结果的影响

退火温度设3个梯度,由图4可知,55℃是最佳退火温度。

2.2 优化后亚麻最佳ISSR反应条件及PCR程序

通过Taq酶浓度优化、dNTP浓度优化、引物浓度优化,优化出适宜亚麻ISSR的PCR反应体系PCR体系(20 μL):10Buffer 2 μL,Mg2+(2.5 mmolL-1),dNTP(0.25 mmolL-1),ISSR 引物(0.5 μmolL-1),Genome DNA(50 ng),Taq1.5 UμL-1。通过退火温度梯度试验优化出适宜亚麻ISSR的PCR程序,确定优化后的PCR程序为94℃ 4 min;94℃ 40 s,55℃ 1 min,72℃ 90 s,40个循环;72℃ 10 min。

2.3 筛选出适宜亚麻ISSR的引物

该试验筛选出适宜亚麻ISSR的引物13条,其序列见表1。

1:U822,2:U824,3:U835,4:U836,5:U841,6:U848,7:U853,8:U854,9:U857,10:U859,11:U886,12:U888,13:U889,M:100 bp ladder

从60条ISSR引物中选取扩增结果较好的引物(见图5),综合原2003-84、K-6542、SXY8,3个品种为模板的结果,60条ISSR引物中有13条(序列见表1)扩增出的条带清晰,多态性好,重复性高。

3 结论与讨论

植物材料DNA的提取质量往往是决定PCR成功与否的关键。由于亚麻叶片中含有大量单宁、多糖类及色素等物质,同时蛋白质含量也较高,且越老的叶片中这些杂质含量越高,这些物质易与DNA结合形成粘稠的胶状物,既难溶解,又会抑制Taq酶活性,从而影响PCR反应的质量。因此该试验以亚麻的幼嫩叶片为材料提取DNA,并且采用Tiangen公司生产的DNA提取试剂盒,这样既保证了试验质量,又提高了试验效率。

通过优化适宜亚麻ISSR的PCR体系和程序,利用筛选出的适宜亚麻的ISSR引物可以对亚麻种质资源进行分子鉴定,并为亚麻种质资源的亲缘关系提供分子依据。

参考文献

[1]Zietkiewiecz E,Rafalske A,Iabuda D.Genome finger-printing by si mple sequence repeat(SSR)anchored poly-merase,chain reaction amplyficatlon[J].Genome,1994,20:178-183.

[2]Fritsch P,Riese L H.The use of random amplified poly-morphic DNA(RAPD)in conservation geneties[M]//SmithT B,Wayne R K.Molecular Genetic Approachesin Conser-vation.London:Oxford University Press,1996:54-73.

[3]Hedrick P W.Conservation genetics and molecular tech-niques:Apespective[M]//Smith T B,Wayne R K.Molec-ular Genetic Approaches in Conservation.London:OxfordUniversity Press,1996:459-477.

[4]CHEN Xiang-ming,ZHENG Guo-sheng,MENG Li.RAPD-PCRanalysis of genetic diversity of different colour35 tree paeonia cultivars[J].Sci Agric Sin,2002,35(5):546-551.

[5]LI Jin-bo,JI ANG Liang-rong,LI Chun-hai,et al.Compari-sions of genetic analysis based on ISSR and SSRin PGMSand TGMS rice lines[J].Moecul Plant Breed,2003,1(1):42-47.

ISSR反应 第2篇

利用正交试验L16(45)对影响獐(Hydropotes inermis)ISSR-PCR反应的Taq DNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度及模板DNA浓度5个因素在4个水平上进行优化,同时对退火温度进行梯度PCR反应,以建立适合于獐ISSR-PCR反应的最佳体系.最终确定獐25μL ISSR-PCR反应体系为:Taq酶1.25 U・25μL-1、Mg2+浓度2.5 mmol・L-1、引物浓度0.3 μmol・L-1、DNA模板量350 ng・25μL-1、dNTP浓度0.15 mmol・L-1.在此基础上,利用优化的反应体系成功筛选出10条用于獐相关研究的ISSR引物并确定了各自的`最佳退火温度,为今后利用ISSR技术进行獐的物种鉴定与分类、亲缘关系、系统发育和生理病理学研究奠定了技术基础,也为开展其它大型资源动物如黑麂的保护遗传学研究提供理论基础.

作 者：张龙龙 鲍毅新 于华会 许婧 孙波 ZHANG Long-long BAO Yi-xin YU Hua-hui XU Jing SUN Bo  作者单位：张龙龙,鲍毅新,许婧,孙波,ZHANG Long-long,BAO Yi-xin,XU Jing,SUN Bo(浙江师范大学生态研究所,金华,321004)

于华会,YU Hua-hui(中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江,富阳,311400)

ISSR反应 第3篇

【关键词】 白芨；ISSR-PCR反应体系；单因素试验；正交试验

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）24-0028-03

白芨属兰科，其性味甘、苦、涩，微寒，主要归经于肺[1]。白芨现已成为濒临灭绝的珍贵物种，对白芨遗传资源的分类保护已成为人类研究的重大课题之一[2]。ISSR是近年来新兴的一种分子标记技术，在植物遗传资源的保育工作中已得到普及使用[3]。PCR扩增为ISSR的关键技术，主要受到6个因素的影响（Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+）[4]。研究采用单因素试验以及正交试验对影响白芨的ISSR-PCR反应体系中的6个影响因素进行优化，寻找白芨ISSR-PCR反应体系的最优条件。

