分化鉴定范文

分化鉴定范文（精选3篇）

分化鉴定 第1篇

采用酶消化后低密度稀释接种法是目前分离、培养肌腱干细胞最为常用的方法。但传统酶消化法培养过程中容易出现细胞损伤及生长周期缓慢等局限性,且培养出的干细胞有体外活力差、纯度不高等问题[4]。目前也没有某种特异性的方法用来鉴定培养出来的肌腱干细胞。因此,本次研究对常规方法进行改进,采用改良的分次酶消化法培养家兔肌腱干细胞,可以达到干细胞活性良好、增殖速度快、纯度较高的目的,并对其进行分化能力鉴定。通过本实验确立高效、稳定的家兔肌腱干细胞分离培养体系和鉴定方案,旨在为进一步研究肌腱相关疾病的发病机制和防治药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

3月龄家兔10只,体重2.0~3.0 kg,由北华大学动物实验中心提供,饲养在北华大学动物实验室。动物标本收集,符合单位相关伦理学规定。

1.1.2 主要实验仪器与设备

70μm细胞过滤器(美国Biologix公司),不锈钢细胞筛网(上海易佰聚经贸有限公司),二氧化碳CO2恒温孵箱(美国Thermo公司),倒置相差显微镜(日本Olympus公司),低速离心机(上海安亭科学仪器厂Anke),超净工作台(上海力申科学仪器有限公司),流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司),细胞培养皿、培养瓶、离心管(美国Coring公司)。

1.1.3 主要试剂

DMEM培养液(美国Gibco公司);胎牛血清FBS(美国Gibco公司),Ⅱ型胶原蛋白酶(美国Sigma公司),0.20%DTA、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司),青霉素链霉素混合液P/S(美国Gibco公司),CD90、CD44、CD14、CD34一抗(美国Becton Dickinson公司),维生素C、地塞米松、β-磷酸甘油钠、骨化三醇、维甲酸(美国Sigma公司),TGF-β(美国R&D Systems公司),碱性磷酸酶染液(南京建成科技有限公司),阿尔新蓝染液(美国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 家兔髌腱组织的分离

适应性喂养1周后,随机取3月龄家兔1只,用25%乌拉坦按4 ml/kg经耳缘静脉麻醉。于髌骨和胫骨结节之间切前正中切口,长约3.0 cm,用眼科剪在髌腱中段剪取2.0 cm×1.0 cm髌腱组织,放入盛有10 ml PBS的Ep管中,将Ep管立刻转移至超净工作台内进行处理。

1.2.2 肌腱干细胞的分离、培养、传代

酶消化后低密度稀释接种法:参照秦胜男等[5]实验方法,剔除腱鞘及腱周组织,将肌腱均匀剪碎成1 mm3的碎块,每100 mg组织加入3 mg/mlⅠ型胶原酶37℃消化2 h,70μm细胞过滤器过滤形成单细胞悬液。将单细胞悬液以1 000 r/min离心5 min,弃去上清液,用PBS洗2遍,将细胞沉淀用10%FBS的DMEM培养液重悬。以200个/cm2细胞密度接种至10 cm培养皿中,置于37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度培养箱中培养。

改良分次酶消化法:在酶消化法分离培养肌腱干细胞的基础上,本实验采用改良分次酶消化法。用PBS冲洗肌腱组织3次,剔除腱鞘及腱周部分组织,将组织转移至另一装有PBS的培养皿中。用眼科剪将肌腱均匀剪碎成1 mm3大小,转移至Ep管中,每100 mg组织加入0.20%EDTA和0.25%胰蛋白酶、3 mg/mlⅡ型胶原酶进行分次消化,放入37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度培养箱中分别消化30 min、90 min,每15 min震荡1次Ep管。将消化液经过100目不锈钢细胞筛网过滤除去未消化完全的组织碎屑,连续用70μm细胞过滤器过滤除去杂质细胞,以1 000 r/min离心5 min,弃去上清液,收集细胞。用不含血清的DMEM培养液离心漂洗2次,弃去上清液,加入10%FBS的DMEM培养液重悬细胞制成细胞悬液,以1×103/cm2的密度接种于10 cm培养皿中,置于37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度培养箱中培养。

