分子生物学基本实验

分子生物学基本实验（精选6篇）

分子生物学基本实验 第1篇

分子生物学实验室所需试剂、耗材清单

1、普通化学试剂，共计约2.89万。

名

称 95%乙醇AR 无水乙醇AR DEPC EDTA二钠AR 柠檬酸钠AR 柠檬酸三钠AR L-精氨酸BR Tris 苯酚AR 变色硅胶 冰乙酸AR 丙酮AR 二甲苯AR 二乙醇胺cp 甘露醇AR 甘油AR 高碘酸AR 甲醇AR 磷酸氢二钠AR 硫酸AR 硫酸铵AR 硫酸镍AR 氯仿AR 氯化钾AR 氯化镁 氯化钠AR 氯金酸AR 莽草酸 明胶CP 钼酸

钼酸铵AR 尿素AR 牛肉浸膏BR 硼酸AR 氢氧化钠AR 去离子甲酰胺 三乙醇胺 碳酸钙AR 单 位 单价(元）

瓶 7 瓶 10 瓶 150 瓶 50 瓶 27 瓶 15 瓶 126 瓶 220 瓶 36 瓶 19 瓶 10 瓶 18 瓶 20 瓶 38 瓶 15 瓶 28 瓶 240 瓶 8.4 瓶 11 瓶 14 瓶 10 瓶 102 瓶 28 瓶 20 瓶 18 瓶 10 瓶 196 瓶 390 瓶 35 瓶 290 瓶 380 瓶 18 瓶 90 瓶 18 瓶 10 瓶 780 瓶 25 瓶 23 购置数量

金额（元）140 20 200 10 1500 9 450 9 243 9 135 5 630 10 2200 9 324 18 342 9 90 5 90 1 20 1 38 1 15 2 56 2 480 5 42 1 11 3 42 17 170 1 102 10 280 2 40 1 18 10 100 1 196 3 1170 1 35 1 290 1 380 5 90 1 90 10 180 10 100 4 3120 1 25 1 23 碳酸钠AR 碳酸氢钠AR 无水碳酸钾AR 硝酸 硝酸银 销酸钴 盐酸AR 乙酸钾AR 乙酸锌AR 蔥酮 AR 消毒/双氧水30% AR Trypan Blue Tween-20 硝酸钾 硫酸铁 氢氧化钾 甲醛 500ml 硼砂

乳酸 500ml 硝酸钙 乙酸钠 异丙醇 AR 异戊醇 AR SDS 合计

瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 16 22 10 350 48 14 45 36 68 11 32 20 15 15 15 8 12 27 12 46 10.45 40 38 1 1 1 5 1 2 1 1 1 4 1 1 1 1 1 15 5 1 1 4 8 8 40 12 16 22 10 1750 48 28 45 36 68 44 32 20 15 15 15 120 60 27 12 184 83.6 320 1520 28890.6

2、分子生物学试剂, 共计约4.5万元。

名称 La高保真酶 高保真Taq HS 高保真Taq HS GC Buffer DnaseI Rnase A 100bp maker 150bp Maker Marker DL500 Marker DL1000 Marker r-ecot14 I digest 去磷酸化酶 X-GLUC

单位

支 支 支 支 支 支 支 支 支 支 支 瓶

单价(元）购置数量 金额（元）

250 700 700 431

250 250 80 80 500 300 450 2 2 9 3 9 9 10 10 1 1 1

1250 1400 1400 3879 390 2250 2250 800 800 500 300 450 Klenow酶 pMD18-T Vetcor T4 DNA聚合酶 T4连接酶 TRNzol 总RNA提取试剂

IPTG X-gal dNTP(10mM)普通Taq酶（1000U）DNA ladder(100bp，1kb等，50ug)琼脂塘 TEMED 丙烯酰胺

溴酚兰 矿物油

Platinum高保真Taq酶

合计

支 支 支 支 盒 瓶 瓶 支 支 支 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 支

280 108 400 420 80 600 80 80 180 300 40 70 40 90 1500 2 1 5 2 10 10 20 20 10 10 20 30 1 6 5