1 材料与方法

1.1 材料 白芨购自同仁堂，购得的白芨放置在干燥阴凉处储存。

1.2 主要试剂与仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp DNA Ladder、BSA、Mg2+均购自克劳宁（北京）生物科技有限公司。PCR扩增仪（PTC.200，美国MJ公司）、核酸检测仪（Bio Photometer，美国Eppendoff公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 白芨基因组DNA的提取方法为改进的CTAB法，并用核酸检测仪测定获得的DNA浓度，并用蒸馏水稀释浓度为0.05g/L，放置在-20℃冰箱中储存。

1.3.2 PCR扩增反应条件及其产物检测 参考预实验结果，退火温度选择52℃，PCR扩增反应条件如下：4min预变性于94℃条件下，30s变性于94℃条件下，1min退火于52℃条件下，90s延伸于72℃条件下，共重复35次操作。取6μL所获得的PCR扩增产物，行1h的电脉操作。用100 bp DNA Ladder作为参照物，1×TAE为缓冲液，5 V/cm恒压条件，琼脂糖凝胶为2.0%。

1.3.3 优化方法 正交设计选取L25（56）的方案，反应液为50μL，结果见表1。由正交实验得到的结果，选取数目多且清晰条带的组合。

1.3.4 正交实验的验证实验 按照优化后的方法行三次ISSR-PCR反应，分析所测定的条带情况。

2 结果

2.1 正交实验结果 6因素5水平的正交设计共产生25个扩增产物，结果见表2。Taq DNA：由电脉图分析可得，当Taq DNA为2.5U时条带数目最多，且最清晰。BSA：由组别4的条件得到的电脉图分析可知，选择7.5g/L为BSA的最优浓度。引物：从正交试验结果可知，当引物浓度为5.0 μmoL/L时电脉图条带数目最多、最清晰。DNA模板：按不同的浓度进行加样，其它因素均设为正交试验的最优条件，由电脉图可知，200ng为最适浓度。dNTP及Mg2+：分别按不同的浓度进行加样，其它因素均设为正交试验的最优条件，分析图谱，得出最优值。

2.2 正交实验直观分析及方差分析 由表2、3可知，最优的白芨ISSR-PCR方案，50μL反应液中Taq DNA聚合酶为2.5 U、BSA为7.5g/L、引物为5.0μmoL/L、模板DNA为200ng、dNTP为0.4mmoL/L、Mg2+为4.0mmoL/L。结果分别见表2、表3。

2.3 正交实验的验证实验结果分析 正交实验的验证实验结果表明，优化后的方案稳定、可行。具体结果见表4。

3 讨论

白芨具有消肿止痛以及收敛止血的功效，临床主要用于肺结核，百日咳，矽肺，十二指肠溃疡急性穿孔，十二指肠溃疡出血等疾病的治疗[5]。如今，白芨已成为濒危物种，对其进行有效的育种至关重要，加之不同的白芨很难采用形态特征进行区分，而分子标记技术对遗传资源的保育十分重要[6]。随着科技的进步，人类对生物体的认识已经上升到微观水平。通过测定微观分子的水平的线性结构（如DNA序列），来横向比较不同物种的差异[7]。ISSR简单易行，普遍应用于物种区分、遗传资源保育等领域。具有检测成功率高、成本较低等特点。ISSR技术可在预先不知序列信息的前提下，能够仅用一条引物以及基因组中众多的简单重复序列就可以进行PCR扩增[8]。

PCR扩增为ISSR的重要技术，主要的影响因素为Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+。故每个白芨物种都要制定不一样的ISSR-PCR条件。由于单因素试验对所考察的因素水平进行逐一分析，任务量过大，操作过于繁琐，且无法考察各因素相互的影响作用，故本研究不予单独采用。正交试验可全面考察各因素之间的相互影响作用，且能分析各因素之间的轻重次序。正交试验的缺点为测定结果精密度较差，且对技术水平要求过高。正交试验与单因素试验具有互补的作用，故本研究将两者结合的试验方法进行优化。最终对影响ISSR-PCR反应体系的Taq DNA聚合酶、BSA、引物、模板DNA、dNTP、Mg2+因素进行系统筛选，得到了最优的反应条件（50 μL反应液中Taq DNA聚合酶为2.5 U、BSA为7.5g/L、引物为5.0μmoL/L、模板DNA为200ng、dNTP为0.4mmoL/L、Mg2+为4.0mmoL/L）。本实验在不设重复时，试验随机误差分散式隐含在正交表各列之中，由于随机误差与模型误差相对混杂，而且较大，至使F检验的误差均方差相对较大。

综上所述，试验结果得出最佳的白芨ISSR-PCR条件，为ISSR技术在白芨物种鉴别方面提供了实验依据。

参考文献

[1]卓微伟. 中药白芨的药理作用及临床应用的研究进展[J]. 北方药学， 2014，（11）：69.

[2]陈灿， 陈海霞. 白芨繁殖研究进展[J]. 湖南农业科学， 2015，（5）：135-137.

[3]王建波. ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]. 遗传， 2002， 24（5）：613-616.

[4]余艳， 陈海山， 葛学军. 简单重复序列区间（ISSR）引物反应条件优化与筛选[J]. 热带亚热带植物学报， 2003， 11（1）：15-19.

[5]陶阿丽， 金耀东， 刘金旗，等. 中药白芨化学成分、药理作用及临床应用研究进展[J]. 江苏农业科学， 2013，（11）：6-9.

