病毒学方法技术研究

病毒学方法技术研究（精选10篇）

病毒学方法技术研究 第1篇

病毒学的里程碑事件应属1935年美国科学家Stanley对于烟草花叶病毒的提纯, 使人们不再空泛地想象病毒的存在, 而是真切地观察和接触到病毒, 为今后的研究开辟了广阔的道路。随后, 观察手段, 培养方法, 以及相关的病理性研究手段的不断提升, 也使得病毒学这样一门起步较晚的学科开始了飞速发展。

回顾病毒学研究的发展历程, 不难发现, 学科的发展很大程度上依赖于技术的进步与革新, 以及与相关学科的借鉴与学习。故了解和掌握病毒学方法技术的发展历史以及技术要求, 对于学科的研究, 以及技术的创新, 都有诸多裨益。

1 病毒鉴定检测的相关方法技术

对于病毒最直观的认识无疑是其生物学上特征, 如病毒的理化性质 (如病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、特外存活期等) 以及在寄主上的反应 (如寄主范围、症状表现、传播方式等) 。目前, 病毒生物学特征的研究鉴定方法主要分为三大类:显微成像技术 (或相关针对病毒形态结构观察的技术) 、免疫-血清学检测和分子生物学检测。

1.1 病毒形态结构的观察技术

众所周知, 病毒颗粒的大小远小于普通细菌, 所以对病毒最直观的鉴定方法就是使用电镜观察, 它可以直接地看到病毒的形态结构、存在与否。自第一台电子显微镜的诞生, 这门技术已为病毒学在内的多种生物学科作出了重要的贡献, 优点也十分明显, 操作简便, 快捷有效, 所以, 即使是在进入了分子研究水平的今天, 电子显微镜仍然发挥着它不可替代的作用。

另外, 在原始的技术基础之上加以改进也形成了一些针对特殊观察对象的电镜技术, 如电镜负染技术和免疫电镜检测技术等。低温电镜技术, 就是一种结合电镜技术和低温结晶观察病毒的三维结构的技术, 其优点不仅在于其分辨率更高, 而且对于病毒样品的损伤和失真的概率都大大减小, 常用于极微量和高保真要求的病毒观察检测。

X-射线衍射技术是通过扫射病毒微晶得到的衍射图像来分析还原原始的病毒结构, 但为了保证衍射图像的准确性, 往往对样品的纯度和颗粒完整性要求较高, 所以这种技术的使用范围相对受限。

核磁共振技术, 相对于前面提到的技术, 对于操作的要求更低, 运用范围也更广, 但是对于结构的准确性判断略低。此技术主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子构象变化的研究。

1.2 免疫-血清检测方法

此类技术的原理主要根据病毒的侵染性以及其作为核蛋白的特性而设计的。运用最为广泛的还是血清学测试, 即利用血清中可以和具有某种特定结构特征的病毒结合的抗体, 从而进行病毒的定性定量分析。此法也广泛应用用于医学临床的诊断, 操作简便, 低廉有效。

酶联免疫吸附实验 (ELISA) 也是利用特异抗体吸附病毒颗粒的原理, 只是在抗体上附带了酶标记, 从而使反应可以有颜色强弱的变化, 利于定时定量监测病毒浓度。此法灵敏度高, 且不受浓度范围或其他抑制剂的干扰, 也越来越多地应用于相关的生产实践中。

免疫组化技术也是将抗体带上特殊的显色基团, 使其游离时不显色, 而于抗原物质结合后显色。利用这个特点, 可以检测特定组织中不同区域的病毒含量已经分布特点, 利于进行组织性毒理分析。

1.3 分子生物学检测方法

病毒寄生在宿主细胞内, 但它又有不同于宿主细胞的特异基因组序列, 特异序列的存在就说明病毒的存在, 这就是分子生物学检测病毒的原理。

聚合酶链式反应 (PCR) 是其中最为常用的一种检测手段, 其原理即利用DNA半保留复制的特点, 以原始DNA为模板合成两条一样的双链, 从而达到扩增量指数增长, DNA总量可检测的目的。另外, 由于病毒的核酸有的是DNA, 有的是RNA, 所以常规的PCR以及反转录PCR即可针对不同的病毒基因进行检测。