560 108 2000 840 800 6000 1600 1600 1800 3000 800 2100 40 540 7500 87930

3、内切酶, 共计约0.41万。

名称 BamHI DraI EcoRI EcoRV HindIII KpnI Pst I XbaI 合计

单位 支 支 支 支 支 支 支 支

单价(元）购置数量 金额（元）77 65 75 77 65 120 70 5 18 9 5 9 2 8

385 1170 675 385 585 240 560 4090

4、试剂盒, 共计约1.84万元。

名称 单位 单价(元）

Promega T-easy载体A1380 盒 1400 Promega T-载体试剂盒 盒 900 质粒提取试剂盒(50次)盒 300 一次性胶回收纯化试剂盒

盒 1000（50次）

RNA提取试剂盒(50次)盒 800 RNA纯化试剂盒(50次)盒 360 植物总RNA 提取试剂盒 盒 1280 RT-PCR试剂盒 盒 1500 合计

购置数量 10 5 1 3 1 2

金额（元）

1400 9000 1500

3000 800 1080 1280 3000 248270

5、组织培养试剂，共计约3.55万元。名称

Ammonium sulfate 硫酸铵 Potassium phosphate monobasic KH2PO4 Potassium nitrate KNO3 MYO-INSOSITOL 肌醇 Magnesium sulfate heptahydrate 硫酸镁

Phytagel™ 琼脂粉

N-Z-Amine 水解酪蛋白 Kinetin MgCl2.6H2O 氯化镁 氯化钙 胰蛋白胨 酵母粉 琼脂粉 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 合计

单位 单价(元）购置数量 金额（元）

瓶 1190 1 1190

瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶 瓶

1390 4260 4650 3220 1350 1580 5050 1580 3600 300 150 52 15 22 200 1 2 1 2 1 1 1 1 2 2 5 5 4 2

1390 4260 9300 3220 2700 1580 5050 1580 3600 600 300 260 75 88 400 35593

6、抗生素，共计约2.22万。

名称 潮霉素 头孢霉素 羧苄青霉素 利福平

单位 单价(元）

瓶 700 瓶 550 瓶 2500 瓶 850

购置数量 5 4 4

金额（元）

5600 2750 10000 3400 卡那霉素 氨苄青霉素 合计

瓶 瓶30 8 8 240 240 22230

7、实验室耗材，共计约1.58万。名称 玻璃拖把 乳胶滴头 乳胶管6*9 1000ml塑料烧杯 1000ml玻璃烧杯 500ml玻璃烧杯 5ml可调定量加液器 5ml玻璃刻度吸管 10ml玻璃刻度吸管 150ml玻璃锥形瓶 100ml消煮管 25ml玻璃刻度试管 10ml塑料离心管

玻璃棒

有机试管架25*30 试管刷 玻璃试管 玻璃三角瓶 玻璃试剂瓶 塑料量筒 塑料烧杯 一次性过滤器

X光片 液氮（35L）冻存盒,离心管盒,离心管架

密封塑料盒 100格冷冻盒 冻存管(2ML)封口膜 硅胶塞24-28 硅胶塞27-31 三角烧瓶（1000ML)三角烧瓶（100ML)双面离心管架 水银温度计 定性滤纸

单位 单价(元）个 3 个 0.13 个 3.6 个 3.73 个 10.2 个 5.5 支 40.5 支 5 支 5.1 个 4.1 个 8.4 支 1.94 个 20 支 1 个 34.6 个 2 支 1.5 个 4 个 12 个 10 个 10 个 7 个 260 个 150 个 12 个 30 个 8 个 2.5 个 200 个 1.9 个 2.7 个 600 个 9.8 个 2.5 支 8.5 个

1.3

购置数量

金额（元）15 10 1.3 5 18 5 18.65 5 51 5 27.5 1 40.5 1 5 1 5.1 1 4.1 1 8.4 9 17.46 45 900 45 45 45 1557 9 18 18 27 18 72 18 216 18 180 18 180 45 315 4 1040 9

1350 108 4 120 4 32 230 575 4 800 45 85.5 45 121.5 1 600 4 39.2 4 10 8 68 45

58.5 药匙

一次性注射器

0.2mlPCR管 1000个/包 96孔PCR板 10块/包 1.5ml离心管 500个/盒 2ml离心管 500个/盒 96孔PCR硅胶密封硅胶盖

一次性无菌细菌培养皿

玻璃培养皿

吸嘴（10ul，100ul）1000个/袋

吸嘴（1000ul）1000个/袋

合计

个 个 包 包 盒 盒 个 个 个 袋 袋 0.7 33 4 7 7 5 1 0.8 3.5 40

186 50 465 50 45 8 800 40 40 40

180 130.2 1650 1860 350 315 40 800 32 140 1600 15826.91

分子生物学基本实验 第2篇

实验四 PCR产物的琼脂糖凝胶检测与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（6学时）实验五 分子生物学软件的使用（4学时）

