降解菌筛选论文

降解菌筛选论文（精选10篇）

降解菌筛选论文 第1篇

本工作从焦化厂活性污泥中筛选得到一株以吡啶为唯一碳源的高效降解菌,对该菌进行了生理生化和16S r DNA鉴定,并就其降解特性和降解动力学进行了研究,为吡啶的生物强化处理提供了基本理论依据。

1实验方法

1.1材料和仪器

实验所用化学试剂均为分析纯。

活性污泥:取自武汉平煤武钢联合焦化有限责任公司污水厂曝气池。

焦化废水:取自武钢联合焦化有限责任公司污水厂曝气池进水,COD约为4 800 mg/L,ρ(NH3-N) 约为200 mg/L,p H为6.5。

LB培养基:Na Cl 10.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母提取物5. 0 g,蒸馏水定容至1 000 m L,p H约为7.2。

吡啶-无机盐培养基:K2HPO40.5 g,KH2PO40.5 g,NH4C l 0 . 5 g , M g S O4·7H2O 0 . 2 g , Fe SO4·7H2O 0.02 g, Ca Cl20.02 g, Na Cl 0.1 g, 微量元素储备液2 m L,蒸馏水定容至1 000 m L, p H约为7。120 ℃、0.10~0.15 MPa高压灭菌后,加入一定量的吡啶作为唯一碳源。

平板培养基:在吡啶-无机盐培养基中加入质量分数为1.5%~2.0%的琼脂。

Mastercycle Gradient型PCR扩增仪:德国Eppendorf公司;1100 C型高效液相色谱仪:美国Agilent公司。

1.2菌株筛选

取2 m L活性污泥加入到已灭菌的100 m L LB培养基中,置于30 ℃、150 r/min恒温摇床富集培养24h。取2 m L富集后的菌液依次转接到100 m L质量浓度为100,200,300,400,500,600 mg/L的吡啶- 无机盐培养基中,于30 ℃、150 r/min恒温摇床培养10~12 h,以此来驯化吡啶降解菌。采用稀释平板涂布法分离单菌落,再用划线法分离纯化2~3次。 最后,将纯化得到的菌株分别用600 mg/L的吡啶- 无机盐培养基培养,检测各菌株对底物的降解能力,将降解能力最好的一株单菌选定为优势菌。

1.3菌种鉴定

将优势菌的培养液稀释涂布到平板培养基上,于37 ℃下培养24 h,观察菌落形貌。按照文献[9]报道的方法进行生理生化实验。提取该菌株的DNA［10］,进行16S r DNA PCR扩增,委托武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序。

1.4优势菌的降解特性

将优势菌的新鲜菌液按2%(φ)的接种量接入100 m L质量浓度为300 mg/L的吡啶-无机盐培养基中,考察降解温度、初始p H、摇床转速等条件对吡啶降解率的影响。

1.5优势菌的降解动力学

将优势菌的新鲜菌液按3%(φ)的接种量接入不同浓度的吡啶-无机盐培养基中,在最优条件下进行降解反应,间隔一定时间取样,测定培养液中剩余吡啶的质量浓度,并用反应动力学模型对优势菌的降解数据进行拟合。

1.6实际废水中吡啶的降解

将焦化废水用蒸馏水稀释至COD约为800mg/L,添加适量吡啶,使初始吡啶质量浓度为430mg/L。分别按以下4种方式加入优势菌:1)不加菌液和活性污泥(空白);2)3 m L菌液;3)3 m L活性污泥;4)3 m L菌液+3 m L活性污泥。在3℃、150 r/min的条件下,考察优势菌对焦化废水中吡啶的降解效果,以及菌种与污泥之间的相互作用。

1.7分析方法

采用高效液相色谱法测定吡啶含量［11］。

2结果与讨论

2.1优势菌的筛选与鉴定

经过分离纯化,得到7株能降解吡啶的菌株, 选取其中降解效果最好的一株B1作为优势菌,进行菌种鉴定。实验结果表明,菌株B1为革兰氏阴性菌,在LB培养基上菌落呈圆形,微凸,表面湿润光滑。对菌株B1进行16S r DNA测序,将测得的基因序列用Blast软件进行比对,数据分析结果表明,序列相关性与菌株B1达到99%甚至更高的菌种都是不动杆菌属(Acinetobacter sp.),因此可以推断菌株B1在分子生物学上可以归类于不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。菌株B1的系统发育树见图1。

2.2降解条件

2.2.1降解温度的影响

在初始p H为7、摇床转速160 r/min的条件下, 降解温度对剩余吡啶质量浓度的影响见图2。由图2可见:在降解反应开始的3 h内,不同温度下,吡啶的降解程度差别不大,可能原因是细菌在这段时间内处于调整期,外界环境温度的影响可以忽略不计;6 h后,菌株B1对吡啶的降解能力在不同温度下存在明显差异,25~30 ℃时,温度越高,菌株B1对吡啶的降解效果越好;30~40 ℃时降解效果显著下降,可能是由于温度过高使得微生物体内酶的活性受到抑制,阻碍了微生物的正常代谢;因此30℃是B1的最适宜降解温度。

降解温度/℃:●25;■30;▲35;◆40

2.2.2初始p H的影响

p H太小或太大都能使微生物酶的活性丧失, 影响细菌的正常生长代谢。在降解温度30 ℃、摇床转速160 r/min的条件下,初始p H对剩余吡啶质量浓度的影响见图3。由图3可见:初始p H为3和5时,吡啶的降解程度很低,说明菌株B1在酸性环境下生长受到了抑制;当初始p H为7~10时,反应18 h后,吡啶几乎被完全降解,说明菌株B1对p H的适应力较强,在中性或碱性环境下都能存活,可能是因为吡啶在降解过程中,发生氧化反应产生了戊二酸,酸性物质中和了碱性条件下的碱性物质。因此,菌株B1降解的最适初始p H为7。

2.2.3摇床转速的影响

在降解温度30 ℃、初始p H为7的条件下,摇床转速对剩余吡啶质量浓度的影响见图4。

初始p H:●3;■5;▲7;◆9;○10

摇床转速/(r·min-1):●100;■150;▲200;◆250

由图4可见:随降解时间的延长,不同摇床转速时吡啶的降解效果慢慢显露出差异;转速过高或过低都会有碍吡啶的降解效果,转速过低时,培养基中的溶解氧浓度降低,细菌的生长代谢放缓;摇床转速为150 r/min和200 r/min时,吡啶的降解曲线基本重合,且吡啶质量浓度较低,这是因为摇床转速为150 r/min时,培养基中的溶解氧基本达到饱和,再进一步增加摇床转速也不能提高溶解氧。综合考虑,选取150 r/min为最适摇床转速。

2.3菌株B1的降解动力学

不同初始质量浓度下吡啶的降解效果见图5。 由图5可见,剩余吡啶质量浓度(ρ)与降解时间(t) 的关系曲线近似为直线,说明菌株B1对吡啶的降解符合零级反应动力学方程。拟合得到的菌株B1降解吡啶的零级动力学方程见表1。由表1可见: 各初始吡啶质量浓度下得到的直线方程的相关系数均大于0.9;初始吡啶质量浓度为50~300 mg/L时,随初始吡啶质量浓度的增加,菌株B1对吡啶的降解速率常数逐步增大;当初始吡啶质量浓度为300 mg/L时,降解速率常数最大,达21.103 mg/ (L·h);当初始吡啶质量浓度大于400 mg/L时, 随初始吡啶质量浓度的增加,降解速率常数反而降低,这可能是因为底物浓度过高时,底物毒性超出了菌体承受能力范围,阻碍了菌体对底物的降解。

初始吡啶质量浓度/(mg·L-1):●50;■100;▲150;◆200;○300;□400;△500;◇800

2.4对焦化废水中吡啶的降解

菌株B1对焦化废水的处理效果见图6。由图6可见,在反应开始约30 h内,4种加菌方式的吡啶降解效果均不好,原因可能是焦化废水中污染物成分多、毒性较大,菌种适应期较长;在随后的40~54 h内,各加菌方式的降解效果逐渐拉开差距,以加菌方式4)的吡啶降解效果最好,在降解时间为54 h时剩余吡啶质量浓度即达到119.53 mg L。这是因为,菌株B1适应了环境,且菌株B1和活性污泥中的微生物可能经过协同效应共同代谢底物,加快了吡啶的降解。在降解时间为54~74时,加菌方式4)对吡啶几乎没有降解,这可能是因为在菌株B1和活性污泥中含有的其他菌种的协同作用下,废水中的有机物被大量去除,造成微生物碳源不足,使得吡啶降解率没有持续增大。 在降解时间为74 h时,加菌方式2)与4)的剩余吡啶质量浓度相同,达到110.7 mg/L,吡啶降解率为74.26%,说明菌株B1在单菌作用时即对吡啶有较好的降解效果。

加菌方式:●空白;■菌株B1;▲活性污泥;◆菌株B1+活性污泥

3结论

a)以吡啶作为唯一碳源,从焦化废水活性污泥中分离筛选得到一株吡啶降解优势菌B1,结合菌落形态、生理生化实验结果及16S r DNA测序对比结果,鉴定菌株B1为革兰氏阴性不动杆菌属(Acinetobacter sp.)细菌。

b)通过单因素实验得到菌株B1的最佳降解条件:降解温度30 ℃,初始p H为7,摇床转速150 r min。

c)菌株B1对吡啶的降解符合零级动力学方程。当初始吡啶质量浓度为300 mg/L时,菌株B1对吡啶的降解速率常数最大,达21.103 mg/(L·h)。

d)菌株B1能在初始吡啶质量浓度为430 mg/L的实际焦化废水中良好生长,反应74 h后的吡啶降解率达74.26%。

摘要：以吡啶为唯一碳源,从焦化厂活性污泥中分离得到一株对吡啶具有高效降解能力的菌株B1,对其进行了菌种鉴定。通过单因素实验研究了菌株B1适宜的降解条件,对反应过程进行了动力学拟合,并考察了菌株B1对焦化废水中吡啶的降解效果。实验结果表明:菌株B1为革兰氏阴性菌,属于不动杆菌属(Acinetobacter sp.);菌株B1适宜的降解条件为降解温度30℃、初始pH为7、摇床转速150 r/min;菌株B1对吡啶的降解过程符合零级反应动力学模型,当初始吡啶质量浓度为300 mg/L时,降解速率常数最高达到21.103 mg/(L·h);用菌株B1对初始吡啶质量浓度为430 mg/L的实际焦化废水处理74 h后,吡啶降解率可达74.26%。