实时定量PCR与传统PCR基本相同, 只是在体系中加入荧光基团, 反应中利用CCD实时读取荧光信号, 检测。不仅减少的污染和浪费, 也使定量快速而方便, 可以实现多样品和高通量的反应。

核酸原位杂交的原理是利用生物素编辑的c DNA探针来杂交组织中的样本, 从而确定病毒在宿主中的分布和载毒量。该技术, 往往与免疫组化一起使用。

ds RNA技术是利用ds RNA在一定条件下与纤维素特异结合的性质, 从来快速简便的提取检测出病毒颗粒中的ds RNA等, 高效准确, 在普通实验室和生产工厂中都有所应用。

2 病毒的分离与培养的相关技术方法

2.1 病毒的提纯技术

作为病毒学研究的重要技术前提, 病毒的提纯质量往往影响了后续一系列的步骤, 所以其重要性不言而喻。由于病毒的生长特性、理化性质和宿主都差异颇大, 提纯的方法也不尽一致。

在病毒研究初期, 沉淀法最常被使用, 其主要利用病毒的蛋白外壳, 改变溶剂性质, 从而分离病毒粒子。相对而言简便快速, 但也常存在粗糙易变性的缺点。

色谱法源于化学中多组分的分离, 由于生物成分的多样性, 也常使用该技术。色谱法主要分为吸附法、柱层析法和电泳法, 都是利用较为温和的环境, 以及病毒的特异吸附或凝集等特质而设计的技术。种类繁多, 应用广泛。

超速离心利用样品中不同成分拥有不同的沉降系数, 在离心过程中, 不同成分会在溶剂的特定位置形成区带, 从而达到分离提纯的目的。此法常使用生物活性溶剂, 且离心本身对病毒粒子损伤较小, 故常用于理想的病毒快速分离技术。

2.2 病毒的获取

最初的植物病毒学和动物病毒学的诸多研究都是建立在活的宿主体系上的, 并且至今仍在应用, 如生产不能体外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、检测疫苗的安全性等。但动物宿主体系存在太多弊病, 随着细胞培养技术和分子生物学的发展, 有逐渐被淘汰的趋势。

现在, 病毒的获取主要是三种途径:从宿主直接获取、感染宿主扩增病毒、直接合成, 其中后两种途径使用更为广泛。

感染宿主扩增病毒即要使用到组织细胞培养, 这项技术本来属于细胞学的范畴, 后由于动物源性或者细菌源性的病毒研究需求, 此技术也越来越多地应用于病毒学的研究中。如, 空斑分析最初用于测定噬菌体含量, 而今也逐渐普及为动物病毒的研究中去。

直接合成法则是利用动物转基因技术, 将病毒的遗传信息整合进目标动物中, 在动物体内完成基因的表达, 蛋白的合成, 以及病毒的组装等步骤。而动物转基因技术也是现今生物领域的热点内容, 技术繁多, 更新迅速, 也为病毒的研究提供了良好的基础。

3 病毒的功能机制研究的相关技术方法

3.1 病毒的遗传学的研究

关于病毒遗传学的研究和细菌等微生物的遗传学研究技术相似, 如PCR等。但是病毒的遗传物质除了可能是DNA还可能是RNA, 而且现在对于RNA病毒的研究居多, 所以针对性的技术也与细菌等微生物的遗传学研究技术有所区别。

对于RNA病毒使用最多的是反向遗传学技术, 最初即使用反转录PCR得到病毒RNA的c DNA, 从而完成病毒基因组的探索工作, 以达到了解或有目的性改造病毒基因组实现生产应用的目的。此法对于类型多样的病毒研究提供的最为基础的遗传学数据, 为疫苗开发筛选、新型病毒载体等多方面都给予有力的技术支持。

针对病毒易变异的特点, 单链构想多态性检测技术 (SSCP) 则理想地解决了这一问题。近年来, 对于多种模式生物的基因组测序的发展, 越来越多的研究开始着重于探索基因变异的问题, 而SSCP技术正是这样发展起来的。其主要用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入, 为病毒的分子演化规律以及流行病学提供充分的证据。

