病毒抑制范文

病毒抑制范文（精选9篇）

病毒抑制 第1篇

HRV在人体内具有自限性, 通常在一周左右可以自愈, 感染后可以人体内可以形成免疫球蛋白, 但是只对同类型病毒有效, 而且持续时间短。另一方面HRV病毒众多的血清型使得接种疫苗的治疗方法可行性很小。目前研究方向转为研发特定的小分子化合物, 这些小分子化合物可以以HRV复制过程中需要的蛋白质和酶为标靶, 选择性的抑制酶的活性, 从而起到抗HRV感染的作用。目前, 按照标靶区分, 主要有三类抗HRV活性药物: (1) 作用于HRV衣壳蛋白的抗病毒药物; (2) 作用于3C蛋白酶的抗病毒药物; (3) 作用于RNA合成酶的抗病毒药物[3]。本文就这三类抗HRV药物的研究进展进行综述。

1 HRV衣壳蛋白类抗病毒药物

1.1 HRV衣壳蛋白抑制剂的作用机理

鼻病毒由核酸和衣壳组成, 其外层衣壳在病毒吸附宿主细胞和病毒脱壳过程中起到不可或缺的作用。目前, 普遍认为的药物作用机理是:在抑制病毒吸附宿主细胞方面, 药物分子可以和鼻病毒外层衣壳结合, 诱导鼻病毒的外层结构发生变化, 使病毒无法识别细胞表面的结合位点, 从而阻止病毒吸附宿主细胞;在抑制病毒脱壳方面, 与小分子结合后, 衣壳蛋白变得更加稳定, 结构更加致密, 从而使病毒无法完成脱壳。

1.2 作用于HRV衣壳蛋白的抗病毒药物

1.2.1 吡罗达韦 (Pirodavir)

杨森 (Janssen) 研究基金会报道了吡罗达韦化合物 (图1) 。这种化合物在体外实验中, 表现出了非常高的抗鼻病毒活性, 浓度为0.064μM/m L时, 可以有效抑制80%的鼻病毒。然而临床实验却显示, 这种药物基本对患者没有益处, 并没有显示出临床效果。原因可能是:一方面由于吡罗达韦化合物在水溶液中溶解度很低, 因此使它难于以与呼吸分泌物一致的水溶液形式给药, 导致药物不易被吸收。另一方面, 吡罗达韦化合物分子结构不稳定, 在体内会发生水解, 生成相应的无活性的酸, 从而导致药物在体内没有抗病毒活性[4]。

1.2.2 普来那利 (Pleconaril)

一系列的实验表明, 普来那利 (如图2所示) 具有较高的抗病毒活性, 在0.18μM浓度下可以抑制90%HRV病毒。Ⅲ期的临床实验结果显示, 普来那利可以明显的减轻患者的症状并能减短疾病的持续时间[5]。普来那利是目前唯一一个向美国食品和药物部门 (the U.S.Food and Drug Administration, AFD) 申请过上市的抗HRV药物。但临床实验表明Pleconaril对EV71无明显的抑制作用, 且安全性有待探讨, 该药未通过FDA批准。Viro Pharma[6]探讨了Pleconaril鼻腔喷雾剂在鼻病毒感染引起的感冒及哮喘中的治疗效果, 相关Ⅱ临床研究已经完成, 相关研究成果并没有进一步报道。

1.2.3 Biota系列化合物

Biota系列化合物的分子结构式如图3所示, 该类化合物是目前作用于HRV衣壳蛋白的抗病毒药物中活性最高的一种。BTA-188 (图4) 是该类化合物中的典型代表, 显示出了广谱的抗鼻病毒活性, BTA-188可以抑制87%的HRV血清型。BTA-188的抗病毒能力 (EC50=1.03μg/L) 高于普来那利 (EC50=30μg/L) 和吡罗达韦 (EC50=3.2μg/L) 。药物毒理学研究显示, 该药物在50μg/L时, 才显示出较低的毒性。同时, 研究显示, 该药物具有很高的口服生物利用度, 可以通过口服入药[7]。用双杂环取代BTA-188 (图5) 分子中的右侧苯环基团, 可以产生一系列的衍生药物。Susanne C.Feil等[8]曾报道了一种新的衍生药物:BTA-798, 第一阶段的研究发现, 该药物具有很好的药物动力学性能和低毒性, 目前该药物已进入Ⅱ期临床试验, 具有很大的研究开发价值。

1.2.4 衍生药物

上述两种药物是目前开发的主要的HRV衣壳蛋白类抗病毒药物, 这两种药物衍生出了一系列的抗病毒药物。Nancy和Makarov[9]用取代的苯环替代普来那利噁唑中的噁二唑环, 合成了双酚氧基丙基异噁唑衍生物 (图6) , 体外培养显示, 该药对HRV-2有着比两者更好的抗病毒活性 (EC50=9 ng/μL) , 但对HRV-14却没有表现出病毒活性。Walter和Eliza Hall研究所合成了一系列普来那利和吡罗达韦的拼接化合物[10] (图7) , 该化合物的抗病毒活性远高于普来那利且具有较好的口服生物利用度和水解性[11]。目前, 这些化合物都处在药物评价阶段。

2 HRV 3C蛋白酶类抗病毒药物

2.1 鼻病毒3C蛋白酶抑制剂的作用机理

小RNA病毒3C蛋白酶是病毒复制所必须的酶, 它在病毒的复制和生命循环中起着关键性作用。在病毒的复制过程中, 首先表达出多聚前体蛋白, 大多数被3C蛋白酶水解, 断裂位点均发生在谷氨酰胺和甘氨酸之间, 最终产生病毒繁殖所需的各种蛋白质。利用半胱氨酸抑制剂进行的位点实验表明:当加入抑制剂时, 前体蛋白的数量与病毒产量呈负相关, 与加入蛋白抑制剂的量也成负直线相关[12], 因此把3C蛋白酶作为药物作用靶点成为当今的研究热点。