[6]和志娇， 吕丽芬， 杨丽云，等. 白芨种质资源遗传多样性的ISSR分析[J]. 西南农业学报， 2008， 21（4）：1081-1085.

[7]郭峰. 分子生物学技术及与其他学科的关系[J]. 河南科技， 2011，（4）：9.

[8]刘亭， 金露， 兰波，等. 白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J]. 贵阳医学院学报， 2014， 39（4）：455-458.

ISSR反应 第4篇

墨兰 (Cymbidium sinense) 花瓣香气浓郁、花色多变、叶形独特, 是国兰中株型最大, 花茎最长的种类。目前对于墨兰的研究主要集中在形态学、生理学及孢粉学上, 而在分子DNA水平上研究很少[1,2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一种新型分子标记技术[3], 该技术在SSR (即简单序列重复) 技术的基础上有所发展, 使实验操作简便且迅速, 稳定性好, 多态性高, 现今在基因定位、遗传作图、遗传多样性、进化以及系统发育等研究中被广泛应用[4]。不同植物对ISSR-PCR反应体系要求不同, 因此在利用ISSR标记之前, 必须建立该种植物最适ISSR-PCR反应体系。本研究旨在通过正交试验分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5个因子在4个水平上对墨兰ISSR-PCR反应影响, 并据此建立墨兰最适ISSR-PCR反应体系, 为利用ISSR标记对其进行后续研究奠定基础。

2 材料与方法

试验材料墨兰来源于国家林业局保育重点实验室。试验方法包括以下3种。

(1) 墨兰基因组DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨兰基因组DNA。

(2) 墨兰ISSR-PCR反应引物筛选。根据哥伦比亚大学公布的60个ISSR反应体系引物序列随机选取11个引物801 (AT) 8T、804 (AT) 8A、812 (GA) 8A、818 (CA) 8G、831 (AC) 8YA、836 (AT) 8YA、838 (TA) 8RC、848 (CA) 8RG、825 (AC) 8T、853 (TC) 8RG、860 (TG) 8RA进行筛选, 采用ISSR-PCR反应体系进行筛选目标引物[6,7,8]。

(3) 正交试验设计。对墨兰ISSR反应5因素 (Taq酶浓度、Mg2+浓度、DNA浓度、dNTPs浓度、目标引物浓度) 进行4浓度梯度试验, 共16个处理L16 (45) , 每个处理重复3次 (表1) 。

3 结果与分析

3.1 目标引物确定

对11个引物进行筛选, 引物818、836、812、825、848的电泳结果都有明显条带, 其中引物836条带最多且清晰, 其它引物的效果都不是很明显, 因此选定引物836作为墨兰ISSR-PCR正交反应试验的目标引物 (图1) 。

3.2 ISSR-PCR最优反应体系

基于引物836墨兰DNA ISSR-PCR反应的正交试验验结果见图2和图3。图中各有8个处理, 24组。16个处理中除1、7和14之外, 其余13个处理都能够扩增出清晰条带, 并且每个处理3个重复效果一致。

根据何正文等的正交设计直观分析方法[9], 以Marker为参照, 根据带的多少和亮度给每个处理打分。带数为4以上=10分, 带数为3=8分, 带数为2=6分, 带数为1=4分, 带数为0=2分;亮度最亮=10分, 很亮=8分, 较亮=6分, 微亮=4, 不亮=2分;3个重复组总和为每个处理后得分。从表2看出, 处理11得分最高, 处理3和处理12次之。处理11为Tag酶浓度1.6U/25μL、Mg2+浓度2.72mmol/L、dNTP浓度0.68mmol/L、引物浓度0.48μmol/L、DNA浓度80ng/25μL, 是最优的ISSR-PCR反应体系。

3.3 墨兰ISSR-PCR单因子分析

当Tag酶浓度为0.4~1.6U/25μL时, 分值随Tag酶浓度的增加而明显增加, 当Tag酶浓度为1.6U~2.2U/25μL时, 分值增加不明显。当Mg2+浓度为2.4mmol/L时, 分值最高。当dNTP浓度为0.4~0.96mmol/L时, 分值随浓度的增加而增加;当dNTP浓度为0.96~1.24mmol/L时, 分值差异不明显。引物浓度为0.64μmol/L, 分值最大。当模板DNA浓度为3.2ng/25μL, 分值最大 (表3) 。

4 结语

采用正交试验分析5个因素 (Tag酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度) 在4个水平上对ISSR-PCR反应的影响, 结果表明:Tag酶浓度为1.6U/25μL、Mg2+浓度为2.4mmol/L、dNTP浓度0.96mmol/L、Primer浓度为0.64μmol/L、DNA浓度3.2ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。Tag酶用量直接影响扩增反应成功与否, 浓度过高造成浪费, 但如果Tag酶浓度过低, 会导致产物合成效率下降。Mg2+浓度主要是通过影响Tag酶活性从而影响PCR反应。dNTP作为PCR反应的原料, 浓度太低会使扩增不完全, 从而降低PCR产物产量;浓度过高会对Mg2+产生抑制作用, 降低Mg2+的有效浓度, 影响Tag酶的活力, 造成浪费。本试验验结果为进一步建立优化、系统的ISSR-PCR反应体系提供了初步的科学数据, 利用IS-SR分子标记技术对墨兰进行种质资源鉴定、遗传多样性及遗传图谱构建等研究奠定了基础。

