红树林海洋细菌的分离鉴定及其活性物质初步分析

红树林海洋细菌的分离鉴定及其活性物质初步分析（精选3篇）

红树林海洋细菌的分离鉴定及其活性物质初步分析 第1篇

红树林海洋细菌的分离鉴定及其活性物质初步分析

从广西北部湾红树林海洋淤泥中分离筛选到270株海洋细菌,用喉癌细胞Hep-2的细胞毒作用为筛选模型,用SRB法检测这270株海洋细菌的.抑制肿瘤细胞生长活性,其中13株呈阳性反应.依据形态和生理生化反应特征及16SrRNA基因序列分析,确定其中一株为短小芽孢杆菌Bacillus pumilusPLM4.取该菌株液体培养上清液,检测对人喉癌细胞Hep-2的生长抑制率为63.9%,经过凝胶过滤层析分析获得2个活性峰,其中活性高的峰估计平均分子量为116kd.采用经典显色反应法初步判断该活性物质为多糖.

作 者：梁静娟 庞宗文 詹萍 LIANG Jing-juan PANG Zong-wen ZHAN Ping  作者单位：广西大学生命科学与技术学院,广西,南宁,530005 刊 名：热带海洋学报  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF TROPICAL OCEANOGRAPHY 年，卷(期)： 25(6) 分类号：Q93 Q936 关键词：红树林   海洋细菌   16SrRNA基因序列   抑制肿瘤细胞生长活性   多糖   SRB法  

红树林海洋细菌的分离鉴定及其活性物质初步分析 第2篇

摘要:从某农药厂污泥中筛选分离出一株高效降解甲氰菊酯(Fenpropathrin)的光合细菌,研究了其降解特性及生物学特性。根据分离菌株的细胞形态结构、活细胞光吸收特征、生理生化特征及其16S rDNA序列同源性鉴定降解菌;气相色谱法测定该菌降解甲氰菊酯的能力;采用超声波破碎法提取该菌降解粗酶,利用(NH4)2SO4分段盐析并测定酶活性。结果表明:PSB07-14属红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.);该菌以共代谢方式降解甲氰菊酯,对甲氰菊酯的最高耐受浓度为800 mg/L,降解最佳条件为:30～35 ℃、pH6～7,光照培养15 d对600 mg/L甲氰菊酯降解率达48.41%。降解酶测定结果表明:30%～60%(NH4)2SO4沉淀的蛋白降解活性最高。

关键词:甲氰菊酯;红假单胞菌;生物降解;降解酶

中图分类号:X172文献标识码:A文章编号:1006-6500(2009)02-0001-05

Isolation, Identification of Fenpropathrin-degrading Strain PSB07-14 and Preliminary Analysis of Its Degradation Crude Enzyme

LUO Yuan-hua1,ZHANG Zhan-hong3,LIU Yong1,2,ZHANG Song-bai1,2,ZHANG De-yong1,2,LUO Xiang-wen1, CHENG Fei-xue1

(1.Hunan Plant Protection Institute,Changsha,Hunan 410125,China;2. Branch of Longping,Graduate College,Central South University,Changsha,Hunan 410125,China;3. Hunan Vegetable Institute,Changsha,Hunan 410125,China)

Abstract:A photosynthetic bacterial strain PSB07-14, with degradability of fenpropathrin, was isolated and identified as Rhodopseudomonas sp. based on its morphology, physiology and homology of 16S rDNA sequence. The degrading characteristics showed the optimum conditions of degrading fenpropathrin were 30～35 ℃, pH 6～7, respectively. This strain could grow in the media supplied with fenpropathrin up to 800 mg/Land degrade fenpropathrin by co-metabolic way. The degradation rate of fenpropathrin was up to 48.41% in a concentration of 600 mg/L within 15 d. The degradation crude enzyme was extracted and subsided by (NH4)2SO4, the results of subsiding enzyme activity showed the highest enzyme activity appeared in the subsiding of 30%～60%(NH4)2SO4.