降解菌筛选论文 第2篇

黄河水体多环芳烃降解菌的筛选及其降解性能研究

通过选择性培养,从黄河水体中分离纯化出3株能够以屈(Chr)和苯并[a]芘(B[a]P)为唯一碳源和能源进行生长的细菌HKS-1,HKS-2和HKS-3,采用16S rDNA序列分析,初步断定HKS-1为杆菌属或无芽孢杆菌属的一个种,HKS-2和HKS-3为芽孢杆菌菌株.微生物降解实验表明,Chr和B[a]P在前25d的降解符合零级动力学规律,3株细菌的混合菌群对Chr和B[a]P有良好的降解效果,泥沙的加入能够促进微生物数量的`增长,从而促进Chr和B[a]P的降解.当Chr和B[a]P的初始质量浓度ρ0分别为15.85和12.10 μg・L-1时,培养35 d后不含泥沙体系中chr和B[a]P的降解率分别为45.79%和37.36%;含泥沙体系中Chr和B[a]P的降解率分别为58.76%和51.69%.进一步采用膜实验对比研究了多环芳烃在水相和颗粒相的降解速率.结果表明,当用零级动力学对Chr和B[a]P的质量浓度(ρ)变化(最初4 d)进行拟合时,chr和B[a]P在颗粒相的降解速率分别约为其在水相降解速率的3和4倍.

作 者：王然 夏星辉 李恭臣 周追 WANG Ran XIA Xinghui LI Gongchen ZHOU Zhui 作者单位：北京师范大学环境学院水环境模拟国家重点实验室,北京师范大学环境学院,100875,北京刊 名：北京师范大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF BEIJING NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：45(3)分类号：P3关键词：多环芳烃降解菌 泥沙 黄河 PAHs-degrader sediment Yellow River

不同来源石油降解细菌的筛选鉴定 第3篇

【摘 要】从江苏油田的原油和四种不同来源的土壤中，用三种不同的培养液筛选得到41株细菌。对具有较强降解能力细菌的其中8株菌进行测序鉴定，初步确定属于芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、食碱杆菌属及无色杆菌属。

【关键词】石油；降解；细菌

石油及其加工品进入土壤，造成土壤的石油污染。微生物修复具有处理效果好，污染物残留量低，不产生二次污染，对环境影响很小，能够保持或改善植物生长的土壤环境等优点[1]。向污染土壤中投加环境适应性强、降解效能高的菌种或菌群是提高石油类污染物降解效率的重要手段[2]。

1.材料与方法

1.1菌种来源

（1）土样：江苏真武石油基地。①132#磕头机（久置未用）旁表层土；②185#磕头机（长期使用）旁表层土；③磕头机附近草地草根土；④计量站旁表层油污土。

（2）原油：江苏真武石油基地。

1.2富集培养基

（1）无机盐培养液（g/L）：NaNO32，K2HPO41，K2HPO4·3H2O0.5，NaCl0.5，MgSO4·7H2O0.1，CaCl20.01，FeSO4·7H2O0.01PH=7，石油烃（原油：柴油体积比1：4）1%

（2）牛肉膏蛋白胨培养液（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，PH=7，石油烃0.5%

（3）牛肉膏蛋白胨培养液，石油烃0.5%，表面活性剂50mg/L

1.3石油中细菌的培养分离

牛肉膏蛋白胨培养基冷却后，加入1%的原油混匀，倒平板。恒温培养箱中30℃静置培养。待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，划线纯化，将纯化菌株于试管斜面培养后于冰箱4℃保存。三个重复。

1.4土壤中石油烃降解菌的筛选

称取10g土样加入到装有100mL富集培养液的三角瓶中。30℃振荡培养7天。静置30min，取10mL上清夜转接入新鲜培养液中。重复上述步骤连续富集培养5次。

富集培养后，取菌液1mL梯度稀释成10-6、10-7、10-8，取三种不同稀释度菌液0.1mL涂布于分离培养基平板上，28℃恒温培养；待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，划线纯化，将纯化菌株于试管斜面培养后于冰箱4℃保存。三个重复。

1.5分离菌株的石油烃降解率测定

将所得菌株制成菌悬液（1.1～1.4×108个/ml），取1ml转接入10ml加了1%石油烃的无机盐培养液中，28℃摇床培养7d后，用重量法[3，4]测定降解率。以不接菌的培养基作对照。

1.6高效石油降解菌鉴定

1.6.1菌株DNA提取

选取降解率较高（大于40%）的纯菌株，30℃振荡培养过夜。取1ml培养液到Eppendorf管中，离心，8000r/min，5min，弃去上清液，倒扣Eppendorf管在干滤纸上，空干溶液。将菌体重新悬浮于50μL 超纯水，置旋涡混合器上旋转混匀3s。将Eppendorf管放在沸水浴中煮10min。取出Eppendorf管冰浴10min。如此反复冻融三次，冷却后迅速离心，12000r/min 8min。取上清液，-20℃保存备用 。

1.6.2菌株16SrDNA的PCR扩增

以DNA为模板，引物27F：5`-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3`和1492R：5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`；TACGACTT-3；总反应体系为50μL，10×Buffer 5μL，25mmol/L MgCl24μL，2.5mmol/LdNTP 4μL，反向引物与正向引物各1μL，Taq酶0.25μL （5U/μL），模板DNA 2.5μL，ddH2O补足至50μL；PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃继续延伸10min，4℃保存。

1.6.3菌株测序

扩增成功后，产物送上海生物工程有限公司进行测序。测序后，用Sequence Scanner v1.0软件进行序列分析，将有效序列到NCBI用Blast进行对比。

2.结果与分析

2.1细菌分离结果

从原油和不同培养时间土壤样品中总筛选到41株细菌，其中石油中筛选出2株，土壤中39株。

2.2降解率测定结果

对筛选得到的41株细菌，测定其对石油烃的降解率，降解率最低1%，降解率高于40%的有12株，菌株编号为5、10、13、14、17、21、23、28、47、48、49、51，降解率分别为54.4%、61.8%、63.2%、69.5%、57.4%、47.9%、44.1%、45.6%、77.9%、63.2%、76.5%，其中5#菌来源于原油。

2.3石油降解菌株的鉴定

将降解率大于40%的12株细菌送上海生物工程公司测序，其中21、47、48、49这4株菌扩增失败未测序。其余8株16SrDNA序列测定结果用SequenceScannerv1.0软件进行序列分析与GenBank中已发表的16SrDNA序列进行同源性比较，初步鉴定5#属于芽孢杆菌属（Lysinibacillussp.），10#属于短波单胞菌属（Brevundimonassp.），13#、17#、23#、28#属于假单胞菌属（Pseudomonassp.），14#属于食碱杆菌属（Alcanivoraxsp.），51#属于无色杆菌属（Achromobactersp.）。

3.结论

目前研究报道，能以烃类为唯一碳源和能源生长的微生物在自然界分布广泛，约有70个属（其中细菌28个属，真菌30个属），200多个种[5]。本研究从江苏扬州真武石油污染土壤中分离得到41株能利用石油的细菌，为石油污染土壤的微生物修复提供了新菌种资源；同时对其中降解率较高菌株进行了初步鉴定，确定菌属。

【参考文献】

[1]Aatry AR，Euis GM.Bioremediation：An effective remedied alternative for petroleum hydrocarbon contaminated soil[J].Environ.Prog，1992，11：312-318.

[2]袁红莉，杨金水，王占生.降解石油微生物菌种的筛选及降解特性[J].中国环境科学，2003，23（2）：157-161.

[3]谢丹平，尹华，彭辉，等.混合菌对石油的降解[J].应用与环境生物学报，2004，10（2）：210-214.

[4]污染源统一检测分析方法编写组.污染源统一检测分析方法（废水部分）[M].技术标准出版社，1983，135-136.

降解菌筛选论文 第4篇

微生物降解石油的活动主要在油-水界面进行, 油的乳化能极大地提高油的分散程度, 增加菌株和油滴接触的表面积, 促进微生物对石油烃的吸收、降解。生物表面活性剂 (Biosurfactants, 简称BS) 是由微生物在一定条件下代谢合成一种次级代谢产物, 其分子结构中同时存在极性亲水基和非极性疏水基, 能够显著降低水溶液的表面张力。其活性较高, 具有很好的亲水、亲油及界面优先分配的性能[2,3]。与化学表面活性剂相比, 其具有特异性强、高效、低毒、不污染环境以及生产成本低等优点。因而, 筛选和应用具有产生物表面活性剂能力的石油降解菌, 并通过对其乳化条件的研究来增强污染土壤中油的生物可利用性, 进而对石油污染土壤修复成为石油污染生物修复的重要课题。笔者从中原油田污染的土壤中筛选出一组能产生生物表面活性剂的石油降解菌, 并构建高效降解菌群, 以期为中原油田石油污染土壤的生物修复提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

随机多点采集中原油田长期被石油污染的0~20 cm土层, 去除样品中的杂物, 碾碎后混合均匀, 保存备用。石油为中原油田原油。

1.2 培养基

含油无机盐培养基组成:NH4NO31g/L、Mg SO47H2O 1 g/L、Na Cl 3 g/L、CaCl2H2O 0.2 g/L、KCl 0.5 g/L、KH2PO41g/L、K2HPO41 g/L、Fe Cl3 (痕量) 、石油5g/L、琼脂20 g, p H 7.2~7.5。LB培养基组成:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5g/L、Na Cl 10 g/L、琼脂20 g/L, p H 7.0。血平板培养基组成:牛肉膏3 g/L、酵母膏0.1 g/L、蛋白胨10 g/L、Na Cl 5 g/L、琼脂20 g/L, p H 7.4~7.6, 培养基灭菌后, 温度降至50℃左右, 按照5% (V/V) 的添加量加入无菌、新鲜的脱纤维羊血, 摇匀后倒平板。