摘要：为建立墨兰的ISSR-PCR反应体系, 采用正交试验分析了5个因素 (Tag酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度) 在4个水平上对ISSR-PCR反应的影响。结果表明:Tag酶浓度为1.6U/25μL、Mg2+浓度为2.4mmol/L、dNTP浓度0.96mmol/L、Primer浓度为0.64μmol/L、DNA浓度3.2ng/25μL是墨兰ISSR-PCR最优反应体系。

ISSR反应 第5篇

粗茎秦艽为中药秦艽原植物之一。近年来,由于种种原因,野生资源临近濒危状态,粗茎秦艽已被列为《国家重点保护野生药材物种名录》[6]。因此,拟建立粗茎秦艽IS-SR-PCR反应体系,以期为深入研究该物种的遗传多样性提供一种有效方法,进而为其种质资源保护及药材道地性研究提供基础资料。

1材料和方法

1.1供试材料

实验样品2007年8月采自云南丽江。取新鲜幼嫩叶片,硅胶迅速干燥,置-20℃冰箱保存。原植物由上海中医药大学赵志礼教授鉴定为粗茎秦艽Gentiana crassicaulis uthie ex Burk,凭证标本:赵志礼20075016,藏于上海中医药大学中药学院药用植物标本室。

1.2仪器

PCR仪(Biometra Thermocycler),电泳仪(BIO-RAD)等。1.3试剂

引物主要参考加拿大哥伦比亚大学公布的序列[7]及相关文献[8],并进行了改进,由上海生工公司合成;其它试剂略。

1.4基因组DNA提取

采用经典CTAB法[9]、改良CTAB法(1)[10]和改良CTAB法(2)[11]分别提取基因组DNA,以筛选最佳提取方法。

1.5 ISSR-PCR初始反应体系及产物检测

参考有关文献[12],并略加改进。10μL反应体系:l0Buffer缓冲液1μL,Mg2+2.0mmol/L,Taq DNA聚合酶0.5U,引物0.9μmol/L,dNTPs0.1mmol/L,10~50ngDNA,ddH2O加至10μL。94℃预变性5min,之后94℃变性30s,52℃复性45s,72℃延伸90s,共38个循环,循环结束后72℃延伸7min。

在1.2%的琼脂糖凝胶中分离扩增产物,电泳结束后在凝胶成像系统下观察照相。

1.6体系优化实验设计

从74条引物中预筛出7条稳定性好的引物,以其中CJ-1为优化实验的引物,采用单因素分析法,分别考察DNA模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、退火温度对扩增的影响。整个过程以初始反应体系为基础,每确定一个因子的最佳参数后即作为后续研究的固定条件,依次类推。

2结果

2.1 DNA提取方法的确定

改良CTAB法(2)得到DNA的OD260/OD280值在1.8~2.0之间,提纯效果好,可直接用于扩增。

2.2反应体系的优化

2.2.1 DNA模板浓度

设置6水平:0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ng/μL。结果显示浓度0.5~1.5ng/μL时条带最多;而大于1.5ng/μL时,条带数减少,条带也变得模糊,因此DNA模板的最佳浓度范围为0.5~1.5ng/μL(图1)。

M:DNA marker 0:阴性对照1-6分别为:0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ng/μL扩增产物。

2.2.2 Mg2+浓度

7水平:0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.75mmol/L。结果显示,浓度低于2.0mmol/L时基本无带;2.0~2.5mmol/L时较好,而2.5mmol/L时,扩增条带最亮,确定其为最佳浓度(图2)。

M:DNA marker1-7分别为:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.75mmol/L扩增产物。

2.2.3 Taq酶用量

6水平:0.25、0.5、0.6、0.75、1.0、1.5U。结果显示,浓度为0.25U时条带少且弱,0.5~1.5U时扩增出的条带基本相同,本着降低成本原则,确定其用量为0.5U(图3)。

M:DNA marker 1-6分别为0.25、0.5、0.6、0.75、1.0、1.5U扩增产物。

2.2.4 d NTPS浓度

6水平:0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35mmol/L。结果显示,浓度0.1~0.15mmol/L时扩增条带较弱,0.2~0.25mmol/L时扩增条带比较清晰,多态性好。0.3mmol/L时扩增条带减少,0.35mmol/L时基本无带,因此其浓度以0.2mmol/L为宜(图4)。

M:DNA marker1-6分别为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35mmol/L扩增产物。

2.2.5引物浓度

6水平:0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μmol/L。结果显示,0.4~1.0μmol/L时扩增的带型一致,在此浓度范围内,随着浓度增高条带变得模糊;当大于1.0μmol/L时条带数目减少。以0.6μmol/L时条带比较清晰、多态性好,因此,引物浓度确定为0.6μmol/L(图5)。

2.2.6退火温度

7水平:46、48、50、52、54、56、58℃。退火温度较低(46~48℃)或较高(54℃以上)时,条带减少;当温度由50℃升到54℃时,带型基本相同。在允许范围内选择较高退火温度可减少引物与DNA模板之间的非特异性结合,所以退火温度确定为54℃(图6)。

2.2.7体系稳定性考察

最佳反应体系:10μL反应体系中含0.5~1.5ng/μLDNA模板,l0Buffer缓冲液1μL,2.5mmol/L Mg2+,0.5U Taq DNA聚合酶,0.6μmol/L引物,0.2mmol/L dNTPs。退火温度54℃,持续45s。