Key words: fenpropathrin;Rhodopseudomonas sp. PSB07-14;biodegradation;degradation enzyme

甲氰菊酯,化学名称2-氰基-3-苯氧基苄基-2,2,3,3-四甲基环丙烷酸酯,商品名灭扫利,对鳞翅目、同翅目、半翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫有效,同时对多种害螨的成螨、若螨和螨卵有一定的防治效果[1],适用于棉花、蔬菜、果树、玉米、大豆、烟草、茶叶等作物以及林木、家畜、卫生和仓储等害虫防治,对一些农作物还有促进生长、增加产量、改善品质的作用。

虽然甲氰菊酯对高等动物毒性中等,在试验剂量内对试验动物未发现致畸、致突变和致癌作用。但是,对鱼类等水生生物、蜜蜂、家蚕等高毒,对光、热、潮湿稳定,在环境中的半衰期较长,长期使用,环境中大量残留,会带来严重的环境污染和生态风险。这迫使我们寻找一种切实有效的方法来解决这一难题 [2,3]。以生物修复(Bioremediation)为理论基础的农药残留降解菌技术为降低农产品和农业生产环境中的农药残留物提供了希望,该技术具有高效、无毒、无二次污染的特点,而且经济实用,操作简便,目前已成为去除农药残留污染的一种重要方法。国内外有很多关于农药残留降解菌研究的报道,由于菊酯类农药在20世纪80年代才在我国广泛使用,对该类农药的研究起步较晚,对拟除虫菊酯类农药的降解菌报道相对较少[3,4]。因此,筛选更多类型的甲氰菊酯高效降解菌,对甲氰菊酯残留的生物修复研究和应用具有十分重要的意义。

笔者从某农药厂污泥中分离到一株能降解甲氰菊酯的光合细菌PSB07-14,对其降解甲氰菊酯的特性进行了研究。该研究为利用光合细菌降解甲氰菊酯残留及其降解机理、克隆降解酶基因打下了基础。

1材料和方法

1.1培养基、试剂和主要仪器

光合细菌(PSB)培养基:MS培养基添加0.15%酵母膏,参照文献[5];选择培养基:在PSB培养基中加入一定浓度的甲氰菊酯;固体培养基:在培养基中加入1.5%的琼脂。

主要试剂:40 %甲氰菊酯乳油,海南正业化工有限公司惠赠;98 %甲氰菊酯标准品购自天津东方绿色技术发展有限公司;其它农药残留检测试剂均为色谱纯。

主要仪器:农药残留检测在湖南省植物保护研究所农药残留检测室进行。6890N气相色谱仪 (Agilent, USA)、扫描电子显微镜(JEXL-230,日本电子公司)、分光光度计(Tu-1901,北京普析通用仪器有限责任公司)、光照培养箱(GZP-350,上海精宏实验设备有限公司)。

1.2培养条件

光合细菌培养采用130 mL的血清瓶。培养条件(除特别说明外):厌氧光照培养,(30±2)℃,2 000 lx光照培养6～7 d;黑暗好氧培养,黑暗条件下,(30±2)℃,培养6～7 d。每天摇瓶混匀1次。

1.3降解菌的分离、筛选

将采自某农药厂的污泥2.0 g加入120 mL PSB培养基中,光照培养7 d后,取1%菌液接种到含甲氰菊酯100 mg/L的选择性液体培养基中,光照培养7 d,取300 μL菌液稀释涂布到选择性固体培养基中,挑取菌落形态不同的菌,分别接种到含甲氰菊酯100 mg/L选择性液体培养基中,光照培养7 d,取1%分别接种到含甲氰菊酯200,400,600,800,1 000 mg/L选择培养基中,15 d后检测培养基农药浓度,以含相同浓度的甲氰菊酯,相同培养条件不接种细菌的培养基为对照。选择降解率最大的细菌进行后续研究,命名为PSB07-14,后续试验中1 mL菌液中约含活细胞109个。

1.4菌种的鉴定

1.4.1电镜样品制备及观察将活的细菌滴到具膜载网上,然后进行磷钨酸染色,TEM(transmission- scanning electron microscope)观察拍照。

1.4.2吸收光谱的测定取1.5 mL培养5 d的光合细菌培养液,8 000 r/min离心洗涤3次,用0.9 %生理盐水重悬浮,在分光光度计上于200～900 nm扫描。