1.3 生物表面活性剂产生菌的筛选

1.3.1菌株的富集与驯化

称取10 g石油污染土壤样品, 加入到100 ml以中原原油为唯一碳源的含油无机盐培养基中进行富集培养, 30℃、160r/min振荡培养72 h后, 以10% (V/V) 的接种量吸取培养液再次接种到含油无机盐培养基培养, 连续转接2~3次。取0.1 ml培养液涂布于含油无机盐培养基平板上, 分离得到能够以原油为唯一碳源的单菌落。将分离到的单菌落接种到LB培养基培养并保存。

1.3.2 菌株初筛

1.3.2. 1 溶血圈的测定

将菌株逐个点种到血平板培养基, 30℃培养2 d, 测定溶血圈直径 (D) 与菌落直径 (d) 的比值。

1.3.2.2排油圈的测定[4]

将菌株活化后接种到含油无机盐培养基中, 30℃、160 r/min振荡培养24 h, 将培养液于4℃下离心 (10 000 r/min, 20 min) 得到上清液。取一直径约9 cm的培养皿, 加入蒸馏水, 水面距皿底约1 cm, 水面上加入100μl原油形成油膜, 在油膜中心滴入10μl发酵液, 油膜被挤向周围形成排油圈, 形成稳定的排油圈后测定其直径, 3次重复。

1.3.3 菌株复筛将初筛菌株接种到含

油无机盐培养基中, 30℃、160 r/min振荡培养72 h, 将培养液于4℃下离心 (10 000 r/min, 20 min) 得到上清液, 测定上清液的乳化性能及表面张力。

1.3.3.1乳化性能的测定

在刻度比色管中加入5 ml上清液和5 ml原油, 用AS2060 B型超声波发生器处理30min, 使油水充分混匀形成白色的乳状液, 室温下静置24 h, 测定乳化液和油相的体积, 3次重复。乳化指数计算公式为乳化指数 (E24) = (乳化层体积/混合物总体积) 100%。

1.3.3. 2 表面张力测定方法[3,5]

采用圆环法, 在室温下用JYW-200A自动表面张力测定仪测定上清液的表面张力, 3次重复。

1.4 生物表面活性剂产生菌的鉴定

对复筛到的菌株进行菌落特征、菌体形态观察及生理生化反应的测定, 依据《常见细菌系统鉴定手册》[6]进行鉴定。

1.5 高效石油降解菌群的构建

将4株菌按比例组合, 构建不同的降解菌群。通过测定不同菌群对原油的降解率, 研究其降解能力。石油降解率的测定:将菌株在LB培养基中30℃、160 r/min振荡培养24 h得种子液, 按10% (V/V) 的接种量接种到含油无机盐培养基中, 振荡培养5 d, 石油含量采用重量法测定[7], 以不接菌的培养基作为空白对照 (CK) , 3次重复。石油降解率计算公式为石油降解率= (CK含油率-样品含油率) /CK含油率100%。

2 结果与分析

2.1 生物表面活性剂产生菌的筛选

2.1.1 菌株的分离与初筛

通过对石油污染土壤样品的富集培养、驯化, 分离到能够以中原原油为唯一碳源、长势较好的菌株12株, 分别命名为BS-1、BS-2、BS-3、BS-4、BS-5、BS-6、BS-7、BS-8、BS-9、BS-10、BS-11、BS-12。生物表面活性剂有降低表面张力的作用, 可使红细胞破裂造成溶血, 平板上出现溶血圈。将12株菌点种到血平板培养基上, 得到溶血圈直径与菌落直径的比值。由表1可知, 菌株BS-2、BS-3、BS-5、BS-8、BS-9、BS-12的溶血圈直径 (D) 与菌落直径 (d) 的比值较大。D/d比值大, 说明菌株产生表面活性剂的含量较高。另外, 菌株BS-2、BS-3、BS-5、BS-8、BS-9、BS-12的排油圈直径均大于5 cm。排油圈的直径大小与发酵液中表面活性剂含量成正比, 说明这些菌株具有较高的表面活性剂产量及活性[8], 因此选择这6株初筛菌株进行复筛。

2.1.2 菌株复筛

通过测定菌株上清液的乳化指数及表面张力, 复筛出乳化性能好、表面张力低的菌株。由表2可知, 菌株BS-2、BS-5、BS-8、BS-12具有较强的表面活性剂产生能力和乳化原油的能力。

2.2 生物表面活性剂产生菌的鉴定

对菌株BS-2、BS-5、BS-8、BS-12的菌落特征、形态特征及生理生化特性进行研究, 依据《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定。经鉴定, 菌株BS-2、BS-12为假单胞菌属 (Pseudomonas sp.) , BS-5、BS-8为芽孢杆菌属 (Bacillu sp.) 。

2.3 高效石油降解菌群的构建

将4株菌培养24 h后的发酵液以10%的总接种量接种到含油无机盐培养基中, 5 d后测定降解率, 研究不同菌群的降解能力。由表3可知, 菌株BS-2、BS-5、BS-8和BS-12按不同接种比例构建菌群的降解效果有一定的差异, 菌群6的降解效果最好, 降解率高达78.16%, 比4种单, 菌群的降解率分别提高了17.4%、12.24%、7.83%、16.11%。这可能是由于不同的降解菌株代谢底物不同, 菌株适当比例的组合具有相互促进降解的作用。

3结论

(1) 以中原原油为唯一碳源, 从石油污染土壤中分离到长势较好的12株菌。通过溶血活性和排油活性的测定, 初筛出6株溶血圈直径与菌落直径的比值较大、排油圈直径大于5 cm的菌株。对初筛的6株菌进行乳化指数和表面张力的测定, 复筛出4株乳化指数较高、表面张力较低的菌株:BS-2、BS-5、BS-8、BS-12。

(2) 对4株菌的菌落特征、形态特征及生理生化特性进行研究, 初步确定菌株BS-2和BS-12为假单胞菌属 (Pseudomonas sp.) , BS-5和BS-8为芽孢杆菌属 (Bacillus sp.) 。

(3) 将菌株BS-2、BS-5、BS-8和BS-12按不同比例组合构建菌群, 研究其石油降解能力。结果表明, 当4株菌以2∶3∶3∶2比例构建的菌群6的降解效果最好, 石油降解率高达78.16%。

摘要：[目的]筛选产生物表面活性剂石油降解菌, 并构建高效降解菌群。[方法]以中原原油为唯一碳源, 经富集培养, 从石油污染土壤中分离到12株菌;通过测定菌株的溶血活性、排油活性、乳化指数和表面张力, 筛选出具有较强的表面活性剂产生能力和乳化原油能力的菌株, 并对其形态特征和生理生化特性进行研究;再将这几株菌按不同比例组合构建菌群, 研究其石油降解能力。[结果]菌株BS-2、BS-5、BS-8、BS-12具有较强的表面活性剂产生能力和乳化原油能力, 初步确定BS-2和BS-12为假单胞菌属 (Pseudomonas sp.) , BS-5和BS-8为芽孢杆菌属 (Bacillus sp.) ;菌株BS-2、BS-5、BS-8、BS-12以2∶3∶3∶2比例组合构建的菌群6降解效果最佳, 石油降解率高达78.16%, 该菌群在石油污染土壤的生物修复中具有一定的开发潜力。[结论]该研究为石油污染土壤的生物修复提供了理论基础。

关键词：生物表面活性剂,石油降解菌,筛选与鉴定,菌群构建

参考文献

[1]刘五星, 骆永明, 滕应, 等.石油污染土壤的生态风险评价和生物修复Ⅰ一株具有乳化石油能力的细菌分离鉴定[J].土壤学报, 2006, 43 (3) :461-466.

[2]张林达, 刘红玉, 鲁双庆, 等.产表面活性剂菌株的筛选及其功能基因的初步定位[J].农业环境科学学报, 2005, 27 (6) :2265-2268.

[3]陆昕.产表面活性剂石油降解菌的选育及对陕北石油污染土壤生物修复的试验研究[D].西安:西北大学, 2010.

[4]YOUSSEF N H, DUNCAN K E, NAGLE D P, et al.Comparision of methods to detect biosurfactant production by diversemicroorganisms[J].MicrobiolMethods, 2004, 56:339-346.

[5]曹娟, 徐志辉, 李凌之, 等.产生物表面活性剂的石油降解菌Acinetobacter BHSN的研究[J].生态与农村环境学报, 2009, 25 (1) :73-78.

[6]东秀珠, 蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社, 2001.

[7]国家环保总局.水与废水监测分析方法[M].4版.北京:环境科学出版社, 2002.

降解菌筛选论文 第5篇

降解棉秆纤维素分解菌的筛选及其降解特性研究

从土壤中筛选到两株能降解棉秆的纤维素分解菌M59、F115,通过构建酶活曲线确定了发酵周期,并进一步检测了不同氮源、不同浓度对菌株降解棉秆酶活的影响.结果表明,M59和F115均能有效降解纤维素,在刚果红纤维素平板上形成的水解圈直径>0.5cm,降解滤纸的CMC酶活>7.8 U・ml-1,FPA酶活>3.9 U・ml-1;两菌株均能降解棉秆且维持较高的酶活(CMC酶活>7.0 U・ml-1,FPA酶活>2.5 U・ml-1,发酵周期均确定为10d;氮源及其浓度对两菌株降解棉秆的CMC酶活和FPA酶活影响显著,以0.5%的酵母粉、蛋白胨作氮源,菌株M59的.CMC酶活和FPA酶活、F115的CMC酶活均最高,可确定0.5%酵母粉、蛋白胨为两株纤维素分解菌较适宜的氮源.