实验六 生物信息学（3学时）生物信息获取与利用 实验考试

实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA

【目的要求】

学习并掌握DNA琼脂糖凝胶电泳基本原理和操作，了解如何通过电泳判断DNA纯度、含量和分子量。

【实验原理】

凝胶电泳是分离、纯化和鉴定DNA的常用方法。因为DNA分子是两性解离分子，在pH高于其等电点（约3.5）的中性或碱性溶液中带负电荷，在电场中向正极方向泳动。DNA凝胶电泳的介质主要有两种：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯凝胶的孔径较小，适合于分离5-500bp的小片段DNA；而琼脂糖凝胶的孔径较大，可以分离100bp-60kb的较大片段DNA。不同浓度的琼脂糖凝胶适合于分离不同大小的DNA片段（表7-1）。

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，当熔化后再凝固时就会形成固体基质，具有多孔的网状结构，孔径大小取决于琼脂糖浓度。DNA在琼脂糖凝胶中泳动时，受到电荷效应和分子筛效应的双重影响。电荷效应由分子所带的电荷量多少来决定，而分子筛效应则与分子大小和构象有关。在一定的电场强度下，DNA分子的泳动速度主要取决于分子量大小和构象。线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶介质中的迁移率与其分子量的对数值成反比。分子越大，迁移速度越慢，从而可以将不同大小的DNA分子分开。因此，通过与DNA标准分子量参照物（MW marker）的迁移率对照，可以鉴定DNA分子的大小。DNA分子的构象也可以明显影响其迁移率。在细胞内质粒DNA有3种构象：超螺旋的共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的开环DNA（open circular DNA，ocDNA）和线性DNA，在琼脂糖凝胶电泳中，其泳动速度依次为：cccDNA >线性DNA >ocDNA，因而未酶切的质粒DNA在电泳中多显示为3条带，泳动速度最快的超螺旋带越亮，说明质粒DNA提取质量越好。

表7-1：不同浓度琼脂糖凝胶对DNA的有效分离范围

琼脂糖浓度（%）线性DNA有效分离范围(kb)0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA的迁移率还与电场强度（即单位长度的电压降）有关，电场强度越大，泳动速度越快。当需要快速观察电泳结果时，可以适当加大电场强度。但是电泳分辨率会随着电场强度的增大而缩小，因为高分子高速流动时摩擦力增加，相对分子质量与移动速度就不一定成正比，因此一般电场强度应不超过5V/cm。特别是当需要较精确测定DNA片段大小、获得理想的分辨率和漂亮的带型时，应该适当降低电场强度，相应的适当延长电泳时间，并选用相对较低的凝胶浓度。

为了显示凝胶中DNA的泳动位置，需要加入染色剂染色。最常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线的激发下发出橘红色荧光。一般是在凝胶中直接加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，这样可以在电泳过程中随时利用紫外灯观察核酸的迁移情况。但是EB与DNA的结合会影响DNA的迁移率，因此对于需要较精确测定DNA片段大小、或需根据荧光强度测定DNA含量时，EB染色应在电泳结束后再进行（将凝胶浸入0.5μg/ml的溴乙锭水溶液中10min即可）。注意：EB是强诱变剂，使用EB必须戴一次性手套，不要洒在桌面地面上，被污染的物品必须专门处理后（加少量漂白粉可使EB分解），再彻底清洗或丢弃。

指示剂溴酚蓝和二甲苯青的作用是指示样品在凝胶中的迁移过程，以确定终止电泳时间。在0.6 %、1%、2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝分别约与1kb、600bp、150bp双链线状DNA片段的迁移率大致相同。在1%琼脂糖凝胶中，二甲苯青大致相当于2kb双链线状DNA的位置。【试剂器材】

1．5×TAE：

2．10mg/ml溴化乙锭（EB），避光4℃保存。/ GoldView 常温保存。3．6×上样缓冲液（配方见附录）4．（电泳）琼脂糖

5． DNA、PCR扩增产物

6．DNA标准分子量marker（λDNA/HindIII）7．水平式电泳槽、电泳仪 8．透射式紫外灯 9．胶带

10．微波炉或恒温水浴 11．微量移液器 【操作步骤】

1．称取琼脂糖1g，置三角烧瓶中，加入1×TAE 100 ml，置沸水浴或微波炉中加热，使充分溶解。注意：微波炉煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反复加热1-2次，注意此时可能出现爆沸现象，避免蒸汽烫伤。

2．待琼脂糖溶液冷却至60-65℃左右时加入溴化乙锭/5ulGold View，使终浓度为0.5μg/ml，混匀。

3．用胶带把制胶模具的两端边缘封好，置水平位置，选择孔径适宜的加样孔模板（梳子），并垂直安插好。注意梳齿必须与模具底面保持一定距离（约0.5-1mm），防止样品槽破裂，导致样品泄漏。