原代细胞接种后24、48及72 h各换液1次,以后每3 d换液1次,当细胞均匀铺满瓶底80%~90%面积时按1∶2或1∶3的比例传代,换液及传代后放入倒置相差显微镜下仔细观察细胞形态特征以及生长情况。原代细胞为P0代,细胞扩增后,取P3-P4代用于相关实验。

1.2.3 肌腱干细胞生长曲线的绘制

取生长状态良好的原代肌腱干细胞,吸除培养基,用PBS冲洗3遍后,加入适量的0.20%EDTA和0.25%胰蛋白酶,消化2~3 min,镜下观察贴壁细胞逐渐脱落,变成圆形,个别细胞开始漂浮时,加入FBS终止消化,反复吹打,以1 500 r/min离心5 min,弃去上清液,收集细胞。加入10%FBS的DMEM培养液重悬细胞,以1×103/L的密度接种于24孔培养板中,1 ml/孔,置于37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度培养箱中培养。每日取3孔,0.20%EDTA和0.25%胰蛋白酶消化,用细胞计数板计数细胞数,求出平均值,以时间为横坐标、细胞数的平均值为纵坐标,绘制细胞生长曲线。

1.2.4 肌腱干细胞的鉴定

取生长状态良好的P3-P4代细胞,按上述方法收集细胞,10 ml PBS重悬细胞,进行细胞计数,应保证分装后每个Ep管的细胞数不少于1×106个。4 ml PBS重悬细胞,将细胞悬液分装到8个2 ml Ep管中,每管500μl,按1~8进行编号,1号管为空白对照组,2~6号管依次为CD44、CD44+90、CD90、CD31、CD14,7、8管为二抗阴性对照组。用PBS洗2次,30μl重悬后按编号加入相应一抗混匀,3个对照组不做处理,30μl重悬后按编号加入相应二抗混匀,避光室温下反应30 min,PBS洗1次后经筛网过滤到相应编号的流式细胞管中,使用流式细胞仪进行细胞表面标志物的检测,并用Win MDI Version 2.9软件进行检测和分析细胞产生阳性信号的数值。

1.2.5 肌腱干细胞诱导分化

①成骨诱导分化:取P3-P4代肌腱干细胞进行成骨诱导,按上述方法将肌腱干细胞按以5×104个/孔的密度种植在6孔培养板中,置于37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度培养箱中孵育。培养24 h后更换成骨诱导培养基(含10%FBS、10 nmol/L地塞米松、10 nmol/L骨化三醇、50μg/ml维生素C、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠的DMEM基础培养基),以后每3 d更换成骨诱导培养基,诱导21 d。诱导完成后,碱性磷酸酶染色,将细胞爬片用试剂1固定2~5 min,自然晾干,用蒸馏水润洗30 s,滴加基质液数滴,37℃避光孵育15 min,甩去多余的染液,立即滴加试剂4染液染色5 min,水洗30 s,甩去多余的水,再滴加试剂5染液染色30 s,水洗30 s,甩去多余的水,滴加试剂6复染30 s,水洗30 s,晾干后中性树胶封固。在倒置显微镜下观察钙盐沉积情况并采集图像。②成软骨诱导分化:取P3-P4代肌腱干细胞同上处理,用成软骨诱导培养基(含10%FBS、1μmol/L地塞米松、104μmol/l维甲酸、50μg/ml维生素C、10 ng/ml TGF-β的DMEM基础培养基)每3 d换液1次,诱导21 d。诱导完成后,用阿尔新蓝在酸性p H组织学染色,检测成软骨细胞特异性表达的Ⅱ型胶原。每孔加2 ml 4%多聚甲醛固定30 min,吸除固定液,每孔加入2 ml阿尔新蓝液,染色20 min,加入3%醋酸洗液,清洗2 min,再使用PBS冲洗3次,每次2 min,将细胞梯度乙醇脱水,蒸馏水冲洗3次,每次2 min,干燥后中性树胶封固,在倒置显微镜下观察成软骨情况并采集图像。

2 结果

2.1 肌腱干细胞细胞形态的观察

细胞经过7 d的培养后,可以观察到肌腱干细胞聚集生长,细胞集落形成大小与细胞的接种密度有关,原代细胞较传代细胞大,细胞多呈多边形;P1代多呈扁平状;P3代多呈成纤维状细胞(见图1)。

2.2 肌腱干细胞的生长曲线

从细胞计数来看,两组细胞潜伏期为2~4 d,对数增殖期为6~9 d,至第12天进入平台期。改良分次酶消化法原代细胞的增殖能力均优于酶消化后低密度稀释接种法,且获得的细胞数量更多(见图2)。