1.4.3菌株的生理生化特征的测定见参考文献[6]。

1.4.4菌体16S rDNA序列的测定及同源性分析细菌基因组提取采用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)。以所提的细菌总DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用引物扩增[5],PCR反应体系(50 μL):10×PCR Buffer 2.5 μL;MgCl2(25 mmol/L) 2 μL;dNTP(10 mmol/L) 2 μL;引物Bpf/Bpr(25 μmol/L) 各0.5 μL;Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL;双蒸水 43 μL。PCR反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循环30次;72 ℃ 10 min。反应完成后,经1%琼脂糖电泳,检测扩增片断的大小和特异性。PCR产物纯化后,委托上海生工生物工程公司测序。将PSB07-14测得的16S rDNA序列在Genbank中利用blast进行比对,比较不同细菌间的相似性。

1.5甲氰菊酯含量的测定

整瓶培养液,用正己烷萃取3次,每次用量分别为40,40,30 mL。氮吹仪上吹干,然后用正己烷溶解并定容至10 mL,接着加入无水硫酸钠脱水。气相色谱测定其含量[4]。以98 %甲氰菊酯标样定性定量,所有数据为3次重复平均值。

测试条件:气相色谱仪型号Agilent 6890N,色谱柱型号为HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm),采用程序升温法:毛细管柱起始温度160 ℃,保持5 min,10 ℃/min升至200 ℃,保持1 min,10 ℃/min升至280 ℃,保持8 min,检测器(μECD)温度320 ℃,进样口温度250 ℃,载气为N2(纯度99.999 9 %),流量1 mL/min。进样量均为1 μL。

降解率的计算方法:降解率=(1-C1/C0)×100%

其中,C1为降解菌处理甲氰菊酯残留浓度(mg/L),C0为对照处理甲氰菊酯残留浓度(mg/L)。

1.6 降解酶的提取与盐析

15 mL离心管加入10 mL培养7 d的PSB07-14菌液,8 000 r/min离心2 min,倒去上清液,重复1次,收集菌细胞,倒去上清液,加入等体积的PBS(pH7.2)缓冲液,降解粗酶的提取采用超声波破碎仪破碎菌体细胞[7],12 000 r/min离心10 min,上清液即为粗酶液,考马氏亮蓝法测定蛋白的浓度[8],用PBS缓冲液调整蛋白浓度为10 mg/L做后续实验。取50 mL粗酶液,加入(NH4)2SO4盐析,静置10 min,离心收集沉淀,PSB(pH7.2)缓冲液溶解,并调整蛋白浓度为1 mg/mL[8]。酶活力测定参照文献[7],本试验的1个酶活力单位(U)定义为在本试验条件下1 min内甲氰菊酯减少的微摩尔数。

2结果与分析

2.1菌株鉴定

2.1.1培养特征和活细胞光吸收特征培养结果表明,PSB07-14最佳生长温度为30～35 ℃、pH6.5～7.5,具有红色培养物、黑暗好氧生长慢以及耐盐低于3%的Rhodopseudomonas的特征[6]。活细胞光吸收结果表明(图1),该菌含有细菌叶绿素a及类胡萝卜素[5],表明该菌属于紫色非硫细菌。

2.1.2形态结构和生理生化特征图2的电镜结果表明,PSB07-14为杆状,大小为0.6～1.0 μm×2.4～3.1 μm,端生鞭毛,以二分裂方式繁殖。生理生化分析结果表明(表1):G-,V-P反应阴性,甲基红反应阴性,不能利用淀粉,H2S反应阴性;可以利用多种小分子的有机酸生长,也能利用部分氨基酸和醇类化合物进行生长。PSB07-14的形态结构和生理生化特征与Rhodopseudomonas基本一致[6]。

2.1.316S rDNA序列分析PSB07-14测定的16S rDNA序列长度为1 429 bp (Genbank accession No.FJ798824),Blast结果表明,在Genebank中,与Rhodopseudomonas palustris strain HZ-1 (EU703955)和Rhodopseudomonas sp. TUT3625 (AB250616) 的同源性分别为98%和97%。

2.1.4鉴定结果根据Bergeys Manual of Determinative Bacteriology[6],将PSB07-14鉴定为Rhodopseudomonas sp.。