作 者：张琴 李艳宾 岳耀峰 龚明福 Zhang Qin Li Yanbin YueYaofeng Gong Mingfu  作者单位：张琴,李艳宾,龚明福,Zhang Qin,Li Yanbin,Gong Mingfu(塔里木大学生命科学学院,新疆,阿拉尔,843300;新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆,阿拉尔,843300)

岳耀峰,YueYaofeng(塔里木大学生命科学学院,新疆,阿拉尔,843300)

刊 名：塔里木大学学报 英文刊名：JOURNAL OF TARIM UNIVERSITY 年，卷(期)：2009 21(2) 分类号：Q-9 关键词：棉秆   纤维素分解菌   筛选   降解   酶活  

降解菌筛选论文 第6篇

改革开放以来, 国家经济飞速发展, 人们生活水平的不断提高, 纺织品的产量有了飞跃性的增长, 质量也有了大幅度的提升。随着科技水平的进步, 新近研究和开发的染料正朝着抗光解、抗氧化和抗生物降解的方向发展。染料的这些优点也导致了对印染废水的处理难度越来越大[1]。

纺织印染行业废水具有废水量大、水质情况复杂、污染物组分含量高, 色度、化学需氧量 (COD) 和生化需氧量 (BOD) 都比较高等特点。印染废水若不经处理或未达标排放, 不仅会对人们的身体健康有着直接的危害, 而且对水环境、土壤环境及其附属的生态系统也将造成严重的威胁和破坏。所以, 印染废水成为国内外最难处理的工业废水之一, 从事水处理研究的技术人员也对其越来越重视[2]。

2 印染废水的处理方法

目前, 印染废水处理方法主要有三种:

2.1 物理法

印染废水物理处理的方法主要是吸附脱色法。吸附脱色技术是依靠吸附剂的吸附作用来脱除染料分子的。现阶段, 该技术的发展方向主要体现在两个方面: (1) 开发寻找新的吸附剂; (2) 对已开发的吸附剂进行优化和改性[3,4,5]。

2.2 化学法

印染废水化学处理的方法主要有序凝处理法, 化学氧化法和电化学法[6]。

2.3 生物法

目前, 国内对印染废水的处理方法以好氧生物处理法为主。由于采用生物法处理废水时, 色度去除率比较低, 所以当对尾水的色度有指标要求时, 就需要增加物理或化学的处理方法。

本次试验的目的是印染废水高效脱色降解菌的分离、筛选、鉴定, 所处理废水采用上海某纺织厂印染废水, 菌群采集自上海某污水处理厂二沉池污泥。本试验采用两种培养基, 一种添加印染废水, 并降低细菌营养成分, 此培养基用于分离优势菌种;一种采用普通培养基, 用于富集增殖所分离菌种。两种培养基交替使用, 多次分离菌群后, 最终得到优势菌种。

3 比较实验

通过Spectrumlab-22型分光光度计对空白培养基对未加入染料培养基空白对照、五组平行实验以及加入染料培养基空白对照并稀释二倍的测定, 结果如表1。

经过计算

平行实验说明该菌种对于染料的脱色效果比较稳定, 同时, 去除率的计算说明这种细菌对于染料培养基中的染料脱色效果良好。

4 菌种鉴定

菌种经两轮多聚酶链式反应 (PCR) 扩增后, 产物送由上海市疾病控制中心纯化并测序。测序结果为:G G A A T G CTGATCCGCGCATACTAGTTGAT T C C…鉴定结果该菌种属于芽孢杆菌纲 (Bacilli) 芽孢杆菌目 (Bacillales) 类芽孢杆菌科 (Paenibacillaceae) 短芽孢菌属 (Brevibacillus)

Brevibacillus agri

Brevibacillus parabrevis

Brevibacillus sp.R-12868

参考文献

[1]张林生, 蒋岚岚.染料废水的脱色方法.化工环保, 2000, 20 (1) :14～18

[2]戴日成, 张统, 郭茜, 曹健舞, 蒋勇.印染废水水质特征及处理技术综述.工业b给排水:45-50

[3]马志毅, 张国洪.处理染色废水专用活性炭研究.环境科学学报, 1997, 17 (3) :328～333

[4]张建英, 梁缘东, 陈曙光等.染色废水吸附混凝效应研究.环境污染与防治, 1998, 20 (3) :9～12

[5]王萍.印染废水处理方法的研究进展.化工环保, 1997, 17 (5) :273～276

一株荧蒽降解菌的筛选及其特性研究 第7篇

近几年来, 渤海湾周边地区经济迅速发展的同时, 也带来了严重的环境问题, 其中一些污染物已经超出了本地环境自身的调节能力, 对生态系统健康构成一定的威胁, 阻碍了渤海湾经济的健康可持续发展。PAHs是渤海湾潮间带沉积物中的主要污染物之一, 且沿岸区含量较高[7], 其中含4个苯环的荧蒽是主要的PAHs污染物之一[8]。渤海湾潮间带中高浓度的荧蒽可能会引起本地微生物菌株发生突变而形成可以高效降解荧蒽的菌体。因此, 我们从受PAHs污染严重的天津新港区潮间带采集表层沉积物以多环芳烃荧蒽为唯一能源和碳源, 筛选优势降解菌株, 并对其生理生化特性、生长特征和降解效能等进行了系统研究, 以期为以后的生物原位修复提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌种来源和培养基

1.1.1 样品来源

从天津新港区潮间带采集表层沉积物, 放于经紫外消毒过的自封袋中, 4℃保存待用。

1.1.2 培养基

营养培养基 (g/L) :葡萄糖10, 牛肉膏3, 蛋白胨5。

无机盐培养基 (g/L) :硝酸铵1.0;磷酸氢二钾0.5;磷酸二氢钾0.5;七水硫酸镁0.5;氯化钠1.0;氯化钙0.1;三氯化铁0.02;酵母膏0.05;pH值7.0～7.2。固体培养基中加入2%琼脂。用丙酮配置20 mg/mL荧蒽母液, 0.22 μm滤膜除菌, 加入灭菌无机盐培养基中作为唯一碳源。

1.2 荧蒽降解菌的筛选、纯化

称取5 g沉积物样品, 放入盛有100 mL荧蒽无机盐液体培养基的250 mL三角瓶中, 放到摇床上30℃、150 r/min避光富集培养, 5天后直接转移10 mL培养液至另一新的含荧蒽无机盐培养基中, 之后采用逐步提高荧蒽浓度的方法 (最终为100 mg/L) , 转移5次后获得富集培养物。

将富集培养物经系列稀释后, 在含荧蒽的固体培养基上反复划线分离, 于恒温培养箱中28℃避光倒置培养, 直至平板上出现单个菌落, 挑选生长最好的优势菌落 (命名为Y1) 进行进一步的研究。

1.3 形态观察

1.3.1 显微镜观察

采用光学显微镜 (Olympus) 进行革兰氏染色, 观察菌体形态。

1.3.2 扫描电镜观察

在无菌条件下挑取适量菌体立刻用以pH值7.4磷酸缓冲液配制的2.5%戊二醛固定, 1%锇酸后固定, 然后经过乙醇系列脱水、常规临界点干燥、样品粘贴和真空镀膜后, 在扫面电镜下观察。

1.4 菌株生理生化指标的测定

对菌株进行系列生理生化特性试验, 主要包括甲基红 (M.R.) 试验、乙酰甲基醇 (V.P.) 试验、淀粉水解试验、过氧化氢酶试验、柠檬酸盐试验、明胶液化试验、硫化氢试验以及吲哚试验等, 每组两个平行。

1.5 环境条件对菌株生长的影响

1.5.1 温度对菌株生长的影响

将所筛选菌株活化24 h后, 接种于营养培养液中, 分别在4℃、20℃、28℃、30℃、37℃和45℃的温度下培养24 h, 用722分光光度计测定波长600 nm时的光密度值 (OD600) , 每组两个平行。

1.5.2 pH值对菌株生长的影响

用1 mol/L的氢氧化钠和1 mol/L的盐酸将营养培养基的pH值分别调至4、5、6、7、8和10。将待测菌株活化24 h后接入上述培养液中, 28℃培养24 h, 用722分光光度计测定不同pH值条件下菌悬液的OD600值, 每组两个平行。

1.5.3 盐度对菌株生长的影响

将菌株活化24 h后, 分别接种于含0、1%、2%、3%、5%、8%和10%氯化钠 (NaCl) 的营养培养基中, 28℃下培养24 h, 用722分光光度计测定盐度下菌悬液的OD600值, 每组两个平行。

1.6 对抗生素和重金属的抗性实验

取0.1 mL制备好的菌悬液接种于固体培养基中, 用无菌玻璃刮涂抹均匀, 将灭菌滤纸浸入供试试剂中, 用无菌镊子夹取浸药滤纸片 (提前将滤纸沥干) , 分别平铺于含菌体平板上, 并做好记号, 28℃下培养72 h后, 观察滤纸片周围有无抑菌圈产生, 每组两个平行。

选择5种常用抗生素进行敏感试验, 其浓度为:卡那霉素, 10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L;氨苄青霉素, 100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L;链霉素, 10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L;四环素, 10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L;利福平, 10 mg/L、60 mg/L和100 mg/L。

金属离子及其浓度如下:镉 (Cr6+) , 10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L;锌 (Zn2+) , 100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L;铅 (Pb2+) , 100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L;铜 (Cu2+) , 10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L;铬 (Cd2+) , 20 mg/L、50 mg/L和100 mg/L。

1.7 菌株DNA的提取和PCR扩增

挑取适量菌株于100 μL无菌去离子水中, 采用水煮法快速提取细菌基因组DNA, 离心取上清液作为PCR扩增的待用模版, 用于16 S rDNA基因的扩增。所用引物为27 F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) 和1 492 r (5’-GGC TACCTTGTTACGACTT-3’) , 反应条件为94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1 min 30 s, 30个循环, 最后72℃延伸10 min。琼脂糖电泳检测, 将纯的样品送至上海英俊公司回收并测序。将16 S rDNA的测序结果输入基因库 (GenBank) 中进行序列比对。

1.8 降解效能的测定

将菌株在液体营养培养基中活化24 h后, 取0.6 mL菌液至装有12 mL无机盐液体培养基的三角瓶中, 然后加入12 μL荧蒽母液, 采用液相色谱 (HPLC) 测定培养瓶中荧蒽初始浓度。然后将3个平行样品放在150 r/min、28℃振荡培养箱中培养。10天后, 采用液相色谱 (HPLC) 测定培养液中荧蒽浓度的变化。

1.9 菌株蛋白质含量和GST酶活性的测定

菌株蛋白质采用考马斯亮兰法测定;GST酶活性采用GST酶试剂盒测定 (南京建成生物工程研究所) , 该试剂盒是通过检测GSH浓度的高低来反应GST活力的大小, GSH (底物) 浓度越低则GST活力越大。

2 结果

2.1 菌株的形态特征和生理生化指标

菌株Y1为革兰氏阴性菌, 在固体营养培养基上菌株淡黄色、圆形、不透明和边缘规则;在以荧蒽为唯一碳源的固体无机盐培养基上菌株呈白色、半透明和边缘规则。在扫描电镜下菌体细胞为杆状 (图1) , 其部分生理生化特征见表1。

注:+为阳性反应;-为阴性反应.