基因芯片技术的概念来源于计算机芯片, 即将大量寡聚核苷酸以阵列形式有序固定于载体表面, 与待测样本的病毒分子杂交, 然后利用化学发光或同位素等显色方法, 用CCD等仪器对杂交信号进行高效检测分析。主要用于病毒基因表达谱和基因多态性等方面的研究。

3.2 病毒表达机制的研究

在病毒的表达机制研究中, 主要是利用不同的检测手段, 判断病毒表达的具体情况, 并对于病毒表达的情况进行总结归纳, 研究其时空上的机制和规律。

Northern Blots即针对病毒RNA样品的技术手段, 原理与Southern Blots相似, 利用探针与固相RNA杂交, 再对探针分子的图像进行捕获和分析。此法特异性高, 常用于分析已知基因的表达情况。

m RNA表达差异技术主要使用反转录PCR以及等量不同宿主的定量检测, 来确定抗病种和感病种的差异表达基因, 从而进一步确定造成品种差异的原因。

3.3 病毒蛋白质的研究

病毒蛋白决定了病毒的形态结构, 常作为抗原来激发人体内的免疫反应, 作用于宿主细胞信号转导途径, 导致宿主细胞内信号转导发生紊乱;并且一些病毒蛋白具有酶的作用, 可作为细胞毒素作用于宿主细胞。

大范围而言, 病毒蛋白质研究的技术, 都隶属于蛋白质组学的研究范畴之内, 只不过针对不同特性的蛋白, 往往会选取最为有效而简便的技术方法进行研究。而由于蛋白质分子结构、化学生物特性等多方面差异很大的特点, 其针对性技术也是五花八门, 在此仅列举较为常用的技术, 以供研究者学习参考。

经典的方法有亲和层析、抗体受体法、抗细胞受体法、抗独特型抗体法、病毒覆盖蛋白法。大多还是利用病毒蛋白和抗体蛋白或者其他蛋白或大分子物质的作用, 来检测病毒蛋白的特性。虽然这些方法快速简便, 但是由于方法本身较为粗糙, 样品用量较大, 准确性存疑等问题, 现在仅在低要求情况下使用。

现代的方法则更加丰富, 也分别具有各自的特点, 常被运用于现在的病毒蛋白的研究。

噬菌体表面呈现技术是利用噬菌体本身表达的两种结构蛋白会暴露在噬菌体表面, 故将外源基因倒入两个结构蛋白基因间, 使外源序列一起表达, 然后让表达产物与大量配体结合, 筛选特殊结合性配体。但此法表达出来的蛋白可能与天然状态不符, 所以使用较为受限。

免疫共沉淀是一种成熟蛋白作用技术, 其原理为在溶液或细胞中, 用一种蛋白的抗体耦合可与此蛋白特异结合的另一蛋白, 从而形成一抗体两蛋白的沉淀, 从而获取具有结合饵蛋白能力的未知蛋白, 探索细胞中蛋白作用机制。

酵母双杂交技术是利用真核基因的特殊表达机制, 通过将两个蛋白的编码序列整合在同一酵母细胞内的特殊转录激活域附近, 若两种蛋白可以发生相互作用, 则会激活相应的报告基因, 从而报告蛋白的相互作用。此法常用于筛选病毒蛋白的特异膜蛋白受体。

除了以上列举的技术之外, 还有c DNA文库技术、质谱分析技术、GST Pull-down技术、串联亲和纯化、荧光能量共转移等多种技术应用于蛋白互作的研究。

摘要：从早期的结晶提纯到今天的分子细胞水平的病毒学研究, 病毒学的研究随着时间而不断发展, 而病毒学发展的重要依据就是相关技术方法的不断进步。本文从病毒的鉴定检测方法、病毒的分离与培养方法、病毒的功能机制研究方法这三个方面总结现在病毒学研究的常用方法, 为通用的技术方法提供参考依据, 以推动病毒研究的技术改革与创新, 为今后的研究工作奠定良好的基础。