2.2 作用于HRV 3C蛋白酶的抗病毒药物

目前对3C蛋白酶抑制剂的设计主要是基于该酶的已知序列Leu-Phe-Gln, 为了提高抑制的亲和力, 人们将小分子非共价物质发展成与亲核体的结合体[13], 利用亲核体与抑制剂作用活性位点亲核体的共价结合来保证抑制剂与作用位点的特异性结合, 于是3C蛋白酶抑制剂的研究重点转到亲电基团随作用位点结构进行有效调整的共价物质上来。

2.2.1 AG7088 (Rupintrivir)

AG7088 (图8) 为Pfizer公司开发的抗人鼻病毒 (HRV) 产品, 是一种鼻内喷雾用强效而不可逆的HRV 3C蛋白酶抑制剂[14], AG7088具有很高的抗病毒活性和低毒性 (EC50=0.023μmol/L, EC90=0.082μmol/L) ;IC50 (致50%细胞毒性浓度) 大于100μmol/L[15]。体外研究显示, AG7088可抑制所有受试的48种HRV血清型的复制, 对柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒B3、EV70等肠道病毒都具有非常好的抗病毒活性[16], 但AG7088不能降低病毒滴度, 目前相关临床实验已经终止。

3 HRV RNA类抗病毒药物

3.1 RNA病毒复制抑制剂

小RNA病毒复制过程涉及很多病毒蛋白, 包括2B、2C、3A、3D等。3A蛋白构成了病毒RNA复制的骨架结构, 在病毒感染过程中调节膜蛋白递呈和抑制细胞蛋白分泌发挥着重要作用。实验证明, RNA病毒复制复合物与病毒诱导的膜泡紧密相关[15], RNA的感染可诱导细胞膜结构成分的改变和宿主细胞膜的渗透性。

3.2 作用于HRV病毒复制抑制剂的抗病毒药物

3.2.1 恩韦肟及其衍生物

恩韦肟是一类苯并咪唑类衍生物, 结构式见图9。体外实验研究表明可有效抑制11种EV70及15种Cox A24, 具有良好的抗HRV活性 (IC50=0.01~0.65 mg/L) , 但该药的口服会引发腹痛和呕吐等胃肠道副作用, 鼻腔给药又限制了它的药性[17]。目前正对恩韦肟进一步的乙烯乙炔化和C2化, 期望产生具有更好药物活性和生物利用度的衍生物。研究显示, 乙烯乙炔化的恩韦肟衍生物经口服给药, 对Cox A21感染的小鼠具有非常好的治疗效果[18]。

3.2.2 黄酮类

黄酮类化合物抗病毒作用已经得到医药界的肯定。通过体外培养发现, Ro09-0179 (4', 5-二羟基-3, 3', 7-三甲氧基黄酮) 能够表现出广谱的抗病毒活性, 研究证实Ro09-0179能够在RNA合成及病毒的脱壳过程中起干扰作用[19]。

4 结语

在过去20多年中, 对作用于病毒复制循环过程的抗病毒药物分子的研究取得了巨大的进步和成功, 许多种药物分子都体现了抗鼻病毒活性, 但是由于这些药物存在着副作用和安全性问题, 目前还没有有效地抗鼻病毒的药物上市。虽然抗鼻病毒药物的研发还未取得成功, 但是通过小分子抑制鼻病毒复制循环过程的可行性得到了认证, 目前存在的问题主要是药物分子自身的问题, 未来, 随着药物分子的作用机理被不断完善, 越来越多的抗药物分子被研发出来, 抗鼻病毒药物的研发终会取得成功。

摘要：人鼻病毒 (human rhinovirus, HRV) 是一种感染性很强的病毒, 是致呼吸道感染的重要致病因子。到目前为止, 还没有有效地抗鼻病毒的药物上市, 尽管如此, 在过去的几十年里, 随着对鼻病毒病理学的深入研究, 鼻病毒感染过程被确定, 并由此产生了许多作用于病毒复制循环过程的抗病毒药物分子, 这些分子有望在未来作为治疗鼻病毒的药物。

病毒抑制 第2篇

目的 探讨重组腺病毒Ad-Rb94基因联合放射治疗对人肝癌细胞的联合抑瘤作用.方法 将重组腺病毒Ad-Rb94基因导入人肝癌细胞株HepG2,观察联合放射治疗对细胞生长、细胞周期及凋亡的`影响.结果 Ad-Rb94基因组、放疗组和Ad-Rb94基因联合放疗组HepG2细胞的生长均受到抑制,尤其在转染后96h细胞存活数量最低,与Ad-lacZ组和空白对照组比较差异均有显著性(P<0.05).联合治疗组HepG2细胞生长最为缓慢, Rb94基因转染后96h Ad-Rb94联合放疗组的抑制作用均明显高于Ad-Rb94组和放疗组(P0.05).Ad-Rb94组、放疗组及Ad-Rb94联合放疗组HepG2停留在G2/M期的细胞增加,G0/G1期和S期细胞数量减少,凋亡细胞数量增加,其中以联合治疗组G2/M期细胞和凋亡细胞所占比例最高.结论 Ad-Rb94基因联合放疗具有协同作用,有效地抑制肝癌细胞的生长.