2.3 肌腱干细胞的鉴定

采用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,肌腱干细胞表面抗原标志CD90、CD44均呈阳性,而CD14、CD34均呈阴性(见图3)。证实之前分离的干细胞为肌腱干细胞,极大程度排除细胞污染的可能。

A:P1代细胞多呈扁平状;B:P3代细胞多呈成纤维状细胞

2.4 肌腱干细胞诱导分化的鉴定

2.4.1 成骨分化能力

肌腱干细胞经21 d成骨诱导后,形成钙盐沉积,碱性磷酸酶染色为灰黑色颗粒或块状、条状沉淀,可见明显的钙化结节(见图4A)。

2.4.2成软骨分化能力

肌腱干细胞经21 d成软骨诱导后,形成软骨样组织,质地较为坚硬,阿尔新蓝染色可见蓝染的Ⅱ型胶原,细胞外有软骨基质形成(见图4B)。

1:改良的分次酶消化法;2:酶消化后低密度稀释接种法

A:碱性磷酸酶染色,可见钙化结节;B:阿尔新蓝染色,可见蓝染的Ⅱ型胶原,有软骨基质形成

3 讨论

自2007年BI等[6]首次从肌腱中分离出肌腱干细胞,并证实其具有多向分化潜能以后。其他学者也先后报道从人和动物的肌腱中分离培养出肌腱干细胞,并进一步明确该细胞具有多向分化潜能和自我更新能力[7,8]。随着人们对体育锻炼的日益重视,肌腱病的发病率也在逐年的提高,其以肌腱局部疼痛、肿胀、功能障碍为主要表现,肌腱病与肌腱干细胞的异常分化有关。肌腱干细胞具有明确的向成骨及成软骨分化,该特性适合修复股骨头坏死的病理过程,因此有望成为治疗股骨头坏死新的种子细胞[9]。然而据RUI[2]和BI等[6]的研究发现,在肌腱组织中肌腱干细胞含量极低,且在生理状态下处于休眠期,不发生增殖和分化。如何建立有效的肌腱干细胞体外分离培养方法是肌腱干细胞研究的核心问题。

目前肌腱干细胞可以从大鼠、家兔等的肌腱组织中分离培养获得[3,7],其体外分离的主要方法是将酶消化法和低密度稀释接种法相结合,酶消化法主要利用胶原酶消化组织间质,使细胞彼此分离,充分发挥肌腱干细胞增殖能力,且对细胞的损伤较小,低密度稀释接种法是利用干细胞能在较低的接种密度时增殖速度较其他已分化的细胞快的特点。但该方法在体外分离培养的过程中只对未消化完全的组织块进行过滤除杂,会使原代细胞中杂质细胞较多,而杂质细胞会影响肌腱干细胞增殖速度,只有经过连续传代后才能逐渐达到纯化的目的。本研究采用改良分次酶消化法,用0.25%胰酶和3 mg/mlⅡ型胶原酶分次消化,在胶原酶的选择上采用Ⅱ型胶原酶,在前期实验过程中发现其优于Ⅰ型胶原酶,更适合消化肌腱组织,弃胰酶消化液和首次胶原酶消化液后,过滤除去未消化完全的组织块,再连续用滤器过滤除去杂质细胞后重悬细胞接种,该方法有效地避免原代细胞中杂质细胞较多的问题,但离心的过程可能会对细胞造成损伤,不过从结果上看原代细胞保持干细胞良好的增殖能力,且获得的肌腱干细胞数量相对前种方法更多,改良分次酶消化法细胞纯度也较前种方法更高,是一种可行且更加有效的方法。

