纳米羟基灰石范文

纳米羟基灰石范文（精选9篇）

纳米羟基灰石 第1篇

1 纳米HA的应用研究

目前,对纳米羟基磷灰石的应用研究,主要集中在以下几个方面,即硬组织修复材料、药物载体及抗肿瘤活性等。下面介绍其主要的应用研究。

1.1 硬组织修复材料

纳米 HA-高分子复合材料通过对天然硬组织的模仿,解决了常规 HA 生物陶瓷脆性大、抗弯强度低、在生理环境下抗疲劳性不好等临床应用中遇到的问题,因此在硬组织修复领域有着广阔的应用前景。崔福斋等[2]将采用仿生沉淀法制得的纳米 HA/胶原骨修复材料植入新西兰大耳白兔骨髓腔中发现,植入体的界面层可发生溶解-沉积的动态快速更新过程,巨噬细胞可在种植体表面或深入种植体内通过吞噬和胞外降解吸收种植体材料,种植体表面及内部被吸收后伴随有新骨的沉积,种植体与骨组织可形成化学键合。Itoh[3]通过动物实验研究了载有骨形态发生蛋白(rhBMP)-2 的纳米 HA/胶原复合材料的性能,结果表明,载有rhBMP 的 HA/胶原复合材料具有较高的骨诱导性,加速骨重塑过程,将其植入承重部位,能够有效缩短骨整合时间。为了提高HA生物材料的强度和韧性,从20世纪80年代开始国内外许多学者从磷灰石分子结构及仿生学等角度出发,以人工合成的磷灰石为基础,采用离子置换法或有机、无机材料掺杂、复合等方法,改进材料的物理机械性能,以期得到力学性能与骨匹配,兼有生物活性的骨修复或骨替代HA复合材料。

1.2 药物载体

Aoki 等[4]将羟基磷灰石纳米微晶用作药物载体,对其吸附和释放药物的性能进行了细致的研究。体外动物细胞培养实验证明,粒子大小为40 nm×15 nm×10 nm的纳米羟基磷灰石溶液对阿霉素的最大吸附量为0.2~1 mg;阿霉素和阿霉素-羟基磷灰石对癌细胞均有抑制作用,但阿霉素-羟基磷灰石的抑制作用明显长于阿霉素。Ijntema K 等[5]采用共沉淀法将蛋白类药物BSA包裹于纳米 HA晶粒中获得了具有缓释功能的药物释放体系。体外缓释实验结果表明,药物的释放速率由 HA 的溶解过程控制。

1.3 抗肿瘤活性

Aoki 等[4]采用体外细胞培养的方法研究发现纳米羟基磷灰石对正常细胞增殖基本无影响。Aoki 等[6]将纳米羟基磷灰石微晶作为抗癌药物的载体,在进行体外细胞培养的实验中发现,用作空白对照的羟基磷灰石对 Ca-9 癌细胞的增殖也有明显的抑制。同时还发现,羟基磷灰石对癌细胞增殖的抑制效应需要一定的时间才可以表现出来,培养液的pH 值发生变化,大量纳米HA 进入细胞内部,引起细胞空胞变形,导致细胞大量死亡。大量的研究表明,人体骨磷灰石的结构长约 40~60 nm,宽约 20 nm,主要基本单元是针状和柱状的磷灰石晶体,它们或定向和卷排列,或相互缠结,构成多种织构。不同的织构形成了骨在纳米尺寸上的功能单元,如束状结构和团聚结构适于承受高强度,而卷曲和疏状交织结构具有很好的韧性,并有利于营养物质的传递。因此近年来人们逐渐认识到许多材料细化到纳米量级性能可能发生突变,包括某些机械性能,并做了大量研究。Wang 等[7]发现 HA 颗粒越小,骨植入体的扭转模量、拉伸模量和拉伸强度就越高,疲劳抗力也相应提高。所以,合成纳米级 HA将有利于骨植入体的力学性能,并有望提高骨缺陷填充的愈合速度。

2 HA的合成方法及研究现状

2.1 干法合成

有文献报道[8,9],CaO与CaHPO4在乙醇中研磨生成HA;Ca2P2O7与CaCO3在丙酮和水中研磨生成HA。也有文献报道[10],不需要乙醇、酮和水作溶剂,CaHPO4与CaCO3研磨60 h可生成HA粉体。由于干法合成难以达到分子尺度的混合,烧结温度较高,研磨过程耗能大,所得粒子尺寸很大程度上取决于机械设备的性能,常规的研磨法难以得到平均粒径小于100 nm的超细颗粒,故一般不用干法合成纳米HA。

2.2 微乳液法

利用两种互不相溶的溶剂在表面活性剂的作用下形成一个均匀的乳液,从乳液中析出固相。Lim G K等[11]以CaCl2-(NH)2HPO4环己烷HP5+NP9为原料制成微乳液,可得20~40 nm的HA粉体。任卫等[12]用AOT-异辛烷-Ca(H2PO4)2·H2O水溶液体系的微乳液与AOT-异辛烷-Ca(OH)2饱和溶液体系的微乳液反应,制备出了平均颗粒尺寸107 nm的HA。

微乳液法制备纳米粉体已受到重视,所得粉体粒度分布窄,且容易控制。用该法合成纳米HA要选择合适的微乳液及彻底清除颗粒表面的油相和表面活性剂。

2.3 沉淀法

将不同的含Ca和P的化合物在水溶液中发生反应,生成HA沉淀。Ca(NO3)2·4H2O和(NH)2HPO4发生复分解反应生成HA[13],Ca(OH)2和H3PO4发生酸碱中和反应生成HA[14]。常用的钙盐有CaCl2、CaO、Ca(OC2H5)2等;常用磷酸盐还有K2 HPO4、Na H2PO4、(CH3O)3PO等。

沉淀法生成的HA颗粒尺寸分布范围宽,且颗粒分散度低。用添加剂钙型或冷冻干燥可以减小颗粒尺寸及改善颗粒分散度。江昕等[15]利用十二烷基硫酸钠作添加剂制备出粒径为80 nm 的HA。Lu Hui等[16]用一般热处理得到平均粒径为 40 nm 的HA,而用冷冻干燥可以得到平均粒径为33 nm的HA。

2.4 溶胶-凝胶法

溶胶-凝胶法是利用金属无机盐或金属醇盐,在水或醇溶剂中发生水解或醇解反应,形成均匀的溶胶,经过干燥或脱水转化成凝胶,再经过热处理得到所需要的超细粉体、纤维或薄膜的化学方法。M.Ashok等[17]采用CaCl2·2H2O,Na2HPO4和Na2SO3·9H2O为原料,首先配制比重为1.03的Na2SO3·9H2O的溶液,用乙酸和Na2HPO4调节其pH值至7.4,然后使该溶液在(37±1)℃的恒温箱中转化成凝胶。将1 mol/L的CaCl2·2H2O溶液覆盖于凝胶表面,使其充分陈化,然后洗涤、干燥,最后在 1200 ℃锻烧。可以得到27 μm×2 μm的片状HA晶粒。

2.5 超声波合成法

超声波在水介质中引起气穴现象,在水中形成微泡,使其生长和破裂。这能激活化学物种的反应活性,从而有效地加速液体和固体反应物之间非均相化学反应的速度。因而可用超声波来合成HA,但是反应机理还不十分清楚。Kim等[18]采用把H3PO4和Ca(OH)2按Ca/P=1.67的比例混合,把混合物加人到蒸馏水中配成悬浮液,用铁制的集音器浸入悬浮液中传导超声波,选择合适的放射时间及温度,可以在常压下合成单相的HA,检测悬浮液的pH值,把平衡值做为反应结束的标志。超声波法合成的HA粉未非常细、粒径分布范围窄,而且这种合成方法在某些方面比其它加热的方法更为有效。

2.6 水解法

日本学者Monma于1976年提出了水解a-Ca3PO4制备HA的方法。1987年又发展了用磷酸氢钙水解并用氯化钙熟化的方法制备HA粉末。陈明源等[19]也采用磷酸氢钙,使其在最佳的pH值、温度和水解时间等条件下水解,得到HA结晶粉末,不用再进行高温锻烧。王友法等[20]选用可溶性的硝酸钙和磷酸氢二铵,在尿素用作添加剂的条件合成了含部分碳酸根的长度为50~150 μm,长径比为40~100的针状HA单晶。反应温度为82~95 ℃,在该温度下尿素逐渐水解,产生OH-,为沉淀HA提供必要条件。醇盐水解法可以制备HA薄片。将 Ca(NO3)2·4H2O和磷酸三甲酯(CH3O)3PO溶于乙醇或甲酰胺中,当溶剂蒸发后,加热到500~1000 ℃,即可得到结晶良好的HA。