猪圆环病毒感染的防治技术研究 第2篇

科技项目申报（合同）书

项目名称：猪圆环病毒感染的防治技术研究

计划类别：

申报单位（盖章）：***市畜牧兽医站

联系人：****

联系电话：****

通讯地址：**省***路***号

管理部门：***市农业局

****市

科学技术局

二○○五年五月十日

填表说明

一、本科技项目申报（合同）书一表两用。在项目申报阶段作为科技项目申报书；经审批列入科技计划后，作为科技项目合同书。

二、封面“批准文号”、“合同编号”、“资助类别”、“资助形式”、“管理部门”由市科技局填写。

三、“项目简介”要求内容简明扼要，字数不超过300字，着重说明本项目的主要研究内容、技术特点、项目的投资情况以及项目完成时预期的经济效益。

四、“技术来源”：

1、自有技术；

2、产学研合作开发技术；

3、国内其它单位或个人技术；

4、国外引进消化与创新技术；

5、其它技术。请在相应数字后“□”内打“√”。

五、“技术领域”：电子、信息、生物、医药、新材料、机电一体化、资源与环境、新能源、高效节能、汽车、纺织、精细化工、食品、农业、林业、畜牧、水产等。请在表中注明项目所处技术领域。

六、“所处阶段”：

1、研发阶段；

2、中试阶段；

3、批量（规模化）生产；请在相应数字后“□”内打“√”。

七、“经济类型”：

1、国有企业；

2、集体企业；

3、联营企业；

4、私营企业；

5、有限责任公司；

6、股份有限公司；

7、股份合作企业；

8、外商投资企业；

9、港澳台商投资企业；

10、其它企业。“港、澳、台商投资企业”指与港、澳、台商合资经营企业，合作经营企业，港、澳、台商独资经营企业及港、澳、台商投资股份有限公司；“外商投资企业”指中外合资经营企业、中外合作经营企业、外资企业和外商投资股份有限公司。请在相应数字后“□”内打“√”。