M:DNA marker 1-6分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μmol/L扩增产物。

M:DNA marker,1-7分别为46、48、50、52、54、56、58℃扩增产物。

以此体系,重复扩增2次,每次平行2份,结果显示2次扩增与平行实验结果均一致,条带清晰、多态性丰富(图7)。

M:DNA marker 1、2重复2次的扩增产物。

引物不同,其退火温度不同。因此以优化好的体系为基础,分别对另外6条引物的退火温度进行考察,均得到最佳退火温度。

3讨论

3.1基因组DNA的提取

经典CTAB法和改良CTAB法(1),出现大量胶冻状沉淀,影响ISSR-PCR反应结果。参考相关文献[11],在提取液中加入0.35倍体积的无水乙醇,迅速混匀并尽快离心除去沉淀物。结果表明,提取的DNA满足ISSR-PCR扩增的要求。

3.2退火温度的确定

ISSR反应 第6篇

水藓科为变齿藓目植物之一,是藓类植物中罕有的完全水中生长类型。全世界有2个亚科和3个属;中国有水藓亚科(Fontinaloideae)的水藓属(Fontinalis)和弯刀藓属(Dichelyma)植物。水藓属为较早确定的藓类植物之一,全世界约有20种,中国有2种,一种为大水藓(Fontinalis antipyretica),另一种为羽枝水藓(Fontinalis hypnoides),其中羽枝水藓为濒危物种;弯刀藓属在全世界有6种,我国仅有1种,为网齿弯刀藓(Dichelyma falcatum)。水藓科在我国分布的种类不多,对其遗传多样性的研究具有非常重要的意义。

随着分子生物学的发展,已出现多种DNA分子标记方法,如DNA随机扩增多态性(randomlyamplified polymorphism DNA,RAPD), 扩增酶切片段多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP),简单序列重复(simple sequence repeat,SSR),可用于植物遗传多样性、品种鉴定、遗传作图、生物进化和分子生态学等方面的研究。与其他标记方法相比,ISSR分子标记具有很多优点:可以在不同的物种间通用,揭示的多态性高,精确度高,信息量大,检测方便等。该技术已在农作物[1,2,3,4,5,6]、树木[7,8,9]和花卉[10,11,12,13]等多方面得到了广泛应用。目前,有关藓类植物遗传多样性的研究不是太多[14,15,16,17,18],而关于水藓科植物的遗传多样性研究更是至今未见报道。本实验通过正交方法对ISSR-PCR反应体系进行优化,以期为后续水藓科植物遗传多样性的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

水藓科植物于2011年由新疆大学采自新疆喀纳斯国家级自然保护区和巴尔鲁克山野巴旦杏自然保护区。

1.1.2 实验试剂

dNTPs、Taq DNA Polymerase购自上海生工;2000 DNA Marker由大连宝生物公司生产;电泳用琼脂糖和CTAB由上海生工生产;ISSR引物由上海生工合成。

1.1.3 实验设备

DY-3型号电泳仪(由北京六一仪器厂生产);PCR仪(美国PE-9600);DYCP-31D型NanoDrop 2000超微量分光光度计(型号为:美国ND-2000);高速冷冻离心机HERMLEZ323K(德国进口);紫外凝胶成像系统(型号为:UVPGDS-8000)。

1.2 方法

1.2.1 提取水藓科基因组总DNA

通过改良的CTAB法[19]提取水藓科的基因组总DNA。步骤如下:

(1)取0.2g材料用双蒸水冲洗2～3遍,用吸水纸将叶片表面水分吸干,快速置于-80℃冰箱中冰冻12h。

(2)将材料取出快速放置到预冷的研钵中,加入少量的Vc和PVP,倒入液氮迅速研磨至细粉状,转入1.5mL EP管中。

(3)向EP管中加入1mL预冷的Buffer A溶液[Buffer A溶液,100mL水中加入5molL-1 NaCl 5mL ,0.5molL-1 EDTA 1mL,1molL-1 TrisHCl 10mL]充分混匀,冰浴0.5h,使用4℃离心机,转速12 000r/min离心10min,将上清液去除。(若离心后溶液太粘稠,可重复步骤3),直至上清澄清)

(4)加入800μL 65℃预热的2%CTAB溶液[2%CTAB溶液,50mL水中加入NaCl 8.16g,CTAB 2g,1molL-1 TrisHCl(pH 8.0) 10mL、0.5molL-1 EDTA(pH 8.0) 5mL加去离子水至100mL],轻轻混匀,65℃水浴60min,期间轻摇混匀2～3次,室温冷却1min。

(5)4℃条件下,转速为13 000r/min,离心10min,小心吸取上清液到新的离心管中,向管内加入相同体积的CI溶液[CI溶液,氯仿溶液的量:异戊醇溶液的量=24:1]重复抽提2～3次,最后离心吸取上清液。

(6)向EP管中加入相同体积的预冷异丙醇,混匀后在-20℃冰箱中静置1h。

(7)用4℃离心机将溶液12 000r/min离心10min,去除上清液,加入4℃保存的75%乙醇溶液将沉淀充分洗涤2次,一次5min左右(第一次13 000r/min,第二次8 000r/min)。

(8) 弃上清液,将沉淀倒置在冰上自然风干至无乙醇味。加入50μL TLE溶液[TLE溶液,1molL-1 TrisHCl(pH 8.0) 1mL,0.5molL-1 EDTA(pH 8.0) 20μL加去离子水至100mL]溶解。