2.7 自燃烧法

自燃烧法是以溶胶-凝胶法为基础,将Sol-Gel湿化学合成法和自蔓延燃烧合成法结合,利用硝酸盐与狡酸反应,在低温下即可实现原位氧化,自发燃烧快速合成产物的初级粉末,大大缩短了制备周期。更重要的是,它利用了Sol-Gel工艺各元素在分子级别混合,凝胶离子活性大,反应物在合成过程中处于高度均匀分散状态,反应时原子只需经过短程扩散或重排即可进入晶格位点,加之反应速度快,前驱体的分解和化合物的形成温度又很低,使得产物粒径小,分布比较均匀,并且避免了Sol-Gel工艺需高温锻烧且锻烧过程中易产生硬团聚而降低粉末烧结活性的缺点,因而特别适于纳米材料的合成。该法具有实验操作简单易行、实验周期短、节省时间和能源、污染少、产物颗粒团聚少等优点。

王欣宇等[21]首次采用自燃烧法研究了纳米级HA粉末的制备,合成了分布比较均匀,平均粒径为85 nm的HA粉,并进一步对自然烧法制备纳米经基磷灰石粉的机理进行了初步探讨,以及对影响该工艺的主要因素(溶液中的水含量、溶液的pH值、柠檬酸的量及加热和烧成温度)做了讨论。

2.8 水热法

水热法是在特制的密闭反应容器里,采用水溶液作为反应介质,在高温高压环境中,使难溶或不溶的物质溶解且重结晶的一种方法。它可以用来生长各种单晶,制备超细、无团聚或少团聚、结晶完好的陶瓷粉体和无机纤维或晶须增强材料须。是一种低能耗,低污染,低投入的方法,而且粉体质量好,产量也较高。改变水热反应条件可得到具有不同晶体结构和结晶形态的产物。

20世纪70年代初日本的H.Aoki等[22]报导了水热条件下水热温度、pH值对经基磷灰石粉末合成的影响研究,并对Ti基磷灰石(HA)的形成过程进行了动力学分析。M. Kinoshita等[23]利用水热法制备了含碳酸根羟基磷灰石晶须,并对其形态进行了研究。

3 结 语

羟基磷灰石义眼台植入临床观察 第2篇

关键词羟基磷灰石义眼台眼内容物剜除

羟基磷灰石HA是一种不吸收的生物活性陶瓷，其化学成分与脊柱动物的骨质所含的矿物质极为相似，其表面结构、摩擦系数、比重、导热性与绝对强度诸方面也与人的骨质十分接近。HA主要成分是磷酸钙，可制成内联多孔结构的球状材料，被广泛用于颌面外科及整形外科，是理想的骨替代材料，在眼部整形手术中已得到广泛应用。眼球摘除或眼内容物摘除术后如不放置框内植入物来填补眼球所占的空间，安装义眼后，往往会出现上睑凹陷、义眼活动不良、上穹隆向后倾斜、结膜囊过大等畸形，如加大义眼厚度来矫正畸形，往往造成上睑位置下移、下睑松弛，儿童患者则会影响眼眶及同侧面部的发育，造成双侧面部不对称。2008年6月～2011年6月应用国产羟基磷灰石义眼台行眼内容物剜除Ⅰ期眶内植入术24例（24眼），取得了良好的临床效果。现报告如下。

资料与方法

羟基磷灰石义眼台眶内Ⅰ期植入术24例（24眼）。其中男20例（20眼），女4例（4眼），年龄18～76岁，平均46岁。眼球摘除或眼内容物剜除原因，外伤性眼球破裂10例（10眼），绝对期青光眼8例（8眼），眼球萎缩6例（6眼）。

植入材料：全部采用天然海珊瑚加工而成的多孔羟基磷灰石义眼台，内联孔径200μm、或500nm，直径分别为18mm、20mm、22mm。并采用薄壳仿真义眼片。

手术方法：常规消毒铺巾，球后阻滞及结膜下浸润麻醉，沿角膜缘360°剪开球结膜，分离4条直肌，在内直肌止端预置缝线，并剪断内直肌，以内直肌为支点剪断球后视神经血管束，压迫止血并将内直肌断端原位缝合。沿角膜缘剪除角膜，彻底清除眼内容物及葡萄膜组织，2%碘酊烧灼巩膜内壁，75%酒精脱碘，直肌间隔处自前向后“花瓣样”剪开巩膜壁，并剪除后极部巩膜壳，根据A超测得眼轴长度，取大小适宜义眼台，用塑料纸包裹，自巩膜壳内植入义眼台至肌锥内，取出塑料纸，将巩膜瓣上下、内外重叠，5-0可吸收线缝合巩膜及筋膜，5-0丝线连续缝合结膜囊，放置义眼模后绷带加压包扎。术后绷带加压2天，术后5天全身应用抗生素及激素，7天拆除球结膜缝线，术后20天放置薄壳义眼片。

结果

本组24例，随访3个月～2年，1例患者術后7天，拆除球结膜后球结膜裂开，少许义眼台暴露，即取自体唇黏膜移植结膜囊后痊愈，其余患者无1例发生切口裂开、义眼台暴露、术后感染及排异反应。放置义眼片后眼球饱满度好，眼睑启闭自如，义眼活动灵活，逼真。无眼睑退缩及结膜囊狭窄。

讨论

眼球摘除和眼内容物剜除术后倘若眼眶内不放置植入体，即使配戴传统陶瓷或仿瓷义眼，也会逐渐出现眼睑凹陷，结膜囊狭窄，睑内翻或外翻，义眼内陷且活动度差，逼真更无从谈起，有碍美观，对患者心理产生不良影响。植入义眼台后眼球饱满度好，眼睑启闭自如，义眼活动灵活，逼真。植入义眼台后就不会出现眼睑凹陷、结膜囊狭窄、睑内翻或外翻。

羟基磷灰石义眼台有良好的生物相容性，且无毒、无刺激，无致敏性，质量轻，以及容易血管化，是目前公认的比较理想的人工植入材料。羟基磷灰石的优点在于植入眶内后，作为支架容许血管和组织长入，且其微孔结构有利于纤维血管内生，2周后就有纤维血管长入，6个月后就可于眶组织一体化。可作为血管、骨生长支架促进新骨沉积，有一定的骨引导作用；多孔性的特点使其植入组织后，纤维结缔组织可充满这种多孔材料的间隙而将其固定，所以能与宿主形成稳定、坚硬的直接骨性结合，植入组织后无炎症及异物反应；常规消毒不改变其理化特性。用这种材料制作成义眼台植入眼内是一种比较理想的手术，并发症较少，在眼科得到广泛应用。但临床应用以来，由于HA义眼座植人术中处理不当及手术时机选择不当，会出现结膜伤口菲薄、糜烂，结膜、筋膜裂开，巩膜溶解，HA义眼座暴露，还可能出现眼眶发育迟缓、眼球摘除综合征、框内感染、义眼座活动度不良等并发症。只要掌握手术技巧及选择合适大小的义眼台，把握手术时机，这些并发症是可以防止和减少的。

本组1例曾发生结膜伤口裂开，巩膜壳暴露，并少许义眼台暴露，究其原因因植入义眼台过大，巩膜及结膜伤口缝合有张力，加之术后放置义眼模太大，重新打开切口，无张力缝合巩膜壳，移植自体唇黏膜于结膜囊后痊愈。故笔者的经验是根据术前A超所测眼轴长度选择大小合适的义眼台。植入时要将义眼台放至足够深度，保证巩膜在前方充分覆盖义眼台，且对筋膜及结膜囊缝合不产生张力。术中将义眼台牢固的固定在肌锥内将义眼台后部裸露，巩膜瓣双层固定在义眼台前。剪断视神经，彻底清除葡萄膜组织，避免交感性眼炎发生及绝对期青光眼术后疼痛。内直肌断端原位吻合牢靠，以保证术后义眼台活动自如。严密缝合巩膜、筋膜及球结膜，避免张力过大，以免伤口裂开。术后加压包扎，全身应用抗生素及激素5天，以防术后感染及排异反应。

此种手术在眼外伤、疾病、肿瘤等诸多因素致眼球摘除或眼内容物剜除，术中眼窝重建及术后义眼配制具有重要临床意义，此术式符合眼球及眼肌生理解剖，手术安全可靠，并发症少，术后义眼台球体稳定，眼眶饱满，活动度好，外形逼真，美容效果满意，值得推广。

参考文献

1林茂昌.现代眼部美容整形学[M].西安：世界图书出版公司，1997：440.

2何守志.临床眼科学[M].天津：天津科学技术出版社，2002：1068.

3文玉民.羟基磷灰石义眼台植入临床观察[J].眼外伤职业病杂志，2003，25（4）：272-273.