2.2 环境条件对菌株生长的影响

(1) 温度对菌株生长的影响。

由图2可知, 菌株Y1在不大于20℃和不小于37℃条件下生长较差, 而在25℃～28℃范围内生长最好。

(2) 盐度对菌株生长的影响。

由图3可见, 随着盐度的增加, 菌株Y1生长状况逐渐变差, 在NaCl浓度为1%时, 生长较差;当NaCl浓度达到3%时细菌几乎不能生长。因此菌株Y1在小于1%NaCl的低盐度环境下生长较好。

(3) pH值对菌株生长的影响。

图4表明, 菌株Y1在pH值小于5和pH值大于9的条件下几乎不能生长, 而在pH值6～8范围内生长良好, 其中在pH值6～7之间生长最好。

2.3 菌株对抗生素和重金属的抗性

2.3.1 抗生素试验

菌株Y1对5种常见抗生素的敏感试验结果发现:在卡那霉素 (10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L) 、链霉素 (10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L) 、氨苄青霉素 (100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L) 和利福平 (10 mg/L、60 mg/L、100 mg/L) 4种抗生素的各个浓度都没有出现抑菌圈, 说明该菌株对这4种抗生素具一定抗性;四环素 (10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L) 各个浓度都出现了抑菌圈, 说明菌株对这种抗生素比较敏感。

2.3.2 重金属试验

菌株Y1对5重金属离子抗性实验结果说明: Zn2+ (100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L) 、Cu2+ (10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L) 、Cd2+ (10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L) 和Pb2+ (100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L) 4种金属测定的浓度中都没有抑菌圈出现, 说明该菌株对这4种离子有耐受性;在Cr6+试验中, 浓度为10 mg/L时没有抑菌圈出现, 但在浓度升至20 mg/L和50 mg/L的试验时出现了抑菌圈, 说明菌株Y1对低浓度的Cr6+ 有抗性, 但对高浓度的Cr6+ 很敏感。

2.416 S rDNA基因的扩增和序列分析

利用细菌16 S rDNA引物27 f和1 492 r进行扩增, 获得1 500 bp左右大小的PCR产物, 符合预期产物长度, 纯化产物并且测定产物的序列, 将测序结果输入GenBank中进行BLAST比对, 发现该菌株与Sediminibacterium sp.的同源性为95%。

2.5 菌株对荧蒽的降解率试验

试验结果如表2所示, 3个平行样品经过10天培养后荧蒽浓度分别降低了16%、14%和18%。

2.6 荧蒽对菌株Y1蛋白质含量和GST酶活性的影响

取活化24 h后的菌液分别接种到营养液体培养基和以荧蒽为唯一碳源的无机培养基中, 培养3 d后, 取适量菌液, 超声波破碎后进行菌体蛋白质含量和GST酶活性的测定, 结果如表3所示。由表3可见, 经荧蒽诱导培养后, 其菌体蛋白质含量和GST酶活性都明显提高。

3 讨论与结论

从受污环境中分离、筛选出高效降解菌株, 是生物修复受污环境的第一步, 也是关键的一步[9], 了解其生物学特性是利用降解性微生物进行原位修复的必要理论基础。笔者从天津新港区渤海湾潮间带筛选出一株具有降解多环芳烃荧蒽能力的土著优势菌株, 并对其生长和降解特性进行了研究。环境条件对菌株生长的影响为摸索菌株的培养条件及其在环境中的适应性提供实践依据。笔者所筛选菌株Y1, 在小于1%NaCl、25℃～28℃和pH值6～8生长最好, 同时对常见抗生素和重金属都具一定抗性, 10天内对荧蒽的降解率在14%～18%。天津新港高潮带盐度较低, pH值一般在7～8之间, 因此初步认为本次所筛选荧蒽降解菌株Y1较适合在春末夏初和秋季 (25℃～28℃) 用于天津新港潮间带多环芳烃污染的微生物原位修复, 但其在自然环境中的生长状况和降解效能仍待于进一步研究。

rRNA广泛存在于真核和原核生物中, 功能稳定, 由高度保守区和可变区组成。将待测菌株提取其遗传物质, 经测序、BLAST比对, 并结合其生理生化特征, 对菌株加以鉴定是目前应用最为普遍的鉴定方法。笔者在对所筛选菌株进行一系列生理生化试验基础上, 采用16 S rRNA同源性序列分析方法鉴定所筛选菌株的种类。16 S rRNA大小为1 500 bp左右, 所代表的信息量能反映生物界的进化关系。笔者采用27 f和1 492 r引物对扩增所提取菌株总DNA, 经过克隆测序, 将序列正确拼接后获得1 620 bp的遗传序列, 经BLAST比对后菌株被鉴定为Sediminibacterium sp., 归属于鞘脂杆菌纲 (Sphingobacteria) 。为进一步确定菌株Y1对荧蒽的降解能力, 我们测定了10天内该菌株对荧蒽的降解效能。采用高效液相色谱 (HPLC) 测定荧蒽浓度的变化, 结果证实菌株Y1对荧蒽有较高的降解能力。另外, 研究表明:在PAHs降解过程中, 谷胱甘肽转移酶 (GST) 在其中起着重要的作用, 曾有人将GST酶作为PAH降解菌存在的分子探针[10,11]。笔者对菌株Y1的蛋白含量和GST酶活性进行了检测, 结果发现在培养基中加入荧蒽后, 菌体的蛋白含量和GST酶活性明显提高, 表明菌体产生了大量与降解多环芳烃相关的蛋白和酶类。

摘要：从天津新港潮间带沉积物中筛选出一株能以荧蒽为唯一碳源和能源且生长良好的菌株Y1, 并对菌株特性进行了系统研究。实验结果发现菌株Y1为革兰氏阴性菌, 适合在低盐度 (<1%氯化钠) 的环境中生长, 最适pH值为6～7, 最适的生长温度为25℃～28℃。该菌株对锌、铅、铜、铬和低浓度的镉均有抗性, 但对高浓度的镉十分敏感;菌株Y1对常见抗生素卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素和利福平具一定抗性, 但对四环素较敏感。通过对菌株Y1的16SrDNA测序和序列比对, 并结合其生理生化特性确定其为Sediminibacteriumsp., 归属于鞘脂杆菌纲 (Sphingobacteria) 。Y1在10天内对荧蒽的降解率为14%, 且GST酶在Y1降解荧蒽的过程中起着重要的作用。

关键词：微生物降解,多环芳烃,潮间带

参考文献

[1]毛键, 骆永明, 腾应, 等.一株高分子量多环芳烃降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究[J].微生物通报, 2008, 35 (7) :1011-1015.

[2]周宏伟, 吴锦雅.不同富集方法分离多环芳烃降解菌的比较研究[J].现代生物学进展, 7 (9) :1308-1312.

[3]韩清鹏, 方昉, 秦利峰, 等.多环芳烃降解菌的获得及应用[J].应用与环境生物学报, 2003, 9 (6) :639-641.

[4]王春明, 李大平, 刘世贵.4株多环芳烃降解菌的分离鉴定[J].应用与环境生物学报, 2007, 13 (4) :546-550.

[5]温洪宇, 廖银章, 李旭东.微生物降解多环芳烃的研究进展[J].微生物学杂志, 2005, 25 (6) :73-75.

[6]房妮, 俱国鹏.多环芳烃污染土壤的微生物修复研究进展[J].安徽农业科学, 2006, 34 (7) :1425-1426.

[7]张蓬.渤黄海沉积物中的多环芳烃和多氯联苯及其与生态环境的耦合解析[D].青岛:中科院海洋研究所, 2009.

[8]聂利红, 刘宪斌, 降升平, 等.天津高沙岭潮间带表层沉积物中多环芳烃的分布及风险评价[J].矿物岩石, 2008, 28 (2) :113-117.

[9]周启星.污染土壤修复的技术再造与展望[J].环境污染治理技术与设备, 2002 (3) :36-40.

[10]LLOYD-JONES G, LAU P C.Glutathione S-transferase-encoding gene as a potential probe for environmental bacteria isolates capable of degrading polycyclic aromatic hydrocarbons[J].Appl Environ Microbiol, 1997, 63 (8) :3286-3290.

降解菌筛选论文 第8篇

利用生物或生物制品来降解环境中残留的高浓度农药的生物修复方法具有无毒、无残留、无二次污染等优点,是一种安全、有效、廉价的方法[2]。微生物具有种类多、变异快和易于操纵的特点,是生物修复的重要生物资源[3,4,5]。据美国市场预测,在今后若干年中,市场对微生物降解技术服务及其产品的需求年平均增长率为15%,而实际市场的需求可能远远超过这一预测结果。

该研究从多年喷洒硫丹的茶园土壤中分离、鉴定一株硫丹高效降解菌H082,并发现其对多种植物病原菌有一定的抑制性能,是具有较好开发前景的微生物资源,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药品、土样与病原菌:

35%硫丹乳油(拜耳公司生产),α-硫丹和β-硫丹标准品(Augsburg-Germany),有机溶剂为乙腈、丙酮(色谱纯,TEDIA)。土样从杭州郊区多年使用硫丹的茶园中采集。供试病原菌由实验室保存。

1.1.2 仪器。

高效液相色谱仪为1525EF(美国WATERS公司),色谱柱为SunFire Prep C18(4.6 mm250 mm5μm)。

1.1.3 培养基。

NSM培养液:K2HPO40.225 g,KH2PO40.225 g,NH4Cl 0.225 g,MgCl20.845 g,CaCO30.005 g,FeCl24H2O 0.005g,D-葡萄糖1.0 g,微量元素1 mL,水1 000 mL(加20 g琼脂制NSM平板)。