2.2菌株对甲氰菊酯的降解

2.2.1对甲氰菊酯的耐受浓度在120 mL PSB液体培养基中,加入5 mL菌液和适量甲氰菊酯,使培养基中甲氰菊酯终浓度为200,400,600,800,1 000 mg/L,光照培养,第15 天观察PSB07-14的生长情况。结果如表2示,PSB07-14耐受甲氰菊酯的最大浓度为800 mg/L。

2.2.2对甲氰菊酯的降解120 mL的PSB液体培养基中加入5 mL PSB07-14和适量甲氰菊酯,使其最终浓度为600 mg/L,光照培养15 d取样测定甲氰菊酯的残留量,以含600 mg/L甲氰菊酯培养液为对照。甲氰菊酯在光照下,经过15 d有一定量的降解,可见光照对甲氰菊酯有一定的降解效果,但作用并不是很大(4.13%)。PSB07-14在600 mg/L甲氰菊酯培养液中培养15 d,对甲氰菊酯的降解率为48.41%(表3)。

2.2.3最佳降解条件在pH为5,6,7,8,9,10的120 mL的PSB培养基中,加入5 mL的PSB07-14菌液和适量甲氰菊酯,其最终浓度600 mg/L,光照培养15 d后取样,样品经萃取后检测甲氰菊酯残留量。结果表明(图3),pH在6～8之间,PSB07-14的降解效能都比较好,最适pH为7。

在120 mL含甲氰菊酯600 mg/L的PSB培养基中,加入5 mL的PSB07-14菌液,不同温度下,光照培养15 d后测定甲氰菊酯残留量。图4表明,PSB07-14在25～35 ℃之间,具有良好的甲氰菊酯降解能力,在35 ℃降解能力最好。温度过高或过低都显著影响菌株的降解能力,当温度低于25 ℃或高于45 ℃,菌株几乎丧失降解能力。

2.2.4菌株对甲氰菊酯的共代谢特点PSB07-14在以甲氰菊酯为唯一碳源的PSB培养基中不生长(表4),但在有其他碳源(酵母膏)存在时可以降解甲氰菊酯,表明PSB07-14是以共代谢的方式降解甲氰菊酯[9]。

2.3分段盐析粗蛋白降解活性

分段盐析粗蛋白降解活性表明,30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性为38.27 U/L,大大高出0～30%、60%～80%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白的活性(表5)。

3讨 论

通过富集培养法分离出甲氰菊酯降解菌PSB07-14,生理生化方法和16S rDNA序列同源性将其鉴定为Rhodopseudomonas sp.。在农药残留的降解菌研究中,光合细菌的研究报道相对较少;光合细菌(Photosynthetic Bacteria, PSB)是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物。近年来,对光合细菌的应用研究获得了很大的进展。研究表明,光合细菌在种植、养殖、新能源开发利用以及医药方面具有十分广阔的前景[10-13]。在环境治理方面,光合细菌可以有效地处理有机废水[14],净化水质[15],降解芳香族化合物[13]。在农药降解方面,光合细菌可以有效地降解有机磷农药[5]、 硫代磷酸酯类农药[16]。而且光合细菌具有很好的促进作物生长和提高作物抗逆性的作用[17],因此,筛选光合细菌降解菌具有良好的应用前景。

PSB07-14对高浓度的甲氰菊酯具有良好的降解效果,在600 mg/L甲氰菊酯培养液中培养15 d,对甲氰菊酯的降解率为48.41%。高于丁海涛等[18]分离的降解菌降解速率以及笔者先前分离的光合细菌株PSB07-19[19],与洪源范等[9]分离的降解菌降解速率相当。PSB07-14降解甲氰菊酯的最佳条件与该菌生长的最佳条件基本一致,表明该菌具有潜在的实际应用价值。

PSB07-14不能以甲氰菊酯作为唯一碳源,只能以共代谢的方式降解甲氰菊酯。表明PSB07-14对甲氰菊酯的降解作用是一种酶促反应,该结果与洪源范等[9]的研究结果一致。

PSB07-14降解酶分段盐析结果表明,在30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性为38.27 U/L,该研究为降解酶的分离纯化提供了参考。其降解酶的研究以及降解酶基因的克隆是下一步的工作方向。

参考文献:

[1] 中国百科网. 甲氰菊酯[EB/OL]. http://www.chinabaike.com/article/396/397/2007/2007031293322.html,2009-03-05.