一维纳米羟基磷灰石的制备与表征 第3篇

羟基磷灰石(hydroxyapatite,Ca10(PO4)6(OH)2,简称HAP)是脊椎动物骨骼和牙齿的主要无机矿物相。合成的HAP具有良好的生物活性、生物相容性以及骨传导性能,是无机生物材料的主要研究对象之一[1]。骨骼中的HAP晶粒的形貌为50nm25nm4nm的纳米棒[2]。但是人工合成的HAP脆性大、强度低,抗折强度和断裂韧性指标均低于人工致密骨[3,4],从而限制了它在人体负重部位的应用。

近年来,随着人们对纳米领域的认识与关注,对羟基磷灰石进行研究发现,纳米级的HAP粒子本身就具有一定的生物学效应[5]。而纳米羟基磷灰石可以提高陶瓷的力学性能和韧性,且兼有骨传导和骨诱导作用,提高骨植入材料的成骨能力,不仅如此,纳米级HAP在功能上还表现出一些特异性能[6],如纳米HAP粒子对一些肿瘤细胞的生长具有抑制作用,

而对正常细胞基本没有负面作用;可以做基因或药物的载体等等。因此,对纳米HAP的制备及医学应用的研究已越来越受到研究工作者的广泛关注。

目前纳米HAP的制备方法有:水热法[7],沉淀法[8],溶胶-凝胶法[9],微乳液法[10],超声波合成法[11],微生物法[12]和煅烧磷酸钙法等等。其中水热法,操作简单,周期短,合成的产物纯度高,且在表面活性剂的作用下能够实现对晶体的可控制备。表面活性剂由于具有亲水基和亲油基,能够自组装成各种有序分子模板,又可以利用其长分子链的空间位阻效应避免粒子的团聚,广泛应用于不同形貌材料的制备[13]。

一维纳米材料主要包括纳米线、纳米棒、纳米带、纳米管、纳米电缆等,由于其不仅具有通常纳米材料所具有的表面效应、量子尺寸效应和小尺寸效应等,还具有其独特的热稳定性、机械性、电子传输和光子传输性、光学性质、光电导和场发射效应等[14],使其具有广泛的应用前景。此外,棒状纳米HAP形态类似人工骨,解决了一般HAP无法应用于人体负重部分的问题。

本实验通过水热法,采用CTAB为表面活性剂,氨水调节反应液的PH值,在碱性条件下制备得到在化学组成、微观形态以及结晶结构上均与骨组织磷灰石相仿的结晶度较高的HAP纳米棒,通过XRD、TEM、FT-IR等表征手段对其进行分析,最后探讨了其形成原理。

1 实验

1.1 纳米HAP的制备

试验中所使用的试剂为:Ca(NO3)24H2O分析纯,(NH4)2HPO4分析纯,NH3H2O分析纯,CTAB分析纯,去离子水。

预先分别配制好一定浓度的Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4溶液,接着按照n(Ca)/n(P)=1.67,将(NH4)2HPO4溶液缓慢滴入不断搅拌的Ca(NO3)2溶液中,再滴加5ml的0.05molL-1CTAB溶液,用NH3H2O对溶液调PH值,搅拌均匀后,将HAP的前驱物转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中,置于电烘箱中,按照设计好的温度和反应时间加热高压釜进行反应。待反应结束之后,取出高压釜,室温下冷却,用无水乙醇和去离子水对产物离心洗涤各3次,将产物在60℃的干燥器中干燥24h,研磨后得到纳米HAP样品。

1.2 表征手段

所制样品XRD测试用荷兰Philips公司X’Pert MPD Pro型X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)仪对样品进行物相分析,铜靶(40k V,40m A),扫描速度4(°)/min,步长0.02°,扫描范围为5~90°。TEM照片由美国FEI公司Tecnai G2 F20 S-TWIN型场发射透射电镜(Field Transmission electron microscope,FTEM)拍摄,加速电压200k V。红外光谱用美国Nicolet360型傅立叶红外光谱仪(KBr压片法)测定。

2 结果与讨论

2.1 对样品XRD分析

对反应体系p H=11,150℃下反应24h的样品进行XRD分析,如图1。从图中,我们可以看出,该图谱与HAP粉末衍射标准卡片(JCPDS File No.9-432)能够很好的吻合。并且产物中没有其他相的衍射峰,表明获得的纯度较高的纳米HAP。吸收峰较尖锐,说明样品具有较好的结晶度。根据Scherrer公式,通过(211)晶面衍射峰的半峰宽,计算出此晶粒尺寸为16.6nm。

2.2 样品的红外光谱分析

从图2可以看出3680cm-1吸收峰对应为OH-中O-H的伸缩振动;3488cm-1和1682cm-1处的吸收峰分别对应于吸附水中O-H的收缩振动和弯曲振动;580cm-1、609cm-1和630cm-1处的吸收峰对应于PO43-的弯曲振动峰,913cm-1对应的是PO43-的对称伸缩振动峰;1082cm-1,1122cm-1处的吸收峰对应于PO43-的非对称伸缩振动峰;1498cm-1和1525cm-1的双分裂吸收峰对应于CO32-的非对称伸缩振动峰,表明不是自由的CO32-和碳酸盐中的CO32-单峰,这标志着碳酸根进入羟基磷灰石晶体结构,类似于天然骨磷灰石的组成。分析原因,可能是在制备样品的过程中吸收进了空气中的CO2所致。由Sigma公司提供的CTAB的标准谱图可知:CTAB的3个最强峰应该依次出现在2918cm-1、2860cm-1和2944cm-1处[15],对照图2可以发现纳米HAP的红外光谱在上述位置并没有出现任何吸收峰,这表明在合成过程中引入的CTAB已经被清洗干净。

此反应在碱性(p H≥8)条件下进行,前驱物NH3H2O提供的OH-与CO32-形成[CO3OH]四面体,实际上是[CO3OH]四面体替换了纳米HAP中的部分[PO4]四面体[16],FT-IR图谱中CO32-的双分裂吸收峰的位置也与文献[16]报道的结果基本吻合。所制得的纳米HAP,由于CO32-替换PO43-进入晶格,更接近入骨的矿物成分,有利于提高材料的生物性能。

2.3 样品的透射电子显微分析

图3是纳米HAP的TEM(A)和HRTEM(B)的照片。由图A可以看出,样品为分散度较高的一维纳米棒,其长度约为60~360nm,直径为15~25nm,轴径比约为5~20。图B中选区电子衍射可以看出,产物为单晶,六方柱状结构。从HRTEM照片得知,晶格条纹间距与(110)晶面间距相近,且平行轴向的是{002}晶面,进一步表明HAP纳米棒是沿着c轴方向择优生长的。

3 机理分析

本实验,在纳米HAP合成过程中,所选用的CTAB是阳离子型表面活性剂。CTAB在体系中浓度不同时,可聚集成不同形貌的胶束,并借助于电荷和结构的互补实现对晶体形成与生长的控制[17]。据报道在室温下,其临界胶束的浓度是0.8~1.0mmolL-1[18]。

从热力学角度看,在其它因素不变的情况下,提高过饱和度S不仅能提高晶核的热力学稳定性,也可提高生成晶核的数目和速率。在水溶液中,CTAB能够离子化,形成具有四面体结构的阳离子型的亲水头基。这个带正电荷的四面体便和反应体系中的PO43-结合,从而使PO43-在其界面处富集,提高了HAP的局域过饱和度S。这样HAP就可以在胶束的表面原位成核成长。根据生物矿化的基本原理,CTAB作为晶体异相成核的基底,与均相成核相比,异相成核需要的活化能较低,更易于成核。

羟基磷灰石单晶是截面为正六边形的柱状晶体,晶体的c轴为柱轴方向,且又是HAP晶体择优生长的方向[19],因此成核后的晶体沿着c轴开始生长。在p H=11的情况下,溶液体系中存在着大量的OH-,OH-包围了CTAB电离出来带正电荷的四面体,控制其胶束的诱导作用;此外,OH-与PO43-的相互排斥也减少了PO43-四面体与CTAB电离出的四面体碰撞几率,阻碍了两个四面体的互补作用,进而妨碍纳米HAP晶体进一步的生长。因此,本实验获得的样品为沿c轴方向的生长长度为60~360nm的棒状晶体。并且,在形成HAP晶体后,CTAB胶束便吸附在其表面上,由于胶束的体积较大,使得每个HAP分子之间互相远离,减少了HAP分子之间的碰撞接触的几率,从而有效的避免的粉末团聚现象的出现。

4 结论

1)本实验以Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4为前驱体,CTAB为表面活性剂,用水热法成功的合成了高纯度,分散性较好的棒状纳米HAP。长度为60~360nm,直径为15~25 nm,轴径比为5~20,且具有与人体骨骼成分相近的结构。

羟基磷灰石义眼台植入术的护理观察 第4篇

【关键词】羟基磷灰石；义眼台植入术；护理

【中图分类号】R779.64【文献标识码】A【文章编号】1004-4949（2013）11-126-02

患上眼病的人越来越多，由于眼外伤、角膜葡萄肿等疾病到医院就诊的人数大幅度增加，需要进行手术才可解决问题，但是手术后容易出现并发症，因此，规范性的护理对患者来说至关重要。本研究对2012年1月-2013年11月我院收治的36例接受羟基磷灰石义眼台植入术患者的护理情况进行分析，现报道如下：