(9) 若有RNA污染,向TLE溶液中加入3mL RNaseA试剂,4℃放置1h,于-80℃冰箱内保存备用。

1.2.2 基因组DNA的检测

通过核酸检测仪检测DNA的纯度和浓度;以1%琼脂糖凝胶电泳, 以Marker 2 000为标准, 检查所得DNA的大致分子量、纯度及完整性。

1.2.3 水藓ISSR-PCR反应因素的优化

因模板DNA、引物、Mg2+、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度等均会对PCR 扩增结果产生影响,为了得到客观和清晰的结果,需要对ISSR-PCR反应因素进行优化。以大水藓基因组DNA为模板,UBC860(AGAGAGAGAGAGAGAGC)为引物,设计正交实验表对模板、引物、Mg2+、dNTP和Taq DNA 聚合酶浓度进行5个因素4个水平筛选[20](见表1)。PCR扩增设计的反应程序:94℃预变性5min;94℃高温变性30s,52℃低温退火1min,72℃适温延伸2min,共35个循环;然后72℃延伸10min;最后4℃保存。PCR 用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,待测样品点10μL,电泳的电场强度为5V/cm,电泳缓冲液为1TBE,电泳结束后在紫外凝胶成像系统下(UVPGDS-8000)分析并照像。

1.2.4 电泳图谱的统计分析

根据扩增条带的强弱赋值:清晰明亮的条带记为3分,相对明亮的条带记为2 分,较暗的条带记为1分,无条带的记为0分。将16组体系按照条带的数量和明亮带的强弱计算出总的分数(表2),再根据表2的得分计算出5个因子在4个水平上的总分以及极差,以此可以推导出最佳的反应体系。

1.2.5 最佳反应体系的验证

通过反应因素的优化,以UBC845(CTCTCTCTCTCTCTCTRG)为引物对13种水藓基因组DNA进行PCR扩增,从而验证最佳反应体系。

2 结果与分析

2.1 水藓基因组DNA的提取

M:DNA Marker; 1～13:基因组DNA。

M:DNA Marker; 1-13:Genomic DNA.

本实验利用改进的CTAB法提取基因组DNA(见图1),从图中可见DNA条带清晰,无明显降解现象[21]。用紫外分光光度计测定DNA在260nm和280nm的光吸收比值(A260/A280)为1.8～2.0,浓度在100～200ng/μL之间,达到PCR反应要求。

2.2 水藓ISSR-PCR反应因素的优化

通过对16个反应体系的处理(见图2),发现条带的数量和亮度上均存在明显区别,这说明Mg2+、模板、引物、dNTPs、Taq 酶等5个影响因子在4个水平上对反应体系扩增的结果有很大的影响,因此对水藓科植物PCR反应体系的优化是十分必要的[22]。

1～16为正交反应中不同体系的处理(表1);M为DNA Marker。

1～16:treatments of differents systerm in orthogonal reactions(Tab.1); M:DNA Marker.

通过条带的数量和明亮带的强弱的差异,计算出16个优化反应体系的得分数(见表2),明亮的带记为3分,亮带记为2分,暗带记为1分,分别计算出5个因子的4个水平的得分,进而求取极差(见表3)。

通过表3可知16个反应体系中,反应10的分数最高且明亮带和亮带最多,是最适合的反应体系。因此最佳反应体系组合为A3B2C4D3E1,即20μL体系中,2.0μL Buffer溶液、1.52mmolL-1Mg2+、1.28μmolL-1引物、1.20mmolL-1dNTPs、70.0 ng模板、0.50U Taq酶。极差可以反映出5个因子对ISSR-PCR体系扩增的影响程度,极差值越大表示该因子对体系扩增的影响越大[22]。所以通过表2可知影响扩增反映的因素顺序为Mg2+>Taq 酶>dNTPs> 模板DNA=引物。

M:DNA Marker; 1～13:13份水藓DNA。

M:DNA Marker; 1-13:13 Fontinaloideae DNAs.

2.3 最佳反应体系的验证

利用最佳反应体系对13份水藓植物基因组DNA进行扩增,以UBC845作为ISSR分析的引物,进行最佳反应体系的验证(见图2)。结果显示,扩增的条带清晰,多态性高,可作为其他引物对水藓扩增的反应体系。

3 讨论

植物基因组DNA提取的方法很多,其中以Doyle和Domle提出的CTAB法以及一系列改良的CTAB法的应用最为广泛。本文通过改良的CTAB法提取水藓基因DNA,裂解液中较高浓度的CTAB能增强对细胞壁的破坏能力;使用氯仿/异戊醇反复抽提3次,可以在很大程度上除去多糖。实验结果发现,DNA电泳条带较清晰,无明显降解,RNA去除彻底,DNA含量和纯度较高,可达到ISSR-PCR的反应的要求。