[2] George N, Kalyanasundaram M. Chemistry of synthetic pyrethroid insecticides-some recent advances[J]. Journal of Scientific and Industrial Research, 1994, 53: 933-945.

[3] 王兆守,李顺鹏.拟除虫菊酯类农药微生物降解研究进展[J].土壤,2005,37(6):577-580.

[4] Tallur P N, Megadi V B, Ninneker H Z. Biodegradation of cypermethrin by Micrococcus sp. strain CPN 1[J]. Biodegradation, 2008, 19: 77-82.

[5] 张德咏,谭新球,罗香文,等.一株能降解有机磷农药甲胺磷的光合细菌HP-1的分离及生物学特性的研究[J].生命科学研究,2005,9(3):247-253.

[6] Hot G J, Krieg R N, Sneath H A P, et al. Bergeys manual of determinative bacteriology[M]. Baltirnore: Willianms & Wilkins, 1994.

[7] 林淦,姚威.阴沟肠杆菌W-1粗酶液对氯氟氰菊酯的降解效果及其作用机理[J].江苏农业科学,2006(3):191-192,198.

[8] Marshak D R, Kadonaga J T, Burgess R R, et al. 蛋白质纯化与鉴定实验指南[M].朱厚础,译.北京:科学出版社,2000.

[9] 洪源范,洪青,武俊,等.甲氰菊酯降解菌JQL4-5的分离鉴定及降解特性研究[J].环境科学,2006,27(10):2100-2104.

[10] 夏宏,夏青.光合细菌在早熟甘蓝、油菜上的应用研究[J].山西农业大学学报,2000,39(2):116-118.

[11] 张信娣,金叶飞,陈瑛.光合细菌对鱼病原细菌生长的影响[J].中国生态农业学报,2008,16(3):659-663.

[12] 张全国,荆艳艳,李鹏鹏,等.包埋法固定光合细菌技术对光合产氢能力的影响[J].农业工程学报,2008,24(4): 190-193.

[13] 史国富.光合细菌在医药保健品方面的应用进展[J].科技情报开发与经济,2003,13(7):99-100.

[14] 吕红,周集体,王竞.光合细菌降解有机污染物的研究进展[J].工业水处理,2003,23(10):9-12.

[15] 邓晓皋,唐赟.几株光合细菌的分离鉴定及用于水质净化的初步研究[J].四川师范学院学报:自然科学版,2001,22(1): 84-88.

[16] 李乐,李兰生,孙涛,等.固定化光合细菌降解氧化乐果[J].农业环境科学学报,2006,25: 721-725.

[17] 揭晶,赵越.光合细菌应用的研究进展[J].广东药学院学报,2006,22(1): 113-115.

[18] 丁海涛,李顺鹏,沈标,等.拟除虫菊酯类农药残留降解菌的筛选及其生理特性研究[J].土壤学报,2003, 4(1): 123-129.

红树林海洋细菌的分离鉴定及其活性物质初步分析 第3篇

关键词 红树林 ；链霉菌 ；鉴定 ；利普斯他汀 ；发酵

分类号 Q939.1

肥胖是全球成年人最大的慢性疾病，被世界卫生组织（WHO）明确认定为导致疾病发生的十大危险因素之一。治疗和遏制肥胖已成为全球医学攻关的重要内容。主要有食欲抑制剂、产热剂、消化吸收阻滞剂、激素调控剂等四大类数十种药物。微生物发酵产生的利普司他汀（Lipstatin）能选择性抑制胃肠道中胰脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收。其四氢衍生物奥利司他（Orlistat）被成功开发为新型减肥药物[1]，是目前作为非中枢神经系统作用的唯一一个治疗肥胖症的药物[2]。研究表明，奥利司他非全身作用、具有良好耐受性和有效性，不用食欲抑制剂而治疗肥胖，为肥胖症的药物治疗开辟了新途径[3]。