1资料和方法

1.1一般资料： 随机选择2012年1月-2013年2月我院收治的36例接受羟基磷灰石义眼台植入术的患者，其中男20例，女16例，将所有患者平均分为研究组与对照组，每组18例患者。研究组18例患者，年龄22-46岁，平均（34.61±5.43）岁；其中角膜葡萄肿患者6例，眼内炎患者10例，眼球萎缩患者2例。对照组18例患者，年龄21-44岁，平均（34.18±4.89）岁；其中角膜葡萄肿患者8例，眼内炎患者6例，眼球萎缩患者4例.两组患者在年龄、病症等方面差异不明显（P>0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1常规护理组： 给予18例患者常规护理治疗，既包括日常的生命体征变化观察护理、保持病房舒适环境护理、勤加给患者清除分泌物护理等。

1.2.2规范性护理组： 具体主要采取以下几种护理方法：

术前护理：在患者进行手术之前的护理主要是进行心理护理，面对手术，患者难免会产生恐惧焦虑心理，这样的心理情况对手术带来极大的影响，因此，医护人员给予患者心理护理至关重要[1]。医护人员要亲切热情的与患者进行交谈，告诉其手术的方法，并通过成功病例来鼓励患者，消除患者的紧张心理。进行心理护理的同时，还需要给患者做眼科的检查，检查内容包括测量血压、体温以及血常规与凝血常规检查等。

术后的护理：在患者完成手术之后，嘱咐患者要多卧床休息，术眼加压包扎时间为48小时（若是包扎时间不足，则会出现出血现象）。医护人员要严密观察患者的恢复状况，做好保暖工作，避免患者感冒（若是患者由于感冒出现咳嗽，伤口容易裂开，延长愈合时间），并嘱咐患者不可直接用手擦拭眼睛，多食用蔬菜等高纤维的食物，进行换药时，要对患者全身采用抗生素，精心包扎，避免眼心反射。

并发症的护理：结膜渗出与水肿是羟基磷灰石义眼台植入术后常见的一种并发症，术后激素类眼液的规范点用有利于消肿。一般情况下，在患者完成手术后的1周左右，经常会发生义眼台暴露，此时，要立刻将此情况向医生汇报，当进行药物治疗无法获取理想效果时，需要进行手术修复[2]。在患者完成手术之后，若是出现发热或是局部病变，需要汇报给医生及时做处理。

2结果

经过治疗之后，18例研究组患者手术完成之后，出现感染的患者有3例，羟基磷灰石脱出患者有2例，经过治疗之后，所有患者都痊愈，可出院；18例对照组患者，出现感染的患者8例，羟基磷灰石脱出患者有5例，所有患者都需要在医院进行进一步的观察治疗。研究组患者的感染率、羟基磷灰石出现脱出率明显低于对照组，两组对比差异显著（P<0.05）。

3讨论

近年来，到医院就诊的人越来越多，由于眼病到医院就诊的人数也呈现出攀升趋势，目前，临床上治疗全眼球炎、眼外伤等疾病，多是采用手术的方式进行治疗，但是进行手术治疗，并发症的发生率比较大，例如会出现以下几种并发症：下睑缘下沉义眼陷没、义眼滑脱以及下睑板沟凹陷等，十分影响美观。现如今，羟基磷灰石义眼台植入术，已经广泛运用于临床眼病治疗中，使用该治疗方式，不但可有效避免眼睑凹陷现象，而且还可佩戴活动义眼片，可以对外观进行改善，患者比较乐意接受。羟基磷灰石义眼台植入术是一种理想的手术治疗方法，患者完成手术后，由于极易出现并发症，因此，要给予患者进行规范性的护理[3]。在患者进行手术之前，做好患者的心理工作非常重要，消除患者的紧张心理，以一个良好的心态去面对手术，积极配合医生的工作，可提高手术的成功率，在完成手术之后，嘱咐患者多休息，并做好保暖工作，一旦出现义眼台暴露或是体温异常等并发症现象，立即向医生汇报。本研究给予对照组基础的护理治疗，给予研究组规范性护理治疗，结果为研究组患者的感染率、羟基磷灰石出现脱出率明显低于对照组。

综上所述，给予接受羟基磷灰石义眼台植入术患者规范性护理，能够取得较好的治疗效果，值得在临床上推广和使用。

参考文献

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纳米羟基灰石 第5篇

贝壳是贝类养殖的副产物, 其主要成分是碳酸钙。废弃贝壳很难自然分解, 已成为了世界性的环境问题。与国外相比, 我国对海洋废弃贝类的综合开发利用的研究刚刚起步, 对于贝类产品的加工仅局限于其可食用的部分, 对于占贝类质量分数占60%以上的贝壳的深加工很少涉及。目前贝壳最主要的利用方式是直接粉碎, 作为钙粉添加到动物饲料中, 或制成一些附加值低的工艺品, 利用率低。随着现代科技的不断进步, 对海洋生物壳资源的开发趋向高值化。目前已经有科学家通过水热反应法将贝壳转变为羟基磷灰石, 开辟了新的贝壳利用途径[8,9,10]。但水热方法反应温度, 压力大, 对设备要求比较严格, 同时反应周期较长, 成本太高, 工业化不理想。目前还没有相关文献报道在低温常压的条件下实现贝壳的高效转化。

针对目前贝壳资源利用不充分、环境污染严重的工艺技术现状, 本研究利用废弃贝壳作为钙源, 设计低能耗的实验条件, 开展以贝壳为原料制备纳米带状羟基磷灰石粉体技术研究。

1 实验部分

1.1 实验原料及仪器

所用仪器:分析天平 (Sartorious赛多利斯BS124S) , 恒温水浴锅 (金坛市荣华仪器制造有限公司HH-601) , 电热鼓风干燥箱 (上海博讯GZX-9240MBE) , p H计 (雷磁PHS-3C) , 三口烧瓶, 冷凝管, 布氏漏斗。

所用原料:贝壳粉 (取自江苏连云港, 800目) , 磷酸氢二氨 (分析纯) , 磷酸二氢氨 (分析纯) , 盐酸 (分析纯) , 碳酸氢铵 (分析纯) , 蒸馏水。

1.2 实验过程

1.2.1 制备过程

取预处理过的贝壳粉原料加入三口烧瓶中, 采用分析纯磷酸氢二氨、磷酸二氢氨作为磷源, 按照钙磷原子比1.67称取各原料后进行混合, 以蒸馏水为溶剂, 不断搅拌使之混合均匀。将尿素按1%的浓度添加到溶液中, 用盐酸调节p H至6~7左右, 保持弱酸性条件。水浴加热至95℃左右反应1h, 反应完后用布氏漏斗抽滤, 蒸馏水洗涤至中性, 105℃恒温干燥4h, 得到白色羟基磷灰石晶体。

1.2.2 分析测试

样品的物相分析采用荷兰帕纳科PANalytical X’Pert Pro MPD的X射线衍射仪, X射线源为KCu-Kα1, , 管电压40k V, 管电流40m A, 扫描范围5°~60°;样品的形貌利用日本JEOL公司生产的JSM-6390LA型扫描探针显微镜观察;样品的红外测试采用德国Bruker Tensor27红外光谱仪进行测试。

2 结果与讨论

本实验原料贝壳粉主要成分为碳酸钙, 以尿素为沉淀剂, 通过水浴反应将碳酸钙转化为羟基磷灰石。澄清的反应溶液在反应30min后变为白色悬浊液, 离心分离这些沉淀, 该沉淀为磷酸氢钙, 继续反应, 溶液内出现白色絮状沉淀。这个过程与反应温度的高低和添加尿素的量有关系, 温度越高, 尿素的添加量越多, 反应越快。基本的反应方程式如下:

2.1 XRD分析

图1是贝壳粉原料及在95℃水浴反应1h制得的样品的X射线衍射谱图。

图1A贝壳原料的XRD衍射图谱在2θ角26.2, 33.1和36.2°等位置出现文石碳酸钙的特征衍射峰, 各衍射峰的位置与XRD卡片数据库卡片号JCPDS 41-1475衍射峰一一对应, 表明该贝壳中的成分主要为文石型的碳酸钙。

图1B是将上述贝壳粉经过水浴反应后得到的产物粉体进行的XRD表征图谱, 该粉末样品在2θ角25.9, 31.8, 32.2, 32.9和39.8°等位置处均出现衍射峰, 与粉末衍射标准联合委员会标准卡片上羟基磷灰石Ca10 (PO4) 6 (OH) 2 (JCPDS 09-0432) 的特征衍射峰对应, 表明贝壳碳酸钙已经转化为羟基磷灰石。此外, 衍射峰的强度也很大, 说明产物具有良好的结晶度。

2.2 SEM分析

图2中a、b为实验贝壳的SEM图片, 从SEM扫描结果中可以看出该贝壳由规则的片层结构和棱柱结构共同组成, 晶体发育完善, 形状规则, 层片状排布较为整齐, 有明显的阶梯分布。