实验利用改良分次酶消化法分离纯化大量肌腱干细胞,细胞培养至P3代时,可得到活性良好、形态均一、较高纯度的肌腱干细胞。然而肌腱干细胞仍缺乏特异性的免疫标志物,目前已证实,肌腱干细胞具有和骨髓间充质干细胞(BMSCs)等其他干细胞相似的标志物:白细胞分化抗原分化群(CD44、CD90、CD90.1、CD90.2、CD105、CD146)、干细胞抗原-1(Sca-1)、基质细胞抗原(Stro-1)、核干细胞因子(NS)等。不表达造血干细胞表面标记物CD34和白细胞分化抗原CD14[10]。该数据表明肌腱干细胞与BMSCs非常相似,但又不完全一致。有研究进一步证实肌腱干细胞中肌腱相关标记物(tenomodulin,scleraxis,typeⅠcollagen,decorin和biglycan)、软骨相关标记物(typeⅡcollagen和aggrecan)以及骨相关标记物(ALP和Os teocalcin)的m RNA表达均明显高于BMSCs[6]。在人和鼠的肌腱干细胞中都没有CD18的表达,而在BMSCs中就存在这种分子[11],该差异可能决定肌腱干细胞在分化时不同于BMSCs。但其特征性的免疫标志物还有待进一步研究。本实验经流式细胞仪检测发现,改良分次酶消化法培养P3代细胞能够较稳定、均一地表达细胞表面抗原CD90、CD44,几乎不表达CD34、CD14,证实该方法可制备纯度较高的肌腱干细胞群。

除检测细胞表面标志物外,本实验还分别将P3-P4代的肌腱干细胞向成骨、成软骨方向进行诱导。结果显示,在诱导分化过程中,分别诱导出成骨细胞、成软骨细胞的标志-钙化结节和蓝染的Ⅱ型胶原,证实本方法培养的肌腱干细胞具有向成骨细胞、成软骨细胞分化潜能。

综上所述,本研究采用改良分次酶消化法成功分离、纯化肌腱干细胞,此法分离培养的肌腱干细胞具有活性良好、形态均一、较高纯度的特点,因此有望成为较理想的组织工程种子细胞,为肌腱干细胞的进一步研究和应用提供良好的基础。

摘要：目的 采用改良分次酶消化法体外分离培养家兔肌腱干细胞,观察其生物学特性,并进行诱导分化及鉴定。方法 无菌条件下取出家兔髌腱组织,分别运用改良的分次酶消化法和酶消化后低密度稀释接种法进行分离、培养、传代,用倒置相差显微镜观察细胞形态特征并绘制两种方法的生长曲线,通过流式细胞鉴定仪检测肌腱干细胞表面抗原标志物的表达,取P3-P4代肌腱干细胞向成骨细胞、成软骨细胞诱导分化并鉴定。结果 改良的分次酶消化法较酶消化后低密度稀释接种法细胞增殖速度加快,形态均一,杂质细胞少。分离出的肌腱干细胞表面抗原标志CD90、CD44呈阳性,而CD34、CD14呈阴性,证实之前分离的细胞为肌腱干细胞。鉴定出肌腱干细胞具有向成骨细胞和成软骨细胞分化能力。结论 采用改良的分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞简单易行,肌腱干细胞生长及传代速度可观,活性良好,纯度较高。另外,肌腱干细胞的成功分离培养,也为肌腱相关疾病的研究开辟了一条新途径。

关键词：改良酶消化法,肌腱干细胞,分化鉴定

参考文献

[1]芮云峰,郭永刚,等.BMP-2诱导人髌腱来源肌腱干细胞成软骨分化的实验研究[J].中国修复重建外科杂志,2013,27(12):1492-1498.

[2]RUI Y F,LUI P P,WONG Y M,et al.Altered fate of tendonderived stem cells isolated from a failed tendon-healing animal model of tendinopathy[J].Stem Cells Dev,2013,22(7):1076-1085.

[3]LONGO U G,LAMBERTI A,MAFFULLI N,et al.Tissue engineered biological augmentation for tendon healing:a systematic review[J].Br Med Bull,2011,98:31-59.

[4]王双利,查振刚,等.改进酶消化法培养SD大鼠成骨细胞及其鉴定[J].实用医学杂志,2008,24(6):915-918.

[5]秦胜男,王文,傅世铨,等.人髌腱干细胞的分离培养与鉴定[J].中国矫形外科杂志,2014,22(24):2269-2276.

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[7]ZHANG J Y,WANG J H.Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes[J].BMC Musculosk-elet Disord,2010,11:10.

[8]胡超,唐康来,陈万,等.大鼠跟腱来源肌腱干细胞的分离培养及鉴定[J].第三军医大学学报,2013,35(11):1097-1101.

[9]张立岩,徐睿.肌腱干细胞的特性及在股骨头坏死治疗中的应用[J].中国临床医生杂志,2015,43(3):30-33.

[10]LEE W Y,LUI P P,RUI Y F.Hypoxia-mediated efficient expansion of human tendon-derived stem cells in vitro[J].Tissue Eng Part A,2012,18(5/6):484-498.