八、“三项经费预算（分项表）”请据实填写，其中“审批经费”内容由市科技局填写。

九、“技术水平”：国际领先、国际先进、国内领先、国内先进、省内领先、省内先进。“技术表达形式”：论文、新材料、新工艺、新产品（品种）、成熟产品（品种）。

十、“项目实施基础条件”要求填写项目实施在技术人才、资金投入、技术装备、企业管理及水电条件等方面的情况。

十一、“技术指标”要求注明项目研究开发产品（品种）执行的标准，项目完成后达到的具体技术性能指标。

十二、“经济指标”指项目完成后，达到的年产量、产值、利润、税收、创汇等。

十三、“社会与环境效益”指项目完成后，资源利用、人员就业、环境污染与防治等方面的情况。

十四、“管理部门意见”、“项目管理”部分由市科技局填写。

一、基本情况

1、项目简介（限300字以内）

一、主要研究内容

1.猪圆环病毒（PCV-2）感染的致病机理研究；

2.猪圆环病毒的实验室培养方法的研究；

3.猪圆环病毒感染发病的防治技术研究。

二、技术特点

本研究的技术关键在于猪圆环病毒感染致病机理的研究。针对猪圆环病毒感染发病引起的特征性高度免疫抑制，探讨猪圆环病毒与免疫系统之间的相互作用。

三、投资情况

预计总投资20万元，其中申请经费15万元，自筹经费5万元。

四、预期经济效益

1.仔猪成活率提高5以上；

2.研制出猪圆环病毒单克隆抗体、疫苗和药物，通过技术成果转让产生直接经济效益30--50万元，推广应用产生间接经济效益500万元。

2、项目技术领域及所处阶段

技术来源1√2□3□4□5□

技术领域畜牧

所处阶段1√2□3□

3、项目承担单位

主要承担单位单位名称**市畜牧兽医站

单位地址**市**210号

法人代表**联系电话****

传真*****邮政编码****

经济类型1√2□3□4□5□6□7□8□9□10□

上级行政主管部门**市农业局

合作或

协作单

位及其

分工

4、项目主成员情况

姓名性

别年

龄职务

职称学历所学

专业现从事专业所在单位

负责人****38站长、高级畜牧兽医师大学本科畜牧畜牧兽医**市畜牧兽医站

主

要

参

加

人

员**********副站长、高级畜牧兽医师大学专科畜牧畜牧兽医**市畜牧兽医站

*****男**站长、高级畜牧兽医师大学本科兽医畜牧兽医**市家畜家禽检疫站

*****男**中级畜牧兽医师大学本科畜牧畜牧兽医

**市畜牧兽医站

*****男**助理畜牧兽医师硕士兽医畜牧兽医**市畜牧兽医站

*****男**助理畜牧兽医师大学本科畜牧畜牧兽医**市畜牧兽医站

*****男**助理畜牧兽医师大学专科畜牧畜牧兽医**市畜牧兽医站

5、三项经费预算（单位：万元）

费用名称申报

经费审批经费备注

设备、仪器购置费

2材料、样品加工费

2土建安装费

3资料、调研费

2实验、检测费8

鉴定费

1技术合作费1

其它费用1

合计20

二、立项依据

1、项目的目的、意义及国内外发展趋势、市场预测

猪2型圆环病毒(PCV-2)感染及其相关疾病现已在全球范围内被认识并被看成是造成猪场主要经济损失的原因，已引起世界各国的广泛重视。猪圆环病毒与其他病原体混合感染的高度相关性；在短时间内世界范围广泛的传播;对猪广泛的高度易感性；对免疫器官的严重攻击，导致高度免疫抑制性；目前尚缺商品化的疫苗、有效治疗药物和有效的控制能力，使养猪业蒙受惨重的经济损失，成为当前国内外对养猪业危害极大的病毒性传染病。探讨防制该病的有效措施，是当前国内外养猪业密切注视的热点。

2、项目研究开发内容、技术关键、技术方案或技术路线，预期技术水平

及表达形式

一、主要研究内容

1.猪圆环病毒（PCV-2）感染的致病机理研究；

2.猪圆环病毒（PCV-2）的实验室培养方法的研究；

3.猪圆环病毒（PCV-2）感染发病的控制技术研究。

二、技术关键

本研究的技术关键在于猪圆环病毒（PCV-2）感染致病机理的研究。针对猪圆环病毒感染发病引起的特征性高度免疫抑制，探讨猪圆环病毒与免疫系统之间的相互作用，这是项目研究的重点和难点。

三、技术路线

3、项目实施基础条件

具有一定水平的动物疫病诊断实验室和饲料质量检测室，为项目实施提供有力的设备支持。拥有全自动生化培养箱、酶标仪、高效液相色谱仪、冷冻离心机、冷冻切片机、荧光显微镜、双道原子荧光光度计等仪器设备。另外，我站**白猪育种中心下属的四个原种场，进贤县、新建县、**县、安义县畜牧良种场可提供优良的试验猪场和推广基地。

二、项目主要技术、经济指标和社会与环境效益

技

术

指

标

探讨猪圆环病毒（PCV-2）感染致病机理。

经

济

指

标

1.仔猪成活率提高5以上；

2.研制出猪圆环病毒（PCV-2）单克隆抗体、疫苗和药物，通过技术成果转让产生直接经济效益30-50万元，推广应用产生间接经济效益500万元。

社

会

与

环

境

效

益

猪2型圆环病毒(PCV-2)感染及其相关疾病现已在全球范围内被认识并被看成是造成猪场主要经济损失的原因，已引起世界各国的广泛重视。目前尚缺商品化的疫苗、有效治疗药物和有效的控制能力，使养猪业蒙受惨重的经济损失，成为当前国内外对养猪业危害极大的病毒性传染病。探讨防制该病的有效措施，是当前国内外养猪业密切注视的热点。

三、项目工作进度安排

起止年月主要工作资金使用安排（万元）

自筹资金三项经费

2005.1—2005.6

完成开题报告和相关资料的查新

2005.7—2006.6

猪圆环病毒（PCV-2）的实验室培养

2006.7—2007.6

猪圆环病毒感染的致病机理的研究

2007.7—2008.6总结猪圆环病毒感染相关疾病的综合防治技术

2008.7—2008.12完成结题报告和撰写论文

五、管理部门意见

项目管理人意见：

项目管理人(签章):