作 者：张耀文 王芹 李进 穆传杰 曹永珍 荣庆林 作者单位：张耀文,曹永珍,荣庆林(天津医科大学总医院放疗科,天津,300052)

王芹,李进,穆传杰(中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所分子核医学重点实验室,天津,300192)

板蓝根抑制病毒的神药？ 第3篇

南北板蓝根

在很长一段时间里，我并没有找到“板蓝根”这种植物，原因也好笑，因为这个名字根本就不是一种植物的名字。准确地讲，它应该是个短语——“板蓝的根”，也就是说，我们要找的植物是“板蓝”。

板蓝（Strobilanthes cusia）是爵床科馬蓝属植物，且该属植物仅此一种。小名“马蓝”其实更为常用。板蓝曾经在中国南方地区以及缅甸、泰国、印度等地广泛种植。不过现如今，国内的种植区域已经退缩到西南的零星地域了。

板蓝需要比较温暖湿润的环境，所以只能生活在我国南方，因而有了“南板蓝根”的称号。但与此同时，在我国广大地区生活着一种强势替代品——菘蓝（Isatis tinctoria）。

实际上，最早出现于医药典籍中的只有“蓝”这一个字而已，而这个“蓝”指的就是菘蓝。《说文解字》中的描述是：“蓝，染青草也。”当时的菘蓝，主要是衣服的染料。至于名字逐渐演变成“菘蓝”，则很可能是为了区别其他的蓝色染料植物，例如上面提到的板蓝。而加的这个“菘”字，则是为了描述它的特征。

菘是古语中对白菜类蔬菜的统称，油白菜、大白菜都在“菘”的范围之内。菘蓝与油白菜极其相似——从叶片到花朵的细节。不过，菘蓝与油白菜还是有明显的区别——油白菜结出的是长角果，种子可以多达数十粒，而菘蓝结出的则是短角果，种子只有寥寥数枚。因为菘蓝比较适合在北方种植，所以也被称为“北板蓝根”。

除了上面说的南北双雄，蓼蓝（Polygonum tinctorium）也是一种提供板蓝根的植物，只不过蓼蓝的栽培数量远低于板蓝和菘蓝，所以出场的机会并不多。在这三种“蓝”中，目前产量和用量最大的植物是菘蓝。也就是说，我们吃到的“板蓝根”很有可能不是板蓝的根，而是菘蓝的。而且，最早入药的并不是“板蓝的根”，而是菘蓝的果实和种子，然后是这三种植物的茎叶，最终是因为染料的不足，才用根作为替代。逐渐的，这三种植物的茎叶和根有了不同的名字：前者叫做大青叶，后者便是板蓝根。大青叶通常会被磨碎成粉末状或者制成团块以便使用——“青黛”就是这类制品在中药房中的名字。

抑制病毒的“神药”？

对于板蓝根的药用价值一直存在两派截然不同的声音，支持者认为板蓝根中的化学物质能够杀灭病毒，特别是对于预防各种传染性疾病效果显著；而反对者则认为那不过是些安慰剂效应罢了。

实际情况是，到目前为止我们并不清楚板蓝根中的化学物质究竟是如何发挥作用。一些体外试验表明，板蓝根中所含的靛苷可以抑制病毒与细胞结合——这在一定程度可以缓解病情，不过，要注意的是，靛苷并不能像金刚烷胺或者达菲那样杀死病毒。

另外，靛苷还可以抑制体内毒素的活性，从而在一定程度上缓解人体感染后的炎症反应，对于发热等症状可能有一定的缓解作用。只不过，同上述作用一样，这项功能还在实验室研究阶段。

不得不看到，很多人是本着喝喝没坏处的想法来使用板蓝根的。真的没坏处吗？板蓝根同其他植物一样，有着复杂的化学成分，很容易引发各种过敏反应，在实际用药过程中，发生皮疹等症状的情况并不罕见。所以，把板蓝根当茶泡着喝，这并不是什么好习惯。

病毒抑制 第4篇

经过3年的科技攻关, 东北农业大学生命科学学院在利用“鸡瘟病毒”抑制肿瘤方面, 取得突破性进展, 目前已在动物实验阶段取得了成功。

据东北农业大学生物制药研究室李德山主任介绍, 新城疫病毒即俗话说的亚洲鸡瘟病毒, 它是一种禽类感染的病毒, 对人类没有致病性, 但是可以特异地杀伤人体的肿瘤细胞, 该病毒在肿瘤细胞中的复制能力是正常细胞的1万倍。新城疫病毒已经被证明对多种癌细胞具有明显的杀伤作用, 其中包括乳腺癌、结肠腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、鼻咽癌等。

(新闻来源:东北畜牧业信息网)

病毒抑制 第5篇

利巴韦林( ribavirin) 又名病毒唑,是一种广谱、强效的抗病毒药物,对多种RNA病毒和DNA病毒均有抑制作用[5],如艾滋病病毒、疱疹病毒、Lassa热病毒、 流感病毒、呼吸道合胞体病毒、肝炎病毒、肠病毒等, 价格低廉,毒副作用较小,临床使用广泛,但评价不一[6,7,8,9]。

目前,一般采取对症疗法治疗猫细小病毒病,总体原则为解热止吐、抗毒消炎、制酸补液[10]。对于抗病毒治疗,临床上多使用猫瘟单克隆抗体或免疫血清,但价格较贵。本试验通过观察利巴韦林对FPV的体外抑制作用,了解利巴韦林抗FPV的效果和强度,为临床利巴韦林治疗FPV的提供试验依据。

1材料与方法

1.1细胞与病毒

猫肾( F81) 细胞,由肇庆大华农生物药品有限公司重点实验室保存,用含10% 胎牛血清( GIBCO) 的RPMI 1640培养液培养细胞; FPV,由肇庆大华农生物药品有限公司重点实验室分离培养,用F81细胞扩增繁毒。维持液为含2% 胎牛血清的RPMI 1640培养液。

1.2药物和主要试剂

利巴韦林注射液,规格为1 m L∶100 mg,批号为1208286412,由辰欣药业有限公司提供。用维持液将药物稀释至100 μg /m L,作为药物毒性试验的起始浓度; 四唑盐( MTT) 、二甲基亚砜( DMSO) ,Sigma公司产品。

1.3病毒毒力的测定

将生长良好的细胞稀释成适当浓度的细胞悬液, 以每孔100 μL接种至96孔细胞培养板,再每孔加入用RPMI 1640培养液10倍系列稀释的病毒100 μL, 共6个浓度梯度,每个浓度设8个重复孔,同时设正常细胞对照; 于37 ℃、5% CO2培养箱内培养,逐日观察细胞病变( CPE) 情况; 5 d后记录CPE孔数,并采用Reed - Muench法计算半数细胞培养物感染量 ( TCID50) 。