贫富分化和智能分化散文 第2篇

薛涌说：“这反映了美国社会一个深刻的矛盾：“不仅贫富分化加剧，智能分化或者说教育分化也在加剧。如果说贫富分化是市场竞争的结果，教育分化则是所谓起跑线’的问题，在某种意义上更可怕。”“美国的教育条件其实相当好。一流人才在这种环境中成长，当然就更加一流了。但是，失败文化’养育出来的生活态度，则是义务教育乃至大学很难扭转的。美国的精英非常聪明勤奋，不停地创造，昨天是互联网，今天是iPhone、Facebook。但是，论者指出，这些产业利润极大，创造的就业则不多，使得财富更加集中。草根越来越被甩在后面。”“美国的困境，给中国提一供了宝贵的前车之鉴矫正贫富分化要趁早。如果动手晚了，等形成世代贫困再想办法，那就难上加难了。”

人脑中神经元的数量是已知的，大约为1000亿个，具有极大的信息贮存量。一个信息单位叫做比特，大约相当于一个单词。人脑的容量有一百万亿个比特，这还是较为保守的估计。这一百万亿个比特，究竟有多大呢?它可以装下全世界所有图书馆的藏书内容。何况人类还有潜意识，有许多难以用语言表达的微妙感觉和印象。

人脑的功能比现在任何最先进的电脑强大得多。美国加利福尼亚的大脑智力研究所的一些专家认为，人的大脑功能实际上是无限的。实际上，普通一个人能够表达出的信息量只是巨大的冰山露出海面的峰面。现代科学研究表明，象爱因斯坦那样伟大的科学家，只用了自己大脑的三分之一的功能，而一般人则更少，绝大部分脑细胞仍处于“待业”状态。而且人脑不同于机器，使用久了会有磨损，而是越用越好用，就象有人学外语，一旦掌握了一两门外语，再学第三门和第四门就会容易许多。

那么是什么因素阻碍着我们充分利用大脑如此巨大的潜能呢?科学研究表明：一般来说，人脑的潜能只发挥了不到10%，而90%以上的潜在能力被浪费掉。

儿童生后一年内，神经结构和机能方面的发展是非常迅速的，是出生后发展最快的时期，脑重迅速增加近900克。3岁时增到1000克，7岁时为1280克，已接近成|人的水平，7岁以后就非常缓慢了。少年儿童时期，特别是婴幼儿阶段，随着大脑高速度发展，人的智力也在高速度发展，在这个年龄阶段，如果环境丰富和教育训练适当那将会获得意想不到的效果。相反，教育如果失当，即不可符合儿童身心发展规律，错过了适当的教育时机，或措施方法不当，往往产生不一良的后果，使儿童本来具有的发展潜能得不到充分实现。

近30年的研究表明，许多教育工作者和父母们对青少年和婴幼儿的心理发展水平估计过低，不相信学生们的学习潜力，采取粗一暴的态度，硬性灌输知识，从而扼杀了学生学习的积极性。

美国著名的心理学家布卢姆曾对近千名婴幼儿进行跟踪观察，一直到他们成年，他得到一个引起教育界轰动的结论：5岁以前是儿童智力发展最迅速的时期。他说，如果把17岁时，人所达到的智力水平定为100%，那么出生后的`前4年即可获得50%，到8岁已获得80%，从8岁到17岁仅获得20%。布卢姆的“5岁前是智力发展的最快时期”及“7岁前获得的智力占80%”两个结论引起了教育界的极大兴趣和重视。可见一个没有受到早期教育和环境丰富刺激的儿童，在学习上要比别的儿童吃力许多倍，那是因为他的部分脑细胞由于没有使用而急剧老化，因而失去功能。

教育心理学家林崇德指出，中学阶段，随着年级增高，年龄增大，学生的智力水平不断提高，“初中二年级是智力发展的关键年龄，高中二年级是智力发展的成熟期。”初二基本上摆脱了小学生的智力特点，他们的思维形式从经验型思维逐步向理论型思维发展，观察力、理解记忆能力和创造想象力也在迅速发展。高二是智力发展的成熟期，它意味着智力的主要成分基本上趋于稳定，基本上完成了向高水平的转化。有意识、有目的的观察占主导，有意记忆和理解记忆占主导地位，理论型的一抽一象思维占优势，个人的智力品质已基本定型，智力的个体差异基本形成。