ISSR分子标记技术是基于PCR反应的一种方法,具有重复性高的优点,但受到Mg2+浓度、引物、dNTPs 、模板DNA和Taq 酶等多种因素的影响。Mg2+是Taq DNA聚合酶的激活剂,浓度过高会使非特异性扩增产物增加,过低则造成扩增产物减少,甚至不能扩增。当Mg2+浓度为1.52mmolL-1时扩增产物最清晰,Mg2+浓度为1.6mmolL-1时扩增结果不稳定,Mg2+浓度为1.44mmolL-1时扩增条带较少,说明Mg2+的浓度影响了Taq酶的活性,所以适当的浓度有助于扩增的效果。Taq DNA聚合酶在PCR 反应中常用的浓度为0.5～2.0U反应体系, 本实验中当浓度为0.5U时凝胶电泳条带较清晰,适合水藓植物的遗传多样性研究。适宜浓度的dNTP对于获得理想的PCR反应条带也很重要,当dNTP为1.20mmolL-1时,条带较明亮。分析发现,模板浓度和引物浓度对该反应体系的影响较小。刘芸君等人与刘梦培等人通过ISSR-PCR正交反应的方法分别对岩白菜和华杏仁的体系进行了优化,发现Mg2+、Taq酶及dNTP的浓度是5个因子中比较重要的3个因子,支婷等人同李慧慧等人分别对鸭梨和栝楼的ISSR-PCR反应体系进行优化,发现模版DNA浓度对扩增结果的影响最小。本研究采用在4个水平上对影响水藓植物的五个因子进行优化,影响扩增反应的排列结果为Mg2+>Taq 酶>dNTPs> 模板DNA=引物。这与前述文献基本一致。与植物PCR扩增反应体系正交优化的相关研究较多,但至今还未曾见到有关水藓科植物的报道。优化反应体系的方法很多,包括单因素梯度试验法,但其不能反映各因素之间的相互关系。正交反应是研究多因素多水平的一种设计方法,它是根据正交性挑选出均匀分散,齐整可比的点进行试验,是一种高效率、客观、快速的实验设计方法[23]。本实验利用正交反应对水藓进行ISSR-PCR体系优化,通过电泳条带的亮度、条带数筛选出最佳反应体系,即20μL体系中,2.0μL Buffer溶液、1.52mmolL-1Mg2+、1.28μmolL-1引物、1.20mmolL-1dNTPs、70.0 ng模板、0.50 U Taq酶。

利用最佳反应体系以UBC845为引物,13份水藓基因组DNA为模板进行PCR反应扩增,扩增条带清晰、稳定性好、重复性高,表明优化的反应体系适用于水藓科植物,为水藓的遗传多样性研究奠定基础。

4 结论

4.1影响扩增反应的五个因子因素排列结果为Mg2+>Taq酶>d NTPs>模板DNA=引物。

ISSR反应 第7篇

紫萼藓科(Grimmiaceae)植物性极耐旱,能生长在向阳的裸岩上,久旱不丧失生活力。为典型的旱生植物[1]。在国内,关于该科植物的研究,主要集中于经典分类、形态解剖学等方面等方面的研究[2,3,4,5],但是分子水平的研究还尚存不足。本研究主要通过ISSR-PCR的分子标记技术为紫萼藓科植物遗传多样性的前期研究提供分子数据的支持。

简单序列重复间区(inter-simple sequence repeats,ISSR)是由Ewa Zietkiewicz[6]等于1994年创建的一种新型的分子标记技术[7,8],该技术检测的是两个SSR(simple sequence repeats,SSR)之间的一段短DNA序列的多态性。ISSR技术简易、快捷,同时兼备AFLP(扩增酶切片段多态性)、SSR(简单序列重复)和RAPD(DNA随机扩增多态性)等分子标记方法的优点。引物设计无需预知基因组序列,只要是目标区域的长度在可扩增范围内,就能扩增出微卫星重复序列间的DNA片段[9]。由于扩增的各种因素以及不同的反应程序都会影响ISSR的结果,因此对其各个因素和扩增程序进行优化,是非常有必要的。本试验主要是通过正交设计ISSR反应体系中5个因素在4个水平上对扩增结果的影响,优化筛选出了紫萼藓科植物PCR的最佳体系,为进一步对紫萼藓科植物进行ISSR遗传多样性分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验以16种紫萼藓科植物(见表1)为研究对象。正交设计以13号标本(Racomitrium japonicum)为实验材料,提取其基因组DNA并进行ISSR-PCR扩增。本实验所需药品如:ISSR引物、TaqDNA聚合酶酶、Buffer以及Mg2+均购于上海生工生物工程技术有限公司;dNTPs、Marker DL2000购自北京鼎国生物技术有限责任技术。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

参照柴华[10]改良的CTAB方法,略有改动。提取了16个紫萼藓科植物基因组的DNA。提取DNA样品的质量和浓度采用NanoDrop 2000超微量紫外光检测,并采用琼脂糖凝胶电泳法检测基因组DNA条带,用凝胶成像系统照相记录。

1.2.2 ISSR-PCR的正交设计

参照王助文[11]的ISSR-PCR反应体系,经预实验初步确定出本次正交实验的固定引物为UBC808,并以13号标本(R.japonicum)的DNA作为模板。根据L16(45)正交表进行了正交实验,从而分析各个因素对ISSR-PCR反应的影响。正交设计见表2,共16组,为保证体系的稳定性,每组都做了重复实验。在总体积为25μl的体系中,除表中主要因素外,还加有10buffer(不含Mg2+)以及去离子水。反应在美国PE-9600型PCR仪上进行扩增。扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,52℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环;72℃延伸10min;4℃保存。

1.2.3 ISSR-PCR最优体系的验证

采用筛选出的ISSR引物和16种材料提取的DNA,在正交实验所得的最优体系下进行PCR验证。PCR扩增程序中退火温度采用筛选的各个引物的退火温度,其他程序不变。

1.2.4 ISSR-PCR产物的检测

ISSR-PCR反应产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,在100V电压下电泳40min左右。然后,在紫外凝胶成像系统(UVP GDS-8000)下观察并照相记录。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的提取结果