1.4利巴韦林对F81细胞毒性的测定

药物毒性试验的起始浓度为100 μg /m L,用细胞维持液2倍系列稀释药物,加到单层F81细胞96孔细胞培养板内,100 μL/孔,每个剂量设4个重复孔, 同时设正常细胞对照; 于37 ℃、5% CO2培养箱内培养,逐日观察细胞形态; 5 d后记录CPE程度,然后每孔加入5 mg /m L MTT溶液10 μL,置培养箱内继续培养4 h后终止培养; 弃上清液,每孔加入100 μL DMSO,低速振荡10 min后用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度值( OD) ,试验重复3次。计算药物对细胞的半数中毒浓度( TC50) 及细胞存活率: 采用Reed -Muench法计算TC50; 细胞存活率 = 试验组OD值/对照组OD值 × 100% 。

1.5利巴韦林对FPV的抑制作用

将F81细胞接种于96孔细胞培养板中,同时接种100TCID50病毒液,100 μL/孔,过夜培养至单层后, 弃上清液。用细胞维持液稀释利巴韦林,从最大安全浓度起始进行2倍系列稀释,连续稀释8个梯度,每孔加入100 μL药液。同时设病毒对照组和正常细胞对照组。每个梯度设4个重复孔。逐日观察各孔CPE,当病毒对照CPE达到75% ~ 100% 时终止试验,采用MTT法测定细胞存活率,试验重复3次。计算药物抑制病毒半数有效浓度 ( EC50) 、治疗指数 ( TI) 和利巴韦 林对病毒 的抑制率: 采用Reed- Muench法计算EC50; TI = TC50/ EC50; 病毒抑制率 = ( 试验组平均OD值 - 病毒对照组平均OD值) /( 正常细胞对照组平均OD值 - 病毒对照组平均OD值) × 100% 。

1.6统计学分析

应用SPSS 18. 0软件进行统计学分析,试验数据用± s表示; 对药物剂量对数和病毒抑制率进行相关回归分析,判定是否存在量效关系。

2结果与分析

2.1病毒毒力的测定结果

经计算FPV在F81细胞中的TCID50为1 × 10- 3. 58/100 μL,试验中病 毒攻击量 为100 TCID50。

2.2利巴韦林对F81细胞毒性的检测结果

利巴韦林对F81细胞的TC50为179. 60 μg /m L。 浓度为12. 5 μg /m L的利巴韦林处理F81细胞时,细胞存活率为73. 74% ; 浓度为6. 25 μg /m L的利巴韦林处理F81细胞时,无细胞病 变,细胞存活 率为80. 48% 。因此,以10 μg / m L作为利巴韦林抗病毒试验的起始浓度。

2.3利巴韦林对FPV的抑制作用(结果见表1和图1)

注: 25% ~ 50% 细胞病变用 + + 表示; 50% ~ 75% 细胞病变用 + + + 表示; 75% ~ 100% 细胞病变用 + + + + 表示。

由表1和图1可知,不同浓度利巴韦林对FPV的抑制作用不同。在0. 078 ~ 10 μg /m L浓度范围内,利巴韦林对FPV的抑制作用从54. 35% 逐渐递减,EC50为15. 38 μg /m L,TI为11. 68。

2.4利巴韦林对FPV抑制作用的剂量与效应关系(结果见图2)

由图2可知,利巴韦林抑制FPV致细胞病变的作用随着药物剂量的增加而增强,其抗FPV的作用与剂量对数呈正相关关系,经回归分析得方程: y = 15. 006x + 32. 338,R2= 0. 897 8。

3讨论

FPV是单股无囊膜的DNA病毒,主要感染猫科、 犬科等多种动物,致病性强,死亡率高。目前,还没有应对FPV的特效治疗药物,疫苗是预防该病的最佳选择[1]。

注: 字母相同表示差异不显著( P > 0. 05) ,字母不同表示差异显著( P < 0. 05) 。

利巴韦林是一种抗病毒药物,可以通过抑制单磷酸次黄嘌呤核苷( IMP) 而阻碍病毒核酸合成[11]。相关研究表明,利巴韦林可以抑制16种以上病毒[12]。 临床应用表明,利巴韦林对犬细小病毒病具有一定诊疗作用[13],但对猫细小病毒病应用结果的报道较少, 体外作用试 验结果也 少见。本研究结 果显示, 10 μg / m L利巴韦林对FPV的抑制率为54. 35% ,治疗指数为11. 68,且抑制作用的大小随着药物浓度的降低而减弱,说明利巴韦林具有体外抗FPV的作用, 并与药物浓度有关。利巴韦林可抑制感染细胞的CPE程度,并提高细胞的存活率,这可能与利巴韦林抑制了FPV基因合成、减少病毒复制有关[11]。

病毒抑制 第6篇

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

Raji细胞(ATCC CCL86)购自中南大学分析测试中心细胞生物研究室。Raji细胞是携带和自主复制EBV基因的人Burkitt's淋巴瘤细胞,悬浮生长,聚集成团,体积较大,折光性较强。

1.1.2 主要仪器和试剂

Mx3000p型荧光定量PCR仪购自美国Stratagene公司。盐酸小檗碱(Berberine Chloride),C20H18ClNO4购自Sigma公司(633-65-8),MTT试剂购自Sigma公司(57360-69-7)。Hyclone改良型RPMI1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。病毒DNA小剂量抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司。Taq DNA聚合酶、d NTPs购自广州达安基因股份有限公司。其它仪器试剂均由中南大学现代分析测试中心细胞生物研究室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

Raji细胞株接种到含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 mg/m L链霉素的RPMI1640培养基,37℃,5%二氧化碳条件下培养,2～3 d传代一次,待细胞处于对数生长期进行实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制试验