本研究对广东湛江红树林土壤进行选择性分离，并从中筛选分离到新型减肥药物奥利司他前体物质尼泊司他汀产生菌菌株，对活性菌株进行了分类鉴定及发酵的初步研究，旨在发掘具有潜在应用前景的新型减肥活性药物菌株，为进一步开发利用海洋来源的新型药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样

2013年秋季，通过多点取样法从广东湛江红树林淤泥土中采集土样。

1.1.2 培养基

固体培养基：高氏培养基、燕麦片琼脂培养基[4]。

发酵培养基：甘油（1.5%），胰蛋白胨（2.0%），豆油（4%），燕麦粉（0.8%），ZnSO4（0.01%）， CaCO3（0.5%），复合乳化剂（0.05%），装量80 mL/500 mL锥形烧瓶，将菌株接种到发酵培养基中，30℃，200 r/min，培养7 d，观察其发酵情况，检测发酵产物。

1.2 菌株的分离及鉴定

1.2.1 菌株分离

对采集到的红树林淤泥进行选择性微生物分离，采用以豆油为唯一碳源的改良燕麦琼脂培养基进行菌株分离[5-6]。涂布于含不同浓度豆油的分离平板上，培养观察生长状况，代谢产物经色谱分析确认，获得放线菌菌株GWL1.2012，菌株保藏于广东省微生物种质资源库。

1.2.2 形态观察

将分离得到的菌株分别接种到固体平板上插片培养，30℃培养7～10 d，每24 h观察菌落形态，并进行革兰氏染色观察细胞形态。

1.2.3 生理生化特征观察

参照《伯杰氏系统细菌学手册》（第九版）[7]和《链霉菌鉴定手册》[8]进行生理生化特征的测定观察。

1.2.4 16S rRNA 基因扩增、测序与构建系统发育树

以实验室已有16S rRNA 基因通用引物，对分离菌株进行菌落PCR扩增 16S rDNA，正向引物，27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物，1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增总体积50 μL，94℃预变性30min，94℃变性1 min，60℃ 退火0.5 min， 72℃延伸1.5 min，进行30个循环，72℃延伸10 min。用上海生工DNA纯化回收试剂盒对PCR产物进行回收，与 pMD18-T 载体连接，送由上海英骏生物技术有限公司完成测序。从Genbank数据库中获取与分离菌株亲源关系较近的模式菌株核糖体基因16S（16S rRNA基因）区域序列，结合在GenBank中经BLAST 获取到的菌株16SrRNA基因，运用MEGA4.1软件模型，采用邻接法（NJ） 构建系统发育树（Replications=1000，Bootstrap值取百分比）。

1.3 摇瓶发酵

1.3.1 发酵培养

将菌株GWL1.2012接种到发酵培养基中，接种量10%，30℃，220 r/min，培养192 h，每12 h取样检测，每批3个重复，取其平均值，绘制pH变化和湿重变化曲线。

1.3.2 尼泊司他汀活性测定

菌株发酵粗提物制备 参考Janos[9]方法，菌株192 h后结束发酵培养。取发酵液高速冷冻离心（10 000 r/min，18℃，10 min） ，取菌体，将菌体于细胞破碎仪破碎，离心后取上清，作为提取粗体样品，备用。

产物测定通过HPLC方法与标准品进行标定分析[10]。

2 结果与分析

通过对采集到的红树林淤泥进行选择性微生物分离，获得高产利普斯他汀的放線菌菌株GWL1.201，进一步对该菌株进行分类鉴定和发酵初步研究。

2.1 形态特征

菌株GWL1.2012在固体平板上培养10 d的菌落形态特征：菌落粉状，肉粉色至粉灰色，产生大量孢子，褐色可溶色素，见图1。显微特征为基内菌丝无色，气生菌丝分叉较多，松散螺旋状、柔曲，产孢，孢子椭圆形，表面光滑，见图2。

根据《伯杰氏系统细菌学手册》比对分析，发现该菌株GWL1.2012在固体平板上的生长状态、显微形态特征，与链霉菌属菌株相似，可将其归属为链霉菌。

2.1.2 生理生化特征

进一步对菌株GWL1.2012进行部分生理生化鉴定，结果见表1。

根据《链霉菌鉴定手册》进行生理生化的检

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测与比对分析，发现该菌株GWL1.2012的生化特征与毒三素链霉菌特征相一致，可初步鉴定为毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系统发育树的构建与分析