微量元素配方:MnCl24H2O 0.198 g,ZnCl20.136 g,CuCl22H2O 0.171 g,CoCl26H2O 0.171 g,NiCl26H2O 0.024 g,水1 000mL。富集培养基(PDA):马铃薯(去皮)200 g,蔗糖20 g,水1 000 mL,pH值自然。

1.2 试验方法

1.2.1 硫丹降解真菌的富集与分离。

采用富集培养法筛选能以硫丹作为唯一的硫源生长的真菌[6]。称取5 g土样,置于100 mL富集培养液中,28℃下150 r/min振荡培养24 h。将培养液过滤后涂平皿,挑取单菌落。

将NSM培养液于121℃灭菌20 min后冷却至室温,取适量α-硫丹和β-硫丹标准品用丙酮溶解后,加入NSM中,使其最终浓度为100 mg/L,并放置直至丙酮挥发,制成NSM/硫丹培养液(下同)。将纯化的单菌落分别接入NSM/硫丹培养液中,28℃下150 r/min振荡培养7 d后,吸取其中0.1 mL培养液加入到新鲜配制的10 mL NSM/硫丹培养液中,进一步振荡培养15 d,制得硫丹降解真菌富集培养液。

1.2.2 硫丹降解真菌的筛选。

用平板稀释法将0.5 mL上述富集培养液涂布到含有100 mg/L硫丹的NSM平板,根据菌株在该平板上形成菌落的大小、生长情况进行初步筛选。挑取在平板上产生的较大单菌落转至NSM/硫丹平皿,重复3次,直至分离获得纯化的菌株。挑取单菌落,斜面保存。

1.2.3 硫丹降解率的测定。

用直径7 mm的打孔器从新鲜培养的菌落边缘打取菌丝块,接入50 mL NSM/硫丹培养液中,28℃下150 r/min振荡培养7 d,重复3次。取5 mL培养液加入等体积的乙氰,28℃下150 r/min振荡1 h,然后用0.2μm针头式滤器过滤。所得滤液用HPLC分析,流动相为乙腈∶水=65∶35(V/V),检测波长为212 nm,进样量为10μL。

1.2.4 种类鉴定。

观察菌落形态,结合插片培养法,在显微镜下观察孢子形态、产孢形态等培养性状,按Gams and Bissett(1998)修订的木霉种群分类系统进行菌种鉴定。

1.2.5 抗菌谱测定。

用直径7 mm的打孔器从新鲜病原菌菌落边缘打取菌丝块,接种在PDA平板中间,同时在该病原菌周围放置同样大小的降解菌菌丝块,两者相距4 cm。以病原菌单独培养作为空白对照,每个处理设置3个重复。28℃恒温培养,采用十字交叉法测量对峙培养和对照中病原真菌菌落直径,计算抑菌率。

2 结果与分析

2.1 菌株H082的降解性能

采用富集培养法从土壤中筛选到5株在以硫丹为唯一硫源的液体无机盐培养基中生长的真菌,其中菌株H082长势最好,培养4 d后菌落直径为2.6 cm。液相色谱测定结果表明,H082对100 mg/Lα-硫丹和β-硫丹的降解率分别达到95.52%和98.24%(图1)。

2.2 菌株H082的种类鉴定

在PDA平板上,菌落初呈白色绒状,后期出现轮状的菌丝密实产孢区,颜色为绿色至深绿色。菌丝纤细无色,具分隔,多分枝。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出,呈环状排列,具几次重复分枝,着生分生孢子的小梗瓶形。分生孢子呈球形,绿色或蓝绿色,表面有刺,大小为2.6～4.5μm。初步判断H082为绿色木霉(Trichoderma viride)。

2.3 菌株H082的抗菌谱

对蔬菜、粮食等作物上的常见病原菌的平板对峙测定结果表明,菌株H082具有较为广谱的抑菌效果,表现出竞争、抗生及寄生作用,测定的抑菌谱如表1所示。

注:+++:抑菌率80%以上;++:抑菌率50%～80%;+:抑菌率20%～50%。

3 讨论

大量的研究表明,从长期使用某种农药的土壤中分离相应的降解菌是一种有效的土壤修复方法。从长期使用硫丹的土壤中,经过富集培养分离硫丹降解菌。研究表明,在靶标物选择培养基上培养,菌落最大的菌株具有最好的降解潜力,H082硫丹选择培养基上菌落最大。因此,选择该菌株作进一步的研究。

菌株H082经形态学观察,初步将其鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride)。经过对H082降解性能的研究,发现其对硫丹2种异构体的降解率均在95%以上,是一株对硫丹农药具有较强降解能力的菌株。迄今为止,报道的硫丹降解菌包括细菌和真菌共12个属,尚无木霉属菌株降解硫丹的报道。研究表明,菌株H082对多种植物病原真菌有拮抗作用,尤其对辣椒枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌,平板对峙抑制率为80%以上。因此,H082是一类多功能菌株,有较好的开发前景。

硫丹是一类有机氯杀虫剂,H082是否对除了硫丹外的其他有机氯农药有降解作用,尚待进一步的研究。如能拓宽其应用范围,则其应用价值将更为广泛,值得进一步展开研究。

摘要：从土壤中分离到一株能以硫丹为唯一硫源生长的真菌H082,通过形态学观察初步鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride)。采用高效液相色谱法测定了H082对硫丹的降解性能,并明确了其抗菌谱。结果表明:H082在7 d内对100 mg/L硫丹的降解率大于95%,H082对多种植物病原真菌有抑制作用。

关键词：硫丹,微生物降解,绿色木霉

参考文献

[1]SUTHERLAND T D,HORNE I,LACEY M J,et al.Enrichment of anendosulfan-degrading mixed bacterial culture[J].Applied and Environ-mental Microbiology,2000,66(27):2822-2828.

[2]ALEXANDER M E.Biodegradation of chemical of environmental concern[J].Science,1981(211):132-138.

[3]王宇.欧洲生物技术产业发展现状分析[J].江苏科技信息,2010(10):6-8.

[4]张林.微生物学在环境污染治理中的应用探析[J].中国科技博览,2010(10):307.

[5]我国首创农药残留降解技术日前问世[J].山东农药信息,2009(3):19.

降解菌筛选论文 第9篇

关键词：聚乙烯醇薄膜,生物降解,降解菌筛选,助剂

随着人们环保意识和资源可持续发展意识的增强,利用环境友好型的可降解材料,以减少“白色污染”,已成为绿色包装领域的研究热点之一。近年来,水溶性塑料包装薄膜作为一种新颖的包装材料,因具有良好的水溶性,引起了国内外研究者的普遍关注。水溶性薄膜以水溶性聚合物为主要原料,这些水溶性聚合物主要包括3大类[1]: 水溶性合成聚合物、半合成聚合物和天然 聚合物。其中,聚乙烯醇 ( Polyvinyl alcohol,PVA) 是一种人工合成的水溶性高分子聚合物,具有优异的成膜性、弹性、高抗张强度等优异的物理性能[2]。由其制得的薄膜无色透明,具有良好的力学强度、抗撕裂性、抗氧性、耐磨性、耐油和抗静电性等特点[3],广泛应用于工农业上一些水环境下使用的特殊产品包装[4],例如,农药、化肥、颜料、染料、清洁剂、水处理剂、矿物添加剂、混凝土添加剂等。

然而,PVA具有较大的表面活性,遇水溶解后,能在水中形成大量的泡沫,影响水体的复氧,从而抑制甚至破坏水生生物的呼吸活动,将含有PVA的废水直接排放会带来严重的环境问题,会对水源性生物及人体产生危害[2]。此外,PVA的COD值 ( Chemical Oxygen Demand, COD ) 较高, 而BOD值( Biochemical Oxygen Demand, BOD ) 很低, BOD/COD =0. 07[5],其可生化性较差,在自然环境中是难以自行降解的物质[6]。PVA是工业废水中一种主要的污染物,尤其是在造纸和棉纺织业的上浆过程中含量最高[7]。采用常规废水处理的方法处理PVA时必须先将其从废水中提取出来,操作复杂且消耗大量能源[8]。而在工业生产的乙烯基聚合物中,PVA是唯一能被微生物矿化的聚合物[9]。但研究发现[2,10],自然界中的确存在着可以使PVA降解的微生物。针对日益严重的PVA环境污染问题,微生物法修复PVA环境污染已经成为一种新兴的研究领域。将这些微生物经过适当的驯化培养,应用于PVA废水治理,有望实现PVA的完全生物降解。因此,对PVA的生物降解性研究成为其能否作为制备环境友好材料的第一要素。

目前已报道的可降解PVA的微生物主要分为细菌,真菌,放线菌三大类[2,10],其中以细菌类最多,且细菌类中又以假单胞菌居多。之前的报道主要侧重于PVA纯原料的生物降解性研究,较少涉及到成型PVA薄膜的生物降解性研究。PVA水溶性包装薄膜除主要成分是PVA外,还含有其它各种助剂,如增塑剂、表面活性剂、乳化剂、脱模剂等,这些成分可能会对降解菌降解PVA产生一定的影响。

基于上述原因,本文对取自PVA水溶性包装薄膜工厂排污口处的活性污泥进行PVA降解菌的筛选分离纯化,并从定性和定量角度研究薄膜助剂对PVA降解菌降解PVA的影响。

1 实验部分

1. 1 实验材料

1. 1. 1 样品来源

活性污泥取自株洲蓝海包装有限公司排污口处。

1. 1. 2 主要试剂

聚乙烯醇 ( 1788,分析纯) ,上海紫一试剂厂; 乙醇,硫酸铵,氯化钠,碘,碘化钾,硼酸,乙二醇,丙三醇,葡萄糖,氯化钙,硫酸镁,磷酸氢二钾,硫酸亚铁,琼脂,均为分析纯,湖南汇虹试剂有限公司; 琼脂( 生物试剂) ,BIOSHAPR;十二烷基苯磺酸钠( 化学纯) ,中国医药( 集团) 上海化学试剂公司; 乳化剂 ( OP - 10,化学纯) ,上海山浦化工有限公司; 吐温80( 化学纯) ,天津市科密欧化学试剂有限公司; 十二烷基硫酸钠( 工业级) ,上海白猫股份有限公司; 聚乙二醇 ( 400,实验试剂) ,天津市大茂化学试剂厂; 酵母膏 ( 生物试剂) ,北京奥博星生物技术有限责任公司。