取对数生长期Raji细胞,用含药培养基调整细胞浓度为104个/m L,接种于96孔板中,每孔100μL,同时设置调零孔(培养基),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液),每组设置4个平行孔,于37℃,5%二氧化碳条件下培养48 h后,每孔加入20μL MTT溶液,轻轻摇匀,在37℃,5%二氧化碳培养箱中培养4 h。1 000 r/min离心10 min,弃去上清,每孔加入150μL二甲基亚砜,振荡10 min,使结晶物充分溶解。用酶标仪在490 nm波长下测量各孔的吸光度值。

1.2.3 巢式荧光定量PCR检测EBV-DNA

(1)标准品的制备:取Raji细胞冻存液进行细胞计数,根据文献[4]报道的每个Raji细胞约含有50个拷贝的EBV-DNA进行计算,得到Raji细胞冻存液中E BV-DNA的浓度为2.9105拷贝/μL。(2)巢式荧光定量PCR检测EBV-DNA:使用病毒DNA小量抽提试剂盒从培养的Raji细胞中抽提病毒DNA,操作步骤按试剂盒说明书(稍加改进)进行。选择EB病毒DNA全序列20 206～20 426位为外扩增区,20 279～20 343位为内扩增区,荧光探针在内扩增区内20 299～20 318位。外扩增引物:上游引物为5'-TC AAAACTTTAGAGGCGAATGG-3',下游引物为5'-CTGAGAAGGTGGCCTAGCAAC-3',扩增片段长度为221 bp。内扩增引物:上游引物为5'-CCA GGAAGCGGGTCTATGG-3',下游引物序列为5'-GGCTTATTCCTCTTTTCCCCT CTA-3',扩增片段长度为65 bp。荧光探针:Taqman探针序列5'-FAM-TGGCTGCGCTGCTGCTATC-TAMRA-3'。扩增引物、探针由广州达安基因股份有限公司设计合成。标准品的外扩增反应体系及反应条件:将Raji细胞抽提的EBV-DNA稀释成一定浓度梯度(1106、1105、1104、1103、1102拷贝/50μL反应体系)。50μl反应体系:5定性缓冲液10μL,Taq DNA聚合酶1μL,dNTPs 1μL,上游外引物1μL,下游外引物1μL,标准品nμL(n为根据浓度计算的体积0.40),加水补至50μL。反应条件:95℃5min;95℃45 s,55℃45 s,72℃45 s,30个循环;72℃7 min。样品的外扩增反应体系及反应条件:50μL反应体系:5定性缓冲液10μL,Taq DNA聚合酶1μL,dNTPs 1μL,上游外引物1μL,下游外引物1μL,模板10μL,加水补至50μL。反应条件:95℃5 min;95℃45 s,55℃45 s,72℃45 s,30个循环;72℃7 min。内扩增反应体系及反应条件:标准品与样品相同。50μl反应体系:5定量缓冲液10μL,Taq DNA聚合酶1μL,dNTPs 1μL,上游内引物1μL,下游内引物1μL,Taqman探针1μL,外扩增产物5μL,加水补至50μL。反应条件:95℃5 min;95℃45s,55℃45 s,40个循环。

1.3 统计学处理

运用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计分析,数值用均数±标准差表示,两个均数比较采用t检验以及独立样本T检验。

2 结果

2.1 MTT法检测BBR对Raji细胞的细胞无毒性浓度

为观察BBR对鼻咽癌细胞生长的影响,采用MTT法分析不同浓度(100、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0μmol/L)BBR处理Raji细胞后细胞增殖情况。结果显示,在BBR浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078μmol/L时,细胞数与空白组比较无明显差异(P>0.05),而BBR浓度为100、80、40、20μmol/L时,细胞数明显少于对照组(P<0.05),且细胞数随BBR浓度的增高而减少(图2),表明高浓度(10μmol/L以上)BBR对Raji细胞增殖生长有明显的抑制作用。鉴于在10μmol/L以下浓度的BBR对Raji细胞生长增殖没有明显影响,因而BBR对Raji细胞的细胞无毒性浓度为0～10μmol/L。

2.2 不同浓度BBR对Raji细胞形态的影响

为进一步确证细胞无毒性浓度的BBR对Raji细胞生长的影响,用倒置显微镜观察不同浓度(40、10、1.25μmol/L)BBR处理的Raji细胞形态。结果表明,用细胞无毒性浓度的BBR(10、1.25μmol/L)处理的Raji细胞,与对照组细胞一样呈悬浮生长,生长良好,细胞呈圆形、体积较大、折光性强。当BBR浓度为40μmol/L时,细胞数明显少于对照组,细胞散在生长且未聚集成团,体积略小,折光性较低(图3)。

2.3 巢式荧光定量PCR检测EBV-DNA表达

2.3.1 建立标准曲线

用稀释成不同浓度的Raji细胞进行扩增反应,反应结束时得出扩增的动力学曲线(图4)及荧光定量标准曲线(图5)。

2.3.2 不同浓度BBR

处理的R aji细胞中E-BV-DNA表达运用巢式荧光定量PCR方法分别检测不同浓度BBR(40、10、1.25和0μmol/L)处理的Raji细胞中EBV-DNA表达,根据已建立的标准曲线计算不同药物浓度处理的Raji细胞中E-BV-DNA的拷贝数。结果显示,细胞无毒性浓度的BBR(10、1.25μmol/L)处理Raji细胞后,EBV-DNA的拷贝数明显低于未经药物处理组(P<0.05),见图6。

3 讨论

鼻咽癌是我国南方一种常见的头颈部恶性肿瘤,鼻咽癌确切发病机制尚不十分明确,目前无法进行鼻咽癌的一级预防。研究表明,EBV的感染与鼻咽癌的发生、发展密切相关[5,6],EB病毒不仅参与了鼻咽癌各阶段,而且EB病毒潜伏感染的程度,如EB病毒相关抗体滴度和DNA拷贝数,间接提示鼻咽癌疾病状态,尤其是鼻咽癌高危人群的预防方面,已经将降低和清楚EB病毒潜伏感染作为鼻咽癌高危人群预防一项重要指标[7,8]。