图2中c、d为实验所制备的羟基磷灰石样品的SEM图片, 反应后的羟基磷灰石转变成带状结构。随体系温度上升, 时间延长, 尿素分解, 调控体系p H值缓慢上升, 使HAP沉淀出来, 同时由于体系p H值缓慢上升, 所以HAP晶粒发育完整, 晶粒长宽比大, 形成纳米带状结构。

2.3 FTIR图谱分析

从图3样品红外谱图中可以看到, 3565.77cm-1处的吸收峰对应为OH-中O-H的伸缩振动, 3398.56cm-1处的吸收峰对应于H2O中O-H的收缩振动和弯曲振动, 是样品中自由水造成的, 605.89cm-1和1038.86cm-1处的吸收峰对应于PO43-的特征谱带, 568.41cm-1属于PO43-和HPO43-多个吸收峰重叠的结果[11]。

3 结论

本文主要利用高强度和高韧性的贝壳原料中的钙成分, 在对贝壳成分及结构深入了解的基础上, 创造合适的实验条件, 在低能耗和低成本的条件下实现贝壳低温转化合成纳米羟基磷灰石。

研究结果表明, 贝壳粉与磷酸氢二氨按照钙磷原子比1.67进行混合, 添加1%的尿素, 水浴加热95℃反应1h可以制得纳米级带状羟基磷灰石粉末。XRD分析结果显示:贝壳中的碳酸钙已经完全转化为羟基磷灰石;SEM分析结果表明:采用水浴法合成得到的羟基磷灰石为纳米级别的带状结构;FTIR表征检测到羟基磷灰石中的羟基, 进一步验证产物为羟基磷灰石。

本研究以安全、节能、环保、经济等为出发点, 探索了利用废弃贝壳制备生物活性材料羟基磷灰石的工艺路径, 解决了废弃的贝壳材料资源浪费的难题, 同时降低了羟基磷灰石的制备成本, 研究成果为废弃贝壳的综合开发利用提供了技术支撑, 具有良好的经济与社会效益。

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纳米羟基灰石 第6篇

1资料与方法

1.1一般资料纳米羟基磷灰石、纳米羟基磷灰石天然复合材料、纳米羟基磷灰石半合成符合材料、纳米羟基磷灰石全合成符合材料;MTT溶液:用浓度为0.1mol/L的PBS(PH=7.4)50ml溶解250mg的MTT,滤过除菌4℃保存备用;细胞培养基:浓度为10%的胎牛血清(Gibco,USA)的PRMI1640(维森特,加拿大);浓度为0.25%胰蛋白酶;二甲基亚砜(DMSO,南京化学试剂厂生产),酶联免疫检测仪(Clini Bio128C,Japan);抗波形丝蛋白多克隆抗体(DAKO,USA);抗细胞角蛋白多克隆抗体(DAKO,USA)。

1.2方法

1.2.2高分辨透射电镜观察结能谱分析用适量的无水乙醇溶少量的纳米羟基磷灰石的粉末,震荡直至悬浮,将混悬液移入带微栅膜的铜网,挥发乙醇后用JEOL TEM-2010高分辨透射电子显微镜对纳米羟基磷灰石粉末进行观察。纳米羟基磷灰石的复合体采用相同的处理方式进行观察。

1.2.3牙周膜细胞原代培养采用司徒镇强组织块培养法,选取因正畸需要进行拔牙的患者,年龄范围在13~17岁之间,在局部麻醉的状态下将患者前磨牙拔除,离体后用含有青霉素、链霉素100μg/ml的RPMI1640培养基清洗3~4次,然后对牙周膜进行剥离,用手术刀片从牙齿根中1/3处将其刮下,剪碎,并放置在培养瓶底部均匀摆放,加入少量完全培养基,将瓶底向上37℃孵箱静止2h,待组织贴壁后翻转瓶底静置培养,铺满瓶底后传代。

1.2.4细胞鉴定取生长状态良好的第四代细胞用于鉴定,将其接种在预先消毒过的盖玻片上,37℃孵箱培养24h后,用0.001mol/l的PBS对细胞进行清洗2~3次,用浓度为95%的乙醇固定2h,梯度乙醇洗涤至水,按免疫组化试剂盒说明书对细胞的抗波形丝蛋白和角蛋白进行免疫组化染色。

1.2.5分组用浓度为0.25%的胰蛋白酶对生长良好的牙周膜细胞进行消化,制备成1×104个单细胞悬液,按如下分组接种于24孔板,组1纳米羟基磷灰石组(1mg/ml),组2纳米羟基磷灰石天然复合材料组(1mg/ml),组3纳米羟基磷灰石半合成复合材料组(1mg/ml),组4纳米羟基磷灰石全合成复合材料组(1mg/ml),组5致密羟基磷灰石组(1mg/ml),组6空白对照。加入实验材料,每组4个孔。

1.2.6 MTT比色法鉴定将细胞培养板放入孵箱(37℃,5%CO2);培养4 h后,每孔加100μl MTT溶液,继续培养4小时,终止培养,吸净培养基,每孔加入DMSO150μl,震荡10min,吸入96孔板进行测定,测定波长为450nm,用没有加入细胞的孔调零,对每个孔的吸光度(OD)值进行测定。

1.3统计学处理采用SPSS 16.0统计学软件对实验结果进行处理分析,计量资料以(x-±s)表示,采用t检验,计数资料以率(%)表示,采用字2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

对不同材料对于细胞增殖活性OD450值比较结果显示,第1~4组与对照组相比,各组在细胞培养后OD值第2d、第3d、第4d差异有统计学意义(P<0.05),第1~4组与5组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。1组、2组、3组、4组各组之间OD值比较显示差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1和表2。

3讨论

纳米羟基磷石灰是具有纳米材料和良好组织相容性的双重特性[4]。纳米羟基磷灰石复合体是以仿生矿化原理,应用纳米自组装化学途径合成的纳米磷石灰胶原复合材料成分,解构与天然的骨组织具有极强的相似性[5]。层状结构有利于牙周膜细胞的长如及营养物质的交换。

对不同材料对于细胞增殖活性OD450值比较结果显示,不同材料的纳米羟基磷灰石与对照组相比,各组在细胞培养后OD值第2天、第3天、第4天差异有统计学意义(P<0.05),不同材料的纳米羟基磷灰石与致密羟基磷灰石相比,差异有统计学意义(P<0.05)。纳米羟基磷灰石、天然纳米羟基磷灰石复合体、半合成纳米羟基磷灰石复合体及全合成纳米羟基磷灰石复合体之间各组OD值相比,差异无统计学意义(P>0.05)。

纳米技术是21世纪重要的科技发展方向,纳米磷灰石及其复合材料的构想源于天然组织,且与人体组织具有较好的组织相容性。对牙周细胞的分化、牙骨的形成、牙齿正畸等方面有着非常广泛的应用前景。

摘要：应用MTT比色法对纳米羟基磷灰石、纳米羟基磷灰石天然复合材料、纳米羟基磷灰石半合成复合材料、纳米羟基磷灰石全合成复合材料及致密羟基磷灰石对牙周膜细胞生长情况进行比较分析。结果对不同材料对于细胞增殖活性OD450值比较结果显示,第1~4组与对照组相比,各组在细胞培养后OD值第2天、第3天、第4天差异有统计学意义(P<0.05),第1~4组与5组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。1组、2组、3组、4组各组之间OD值比较显示差异无统计学意义(P>0.05)。纳米羟基磷灰石及其复合材料对促进牙周组织再生有一定作用。

关键词：纳米羟基灰石,复合材料,牙周膜细胞

参考文献

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纳米羟基灰石 第7篇

细胞毒性试验是一类在离体状态下模拟生物体生长环境, 检测材料和器械接触机体后生物学反应的体外实验, 它是生物学评价体系中最基本的检测指标之一, 一般列为首选和必选项目。随着现代细胞生物学技术的进步, 评价细胞毒性的试验方法亦在不断完善。为了更灵敏地反映材料的细胞毒性, 利用分子生物学技术, 采用材料浸提液或材料直接与细胞接触的方法能够全面、客观地反映被测材料对细胞生长及活性的影响。

本实验在前期研究的基础上[9]利用原位合成法制备出羟基磷灰石/碳纳米管复合材料, 并依据ISO10993标准, 采用噻唑蓝比色 (MTT) 法测试材料的细胞毒性, 从而对材料的生物性能进行初步评价, 为复合材料的开发和临床应用提供依据。

1 实验

1.1 材料与试剂

实验所用HA/CNTs复合粉体由本实验室通过原位合成法制备, 复合粉体中m (羟基磷灰石) ∶m (碳纳米管) =20∶1。实验用细胞为中科院上海细胞所提供的标准L-929小鼠成纤维细胞。溴化3- (4, 5-二甲基-2噻唑基) -2, 5-二苯基-2H-四氮唑 (MTT) 由Sigama公司提供, 二甲亚砜 (DMSO) 由Scigene公司提供, RPMI1640培养基由GIBCO公司提供, 10%胎牛血清由杭州四季青生物制品公司提供。