1. 1. 3 培养基组成

配方组成参照文献[6 - 7,11 - 12]进行设计。

A类培养基 ( 即筛选培 养基 ) ( g / L ) : PVA ( 1788 ) 1. 0,( NH4)2SO41. 0,K2HPO40. 1,MgS O4·7H2O 0. 1,NaC l 0. 05,CaC l20. 05,FeS O4·7H2O 0. 1,琼脂15,自然pH ( 自来水配制) 。

B类培养基 ( g / L) : PVA包装薄膜 ( 蓝海公司生产) 1. 5,( NH4)2SO41. 0,K2HPO40. 1,MgS O4·7H2O 0. 1,NaC l 0. 05,CaC l20. 05,FeS O4·7H2O 0. 1,琼脂15,自然pH ( 自来水配制) 。

种子培养基( 即马铃薯土豆培养基) ( g/L) : 马铃薯200,葡萄糖20,琼脂15,自然pH ( 自来水配制) 。

发酵培养基( g/L) : PVA( 1788) 1. 0,酵母膏1. 0,K2HPO40. 1,MgS O4·7H2O 0. 1,NaC l 0. 05,CaC l20. 05,FeS O4·7H2O0. 1,pH 6. 5 ( 自来水配制,用0. 1 mol / L的HCl和0. 1 mol / L的NaO H调节) 。

1. 1. 4 碘 - 碘化钾 - 硼酸溶液

0. 1 mol / L的碘 - 碘化钾溶液与25 g / L的硼酸溶液以1∶10的比例混合。

1. 2 主要设备及仪器

超净工作台( SW - CJ - 2FD型) ,苏州苏洁净化设备有限公司; 智能生化培养箱( SPX - 250型) ,金坛市医疗设备厂;落地恒温振荡器( HZQ - 211型) ,上海一恒科学仪器有限公司;紫外可见分光光度计( UV2900型) ,上海舜宇横平科学仪器有限公司; 台式高速冷冻离心机( TGL20型) ,长沙英泰仪器有限公司; 立式压力蒸汽灭菌器( LDZM - 40KCS型) ,上海申安医疗器械厂; 凤凰PH50系列生物显微镜 ( PCMD02 - 64B TCH型) ,上饶市凤凰光学集团有限公司; 先行者CP系列电子天平( CP214型) ,上海奥豪斯仪器有限公司。

1. 3 试验方法

1. 3. 1 PVA 包装薄膜降解菌的筛选

筛选方法参照文献[11,13 -14],并在此基础上进行优化设计。

取待测样品1 g,加适量生理盐水稀释,震荡摇匀静置。取1 mL上清液于9 mL生理盐水中制成10- 1稀释溶液。按照此法依次稀释成10- 4、10- 5、10- 6溶液。在无菌工作台中,用无菌涂布棒涂布到已灭菌的以PVA为唯一碳源的筛选培养基( A类培养基) 上,30℃下倒置培养3 d。

透明圈试验: 向长有单菌落的筛选培养基上喷洒5 mL碘- 碘化钾 - 硼酸溶液,置于暗处反应3 min。查看菌落周周是否产生透明圈。透明圈的产生表明该菌株能够降解PVA。将产生透明圈的单菌落接种到新鲜的筛选培养基上,进行多次平板划线分离,直至产生纯的单菌落为止。然后将获得的纯菌株编号置于4℃冰箱中保存,每隔1个月传代培养保存。

测量菌落直径D1( mm) 及产生的透明圈直径D2( mm) ,D2/D1比值越大,说明该菌株对PVA的降解效果越好。根据D2/D1比值得大小,选出降解效果最好的菌株。

1. 3. 2 PVA 降解菌的观察及鉴定方法

菌落法观察[15,16]: 将1. 3. 1筛选出降解效果最好的菌株接种到种子培养基中央,30℃倒置培养5 d。观察其生长过程中的菌落形态,包括菌丝颜色,菌丝致密度,整体质感,孢子颜色,表观干燥还是湿润,菌落正反面颜色是否一致,是否有色素产生。

插片培养及形态观察[15]: 用已灭菌的镊子将无菌的的盖玻片以40° ~50°的角度插入凝固好的稀释的种子培养基上,每个培养基插入5 ~7片。再用接种环以无菌操作法从斜面培养基上挑取少量孢子,接种到无菌盖玻片与培养基的交界线上。然后,将其在30℃的培养箱中倒置培养。10 h后即可在光学显微镜下观察其孢子萌发,菌丝伸展,分化和子实体等的形成过程。

结合菌落形态、光学显微镜形态观察及结合《真菌鉴定手册》[17]对菌株进行鉴定。

1. 3. 3 定性研究薄膜助剂对 PVA 降解性的影响

将1. 3. 1分离得到的纯菌株分别点接种到以PVA包装薄膜( B类培养基) 及以PVA原料( A类培养基) 为唯一碳源的固体培养基上,30℃下培养3 d后进行透明圈实验。然后通过测量D1和D2,计算D2/ D1的值,比值越大,说明对PVA降解性的影响越大。

1. 3. 4 定量研究薄膜助剂对 PVA 降解性的影响

参照Finley法测PVA浓度[18],通过计算PVA降解率来表示降解效果。

PVA标准曲线的建立: 取一定量 ( 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19 mL ) 的0. 1 g / L的PVA标准溶液分别移入相应编号的10只50 mL容量瓶中。各加16. 5 mL碘 - 碘化钾 - 硼酸溶液,最后用去离子水稀释至刻度 ( 此时PVA的质量浓度分别为2,6,10,14,18,22,26,30,34,38 mg/L) ,摇匀,静置10 min; 同时,用添加16. 5 mL碘 - 碘化钾 - 硼酸溶液,最后定容至50 mL的参比溶液作为空白对照。在690 nm处测定PVA水溶液的吸光度。以吸光度为横坐标,PVA的质量浓度为纵坐标拟合标准曲线。

PVA浓度的测量: 取一定量的发酵培养液,10000 r / min下离心5 min,取1 mL上清液加到9 mL去离子水中,摇匀静置10 min。然后再取1 mL稀释液于10 mL离心管中,添加3. 3 mL碘 - 碘化钾 - 硼酸溶液,最后加5. 7 mL去离子水,摇匀静置10 min。此时,发酵液被稀释100倍。用紫外分光光度计在690 nm处进行检测,然后将吸光度值用标准曲线进行换算,再乘以稀释倍数( 100倍) 即得降解后的PVA浓度。

PVA降解率的计算公式:

式中: C0———PVA初始浓度,mg/L

C———PVA降解后浓度,mg / L

2 结果与分析

2. 1 高效 PVA 降解菌的筛选及鉴定

2. 1. 1 菌株的筛选

经过筛选最终得到10株PVA包装薄膜降解菌。通过测量发现,这10株菌株的透明圈直径与菌落直径比如图1所示,从图可知菌株XP - 02的D2/ D1比值远远大于其他菌株,根据上述D2/ D1比值越大表明该菌株产生的PVA降解性越好可知菌株XP - 02降解效果最好。故将该菌株作为后续研究的菌株,其透明圈如图2所示。

2. 1. 2 菌株的鉴定

菌落形态: 菌株XP - 02开始生长时,有白色营养菌丝产生,中央凸起,菌丝致密。生长较快,菌落较大。后期,菌丝表面从菌落中央开始向外产生致密的青色孢子,表面干燥,有褶皱产生,正面、背面颜色不一,背面中央有水溶性黄色色素产生。培养5 d后的菌落如图3所示。

菌丝及孢子形态: 菌株XP - 02在高倍显微镜下的形态如图4所示,呈典型的帚状枝,分生孢子梗,梗基,小梗,分生孢子等明显可见。

结合菌落形态特征、光学显微镜形态观察并参照《真菌鉴定手册》可以推测菌株XP - 02为青霉菌。

2. 2 PVA 薄膜助剂对 PVA 降解性的影响

2. 2. 1 定性研究助剂对 PVA 降解性的影响

PVA包装薄膜是成膜剂PVA及各种助剂 ( 如增塑剂、表面活性剂、乳化剂等) 经溶液流涎法制得的。将2. 1. 1分离得到的10株纯菌株分别点接种到A类、B类两种固体培养基上,30℃下培养3 d后进行透明圈实验。由图5可以明显看出同一菌株在两类PVA培养基上D2/ D1比值的大小,B类培养基上D2/ D1比值明显比A类培养基上大的多。但从图6却可以看出,同一菌株在两类PVA培养基上菌落直径的大小正好呈现一个相反的关系。通过初步分析,PVA降解菌菌落直径的减小可能是因为PVA包装薄膜中的某种或某几种助剂对菌丝的生长产生毒害作用抑制其生长; 另一方面PVA降解菌菌落透明圈的增大可能是薄膜中的某种或某几种助剂提高PVA降解酶的活性,或者是可以提高PVA降解酶在培养基中的迁移率造成的,或者是二者共同原因造成的。

2. 2. 2 定量研究助剂对 PVA 降解性的影响

图7所示的是以吸光度( X) 为横坐标,PVA浓度( Y) 为纵坐标绘制PVA标准曲线。

利用origin拟合PVA ( 1788 ) 的标准曲 线方程为Y =28. 16505X + 0. 74231,R2= 0. 99936。可见,在一定浓度范围内( 2 ~ 26 mg/L) ,PVA浓度与吸光度呈高度相关的线性比例关系。

为了分析B类培养基上透明圈增大的原因,设计了表1所示的研究方案。采用单一变量法在PVA液体发酵培养基中分别添加不同薄膜助剂进行研究,并求出对PVA降解效果最好的菌株XP - 02的降解率。

从图8中可以看出,各助剂浓度分别为0. 05 g/L时,PVA包装薄膜中的增塑剂、表面活性剂、乳化剂等对PVA的生物降解性均有不同程度的提高。其中,增塑剂中的聚乙二醇、表面活性剂中的十二烷基苯磺酸钠、乳化剂中的吐温 - 80提升效果最佳,最高可以分别提高5. 01% 、8. 67% 、11. 21% 。可知,B类培养基上透明圈增大的原因是薄膜助剂可以提高PVA降解酶的活性所导致的。在PVA水溶液中,小分子的薄膜助剂更利于进入PVA分子的碳链结构中,降低了分子间作用力,增大了PVA分子链的灵活性,使得PVA降解酶的活性中心更易破坏PVA分子链的敏感部位,提高PVA的降解率。因此可以预知,在PVA包装薄膜中提高增塑剂聚乙二醇、表面活性剂十二烷基苯磺酸钠、乳化剂吐温 - 80的含量可以提高PVA包装薄膜的生物降解率,但PVA包装薄膜中各组分具体含量还有待于进一步的实验研究。