既然“美国的教育条件其实相当好”，为什么教育结果会如此两极分化呢?如果用简单的“贫富分化”来解释，好像并不完全。

教育分成家庭教育、学校教育和社会教育。一个小孩的教育结果，是三方面的综合结果，而小孩本身的心理状态(持久的上进心、浓厚的学习兴趣、强烈的好奇心和求知欲)是其基础。人才学研究指出：人才大多出在中等家庭。因为这种家庭环境有利于养成小孩的良好心理状态。富裕家庭和贫困家庭都会破坏小孩的良好心理状态。

薛涌说：“教育分化则是所谓起跑线’的问题。”这种“起跑线”是什么?大多数家长认为是“重点学校”问题。其实是家庭教育、学校教育和社会教育三方面的综合。其中家庭教育非常重要。同样的学校，学生之间的差异也很大。当然，社会风气的影响也很大。我们现在的义务教育到初中。但是，家长素质、教师素质、教育方法、社会风气从来没有把小孩的良好心理状态放在第一位，都把“分数”放在首位。用“分数”衡量学生优劣、教师优劣、学校优劣。同样，社会上衡量人才的标准在人场市场可见一斑：学历、资历。人力资源部门基本是选用奴才，而不懂人才。私人老板宁用裙带，搞亲属集一团一。学术界搞派系、门第。还有“同行是冤家”;宁用奴才、蠢材，不用人才

分化鉴定 第3篇

本研究利用基因芯片技术,筛选在DPSCs分化过程中差异表达的mi RNAs,通过数据库进行靶基因预测,初步探讨mi RNAs在DPSCs分化过程中可能发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本取材

采集重庆第三军医大学新桥医院口腔科门诊18~25岁因正畸或阻生需要拔除的健康、完整、无龋损的牙齿。

1.1.2 主要试剂

I型胶原酶、dispase酶、α-MEM培养基、优等胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)及青霉素、链霉素、胰蛋白酶/细胞I型胶原、vimentin、nestin、GFAP抗体(Sigma,USA)。Trizol(Invitrogen公司产品)。所有引物由软件primer5设计,Invitrogen公司合成。芯片由博奥生物技术服务中心研制。

1.2 方法

1.2.1 人DSPCs的分离、原代培养

培养条件:α-MEM基础培养基+10%胎牛血清+100 U/ml青、链霉素。

将牙髓剪碎成0.5 mm0.5 mm大小,置于锥形瓶中,加入10~15倍体积的3 mg/ml I型胶原酶和2.4 U/ml dispase酶,消化1~1.5 h,至无成形的牙髓组织为止。200目铜网过滤;D-Hanks液洗细胞1遍,1 000 r/min离心5 min,以1103/ml的密度接种于6孔板;倒置显微镜观察细胞生长情况,细胞贴壁后,每3 d换液1次。

1.2.2 DPSCs的鉴定

细胞免疫表型vimentin、GFAP、nestin、I型胶原的表达:采用北京中山生物公司SP免疫组化试剂盒,以PBS代替一抗作为空白对照。细胞多向分化能力检测:成脂细胞分化诱导:2~4代DPSCs,以诱导培养基[α-MEM+100μg/ml吲哚美辛+10μg/ml胰岛素+0.5 mmol/L IBMX(3异丁基-1甲基-黄嘌呤)+1μmol/L Dex]诱导72 h,换以维持性培养基(α-MEM+10%FBS+10μg/ml胰岛素)培养24 h,反复诱导3~5周,油红O染色。

成牙本质细胞分化诱导:2~4代DPSCs,传代24h,更换为诱导性培养液(α-MEM+10%FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50μg/ml Vit C+10 nmol/L dex)连续培养14 d,茜素红染色。

1.2.3 基因芯片筛选成牙本质细胞诱导分化过程中DPSCs mi RNAs表达谱

4代DPSCs,传代24 h,细胞

贴壁,更换为成牙本质分化诱导性培养液,2~3 d换液,进行连续培养;用Trizol试剂分别提取诱导0 d组、7 d组、14 d组细胞总RNA,送北京博奥生物有限公司利用Affymetrix mi RNA芯片进行mi RNA芯片杂交。