BBR是一种异喹啉生物碱,为白毛茛、黄柏、黄连等植物药的主要成分,具有抗菌、抗感染、解热镇痛等作用[9]。近年来,BBR又被证实具有抗肿瘤作用[10,11]。BBR抗肿瘤机制研究表明,BBR通过抑制COX-2[12]、DNA拓扑异构酶[13]以及与DNA形成复合物[14,15]等方式,抑制肿瘤细胞的DNA、RNA和蛋白质合成;通过抑制激活蛋白-1(AP-1)的活性,阻断肿瘤转移相关的信号通路等,最终抑制肿瘤转移[16]。在我们的前期研究工作中,用BBR或含BBR的中药复方进行鼻咽癌高危人群预防[1],发现其能降低鼻咽癌高危人群EBV相关抗体滴度或使其转为阴性[2],进而抑制EBV潜伏感染,降低鼻咽癌的发病率[3]。在增强鼻咽癌患者放射治疗的敏感方面,BBR的中药复方降低鼻咽癌患者EBV相关抗体,增强鼻咽癌放疗的敏感性[17]。由此,我们推测在BBR可能干预EBV病毒复制,进而降低鼻咽癌组织或者血浆中EBV-DNA的含量。

本文采用巢式-荧光定量PCR方法检测BBR处理Raji细胞后EBV-DNA拷贝数,结果发现,BBR能够明显抑制Raji细胞中EBV-DNA复制,且呈药物浓度依赖性。此结果提示,BBR也可能通过抑制鼻咽癌细胞EBV-DNA的复制降低鼻咽癌的发生。在本项目研究中,为排除因药物毒性作用而对细胞生长产生影响,我们采用MTT法筛选BBR的无细胞毒性浓度,该浓度对细胞生长增殖没有明显毒性,因而我们认为BBR对Raji细胞EBV-DNA复制抑制作用不是因为其本身毒性作用影响细胞生长,而是小檗碱的药理学作用,其具体作用分子机制有待进一步研究。

BBR抑制EBV-DNA的复制,因而可以阻断E-BV致癌作用,降低鼻咽癌的发生率。另外,BBR在治疗过程中毒性较小以及价格低廉,因而,在鼻咽癌的一级预防应用中有潜在临床应用前景。

摘要：目的通过分析小檗碱处理后的Raji细胞中EB病毒DNA的变化,探讨小檗碱对EB病毒DNA复制的抑制作用。方法运用四甲基偶氮唑蓝法确定小檗碱对Raji细胞生长的细胞无毒性浓度,然后采用巢式荧光定量PCR方法检测该浓度处理后的Raji细胞EB病毒DNA含量,分析小檗碱对EB病毒DNA复制的影响。结果小檗碱对Raji细胞的细胞无毒性浓度(NCC)为0～10μmol/L.不同浓度(1.25、10和40μmol/L)的小檗碱处理后的Raji细胞EB病毒DNA拷贝数与未加药组相比显著降低(P<0.05),呈药物浓度依赖性。结论小檗碱在细胞无毒性浓度下,可抑制Raji细胞中EB病毒DNA的复制,为使用小檗碱或含小檗碱的中药复方防治EB病毒相关肿瘤提供了新的实验依据。

病毒抑制 第7篇

香港大学近日公布，该校医学院与加拿大的研究人员合作研发出新的禽流感病毒抑制剂。

香港大学医学院与加拿大卑诗省基因科学中心合作，利用计算分子对接技术程式，筛选23万个化合物，并从中找到20个有可能抑制流感病毒的化合物。研究人员在这20个化合物中发现“化合物-1”具有对抗H5N1禽流感病毒和H1N1流感病毒的功效。

“化合物-1”能吸附在流感病毒的氨酸酶上，有效抑制病毒复制，因而推论能抑制已出现抗药性的病毒。研究人员还将改良“化合物-1”的分子结构，以降低其产生抗药性的机会。预计5～8年后能研制出新药。

病毒抑制 第8篇

关键词：平菇蛋白,TMV,抑制活性

植物病毒对全球农作物生产造成了巨大的影响[1]。据报道,在美国、英国、肯尼亚、澳大利亚、德国、比利时等6国,仅作物中18种主要病毒造成的危害就使作物减产3%~92%[2]。在我国,植物病毒病的发生在各省区也都较为普遍,给农业生产造成了极大损失。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是植物病毒中较重要的病毒之一,也是烟草花叶病毒属(Tobamovirus Group)的模式种。烟草花叶病自苗床至大田皆可发生,田间发病率一般在5%~20%,幼苗期或大田期感染损失可达30%~50%,严重者绝收。

实际生产中,已有多种化学源抗植物病毒农药在应用,但几乎没有一种化学药剂能有效治愈感染植株,且随着植物抗药性的增加和人们对生态环境的重视,化学源农药的发展受到限制[3,4]。近几年,抗植物病毒的研究重点是寻找对环境损害小且抗病毒活性高的生物农药。与传统的化学农药相比,生物农药具有对人畜和非靶标生物安全、环境兼容性好、不易产生抗性、易于保护生物多样性、来源广等优点,故生物源农药为较理想的方案[5]。目前,已有人报道某些微生物中存在抑制植物病毒的活性物质,但是这些微生物一般较为昂贵,大规模生产存在困难,且获得其活性物质的操作步骤较为繁琐,不利于实际生产的应用。平菇(Pleurotus ostreatus)属担子菌亚门(Basidiomycotina)侧耳属(Pleurotus),该菌分布广泛,易于大规模培养,且生长迅速、产量高。黑平菇是平菇的一个菌株,其子实体颜色为深黑色,色泽的深浅随温度的变化而变化,栽培简易,品质好。到目前为止,国内外尚未有关于平菇提取物抗植物病毒的报道。

1 材料与方法

1.1 材料

平菇菌株[Pleurotus ostreatus(Jacq.ex Fr.)Kummer]菌种保存于-80℃,由宜昌森源食用菌有限责任公司提供。

烟草花叶病毒普通株系(Tobacco mosaic virus-ordinary strain)活体寄生于普通烟(Nicotiana tobacum),品种为哈瓦那38号,温室培养。