图3-1：凝胶灌胶过程示意图

4．将冷却至50-60℃左右的琼脂糖溶液缓慢倒入制胶模具中，使凝胶液缓慢展开，直至形成厚度适当（一般为0.3-0.5cm）的胶层。小心去除加样孔周围的气泡。室温静置30-60分钟。（如图3-1）

5．琼脂糖完全凝固后，小心取出梳子，去掉模具两端的胶带，将凝胶放入电泳槽中。6．电泳槽中注入适量0.5×TBE缓冲液，使液面高于凝胶约1mm左右。7．分别取5μl DNA或者2μl PCR产物和约0.5μg DNA分子量marker，加入1/5体积（2ul）的上样缓冲液，混匀。

8．小心缓慢将样品上样于凝胶加样孔中。记录样品加样孔顺序。

9．上样完成后，尽快开始电泳，以防止样品漂流。接通电源，注意正负极是否正确。调节电压在1-5V/cm左右，样品进胶前电压不要太高。电泳开始后不久就可以观察到溴酚蓝从加样孔迁移到凝胶中。

10．根据指示剂迁移的位置，或根据反射紫外灯显示的DNA迁移位置，判断是否需要终止电泳。切断电源后，取出凝胶。

11．将凝胶置于透射紫外灯上，打开紫外灯（注意尽量避免使用254nm短波紫外灯，并戴好防护眼镜或防护罩），观察染色后发出橘红色荧光的DNA条带，拍照记录。

注意观察样品DNA条带是否清晰，有无拖尾现象，条带数量、大小是否正确，判断样品DNA分子大小，与预期大小是否相符，并目测粗略估算样品DNA含量。【注意事项】

（1）凝胶不能有气泡。（2）电泳是从负极到正极。

（3）EB是致癌剂，操作要带手套。【实验安排】

本实验一天内可做完。【作业】

写出实验步骤及注意事项。

相关溶液配制

1,50倍TAE缓冲液的配制(pH8.5)配方：2MTris-HAc、100mM EDTA 配制量：1L 配制方法：

1）称取Tris碱242.3g，置于烧杯中

2）称取EDTA固体29.3g或Na2EDTA-2H2O固体37.2g 3）加入700mLddH2O，溶解完全 4）加入57mLHAc，充分搅拌 5）用HAc调pH至8.5 6）定容至1L，室温保存

2，溴化乙锭(EB)【强致癌物】 配制量：100mL 配制方法：

1）1gEB于专用容器中

2）加入100mLddH2O,搅拌数小时至溶解完全 3）转移至棕色瓶中，避光保存 3，6×上样缓冲液Loading Buffer 配方：30mMEDTA；36%（V/V）丙三醇；0.05%溴酚蓝；pH7.0 配制量：100mL 配置方法：

1）6mL EDTA（500mM，pH8.0）加入50ml ddH2O中 2）5mL 1%溴酚蓝 3）取36mL丙三醇

4)用2N的NaOH调pH=7.0 5）定容至100mL 4，6×甘油上样缓冲液Loading Buffer 配方、配制量：

成分及终浓度 0.15%溴酚蓝

0.15%二甲苯靑EF 5mmol/L EDTA 50%甘油 水

配制10ml溶液各成分用量 1.5ml 1%溴酚蓝

1.5ml 1%二甲苯靑EF

100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)3ml 3.9ml

5.GoldView(GV)GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView™即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。

由于未发现GoldView™有致癌作用，且灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。

概 述

GoldView™是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView™与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。

通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性；而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用Goldview™代替EB不失为一种明智的选择。

使用方法

1.将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）在微波炉中融化。

2.加入5ul GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。

3.冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。

4.电泳完毕在紫外灯下观察。若使用数码相机照相记录，则关闭相机的闪光灯，放在自动档即可；若使用凝胶成像系统照相，通过调节光圈、曝光时间，选择合适的滤光片，可得到成像清晰、背景较低的照片。

注意事项

1.胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。

2.加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。

3.通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割DNA条带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物学下游操作的效率。

谈分子生物学实验教改及体会 第3篇

关键词：分子生物学实验,实用性,实验技能

分子生物学是研究蛋白质、核酸等生物大分子形态结构及其规律性和相互关系的科学。在分子生物学教学中, 实验教学比理论教学更易让学生理解和掌握, 因为学生有实践的机会, 操作后能加深与巩固理论知论。分子生物学技术种类繁多, 有些实验所用的仪器与材料往往是精细的、昂贵的, 对实验条件、操作技能要求非常高, 而本科教学又具有学时少和学生人数多的特点, 如何通过对实验教学的内容和方法的改革, 精选出合理的实验内容, 开设综合性、设计性的实验, 培养学生的独立操作能力, 激发学生对实验的学习兴趣, 使学生理解与掌握生命微观世界的一些知识, 认识到分子生物学实验的重要性和实用性, 对学生的实践能力进行培养。本文就如何进行分子生物学实验教学质量改进及学生能力的培养谈几点体会。