1.2.4 差异显著mi RNA靶基因的分析及预测

使用Cluster&Treeview软件对芯片结果进行聚类分析。应用Target Scan在线对芯片结果差异大于2倍的mi RNAs进行靶基因预测,并结合文献资料查找与牙髓干细胞成牙本质细胞分化相关的靶基因。

1.2.5 荧光实时定量PCR验证芯片结果

结合靶基因预测结果,对芯片结果中hsa-mi R-633和hsa-mi R-210的表达水平应用实时定量PCR进行验证。hsami R-633引物:RT:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC-CGAGGTATTCGCACTGGATACGACtttatt-3',AS:5'-GCG GGCTAATAGTATCTACCACAA-3';hsa-mi R-210引物:RT:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG AGGTATTCG-CACTGGATACGACtcagcc-3',AS:5'-TGTGCGTGTGA-CAGCGGC-3';看家基因U6引物:Forward:5'-CTCGCT-TCGGCAGCACA-3',Reverse:5'-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3';mi RNAs通用Sense引物:5'-GTGCAGGGTC-CGAGGT-3'。实时定量PCR反应条件:95℃,10 min;95℃,15 s;60℃,1 min;5℃,20 s,重复40个循环,溶解曲线温度范围:60~95℃。

1.2.6 统计学处理

所有结果都在计算机上用SPSS10.0版软件处理。数据均采用表示,组间比较采用非配对t检验,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 DPSCs倒置显微镜观察

酶消化法分离出的DPSCs细胞个体较小,大多数为梭形或多角形,原代培养约2周基本长满(图1),可进行传代,以后平均3~5 d传代1次;随培养时间延长,传代次数增多,细胞胞体增大,变为长梭形。

2.2 DPSCs鉴定结果

2.2.1 细胞免疫表型检测

免疫组化法显示细胞有vimentin、I型胶原、GFAP和nestin的表达(图2~5)。

2.2.2 多向分化能力检测

成脂诱导:诱导3周细胞内有油红O染色阳性脂滴形成(图6);

成牙本质诱导:连续培养14 d细胞矿化结节行茜素红染色呈阳性(图7)。

2.3 mi RNAs表达谱芯片检测

2.3.1 DPSCs在成牙本质细胞分化过程中mi RNAs表达谱的变化

表达谱芯片结果显示DPSCs在成牙本质细胞分化过程中共有6条mi RNAs表达发生了2倍以上的改变,3条表达上调,3条表达下调。上调mi RNAs分别为hsa-mi R-633_st,hsa-mi R-559_st,hsami R-122-star_st,下调mi RNAs分别为hsa-mi R-210_st,hsa-mi R-1246_st,hsa-mi R-31_st。

2.3.2 差异表达mi RNAs芯片数据靶基因分析及预测

采用芯片的mi RNAs的标准值进行聚类分析(hierarchical clustering),关系近的mi RNAs会聚到一起(图8)。通过软件预测并结合文献,发现hsa-mi R-633的靶基因MEPE和hsa-mi R-210的靶基因GIT2可能与成牙本质分化相关,可作为后续研究靶点。

2.3.4 部分差异表达显著mi RNAs荧光实时定量PCR验证结果

荧光定量RT-PCR结果显示hsami R-633显著上调,hsa-mi R-210显著下调,与芯片结果基本一致(图9~10),说明本研究芯片获得的结果真实可靠。

3 讨论

利用DPSCs等“种子细胞”与支架复合,实现牙齿再生及功能性萌出的实验研究为人类再生第三副牙齿带来了希望[5]。DPSCs存在于成年机体牙髓组织中,具有自我更新和多向分化潜能,同其他组织成体干细胞具有相似的生物学特性[6]。DPSCs的研究目前面临以下难题:确保分离DPSCs的效率;控制干细胞分化的具体的信号传导路径,干细胞的定向分化等[7,8]。随着mi RNA的发现和基因芯片技术的飞速发展为DPSCs的研究开辟了新的思路。

mi RNAs是存在于真核细胞中具有进化保守性的一族非编码小片段RNA,为18~24 bp大小,通过与靶基因m RNAs的碱基互补配对(以前观点认为mi RNA仅仅和m RNA3'-UTR区完全或不完全配对发挥作用,最新研究显示[9],其也可与m RNAs编码区结合发挥作用)来影响m RNAs的稳定性或抑制其翻译,实现对蛋白表达的调控[3]。mi RNAs不仅在细胞分化、增殖等诸多生理过程中发挥作用,如凌宏艳等[10]研究发现3T3-L1前脂肪细胞分化过程中存在mi RNAs表达谱的变化,也与多种疾病,特别是肿瘤的发生发展有密切关系。研究表明[11,12],mi RNAs在恶性肿瘤的转移和侵袭中担当重要角色,也在血管生成中起到了重要的调节作用。作为机体内源性RNA,mi RNAs很可能在DPSCs的生长分化中起到重要的调控作用。