菌株GWL1.2012的核糖体基因中的16S区域经测序，长度为1 437 bp，通过BLAST与GenBank数据库相关序列比对，构建系统发育树，见图3。结果显示该序列与Streptomyces toxytricini相似性最高，为99.7%。根据放线菌16SrDNA序列在分类鉴定中的划分依据，大于99%即可归为同一个种，可将其鉴定为毒三素链霉菌。

结合GWL1.2012的生长形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析结果，菌株GWL1.2012鉴定为毒三素链霉菌。

2.2 摇瓶发酵初步研究

菌株GWL1.2012菌体湿重随培养时间逐渐增加，0～48 h为生长迟缓期，48 h后开始增长加快，进入生长对数期， 60～144 h菌种生长进入稳定期，随着培养时间的延长繁殖速度渐减，死亡数逐渐增加进入衰亡期；从发酵开始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起开始利用迟效碳源pH逐渐上升，60～144 h菌体生长阶段维持在6.7～6.9，之后随菌体也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，结合菌体湿重生长状态基本一致，见图4。

2.3 发酵产物尼泊司他汀测定

同时通过对其发酵过程的检测数据分析发现，发酵60 h左右时，产物Lipstatin开始生成，随着菌株进入稳定生长期而逐渐增加，到发酵结束时浓度达到最大值为1 900 mg/L，见图5。

3 结论与讨论

本研究对采集到的红树林淤泥进行选择性微生物分离，获得高产利普斯他汀的放线菌菌株GWL1.2012，也是国内首次报道由红树林淤泥分离得到产lipstatin的菌株；通过培养生长形态特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比对，GWL1.2012鉴定为毒三素链霉菌；对菌株的发酵代谢过程及产物进行了初步研究，发酵水平达到1 900 mg/L，领先国内已有文献报道水平；微生物来源的酶抑制剂是一类重要的微生物次级代谢产物，也成为了新型减肥药物开发的重要途径。菌株GWL1.2012能产生活性较强的脂肪酶抑制代谢产物利普斯他汀，将进一步对其进行发酵优化及代谢产物深入研究， 有望开发为新型的减肥药物。

参考文献

[1] MELIA A T， Zh I J， ZE I R， et al. The interact ion of the liposeinhibitor orlistat with ethanol in healthy volunteers[J]. Eur J Clin Pharmacol， 1998， 54（9-10）： 773-775.

[2] Hollander P A， Elbein S C， Hirsch I B， et al. Role of orlistat in the treatment of obese patients with type 2 diabetes[J] . DIABET ES CARE， 1998， 21（8）： 1 288-1 289.

[3] 馬 微，付 丽，等.新型减肥药奥利司他的研究进展[J]. 华西药学杂志，2009，24（4）：431-433.

[4] Waksman S A. Classification， identification and description of genera and species [A]， In The Actinomycetes[M]. Vol. Ⅱ. Baltimore： The Williams and Wilkins， Co.1961： 328.

[5] M arkus G， Wo lfg ang E， Adelber t B， et al. Biosynthesis origin of hydrogen atoms in the lipase inhibitor lipstatin[J]. J Biol Chem， 2000， 275（28） ： 21192

[6] M arkus G， Wo lfg ang E， Adelber t B， et al. Biosynthesis of lipstatin [J] . J Org Chem， 2001， 66（13）： 4668

[7] John G H， Bergey D H， Noel R K. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology（9th Revised edition[M].

[8] Group of Actinomycetes Taxonomy of Institute of Microbiology of Chinese Academy of Sciences.Streptomyces identification manual（ in Chinese）[M].Beijing：Science Press（北京：科学出版社）， 1975.

[9] Janos E， Eva G， Gabor B， et al. Fermentation process for lipstatin and method of extracting lipstatin from a fermentation broth： US， 6844174[P]. 2005-01-18.

[10] 胡为民，庄英萍，王永红，等. 毒三素链霉菌生产利普司他汀的发酵与提取工艺[J]. 中国医药工业杂志，2007，38（10）：705-708.