1.2 复合材料结构与成分分析

采用Rigaku D/MAX-VA X射线衍射 (X-ray diffraction, XRD) 仪测定物相组成。采用JEM-100CⅫ型透射电镜 (Transmission electron microscope, TEM) 观测样品的形貌。

1.3 体外细胞毒性试验

1.3.1 细胞培养

目前细胞毒性试验中应用最早、使用最广泛的细胞是L-929细胞, 为细胞毒性试验中的标准细胞[10]。L-929细胞具有传代稳定、繁殖迅速、体外培养条件低、能为许多生物材料细胞毒性所共用等优点。将L-929细胞用RPMI1640培养液在100mL培养瓶中培养, 待细胞长成单层后传代, 弃去培养液, 加入37℃预温的pH值约为7.8的0.25%胰酶消化液, 于37℃消化2～3min, 弃去消化液, 再加入少量RPMI1640培养液反复吹打, 使细胞分散均匀, 计数细胞, 调至1105个/mL移至96孔细胞培养板中。

1.3.2 MTT法检测细胞活性

MTT法的原理是活细胞中的线粒体脱氢酶将溴化3- (4, 5-二甲基-2噻唑基) -2, 5-二苯基-2H-四氮唑还原, 产生紫色结晶物, 用二甲基亚砜溶解, 其吸收值与活性细胞量成正比。

按照ISO10993.5标准中推荐的材料及浸提介质比例进行材料浸提制备, 其中浸提介质为RPMI1640细胞培养液。首先将HA/CNTs复合粉经高温高压消毒, 按照200mg/mL的粉体与介质比例浸泡在RPMI1640细胞培养液中, 于37℃保持72h, 然后在无菌条件下抽取材料的浸提液, 并按指数递减逐步稀释为200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL和6.25mg/mL备用。每种材料的实验均分3组:阴性对照组 (RPMI1640培养液组) 、材料浸提液组及空白组。选择培养48～72h生长旺盛的L-929小鼠成纤维细胞, 用含10%小牛血清的RPMI1640细胞培养液配制成6103个/mL的细胞悬液, 分注于96孔培养板中, 每孔加注1mL RPMI1640细胞培养液, 置于37℃恒温培养箱中培养, 使细胞单层贴壁生长。24h后, 弃去细胞培养原液, 加入0.5mL新鲜培养液和0.5mL材料浸提液, 阴性对照为1mL含10%小牛血清的新鲜培养液。继续在37℃恒温培养箱中分别培养24h、48h和72h, 然后经无菌磷酸盐缓冲溶液 (Phosphate bufer solution, PBS) 漂洗, 向每孔中加入100μL MTT溶液并于37℃培养4h;再用PBS漂洗一次, 加入100μL DMSO, 采用酶标仪 (DNM-9602, 北京普朗新技术有限公司) 在570nm波长下测定光密度 (Optical density, OD) 值。相对增殖率 (Relative growth rate, RGR) =试样OD值/阴性对照组OD值100%。根据不同时期各组RGR值采用5分制法进行细胞毒性分级 (CTS) , 观察材料作用的剂量效应。CTS 0级RGR≥100%, 1级RGR为75%～99%, 2级RGR为50%～74%, 3级RGR为25%～49%, 4级RGR为1%～24%, 5级RGR<1%。0级和1级被认为没有细胞毒性, 2级为轻度细胞毒性, 3级和4级为中度细胞毒性, 5级为明显细胞毒性。

1.3.3 细胞形态学观察

培养细胞用胰酶消化, RPMI1640血清终止, 用培养液及材料浸提液吹打成单细胞悬浮液传代, 然后分别于24h、48h、72h时在倒置显微镜下观察细胞形态及细胞贴壁情况。细胞形态分析标准: (1) 无毒, 细胞形态正常, 贴壁生长好, 细胞呈梭形或不规则三角形; (2) 轻度毒性, 细胞贴壁生长好, 但可见少数细胞圆缩, 偶见悬浮细胞; (3) 中度毒性, 细胞贴壁生长不佳, 细胞圆缩较多, 达1/3以上, 可见悬浮死细胞; (4) 重度毒性, 细胞基本不贴壁, 90%以上为悬浮死细胞。

2 结果与讨论

2.1 XRD分析

复合材料中羟基磷灰石的存在保证其具有良好的生物相容性, 碳纳米管的存在则可以提高基体的力学性能。图1为复合材料的XRD分析, 由图1可知, HA的特征峰全部出现, 说明复合材料中已经结晶生成HA。由于碳纳米管的特征峰与羟基磷灰石的衍射峰重合, 而且HA的衍射峰强度很高, 所以复合粉体的XRD图中并不能分辨出碳纳米管的衍射峰。对照复合粉体的TEM照片 (见图2) 可以观测到碳管的普遍存在, 因此在相应位置将其标出。

2.2 TEM分析

图2为原位合成法制备的HA/CNTs复合粉体的TEM照片。从图2中可以看出, 羟基磷灰石均匀吸附在碳管表面, 并与之形成较强的界面结合;粉体中HA为短棒状, 长约40～60nm, 直径约15～25nm。以该粉体为原料制备的复合材料理论上应具有较强的力学性能。

2.3 细胞增殖活性

根据有关文献, 当培养孔中细胞数量过多时, 培养72h后会形成细胞融合, 导致细胞总代谢率不变;当细胞数量过少时, 测试结果不稳定。因此, 每孔所选用的细胞数量原则上应以避免引起细胞融合为宜, 文献[11]表明, 通过测定L-929细胞的生长代谢曲线, 细胞数量选用6103个/孔为宜[11]。

表1是L-929细胞在HA/CNTs复合粉体浸提液中的毒性试验结果。由表1可知, 细胞在浸提液中培养不同时间后的相对增殖率无明显差异, 复合材料的毒性评级为0～1级, 即该复合材料对L-929细胞无毒性。

2.4 细胞形态观察

图3是复合材料浸提液培养不同时间后的细胞形态观察 (400倍) 。在倒置相差显微镜下观察实验组与对照组未见明显差异。24h后观察实验组发现细胞呈梭形、三角形, 贴壁生长良好, 细胞间有一定间隙 (见图3 (a) ) 。48h后细胞数量大增, 细胞间隙减小, 细胞突充分伸展, 可见多角形细胞, 细胞逐渐铺满视野;实验组及阴性对照组细胞形态、数量无明显差异 (见图3 (b) ) 。72h后细胞间隙消失, 细胞间排列紧密, 随时间延长, 细胞数量明显增加, 形态正常 (见图3 (c) ) 。根据细胞形态分析标准, HA/CNTs复合材料无细胞毒性。

3 结论

采用原位合成法成功制备出羟基磷灰石/碳纳米管复合粉体, 在该复合材料中纳米短棒状的羟基磷灰石均匀附着在碳纳米管表面并与之形成较强的界面结合。细胞形态分析表明, L-929细胞在该复合材料浸提液中培养不同时间后均正常增殖;MTT检测结果表明, 该复合材料毒性等级均在1级以下, 表明HA/CNTs复合材料具有良好的细胞相容性。本研究为HA/CNTs复合材料的基础研究和临床应用提供了生物学依据。

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纳米羟基灰石 第8篇

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ca (HO) 2、H2PO4、醋酸溶液均为分析纯, 80目的壳聚糖粉末 (脱乙酰度为90%, 购自济南海得贝生物工程有限公司) , 以及实验中所用的其它试剂均为分析纯。利用JEM2100CXⅡ型透射电镜 (JEOL公司, 日本) 进行晶粒观察, 应用Quanta-400扫描电镜进行形貌和孔隙率分析, 利用PHILIPS AUTOMATED X-RAY POWDER DIFFRACTOMETER SYSTEM APD-10测定HA/CS样品的X射线衍射谱。

1.2 纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的制备

(1) 多孔羟基磷灰石的合成。按照羟基磷灰石 (简称HA) 的化学计量比Ca/P = 1.67 称取合适量的Ca (OH) 2和H3PO4, 以过氧化氢为发泡剂, 并将Ca (OH) 2溶于乙二醇中配成5%的悬浮液, 得到A液, 备用。 (2) 羟基磷灰石/壳聚糖的合成。将磷酸稀释为10%的水溶液, 然后按照n-HA/CS 重量比分别为80/20、70/30、60/40、50/50、40/60、30/70的6种比例称取壳聚糖粉末, 并将其溶于2%醋酸水溶液, 连续搅拌5h, 过滤得到完全透明的3%壳聚糖溶液。将配好的磷酸溶液倾入壳聚糖溶液中, 充分搅拌, 得到B液。整个反应在室温下进行, 在剧烈搅拌下将B液缓慢滴入A液中, 该过程pH值保持在10左右, 滴加速度4mL/min。滴加完毕, 继续搅拌24h, 所得浆料室温下陈化1d。将沉淀过滤、洗涤, 于80℃真空烘干, 并研磨成粉。再分别在300℃、600℃、800℃马弗炉中煅烧2h后制成样品。