目前采用芯片技术筛选出DPSCs在成牙本质细胞分化过程中mi RNAs表达谱,还少见报道。本研究采用酶消化法,成功分离培养出DPSCs,利用mi RNAs芯片检测诱导DPSCs向成牙本质细胞分化过程中差异表达的mi RNAs,发现DPSCs在这一过程中发生了2倍以上表达改变的mi RNAs共有6条,表达上调和下调的各3条,这一结果表明mi RNAs可能对人DPSCs向成牙本质细胞分化起着一定的调控作用。

随后我们采用Target Scan数据库预测这6条mi RNAs靶基因,结合文献发现hsa-mi R-633的靶基因细胞外基质磷酸化糖蛋白MEPE(matrix extracellular phosphoglycoprotein)和hsa-mi R-210的靶基因G蛋白偶联受体激酶结合因子2(G protein-coupled receptor kinase interactor 2,GIT2)可能与成牙本质诱导相关。MEPE是一种细胞外基质的非胶原磷酸化糖蛋白,在牙发育过程中有重要意义,主要在人牙组织和骨组织中表达。对于MEPE在DPSCs分化过程中的表达和作用,不同的学者持不同的观点。Liu等[13]认为ME-PE很可能抑制DPSCs的分化和矿化,可以与DSPP一起作为DPSCs的分化标志。Wei等[14]却发现在牙髓细胞矿化过程中,MEPE和dspp m RNA随着诱导时间的增加表达上调。由于mi RNAs起负性调节作用,如果DPSCs向成牙本质细胞分化过程中hsa-mi R-633显著升高,说明MEPE表达很可能会受到抑制,故本研究结果支持MEPE抑制DPSCs分化的观点。GIT是一个支架蛋白家族,具有复杂的区域结构,可以绑定许多蛋白。他们在细胞支架动力学和质膜与内涵体之间膜运输等方面具有重要功能。有证据表明GIT2在骨形成和骨吸收中发挥重要作用,由于成牙本质诱导与成骨诱导的相似性,故我们推测GIT2有可能在DPSCs成牙本质细胞分化过程中发挥作用。

由于基因芯片检测存在一定的假阳性率、不稳定性及可重复性较差等缺点,针对芯片所得结果应通过诸如实时荧光定量PCR或Northern blotting等方法来加以验证,因此我们采用荧光定量RT-PCR方法对实验各组间hsa-mi R-633和hsa-mi R-210实际表达情况进行了验证,所得结果与芯片结果基本一致,说明芯片结果是可靠的,可以作为深入研究的数据基础。

本研究结果表明DPSCs经诱导向成牙本质细胞分化过程中mi RNAs表达谱具有显著变化,但所得差异显著mi RNAs在DPSCs成牙本质细胞分化中的具体机制还没有完全阐明,具有进一步研究的必要。

摘要：目的:筛选人牙髓干细胞向成牙本质细胞定向分化过程中差异表达的microRNAs(miRNAs)并进行初步鉴定。方法:体外分离、培养和鉴定人牙髓干细胞,miRNAs芯片筛选牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中差异表达的miRNAs,并通过TargetScan数据库预测靶基因,实时定量PCR法对结果进行初步鉴定。结果:人牙髓干细胞vimentin、nestin、GFAP和I型胶原4种细胞表型均表达;成脂诱导3周后细胞内有油红O染色阳性脂滴出现;成牙本质诱导可见钙结节形成;基因芯片结果显示,牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中,发生2倍以上表达变化的miRNAs有6条,其中上调3条,下调3条。通过miRNA靶标预测工具预测靶基因,发现hsa-miR-633和hsa-miR-210有与牙髓干细胞分化相关的靶基因;real time-PCR验证hsa-miR-633和hsa-miR-210表达变化与基因芯片结果相符。结论:人牙髓干细胞经诱导向成牙本质细胞分化过程中miRNAs表达谱具有显著变化,为牙髓干细胞分化机制研究提供了新的提示。