3 结 论

鉴于微生物法修复PVA环境污染问题已成为国内外学者的研究热点。本文利用以PVA为唯一碳源的筛选培养基从PVA包装薄膜生产工厂的污水排水口处的活性污泥中筛选出10株PVA降解菌,最终经透明圈实验筛选出一株PVA降解效果最佳的菌株XP - 02,并经形态学及光学显微镜观察鉴定为青霉菌。定性研究发现,PVA包装薄膜中的某种或某几种助剂可以抑制PVA降解菌菌落的生长,但却可以通过增加PVA降解酶的活性来提高的PVA的生物降解性。而定量研究则发现,适量的增塑剂、表面活性剂、乳化剂可以增加PVA包装薄膜的生物降解率。但PVA包装薄膜中成膜剂PVA及各种助剂的具体比例关系还需要后续进一步实验研究。

降解菌筛选论文 第10篇

甲醛(HCHO)常温下为具有刺激性和窒息性的无色气体，商品为其水溶液，世界上产量最高的十种化学品之一[1,2]。甲醛对人体有害，能和人体内的蛋白质结合，改变蛋白质内部结构并使其凝固，因而具有杀伤力[3,4]。目前，除甲醛的方法主要有化学反应方法、物理吸附技术、臭氧负离子技术、植物净化等，但是这些方法存在降解时间长，成本高等缺点[5]。相对的，微生物法则以生态环境中的有益菌为材料，成本低，效果好，而且无二次污染。因此，甲醛的生物降解已成为研究的热点。

已报道的，在自然界中分离得到的甲醛降解菌大部分为细菌和少部分的真菌。目前，甲醛降解细菌的种类大致有恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、假产碱假单胞菌株、睾丸酮假单胞菌、甲基营养菌等[6,7,8]，它们能以甲醛为唯一的碳源和能源进行生长，具有一定的甲醛降解能力;但真正应用到废水或空气中甲醛降解的尚属空白，究其原因是它们对甲醛的降解能力都有待提高。本研究从动物肝脏浸置标本中，得到1株能够在较高甲醛浓度下存活的微生物，将其命名为CSLG1;对其进行初步鉴定及降解特性的研究，实验证明菌株CSLG1能降解较高浓度的甲醛溶液，与之前报道的相比具有明显的降解优势。此结果可作为甲醛污染环境的生物降解的理论依据，同时为甲醛降解酶制剂提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:菌种CSLG1由常熟理工学院生物与食品工程学院实验室保藏。

1.1.2 试剂

葡萄糖、硝酸钠、硫酸镁、硫酸亚铁、牛肉浸膏、氯化钾、乙酸铵、冰乙酸、乙酰丙酮均为分析纯，江苏省强盛化工有限公司;甲醛溶液37～40%，苏州市振兴化工厂。

乙酰丙酮溶液[9]:50 g乙酸铵、6 m L冰乙酸及0.5 m L乙酰丙酮试剂溶于100 m L水中。此溶液4℃冷藏。

1.1.3 仪器

722型分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;EL-20台式p H计，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.1.4 培养基

(1)液体培养基(g/L):葡萄糖4，牛肉膏0.4,KCl 0.05,MgSO4·7H2O 0.1,Fe SO4·3H2O 0.01,p H 7.5。分别添加150μL、300μL、500μL和750μL甲醛(37.25%,W/W)至90 m L的液体培养基中，配制甲醛浓度分别为1.12 g/L、2.24 g/L、3.73 g/L和5.60 g/L。

(2)固体培养基(g/L):葡萄糖30,Na NO32,K2HPO4·3H2O 1,KCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,Fe SO4·3H2O 0.01，琼脂20，甲醛0.3,p H 6.7。

1.2 方法

1.2.1 种子液培养:

取菌CSLG1的纯培养物至不含甲醛的液体培养基，于27℃、150 r/min培养3 d。

1.2.2 发酵培养:

吸取10 m L种子培养液(含大小均一的菌丝球)至500 m L锥形瓶中，其中装有90 m L含有一定甲醛浓度的液体培养基，于27℃、150 r/min培养5 d。

1.2.3 甲醛含量测定(g/L)[9]:

参照修订后的GB/T13197-1991，试样稀释100倍后取0.05 m L，加入1 m L乙酰丙酮溶液、4.95 m L蒸馏水，沸水浴煮沸10 min，室温冷却放置10min，在414 nm处测其吸光值，从标准曲线上查出对应的甲醛含量。

1.2.4 生物量的测定(g/L)[10]:菌丝干重法。

1.2.5 实验菌的分子鉴定:

DNA的提取参照CTAB法[11]进行。PCR采用真菌18S r DNA扩增通用引物;上游引物F1:5’-GAT CCT GCC AGT AGT CAT ATG C-3’，下游引物ITS2:5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’，反应条件为94℃预变性5 min,94℃变性1 min、56℃退火1 min、72℃延伸2min进行30个循环后，于72℃反应7 min。用W=3%的琼脂糖凝胶电泳40 min，使用Ta KaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收目的片段，送上海宝生物工程公司进行测序，测序结果在Gen Bank中进行BLAST比对。

1.2.6 葡萄糖浓度测定(g/L)[12]。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

菌株CSLG1的菌落特征是:平薄粗糙，稍呈颗粒状;外缘为白色，内部为黄色，后期稍呈绿色;干燥无渗出液，表面有不规则的辐射皱折沟纹(图1)。用高倍镜(10×40)观察菌CS-LG1的形态特征(图2)。菌丝中有横隔膜，菌丝体呈帚状，为典型青霉菌菌丝体特征。

菌株CSLG1的18S r DNA序列，长1 594bp，在Gen Bank注册，其登录号为KF358998。通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示分离得到的菌株属于拟青霉属(Paecilomyces dactylethromorphus)。利用Clustal X 1.81软件和MEGA4.0软件构建系统进化树，结果如图3所示。

2.2 考察不同甲醛浓度对菌CSLG1生长的影响

在液体培养基中分别添加不同浓度的甲醛溶液培养菌CSLG1，结果如图4所示。随着甲醛浓度的增加，菌株CSLG1的生长整体呈现下降的趋势;当培养基中甲醛的含量在1.49g/L增加至4.47 g/L时，菌种的生长变化不显著(DCW约为3.10 g/L)，表明菌种CSLG1对甲醛具有一定的抗性，能在含有甲醛溶液的培养环境中存活。实验结果显示，当甲醛浓度达到一定值后(>6.52 g/L)，菌体基本无生长迹象(DCW低于1.0 g/L)(表1)，故判断6.52 g/L的甲醛浓度为其的临界值。实验重复性较好。

注:“+++”表示有密集较大的菌球产生;“++”表示密集但较小的菌球;“+”较少而且较小的菌球或菌团;“+-”表示无菌球或者菌团，培养瓶壁上有白色菌体物质;“-”培养液无任何变化，培养瓶壁上无任何物质。

Note:+++:there was numbers of bigger mycelial pellet in the culture,++:there was much of small mycelial pellet in the culture,+:there was less smaller mycelial pellet in the culture,+-:there was no mycelial pellet in the culture,while some mycelial was adhering to flask wall,-:there was no mycelial pellet in the culture,and nothing was adhering to flask wall.

2.3 菌株CSLG1甲醛降解性能的测定

图5所示，菌株CSLG1可以在48h内彻底降解低于3.73g/L的甲醛，并在降解过程中伴随着生物量的增加，表明菌株CSLG1能够通过降解利用甲醛。继续提高甲醛浓度，菌株CS-LG1降解周期延长;当甲醛浓度为5.60 g/L，在120 h内菌株CSLG1无法彻底降解(降解率为69%)，说明菌株CSLG1对甲醛的降解能力是有限的。从图5a、b和c看出，随着培养基中初始甲醛浓度的提高，菌株CSLG1的生长受到抑制的影响逐渐显现，表现为生物量的下降，说明甲醛对于该菌种仍然具有一定程度的危害。

3 讨论

目前，已发现有甲醛代谢能力的微生物主要为甲基营养型细菌，也有一些真菌和非甲基营养菌。国内关于甲醛降解菌的报道较少[6,8,13,14]，国外的文献报道相对较多[15,16,17]。但在发现的各类菌株中，拟青霉属的报道却屈指可数。本研究的菌株CSLG1能在6.52 g/L的高甲醛浓度下生长，且具有比其他甲醛降解菌更高的降解能力(表2)。

注:甲醛浓度分别为(a)1.12 g/L;(b)2.24 g/L;(c)3.73 g/L;(d)5.60 g/L。■-■:甲醛降解率(%);●-●:DCW(g/L);▲-▲:葡萄糖消耗率(%)。

Note:formaldehyde concentration were respectively.(a)1.12 g/L;(b)2.24 g/L;(c)3.73 g/L;(d)5.60 g/L.■-■:formaldehyde degradation(%);●-●:DCW(g/L);▲-▲:glucose consumption(%).

近年来关于甲醛的降解越来越得到关注，而微生物降解无疑是一个好的选择。但在报道的降解菌中，其降解能力都无法达到实际使用的要求。虽然，目前已经获得甲醛降解酶的基因，并进行转化表达，但离真正应用仍有不少差距;究其原因是降解酶的酶活不高，因此筛选获得高效降解甲醛的微生物仍然具有重要的现实意义。

4 结论

(1)对分离得到的甲醛降解菌CSLG1，进行显微观察和分子生物学分析，鉴定为拟青霉属(P.daclyethromorphus)。

(2)培养基中的甲醛浓度低于6.52 g/L时，菌株CSLG1能够在此环境中生长;当甲醛浓度高于6.52 g/L时，其几乎不能生长，故判定菌株CSLG1的耐受甲醛临界值6.52 g/L。