1 精选合理的实验内容

分子生物学是一门新兴学科, 为适应21世纪经济和科技激烈竞争的形势以及市场经济的社会环境, 培养学生的创新能力, 要合理设置实验内容, 结合课时安排, 挑选一些经典的实验, 如从植物或动物组织中提取DNA, PCR扩增, 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化, 蓝白斑筛选, 质粒DNA的提取及酶切, 琼脂糖凝胶电泳等实验。将基本技术实验与综合开放实验相融合, 再结合实验室现有的仪器设备进行合理设置。结合本科分子生物学技术的特点, 将分子生物学实验课程从整体上设计为个2~3个完整的大实验, 每一个具体实验之间既独立又相互关联, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。

2 开设综合性实验

分子生物学实验与其它科目的一些基础实验不同, 一般科目基础将实验基本上可在2~3节课内完成, 并可得出结论, 而分子生物学实验具有时间长、连贯性、紧密结合性, 一般难以在2~3节课内完成, 因此分子生物学适宜开设一些综合性实验, 集中安排在一段时间内进行, 时间最好能控制在2~3天内完成, 结合学生的其它课程安排, 最好安排分子生物学实验在星期五、星期六、星期天进行, 每天完成一项实验内容, 3天学生刚好能完成一个综合性实验的流程, 形成一个完整的实验概念, 加深了学生对实验的印象, 让学生充分意识到实验时间安排的灵活性, 在实验进行过程中需要等待时间较长时, 可利用该空隙进行下一个实验材料的准备。从而提高学生的主动性, 调动学生的积极性, 培养学生的实践操作能力。这样, 改变了传统实验教学时间安排过于死板, 时间过少且不连贯的现象。

3 增开设计性实验

一般的实验均是由老师根据本学期的实验学时数进行开设实验, 学生基本上都是按部就班地跟着老师的思路走, 学生在上实验课前都不知道自己这学期要做哪些实验, 学生往往很被动。而分子生物学实验则改传统实验为设计性实验, 学生可以根据自己掌握的理论知识, 通过教师的指导, 来设计一些实验。从而大大提高了学生对该学科的兴趣, 也使学生更加熟练地掌握分子生物学的常用技术, 这一实验教学改进深受学生的好评, 从根本上改变了学生学习分子生物学的态度。

4 开设小组实验教学

针对学生人数较多的特点, 为保证学生能真正地学习掌握分子生物学实验操作要领, 我们开设小组实验教学, 分批分次地进行实验课程教学。从移液枪的使用方法以及注意事项开始, 实验耗材的灭菌烘干, 选择性培养基的制备、溶液的配制及pH的调节, 实验过程的无菌操作规范, 琼脂糖凝胶制备时, 需注意用1TAE或0.5TBE来配制, 电泳时也需用相对应的缓冲液作为工作缓冲液, 超净工作台、冷冻离心机、恒温振荡器、制冰机、电泳仪、凝胶成像系统等仪器的规范使用, 均按师生比为1:8进行实验教学, 每次实验均由老师亲自演示操作, 学生分成2组同时进行实验, 理论与实践相结合进行教学。这样学生基本操作技能得到很好的训练和提高, 培养学生学习的积极性、主动性, 引导学生探索分子生物学奥妙的微观世界的兴趣。

参考文献

[1]杨清玲.本科生分子生物学实验教学改革的实践和体会[J].山西医科大学学报:基础医学教育版, 2007, 9 (1) :44～46.

[2]卢亚萍, 杨志敏, 徐朗莱.“基地班”分子生物学实验课教学探讨[J].教学研究与课程改革, 2004 (4) .

分子生物学基本实验 第4篇

摘 要：针对中医专业八年制高层次、高素质综合医学人才的培养需要，我室在医学生物学实验的基础上，开设了现代生物学实验技术教学。在进行现代生物学实验技术教学过程中，我们就观察体外培养细胞的基本形态这一实验，在实验内容设计和实验具体操作等方法进行了改革，获得了较好的实验教学效果。