2 结果

2.1 TEM观察

n-HA 及n-HA/ CS 复合材料的透射电镜照片如图1所示。其中图1 (a) 是在室温条件下合成的n-HA的TEM照片, 图2 (b) 是共沉淀法合成的n-HA/CS复合材料的TEM照片。可以看出n-HA粉末呈纳米级的短棒状晶体, 其平均尺寸大约为10nm×30nm。这些n-HA颗粒具有较好的分散性, 表现出相对均匀的形貌。当加入壳聚糖后, 颗粒变得纤细, 并呈梭状, 但仍在纳米范围内, 平均尺寸大约20mm×80nm。可能是壳聚糖的加入加速了n-HA沿c轴 (002) 方向的生长。

2.2 XRD图谱

n-HA/CS不同比例复合材料的XRD图谱见图2。从图2a中可以观察到n-HA的各个特征衍射峰, 但这些峰都发生宽化, 表明合成的n-HA呈非化学计量的弱结晶状态。图2中在2θ=10°和20°处的两个峰是壳聚糖的两个特征衍射峰。复合材料图谱中 (图2b、c、d、e、f) 也都出现n-HA和壳聚糖的特征衍射峰, 但峰的强度都有不同程度的弱化, 这与二者的含量高低有关。

2.3 SEM观察

扫描电镜观察复合材料具有多孔结构 (图3a～b) , 孔径为100～500μm, 大多数孔径为400～500μm。材料孔内无HA晶体聚集, 孔壁上有大量细小的HA晶体连续、均匀分布, 犹如“铺路石”状紧密镶嵌在孔壁上 (图3b) 。材料具有很高的孔隙率, 而随着CS含量的增加, 支架的孔壁增厚, 孔隙率降低, 密度升高。

a:HA-CS 60:40 (×50) , b:HA-CS 50:50 (×50)

3 讨论

两相之间的相容性一直是无机-有机复合材料体系需要解决的首要问题。本文合成的各种比例的n-HA/CS复合材料中都没有相分离现象发生。SEM也证明, n-HA颗粒在复合材料中分散良好。在n-HA/CS复合材料体系中, 当壳聚糖含量较高时, 细小的n-HA颗粒以填充相均匀分散在连续有机基体中, 但随着壳聚糖含量下降, 有机相不足以将n-HA颗粒完全包裹, 仅作为粘结剂将无机粒子均匀地粘附在一起。

壳聚糖通过胺基与金属离子之间的相互作用可以形成壳聚糖-金属螯合物。在共沉淀过程中, 壳聚糖的瞬时沉积将n-HA微粒包裹在聚合物纤维之间。由于Ca2+与乙醇中-OH之间的螯合作用, 所以Ca (OH) 2在乙醇中的溶解度较之在水中的高, 而且乙醇的分散效果也较水的分散性能好, 因此, 本文选用乙醇做Ca (OH) 2的溶剂。TEM及XRD分析都表明, 共沉淀法合成的HA是类似于自然骨磷灰石的非化学计量的弱结晶含碳酸纳米晶体, 由于晶格缺陷, 该n-HA比高结晶度HA的溶解度高。因此, 当n-HA/CS复合材料植入体内后, 表面的n-HA微粒在生理介质作用下缓慢溶解, 使材料周围的Ca2+、P离子浓度局部升高;反过来, 这些n-HA颗粒又为Ca2+、P离子的沉积提供活性位点, 从而在材料表面形成一层类骨磷灰石。壳聚糖具有良好的生物降解特性, 当其作为组织工程支架植入体内后, 壳聚糖的降解为新骨的生长提供足够的空间, 直至完全被新骨替代。有研究证实壳聚糖还有促进磷灰石和方解石沉积的作用, 而且壳聚糖的表面是亲水性的, 有利于细胞的黏附、生长和分化[10,11], 所以n-HA/CS复合材料植入体内后将可以有效地促进骨的修复和重建。

本文通过共沉淀法合成了不同比例的n-HA/CS复合材料, 其中HA为弱结晶含碳酸的纳米晶体, 均匀分散在复合材料基体中。复合材料中两相间较强的相互作用赋予材料良好的力学性能, 该复合材料作为骨组织替代材料将具有很大的研究价值及应用潜力, 对植入体内后将会引导新骨的生长, 促进骨缺损的修复和愈合的进一步研究提供了理论研究。

摘要：目的:研究合理人工骨复合生物材料的制备及性能。方法:应用共沉淀法制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料, 并采用TEM、SEM、XRD等手段对材料晶相组成、微观结构、晶粒大小进行分析表征。结果:复合材料中的羟基磷灰石为类似于自然骨矿物相的弱结晶含碳酸纳米晶体, 并均匀分散于有机相壳聚糖中。结论:该复合材料可作为骨组织替代材料。

关键词：生物医学材料,纳米羟基磷灰石,壳聚糖,复合材料,共沉淀

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纳米羟基灰石 第9篇

为弥补以上非病毒载体的不足,基于纳米羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2,HAp)的基因载体研究越来越受关注。研究已证实:纳米HAp安全性高、生物相容性好,对正常细胞几乎没有毒性[6];纳米HAp可被细胞降解,降解时间与材料性能密切关联[7];通过尺度控制可实现物理靶向性;相对于病毒载体,纳米HAp无免疫原性,不会引起机体的免疫反应[8,9]。

纳米HAp用作药物载体或基因治疗载体已成为生物材料领域的研究热点之一,对拓宽非病毒载体的研究具有十分重要的意义。目前限制纳米HAp作为基因治疗载体的原因主要是转染效率低,提高转染效率是其关键问题。图1[10]为脂质体作为基因载体转染进细胞后的代谢过程,目前已证实多数非病毒载体包括纳米HAp,进入细胞后均具有类似的过程:当纳米HAp颗粒转染进入细胞后,部分HAp-DNA复合体进入细胞被溶酶体吞噬并降解,降低了纳米HAp颗粒转染效率[11,12]。纳米HAp的转染效率除与细胞有关外,还与HAp自身的理化性质(形貌、大小、晶型、表面电荷)密切关联,只有提高纳米HAp的转染效率并优化颗粒靶向性才能将其最终应用到临床。

纳米HAp携载治疗基因的抑癌效果研究已取得了积极成果,并且发现纳米HAp与部分抑癌基因如p53存在协同抑癌效应[13,14],然而纳米HAp较低的转染效率仍然是其达到理想抑癌效果的主要限制因素,因此寻找提高纳米HAp的转染效率的方法是目前研究的热点之一。

本文就纳米HAp用作基因载体转染细胞的研究现状以及影响其转染效率的因素做全面综述并对提高纳米HAp的靶向性的途径展开论述。

1 HAp-DNA的结合方式

目前制备HAp-DNA复合物有两种方法:一是在制备HAp的过程中将其与DNA以共沉淀方式形成HAp-DNA复合物;二是在制备纳米HAp后,通过纳米颗粒表面吸附DNA后形成HAp-DNA复合物。通过琼脂糖凝胶电泳和Z电位仪可以检测HAp负载DNA的效率。Bisht等[11]研究了上述两种方法对DNA的吸附能力,发现共沉淀方法合成的HAp-DNA复合物能有效抑制DNA酶对DNA的降解,而通过表面吸附的DNA则易被DNA酶分解。他们还发现在酸性条件下(pH=5.0)时,由于纳米HAp的分解,DNA能从HAp中释放出来;在碱性条件下(pH=8.0)时,HAp几乎没有分解,而DNA也不会从HAp中释放,如图2所示[11](其中:泳带1,Hind Ⅲ 酶切过的DNA;泳带2,pSVβgal DNA;泳带3-7,DNA在37℃释放0h、1h、2h、4h、24h的电泳结果)。

Xia等[15]在研究HAp结合DNA的过程时发现,将pDNA加入到纳米HAp悬液后涡旋10s,HAp能够充分负载pDNA。Wu等[16]在室温下,将1.43g/L pEGFPC2-NT3加入到等体积的表面呈正电性的HAp悬液中(1g/L),轻微充分摇匀,电泳发现HAp同样能够与DNA充分结合。HAp与DNA的结合能力与纳米HAp的形状、表面粗糙度及表面电荷密切关联。球形、面粗糙度大、表面带正电荷的纳米HAp颗粒会更加稳定地携载DNA。通过共沉淀方法制备的HAp-DNA复合物比较稳定,但结合DNA的量较少,且释放缓慢,另外具有复合物的溶液保存条件严格、时间短,制备步骤繁琐等不足。为便于临床应用,采用HAp先合成再携载DNA的方法更方便、经济、实用。

图2 DNA在pH 5.0(a)和pH 8.0(b)的溶液中的释放[11]Fig.2 DNA release at pH 5.0(a)and pH 8.0(b)shown by gel electrophoresis[11]