提取的16种材料的DNA电泳检测结果见图1。浓度采用NanoDrop 2000超微量紫外光检测,结果OD260/OD280的值均在1.8～2.0之间。说明所提取的DNA可以用于ISSR-PCR反应。

2.2 ISSR-PCR正交设计结果及分析

正交结果由图2可知,在正交试验设计中,体系1、4、8、14、15、16无条带;体系3、13扩增出1条带;体系6、7、10扩增出4条带;体系11、12扩增出5条带;体系2、5扩增出7条带,但条带较模糊;体系9扩增出了8条带,且条带较清晰。重复试验结果相同,这样紫萼藓科植物的ISSR-PCR最佳反应体系基本确定为9号体系。其反应体系为:引物为1.4μmol/L、dNTPs为0.8mmol/L、Mg2+为3.0mmol/L、Taq酶量为2U、模板量约为15ng,其余为buffer和去离子水,共25μl。

2.3 ISSR-PCR最优体系的验证分析

将其他已筛选出的ISSR引物,在最优反应体系下进行PCR验证,结果扩增出的多态性条带在凝胶电泳图中都很清晰。例如随机采用引物UBC812,对表1中的16种材料的DNA进行扩增,退火温度控制在50℃,扩增结果见图3。在电泳图中可以清晰看到16种材料均能有效的扩增出多态性条带,说明所筛选出的体系适用于紫萼藓科植物的ISSR扩增。

2.4 模板DNA对ISSR-PCR的影响

DNA是遗传信息的载体,其质量的高低是ISSR-PCR反应的关键。质量高的DNA模板,其ISSR-PCR扩增的多样性好,条带的清晰度高。本实验的一些材料是年代较远采集的标本材料,如2、3、4、5号材料是2002～2006年间采集的,其提取的DNA电泳条带较暗(见图1),说明提取的DNA浓度较低。但是在ISSR-PCR反应中同样扩增出了条带(见图3),说明其DNA的完整性较好,仍然可以用于ISSR-PCR反应。分析原因:标本材料存放年代较久远,DNA难免发生部分降解,会有一些损失,但经紫外检测发现存放年代较久远材料的DNA虽然浓度较低,但其OD260μm/OD280μm的值都在1.8～2.0之间,说明其中所含杂质较少,DNA纯度较高,因此也可以扩增出条带来。

2.5 体系中其它因素对ISSR-PCR的影响

为了建立ISSR-PCR反应的最优体系,对影响其反应的各种因素如Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、以及Taq酶量都做了对比试验。结果表明,Mg2+浓度是影响ISSR-PCR的主要因素。DNA聚合酶只能识别Mg2+ 与dNTP以及DNA模板结合形成复合体。dNTP的浓度与Mg2+的浓度应成比例同时提高,否则造成自由Mg2+浓度偏低,影响聚合酶的活性[12],本实验Mg2+浓度在2.4mmol/L～3.0mmol/L效果最好(见图2)。dNTPs是ISSR-PCR的底物,其浓度过低会造成反应条带数少,浓度过高又会螯合镁离子,从而使Taq酶的活性降低,本实验dNTPs浓度为0.8mmol/L时最为合适(见图2)。Taq酶的量合适时会促进整个PCR的反应,酶量过高或多低不但不会促进反应的进行反而会降低酶在反应中的作用,本实验Taq酶的量达到2U时效果最好(见图2)。本实验引物浓度在1.0mmol/L～1.6mmol/L时均能扩增出条带,说明引物浓度在此范围内对该反应的影响不大。根据正交实验确定引物浓度为1.4mmol/L。

2.6 退火温度的确定

采用正交设计筛选出的最佳反应体系,对各个引物进行退火温度的筛选,温度设置从48℃～56℃。结果发现:当退火温度较高时,扩增出的DNA条带数较少,但条带清晰度高;当退火温度较低时扩增出的DNA条带数较多,但许多都较模糊,条带之间较难区分。分析其可能在较低退火温度时,引物与模板结合的要求也较低,因此扩增的条带数较多;随着退火温度的提高,引物与模板结合的要求也随之增高,因此扩增的条带数也较少。但由于引物与模板在高水平下结合,所以扩增产物的条带也比较清晰、明亮。在考虑尽量扩增出较多条带数且保证条带清晰度的情况下,确定了各个引物的最适退后温度(见表3),如选择UBC812的最适退后温度为50℃。

注:R代表A和T,Y代表G 和C。Note:R stands for A and T;Y stands for G and C.

3 讨论

ISSR-PCR是一个受综合因素影响的反应,每一种因素的变化都有可能导致结果不同,因此确定一个理想的最优体系对ISSR-PCR反应是很重要的。DNA模板是ISSR-PCR反应中的一个重要因素,本实验发现质量较高且杂质较少的DNA模板,即使浓度较低也可扩增出条带。这对于年代较为久远的标本材料也可用于分子实验提供了有力的证明。其他因素如Mg2+浓度、dNTPs浓度及Taq酶量对于该反应也很重要,Mg2+浓度过高易螯合dNTPs,使dNTPs消耗殆尽,无延伸反应;dNTPs浓度过高又会抑制Mg2+,从而又会抑制Taq酶的活性[13]。因此三者的浓度比例只有在一定范围时,才能使反应达到最佳的效果。