关键词：生物学实验；方法改进；中西医结合

医学生物学是中医院校的基础课程，是一门实践性很强的学科。实验教学是医学生物学教学过程中重要的组成部分，实验教学效果的好坏直接影响课堂教学的效果和学生对医学生物学的兴趣。高年制的医学生是各医学院校重点培养的高层次医学人才，因此，对他们的要求远远高于五年制学生，除了要求他们掌握全面扎实的专业知识外，还要求他们具有较高的科研素质、创新能力和实践能力，进而全面提高高年制学生的综合素质，培养学生分析问题、解决问题的能力。基于此，实验教学改革成为我们教学的重点。笔者综合分析目前我室的生物学实验教学过程，除了基本的医学生物学实验外，还开设了现代生物学实验技术课，这门实验课主要包括细胞培养、细胞传代和染色体显带等实验；在进行观察体外培养细胞的基本形态这个实验时，对该实验进行几个方面的改革，主要包括对实验教学方法、实验内容设计和实验具体操作进行改进，经调查，改革后实验教学效果较好。

一、实验教学方法改革

观察体外培养细胞的基本形态这个生物学实验的目的有两个：一是掌握倒置显微镜的使用方法；二是让学生了解细胞的基本形态结构和体外培养细胞的生长状况。这样，有助于学生理解细胞是生命有机体的基本结构单位。针对这个实验目的，我们采用多媒体教学和国内外文献教学相结合，从体外培养细胞的形态特征类型开始讲解，结合不同细胞的图片，逐步讲解。同时，结合实物演示（培养瓶中装有不同时间的培养细胞）给学生讲解体外培养细胞的生长状况和细胞培养中的污染情况，使学生对这个实验先有感官认识，然后让学生自己设计实验。

二、实验内容设计

在实验内容设计过程中，我们首先对实验室的实验条件和经费进行考虑，然后结合高年制学生的实际条件进行实验设计。我校高年制的学生在进行现代生物学实验技术学习时，已经完成了基本的医学生物学实验，如显微镜的观察、蟾蜍的解剖等基本实验，所以，在进行现代生物学实验技术时已经具备了一定的知识水平。高年制的学生分两组进行这个实验，每组为21人，结合我室的实验条件，倒置显微镜只有一台，要完成这个实验而且效果要好必须进行以下的实验设计：（1）细胞的准备：培养瓶细胞的准备和24孔板细胞的准备。（2）盖玻片的无菌准备。（3）细胞固定试剂的选择。（4）显微互动实验室进行固定细胞的观察；倒置显微镜进行培养瓶细胞的观察。（5）进行实验结果的分析、讨论。

三、具体操作步骤的改进

实验内容设计好以后，进行具体的操作步骤：（1）将21个学生分为7组，每3人1组。（2）以往实验是利用培养瓶培养细胞，但是只有一台倒置显微镜，所以改为24孔板内放置盖玻片培养细胞。（3）每组进行培养细胞前准备。首先各组进行盖玻片的无菌处理，然后将无菌的盖玻片放入24孔板内。（4）各组进行24孔板内细胞接种培养，即爬片。（5）将有细胞的盖玻片取出，各组进行固定。（6）第一组、第二组采用丙酮固定；第三组、第四组采用95%乙醇固定；第五组、第六组采用甲醛固定；第七组采用甲醇冰醋酸固定。（7）在显微互动实验室进行细胞形态的观察。（8）交叉进行倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞。实验完成后进行实验报告的书写，内容包括实验原理、实验目的、实验设计及实验结果的讨论等。学生将固定的细胞和未固定细胞的形态观察进行讨论分析，讨论的过程较热烈，有的学生提出的问题特别有意义，这样既可以让每个学生参与实验，同时，又增强了同学提出问题、解决问题的能力。

针对观察体外培养细胞的基本形态这个实验，我们进行了以上这几个方面的改进，使学生在教学过程中的各个环节都主动参与并不断地提出新的问题。在这个过程中，学生得到锻炼的同时，教师也在教学中得到了学习，扩展了知识面。实验教学是树立学生实践观念，培养分析、解决实际问题能力， 启迪学生创新思维，提高学生综合素质的重要环节。所以，在实验教学过程中，我们要不断地进行探索和改革，这样更有利于培养学生的創新能力和科研素质。

参考文献：

[1]李健，苗绪红，李光.七年制医学生细胞生物学实验双语教学的实践与思考[J].山西医科大学学报：基础医学教育版，2007，9（4）：465-466.

[2]倪秀珍，莫金钢.普通生物学实验课程教学改革尝试[J].长春师范学院学报（自然科学版），2008，27（3）：136-137.