二○○年月日

处室负责人意见：

负责人（签章）：

是否提交评估：是口否口二○○年月日

市科技局审定意见：

市科技局资助经费总额：

二○○年月日

六、项目管理

项目进展阶段项目进程及完成情况三项经费

（万元）项目管理人

（签章）

第一阶段

（年月开始）

第二阶段

（年月开始）

第三阶段

（年月开始）

第四阶段

（年月开始）

七、共同条款

1、本合同签字生效后，**市科技局（以下简称甲方）按合同规定进度向项目承担单位（以下简称乙方）核拨经费，按合同规定到位配套资金。乙方应实行专款专用，并接受甲方的监督、检查，乙方在经费下达后，必须按计划进度将项目执行情况以书面形式向甲方报告。

2、乙方应在项目完成后的二个月内向甲方申请项目鉴定或验收，并按规定提交鉴定或验收的有关材料。

3、在本合同生效后5年内，甲方有权因非商业目的（如：在政府性会议、报告、文件、统计资料等）使用乙方企业、项目信息。

4、甲方鼓励乙方尽快将本项目进行商业化应用。如在项目验收后2年内，乙方未能将本项目投入实质性商业化应用，甲方有权指定第三方进行商业化应用。乙方应就技术使用费及其支付方式与第三方达成协议，双方不能达成协议的，由甲方确定合理的使用费。

5、任何一方因不可抗拒力不能履行合同时，应及时通知另一方，并在合同期内出具不能履行合同的证明。任何一方提出变更合同的要求，需与另

一方协商，签定变更协议后方可执行。

6、甲乙双方应严格遵守本合同的各项条款、在项目实施过程中，如发现乙方违反本合同及有关规定，甲方有权撤消或终止合同。撤消或中止合同后，乙方应进行项目清算，并将甲方下拨的剩余经费如数退还。同时，甲方在今后三年内不再受理乙方的项目申请。

7、甲乙双方与___________________________（以下简称丙方）共同协商，确认丙方为本项目的委托管理部门，乙方应接受甲方赋予丙方对本项目实施及拨付资金使用的监督和检查。

8、双方如发生争议，应协商解决，协商不成，任何一方均可向**市仲裁委员会提请仲裁。仲裁是终局的，对双方均有约束力。

9、根据项目具体情况，经双方协商订立的附加条款将作为本合同的组成部分。

10、本合同未尽事宜，双方按科技计划、科技三项经费管理等有关规定执行。

11、其它条款：

①、②

12、本合同一式份。

八、签定合同各方

甲方：

地址：

负责人（签章）：

电话：

邮编：

（盖章）

二○○年月日

乙方：

地址：

法人代表（签章）：

电话：

邮编：

开户银行：

帐号：

（盖章）

二○○年月日

丙方：

地址：

负责人（签章）：

电话：

邮编：

（盖章）

二○○年月日

猪流感病毒分子检测技术研究进展 第3篇

关键词：猪流感；流行现状；分子检测

中图分类号： S858.28；S852.65+1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0059-02

收稿日期：2013-12-09

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2012BAD04B01-5）。

作者简介：张文慧（1977—），女，吉林桦甸人，博士，副教授，从事微生物学研究。E-mail：215267612@qq.com。

通信作者：钱爱东，从事微生物学研究。Tel：（0431）84533426；E-mail：qianaidongO115@163.com。猪流感（swine influenza，SI）是由猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一种急性、高度接触传染性猪传染病。1918年，美国首次报道了SI。1930年，Shope分离并鉴定了第一株猪流感病毒SIV A/Swine/Iowa/15/30（H1N1），该病毒被认为是美国20世纪初发生的SI病原[1]。该病传播迅速，往往2～3 d内波及全群。康复猪、隐性感染猪是猪流感病毒的主要储存宿主，也是猪流感的主要传染源[2]。该病一年四季都可发生，在规模化养猪场难以根除，对养猪业危害极大。另外，SIV的HA受体结合位点具有与人流感病毒、禽流感病毒2种流感病毒受体相同的结合特异性，这决定了SIV不仅可以感染猪，同时也可感染人类[3]。历史上SIV感染人的报道并不罕见。1976年美国新泽西州一名士兵死于古典H1N1 SIV感染，这是人类历史上首例SIV致死人的报道，之后在其他地区也出现SIV感染人并致死的报告[4-5]。迄今为止，猪流感已遍及世界各地，已经分离出H1N1、H1N2、 H2N3、H3N1、H1N7、H3N3、H4N6、H5N1等多种血清型，其中在猪群中广泛流行的猪流感病毒主要有古典猪H1N1毒株、类禽H1N1毒株、类人H3N2毒株[6]。本研究对猪流感病毒的分子检测技术以及猪流感在我国的流行现状进行综述，旨在为开展猪流感研究提供参考。