2 影响纳米HAp转染效率的因素

由于纳米HAp的转染效率较低,目前研究纳米HAp携载目的基因抑癌效果的研究尚少[13,17]。因此进一步研究影响纳米HAp转染效率的各种因素对HAp用于癌症基因治疗具有十分重要的理论意义。

2.1 表面电荷对纳米HAp转染效率的影响

纳米HAp载体的表面电荷是影响其转染效率最关键的因素。纳米HAp在偏中性(pH=7.4)溶液中重悬后表面呈负电性,当它携载目的基因转染细胞时,因与细胞表面负电荷[18]排斥作用,使纳米HAp的转染效率不高。多数研究表明,表面带有正电荷的纳米颗粒的转染效率明显高于表面带有负电荷或者不带电荷的纳米颗粒[19,20]。使颗粒表面带正电的方法主要是采用呈正电性的试剂对颗粒进行表面修饰,Chen等[16]采用PEI修饰纳米颗粒并使表面带有正电荷,研究发现,修饰过的基因载体的转染效率得到明显提高。Chen等[21]用12-氨基-十二烷酸对HAp颗粒表面进行带正电荷的表面修饰,研究发现,修饰后的纳米HAp表面电位明显提高(如图3所示,其中(a)12-氨基-十二烷酸,(b)酸性十二烷酸,(c)十二烷酸,(d)对照),用其转染成骨细胞,与带负电或中性电荷的纳米HAp相比,其转染效率明显提升,且修饰后的HAp能够明显促进成骨细胞的分裂增殖。

在纳米HAp的制备过程中添加辅助物质也可以对其表面改性,可改变纳米HAp的表面电荷并提高其转染效率。Chowdhury等[22]研究发现在制备碳酸磷灰石的过程中,添加锶和氟能够使其转染HeLa细胞的效率提高5~100 倍。Wang等[23]采用壳聚糖(CS)修饰纳米HAp表面,发现随着CS/HAp质量比的升高,其转染效率也逐渐升高。Nouri等[24]在含多种离子的模拟体液中合成了纳米磷酸钙颗粒,用其负载pEGFP/Luc后转染293T细胞,发现转染效率比在水溶液中制备的颗粒显著升高。Kimura等[25,26]利用超高静水压技术,制备了PVA/DNA颗粒,用其作为基因载体,然后采用高压方法将纳米HAp包封到PVA/DNA颗粒中制备成PVA/DNA/HAp颗粒,发现该颗粒能够有效地逃避溶酶体的降解,进入细胞核以提高转染效率。另外,表面改性的首要条件是保证改性后HAp良好的生物相容性,不同的表面修饰对细胞生物相容性、粘附性及诱导细胞凋亡的影响作用也明显不同[27]。

2.2 粒径尺寸对纳米HAp转染效率的影响

纳米HAp载体颗粒尺寸与形貌等因素与其转染效率密切相关[28],纳米HAp转染肿瘤细胞时,颗粒穿膜能力与粒径密切关联。Nadra等[29]制备了粒径为1.4~14μm的HAp颗粒并用其转染巨噬细胞,研究结果发现直径为1~2μm的HAp能够使巨噬细胞分泌TNFα的能力最强,而随颗粒粒径增大,巨噬细胞分泌的TNFα减少;当粒径增加到14μm时,细胞分泌的TNFα几乎为零,这是由于颗粒粒径太大,不能转染巨噬细胞引起的。该研究证实粒径对其转染效率具有重要的影响。

当颗粒粒径减小至纳米级(<100nm),尤其小于40nm时,颗粒进入细胞不再被受体介导的胞吞作用限制,而是由细胞直接吞噬,纳米颗粒的转染效率会明显提高[30]。尽管如此,不同颗粒与细胞间的作用呈现明显区别。Lin等[31]以SiO2为研究对象,研究发现直径为15nm和45nm的SiO2均对细胞有明显毒性,且毒性差异不大。Oberdürster等[32]研究表明具有相同尺度的超细TiO2颗粒则能引起严重的肺部炎症反应。这说明当上述两种颗粒的直径减小到纳米级时,转染效率会增加,对机体也产生较大毒性。然而纳米HAp在同样的尺度下对细胞却有良好的生物相容性。Cai等[33]制备了3种不同粒径的纳米HAp(粒径分别为20nm、40nm和80nm),研究发现不同粒径的纳米HAp对骨髓干细胞(MSCs)和骨肉瘤细胞(U2OS)的增殖作用存在明显差异,HAp能促进MSCs分裂而抑制U2OS的分裂,粒径为20nm的HAp效果最显著。该研究证实了纳米HAp能够促进正常细胞的增殖,而抑制癌细胞的增殖,HAp粒径越小对正常细胞生物相容性越好。

HAp的粒径对转染效率的研究虽还没有统一定论,但转染效率除与纳米载体自身的理化性质有关外,还与所转染的细胞类型有关。正常细胞具有一定的免疫功能,进入胞内的外来载体被细胞识别为“异物”,被溶酶体分解。然而癌细胞不能正确识别“自己”和“非己”,不能通过溶酶体完全分解进入胞内的“异物”颗粒,从而可使部分携载治疗性目的基因的载体进入细胞核。

2.3 形貌对纳米HAp转染效率的影响

纳米HAp载体颗粒的形貌包括HAp的形状和表面形貌。目前已报道的纳米HAp的形状主要有球形[34]、棒状[35,36]、针状[37]和纤维状[38]。根据Gao等[30]提出的受体介导的胞吞作用理论,直径为50~60nm球形纳米颗粒的转染效率最高。Zhao等[39]采用粒径40~60nm球形纳米HAp、棒状纳米HAp分别转染成骨细胞,结果表明球形HAp的转染效率显著高于棒状HAp。Motskin等[40]研究球形和棒状HAp转染人单核巨噬细胞时发现,棒状HAp的转染效率高达30%以上,而球形HAp的转染效率仅为2.7%。这些研究结果表明纳米HAp的转染效率与其形貌密切相关,当然同一形貌的纳米颗粒在转染不同的细胞时,其转染效率也会存在差异。

2.4 钙磷比对纳米HAp转染效率的影响

HAp-DNA转染效率主要受以上3个因素影响,已有研究表明改变HAp的钙磷比也可以提高转染效率。Olton等[41]调节Ca/P比例,当Ca/P的摩尔质量比为100~300时制备出颗粒粒径在25~50nm的HAp,携载DNA能够达到90%,转染MC3T3-E1和HeLa细胞的效率在70%以上。

3 纳米HAp的靶向性

纳米HAp载体具有一定的靶向性,然而其靶向性不高,是限制其用于癌症基因治疗的重要因素之一。研究提高纳米HAp靶向性的方法对其用作基因、药物载体的研究具有重要的价值。

Zhu等[42]制备长度为40~50nm的针状HAp,携载pEGFP-N1基因,通过尾部静脉注射到小鼠体内后,发现HAp颗粒主要分布在肝、肾、脑的细胞质内,少量分布在细胞核中。Roy等将HAp颗粒经尾部静脉注射进入小鼠体内后,发现HAp具有肝靶向性[43],并可通过肝脏代谢分解掉。蒋明等[44]利用HAp负载pEGFP-NT3基因,通过耳蜗灌注法,将基因转染进豚鼠损伤的耳蜗,结果在神经节细胞内检测到NT3 蛋白的表达对受损的耳有明显修复作用。Wu等[16]利用聚乙烯亚胺(PEI)修饰HAp颗粒,HAp负载pEG-FPC2-NT3后被注射到南美栗鼠的中耳与内耳之间圆窗膜,48h后检测荧光的表达量,发现在基底膜柱细胞中有荧光表达,表明经PEI修饰的HAp具有一定的靶向性。

改善载体颗粒的靶向性有两种方法:一种是采用癌细胞表面特异识别配体(如叶酸[45]、转铁蛋白[46]及(AspSer-Ser)6[47]等)对载体表面进行修饰,实现载体的主动靶向性。转铁蛋白受体在癌细胞表面大量分布,是临床检测评价体内是否有癌症存在的一种重要参数,Davis等[46]以此为靶标(图4为靶向纳米颗粒设计示意图),采用转铁蛋白修饰环糊精颗粒,携载siRNA治疗人急性黑色素瘤,注射到人体后检测发现载体能靶向转染黑色素瘤细胞。Zhang等[47]制备出一种(AspSerSer)6-脂质体载体,它与HAp具有高度亲和力,用其携载Plekho1siRNA,进入体内能靶向成骨细胞,并发现成骨细胞中Plekho1蛋白表达量快速下降至最终消失,成功解决了骨代谢疾病治疗的靶向性问题。另一方法是实现载体的被动靶向性,可通过控制纳米颗粒的粒径或合成过程中添加磁性元素(如Fe2+/Fe[48,49])。在人体中,肿瘤组织血管壁的细胞间隙为200~300nm,而正常组织血管壁的细胞间隙为100~200nm,当纳米HAp颈静脉注射后,可使纳米HAp通过细胞间隙扩散到周围组织中,实现对肿瘤的被动靶向性[50,51]。

4 展望