基金项目：北京中医药大学教育科研课题（项目编号：XJY14019）。

分子生物学基本实验 第5篇

一、实验目的

熟悉分子生物学实验室常用仪器并熟练使用

二、实验原理

1、恒温气浴摇床：用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养，发酵，杂交，生化反应及酶和组织研究等。

2、超净工作台：用于分子生物学无菌操作。

3、低温台式高速离心机：用于分离纯化DNA和蛋白质等，如基因片段的分离，蛋白酶的沉淀和回收等。

4、微量移液管：是连续可调的，计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。有多种规格：①0.5-10μL②10-100μL③20-200μL④100-1000μL。

5、电泳仪：用于确定大分子物质的分子量以及鉴定物种亲缘关系的仪器。

6、PCR仪：用于目的基因的扩增，是一对寡糖核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段。主要用于基础研究和应用研究等领域。

7、灭菌锅：用于细菌和细胞培养及核酸等有关实验使用的试剂，器皿及实验用具的严格灭菌。

三、实验仪器

恒温气浴摇床、超净工作台、低温台式高速离心机、微量移液管、灭菌锅、PCR仪、电泳仪。

四、实验步骤

（一）、恒温气浴要穿的使用：

1、样品瓶牢固放入弹簧夹中

2、接通电源开关，仪器进入准备状态

3、参数设定，（设定温度、时间、转速等参数）

4、按启动键仪器开始工作，按暂停键可暂停托盘的旋转；

5、按电源键，显示屏显示消失，关闭电源总开关

（二）、超净工作台的使用

1、使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。

2、接通电源，提前30分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，15分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。

3、工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。

4、操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。

5、最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。

（三）、低温台式高速离心机的使用

1、把离心机放置于平面桌或平面台上，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检查离心机是否放置平衡。

2、打开门盖，将离心管放入转子内，离心管必须成偶数对称放入，且要事先平衡，完毕用手轻轻旋转一下转子体，使离心管架运转灵活。

3、关上门盖，注意一定要使门盖锁紧，完毕用手检查门盖是否关紧。

4、插上电源插座，按下电源开关（电源开关在离心机背面，电源座上方）。

5、设置转子号、转速、时间：

在停止状态下时，用户可以设置转子号、转速、时间，此时离心机处于设置状态，停止灯亮、运行灯闪烁；按下启动离心开始

（常用，最高转速为13000r/min，时间最长为20分钟）；

注意：对应的转子一定要设置在相应的转速范围内，不可超速使用，否则对试管或转子有损坏。

6、离心机时间倒计时到“0”时，离心机将自动停止，当转子停转后，打开门盖取出离心管，关断电源开关。

（四）、微量移液管的使用

1． 将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头）2． 将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；

3． 垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部；

4． 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少； 5． 等一秒钟后将吸嘴提离液面

6．平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体； 7． 提起微量移液器，然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。

（五）、PCR的使用

1、开机：打开开关，视窗上显示“SELF TEST”。

2、放入样品管，关紧盖子。

3、如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则开始执行程序。

4、如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM,按《Proceed》，1）命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认(如何输入字母、数字)。2）输入程序步骤：名字输入后，确认，然后输入相关程序

5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。

6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。

（六）、电泳仪的使用

1． 首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。2．按电源开关，显示屏出现“欢迎使用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪…”等字样后，同时系统初始化，蜂鸣4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。3．确认各参数无误后，按“启动”键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start!并蜂鸣4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，注意安全。之后逐渐将输出电压加至设置值。同时在状态栏中显示“Run”，并有两个不断闪烁的高压符号，表示端口已有电压输出。在状态栏最下方，显示实际的工作时间（精确到秒）

4．电泳结束，仪器显示：“END”，并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣

（七）、高压灭菌锅

1、开盖：转动手轮，使锅盖离开密封圈，添加蒸馏水刚没至板上

2、通电：将控制面板上电源开关按至ON处，若水位低（LOW）红灯亮

3、堆放物品：需包扎的灭菌物品，体积不超过200mm×100mm×100mm为宜，各包装之间留有间隙，堆放在金属框内，这样有利 于蒸汽的穿透，提高灭菌效果，灭菌时间： 121℃，20min，；如为液体，液体必须装在可耐高温的玻璃器皿中，且不可装满，2/3即可，121℃，18-20min

4、密封高压锅：推横梁入立柱内，旋转手轮，使锅盖下压，充分压紧

5、设定时间和温度，开始灭菌

6、灭菌结束，所有东西放入干燥箱干燥，排尽水气

五、思考题

1、列出分子生物学常用仪器的名称，用途及操作时的注意事项。

答：①恒温气浴摇床：常用于液体摇匀以培养微生物、细菌和细胞等。注意要依据不同的用途设置不同的参数。②超净工作台：常用于为微生物学实验提供无菌操作环境。注意操作时关掉紫外灯，避免给人类带来伤害。③低温台式高速离心机：常用于分离纯化蛋白、病毒、细胞等。使用时不能随便移动离心机或打开盖子；离心机运行时要处于锁定状态；离心管的放置要处于平衡状态。④微量移液管：用于计量和转移微量液体的专用仪器。操作时注意避免枪头的污染；调节刻度时不宜超过最大量程；使用完后将刻度调到最大收藏。⑤电泳仪：可对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组分分析或单个组分的提取制备。操作时不可把导线极性接反；当电泳仪进入工作状态后，避免人体与其各部分的接触，不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行；若使用时出现异常，要立刻切断电源。⑥PCR仪：用于扩增DNA片断。操作时应注意盖子要盖紧，按正确步骤进行。⑦高压高温灭菌锅：用于杀菌消毒。使用时应严格按照规程操作，避免发生安全事故。