供试寄主为枯斑三生烟(Nicotiana tobacum cv.Samsun NN),温室培养。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化。

将-80℃冷冻保存的平菇菌丝体,接种于PDA平板培养基上,25℃培养3d得到生长旺盛的平菇菌丝。

1.2.2 平菇的发酵培养。

(1)1级菌种制备。将平板活化的菌丝切成小块儿,转入装有100m L培养基的500m L摇瓶中,于27℃、220rpm摇培3d得到一级菌种。培养基(1 000m L)配方:马铃薯淀粉18g,葡萄糖25g,豆浆粉25g,蛋白胨8g,酵母粉5g,牛肉膏3g,KH2PO43g,K2HPO41g,Mg SO41.5g,VB130mg。(2)平菇菌丝体的发酵培养。将得到的1级菌种培养液按照体积百分比浓度8%的接种量接种到装有100m L培养基的500m L摇瓶中,于27℃、220rpm摇瓶培养。

1.2.3 样品处理。

将摇瓶培养得到的平菇菌丝于40℃烘箱中烘干,粉碎,过60目筛得到平菇菌丝干粉。将平菇菌丝干粉与PBS缓冲液(25mmol/L,p H值8.0),按照1g/10m L的比例混合,4℃浸提2h,10 000rpm离心25min,收集上清液,即为平菇菌丝PBS提取液。

1.2.4 平菇抗TMV活性成分测定。

(1)将蛋白酶K加入菌丝PBS提取液中,蛋白酶K工作浓度为50μg/m L,55℃保温2h。(2)将菌丝PBS提取液沸水浴加热30min。

以总蛋白浓度为200μg/m L进行其抗TMV活性生物学测定。

1.2.5 不同发酵培养天数平菇菌丝PBS提取液抗TMV活性测定。

平菇菌丝摇瓶培养,72h后开始取样,每隔24h取一次,取至192h。抽滤收集菌丝,然后按照上述方法获得平菇菌丝PBS提取液,以总蛋白浓度为200μg/m L进行抗TMV活性生物学测定。

1.2.6 平菇菌丝PBS提取液中抗病毒蛋白组分的筛选。

(1)将平菇菌丝PBS提取液中加入硫酸铵至饱和度为30%,于4℃放置8h,10 000rpm离心25min,收集沉淀即为0%~30%饱和硫酸铵沉淀组分。(2)将离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60%,于4℃放置8h,10 000rpm离心25min,收集沉淀即为30%~60%饱和硫酸铵沉淀组分。(3)将离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为85%,于4℃放置8h,10 000rpm离心25min,收集沉淀即为60%~85%饱和硫酸铵沉淀组分。将以上组分于去离子水中4℃充分透析,10 000rpm离心25min,收集上清液,分别进行抗TMV活性测定,对以上所得对TMV抑制效果好的硫酸铵沉淀范围以同样的方法进行以10%分段间隔的进一步硫酸铵沉淀,并分别进行抗TMV活性测定。

1.2.7 蛋白浓度测定方法。

采用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)测定供试样品的蛋白质浓度。

1.2.8 抗TMV活性测定。

将蛋白浓度为200μg/m L样品喷施于温室培养生长至五至六叶期的枯斑三生烟,每株10m L,以清水喷施为对照,每个处理9株,3次重复,处理72h后,在喷施处理的叶片上接种TMV,并在接种后72h调查每张叶片的枯斑数,计算枯斑抑制率[6]。枯斑抑制率(%)=(1-处理每叶枯斑数/对照每叶枯斑数)100。

2 结果与分析

2.1 平菇菌丝PBS提取液蛋白酶K酶解及加热处理

由图1可知,经过蛋白酶K酶解和沸水浴加热处理后,抗TMV的活性明显下降甚至消失,平菇菌丝PBS提取液、蛋白酶K酶解处理及沸水浴加热处理的平菇菌丝干粉粗提液对TMV的抑制率分别为66.54%±4.98%、4.12%±7.13%和3.18%±3.16%。

2.2 平菇菌丝不同发酵培养天数对蛋白抗TMV活性的影响

从表1可以看出,发酵培养3~8d后的平菇菌丝PBS提取液对烟草花叶病毒的平均抑制率均在40%以上,其中发酵培养5d的菌丝进行提取得到的平菇菌丝PBS提取液对烟草花叶病毒的平均抑制率达到68.38%±7.94%,效果最好。由图2可知,在发酵培养的第5天,平菇菌丝PBS提取液中总蛋白浓度最高,为10.19mg/m L。

2.3 平菇菌丝PBS提取液中抗病毒蛋白组分的筛选

从表2可以看出,当硫酸铵饱和度在30%~60%和60%~85%时,沉淀的蛋白对烟草花叶病毒的抑制率较高,可达66.30%±5.54%和62.11%±2.67%,故选取30%~85%硫酸铵饱和度进一步分级。

从表3可以看出,硫酸铵饱和度在40%~50%、50%~60%、60%~70%沉淀的蛋白对烟草花叶病毒的抑制率分别达到60.92%±7.82%、63.81%±8.97%和59.13%±11.95%,说明抗TMV活性蛋白主要存在于硫酸铵饱和度在40%~70%的范围内的沉淀中。

3 结论与讨论

生物学测定结果显示,在平菇生长的不同阶段,其自身的蛋白表达量以及不同蛋白的生物学活性不同。发酵培养120h的平菇菌丝PBS提取液中总蛋白含量达到了最高;在总蛋白浓度相同的条件下,摇瓶培养120h的平菇菌丝PBS提取液对TMV的抑制率达到最高,从而为平菇菌丝发酵培养条件的优化提供了一定的依据。

蛋白酶K是从林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)中纯化得到的一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,可切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键[7],导致蛋白变性失活。平菇菌丝PBS提取液分别经蛋白酶K酶解和沸水浴加热处理后,对TMV的抑制活性均明显下降,说明平菇菌丝PBS提取液中的蛋白质成分在酶解和沸水浴加热的条件下均丧失生物活性,同时经过酶解和加热处理的平菇菌丝PBS提取液对TMV的抑制作用也大幅下降,从而说明在平菇菌丝PBS提取液中抗TMV的主要成分为蛋白质。