实验二 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测

一.实验目的

1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;

2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。二.实验原理

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）未扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。

三、仪器和试剂

仪器： 微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉

试剂： 琼脂糖：1.0%；电泳缓冲液（50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA(pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml）EB：5 µl / 100 ml TBE 电泳材料：标准分子量核酸（DL2000）四.操作步骤

（1）制胶（以20 mL为例）

a.称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的1XTAE缓冲液（pH 8.0），摇匀； b.微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；

c.将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；

d.小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。（2）点样

用微量移液器将5 µl含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。（3）电泳

打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。（4）观察

将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

五、实验结果

点样时效果较好的照片点出的白色荧光线比较亮，条带粗细均匀；条带没有出现两端粗中间细的情况

六、思考题

1、做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题。

医学分子生物学与实验 第6篇

答：共同的第一步都是取动物组织进行清洗剪碎，然后用高速组织捣碎机破碎。

DNA的提取：

通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。

RNA的提取:

取组织，剪成小块，在乳钵种研碎，加20mLSDS-缓冲盐溶液（见试剂1.）使成均浆，倒入磨口具塞锥形瓶内，再加同样体积的含水酚液，室温下剧烈振荡10分钟。置冰浴中分层，在0-4℃下，以4000rpmn离心15分钟。吸出上清液，加等体积氯仿－异戊醇，室温下剧烈振荡10分钟，以4000rpm离心5分钟，或在室温下放置10分钟使分层。吸出上清液（若有必要，该操作可反复多次），加2倍体积2%乙酸钾的乙醇溶液，在冰浴中放置1小时使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱内较长期存放。若要得到干燥制品，可将沉淀液以4000rpm离心10分钟，倾去上清液。沉淀用少许75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各洗1次，同上法离心，倾去乙醇后，空气干燥。

蛋白质的提取:

1.组织称重，切小块放入管中。

2.配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。

3.加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。

4.用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。

5.裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。

原理：在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，因此在提取和制备DNA或RNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl 浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5 mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0 mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14 mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14 mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7 mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP。

提取出DNA或RNA-蛋白质复合体（DNP）后，在将其中的蛋白质除去

2.简述基因工程的原理及过程。

答：基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

所谓基因工程（genetic engineering）是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。一般步骤：1克隆重组：提取供体生物目的基因，酶解，连接到另一个DNA分子（克隆载体）上形成重组DNA；2转化：将重组子转入受体细胞，并在其中复制保存；3筛选鉴定：已吸收重组子的细胞；4大量培养监测外源性基因是否表达。

3.比较原核生物与真核生物的基因表达调控机制。

答：

原核生物基因表达调控 真核生物基因表达调控

启动因子：σ因子决定RNA聚合酶识别的特异性TF2D决定RNA聚合酶识别的特异性

转录激活：操纵子 调节蛋白顺式作用元件转录因子

主要机制：操纵子模型具有普遍性顺式作用元件具有普遍性

主要为负性调节（阻遏调节）主要为正性调节

特有机制：转录衰减染色体结构变化

共同点： 1.基因表达都有时间特异性和空间特异性2.基因调控的多层次性和复杂性3转录起始部分是基因表达的基本调控点

4.简述 PCR的原理及其应用，引物设计的原则。

答：PCR的原理：以扩增的DNA分子为模板，以1对与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，依半保留机制沿模板链延伸直至完成2条新链合成。通过变性，退火和延伸重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。反应体系基本成分有模板DNA，特异引物，耐热性DNA聚合酶，dNTP和含有 Mg²+的缓冲液。

PCR的主要用途：1目的基因的克隆；2.基因的体外突变3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列测定5.基因突变分析

PCRD的衍生技术：1锚定PCR(anchored PCR)2..不对称PCR(asymmetric PCR)3.反向PCR(inverse PCR)4.多重PCR(multiplex PCR)5.逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

引物设计的基本原则

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。③引物内部不应出现互补序列。④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。⑥引物3„端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

5.简southern blot的原理及其应用。

答：原理： 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。可用于检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。