通过饱和硫酸铵分级沉淀的方法,结合生物学测定确定了平菇菌丝抗TMV活性蛋白在硫酸铵饱和度达到40%~70%时被沉淀下来,从而得到了平菇蛋白粗提液。目前,仅从香菇(Lentinus edodes)、杨树菇(Agrocybe aegerit)、榆黄磨(Pleurotus citrinipileatus)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、金针菇(Flammulina velutipes)、毛头鬼伞(Coprinus comatus)、灰树花(Grifola frondosa)等少数几种大型食用菌中分离得到抗TMV活性蛋白[8,9,10,11,12,13,14,15]。前期研究证明,平菇蛋白粗提液对烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒等植物病毒在烟草、辣椒等不同寄主表现出不同程度的抑制作用,与其他食用菌来源抗植物病毒蛋白相比,平菇蛋白粗提液可能是一种广谱性抗植物病毒蛋白。

病毒抑制 第9篇

1 试验材料

1.1 试验用样品配制

中草药喘康制剂由江苏某保健品有限公司生产, 利用超声波提取其有效成分, 经过低温冷冻干燥机制成粉剂;卵黄抗体粉剂由江苏畜牧兽医职业技术学院饲料与营养研究所制备。试验样品为不同配比的中草药“禽喘康复散”与卵黄抗体复合气雾剂, 配比分别为1∶1, 1∶0.8, 1∶0.5, 1∶0.2, 分别记为样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。提取溶剂为70%乙醇溶液, 在水浴上加热回流提取1 h, 趁热过滤, 药渣再重复提取1次, 合并滤液, 浓缩至原液浓度为1 g/m L, 采用间歇法灭菌。

1.2 仪器设备

超净工作台, CO2培养箱, 96孔培养板, 微量滴定板, 普通显微镜。

1.3 试验用病毒及细胞

试验用病毒:柯萨奇病毒3型、5型 (CB3、CB5) , 腺病毒3型、7型 (AdV3、AdV7) , 合胞病毒 (RSV) , 流感病毒 (F) , 副流感病毒 (P) 。试验用细胞:Hep-2细胞单层培养物。选用9～10日龄鸡胚、1%的鸡红细胞。

1.4 组织培养基

生长液为10%小牛血清MEM液, 含青、链霉素各100 IU/mL。维持液为2%小牛血清MEM培养液。

2 试验方法

2.1 样品对细胞毒性测定

选用的4种样品以0.1 g/m L为原液, 按2-n10-1 (n为1～14) 倍比稀释, 分别加入已长成单层Hep-2细胞的96孔培养板中, 放37℃CO2温箱过夜, 观察各配比制剂对细胞的毒性作用, 以对细胞不产生毒性时的样品浓度记为CC0, 作为抑病毒试验的起始浓度。

2.2 病毒感染滴度测定

取CB3、CB5、AdV3、AdV7、RSV的新鲜病毒悬液, 以10倍递次稀释法稀释成不同稀释度, 分别接种到组织培养单层细胞管内, 每管接种100μL, 每个稀释度接种4只细胞管, 使病毒与细胞充分接触, 37℃吸附1 h, 以Hanks液洗3次, 加入细胞维持液, 37℃培养, 逐日在普通显微镜下观察记录细胞病变情况, 观察1～5 d, 测定组织培养半数感染量TCID50。试验选用不同病毒的100TCID50/0.1mL。

2.3 中和实验

将样品从CC0起作系列倍比稀释, 1样品与100TCID50的病毒等量相加, 摇匀放37℃水浴锅作用1.5 h, 接种到形成单层细胞的96孔培养板内, 同时设病毒对照、正常细胞对照、样品对照组, 以产生50%细胞病变的样品最高稀释度作为判定结果。

2.4 血凝抑制实验

取96孔培养板, 将样品顺序作倍比稀释至1∶5 120, 每孔加入4个单位的血凝素100μL等量混合, 37℃作用1 h, 加入1%鸡红细胞各100μL, 摇匀后置室温, 30 min、45 min时各观察1次结果, 以45 min时为准。对照组设样品对照, 病毒对照 (分别加入4, 2, 1, 1/2单位血凝素各100μL+生理盐水各100μL) 、红细胞对照, 以上各对照组再分别加入1%鸡红细胞100μL, 摇匀, 在相同条件下观察结果。以能完全抑制红细胞凝集的最小药物浓度为终点。

3 结果

样品对细胞毒性测定结果见表1。

样品初始浓度选择对Hep-2出现*的浓度, 即样品Ⅰ为1/640, 样品Ⅱ为1/320, 样品Ⅲ为1/160, 样品Ⅳ为1/80。

中草药与卵黄抗体复合气雾剂的最小抑制病毒浓度见表2、表3。从5种病毒7个分型的呼吸道病患常见病毒的抑病毒的试验结果来看, 样品Ⅰ除对AdV7作用较弱外, 对其他病毒的作用都强于其余样品。样品Ⅱ对病毒的作用相对强于样品Ⅲ、样品Ⅳ, 而样品Ⅳ对病毒的作用最弱。

注:@表示100%的细胞病变, #表示50%的细胞病变, $表示25%的细胞病变, &表示12.5%的细胞病变, *表示无细胞病变。

4 讨论

急性上呼吸道感染有70%～80%由病毒引起, 试验所选7种病毒为呼吸道感染最常见的病毒, 尤其是合胞病毒, 对呼吸道病毒感染具有一定代表性。试验结果表明, 中草药与卵黄抗体配比为1∶1, 对各病毒的抑制效果最强。这也合理地解释了其防治呼吸道疾病效果最佳。结果也与先前提高肉鸡日增重和饲料转化效率, 促进蛋鸡法氏囊发育, 有效保护传染性支气管炎等试验一致。