1猪流感病毒分子检测技术研究进展

1.1反转录聚合酶链式反应

反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是目前发展最成熟的分子诊断技术，可以从基因水平检测SIV的RNA，大大缩短了SI病原的检出时间，为猪流感的快速诊断提供了更敏感、更快速的方法。该方法具有省时、省力、灵敏度高、特异性强、诊断速度快等优点，已在猪流感病毒检测中得到广泛应用[7]。Lee等利用RT-PCR方法分别在临床样本中鉴定出H1、H3、N1、N2亚型猪流感病毒[8]。杨焕良等建立了猪流感病毒H1N1、H1N2、H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法，可以在2个反应体系中对猪流感HA、NA基因进行亚型鉴定，极大地节约了人力与时间[9]。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸，核酸最低检测量达2 ng。

1.2实时荧光定量PCR

實时荧光定量PCR（real-tmie flurescent quantitive polymerase chain reaction）是将荧光基团加入PCR反应体系中，利用荧光信号积累对整个PCR进程进行实时监测，敏感性远远高于普通的RT-PCR。实时PCR/RT-PCR技术是将PCR、核酸杂交、信号放大相结合的实时、在线检测的定量PCR技术，比常规PCR更灵敏、特异性更强。目前已被广泛应用于基因表达研究、转基因研究、药物疗效分析、病原体检测等诸多领域。此方法已被用于A型、B型流感病毒检测，检测流感病毒的M 基因、HA基因来区别A型、B型流感病毒，或是用于区别A型流感病毒的亚型[10-11]。段廷云等建立了实时荧光定量PCR检测H1N1亚型猪流感病毒，以NP基因的阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线。对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度、退火温度进行优化，建立最佳荧光定量PCR反应体系、扩增程序[12]。荧光定量PCR的建立为早期诊断猪流感病毒、定量分析猪流感病毒感染程度奠定了基础。张太翔等选取猪流感病毒的NP基因序列设计引物、探针，建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法[13]。张鹏超等建立的猪流感病毒SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR 检测方法对SIV核酸检测灵敏度达30 TCID[14]。陈艳等建立了H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法[15]。徐敏等建立了以RNA为反应模板的一步法荧光定量RT-PCR诊断方法，该方法操作简单，可以用RNA作为模板直接检测，节省时间，特异性好，灵敏度高[16]。张春明等根据猪流感病毒（SIV） M 基因的保守序列，设计并合成1对特异性引物及TaqMan MGB 探针，建立了SIV M 基因实时荧光定量PCR 检测方法，结果表明，该方法样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%，特异性强，重复性好[17]。Real-Time PCR技术能精确检测样品中SIV的含量，对SI临床检测诊断具有较强的实用价值[18]。

1.3基因芯片

基因芯片技术指将大量探针分子固定于支持物后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号强度而获取样品分子的数量、序列信息。通过设计不同的探针阵列，使用特定的分析方法，可将该技术用于基因表达检测、突变检测、多态性分析、基因文库作图、杂交测序、微生物检测等领域[19]。陈红军等根据流感病毒血凝素、神经氨酸酶、亚型基因序列间的差异性，分别设计H1、H3、H9、N1、N2的特异分型引物，根据M基因设计A型流感病毒的通用引物制成基因芯片，并对217 份不同地区的样品进行检测，结果表明，该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒，并显示了较高的灵敏度、特异性，灵敏度比PCR 高1个稀释度，比病毒分离高2个稀释度[20]。杨林等根据猪流感病毒的M基因序列设计了1对特异性引物，通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对SIV的检测[21]。高淑霞等制备了检测H1N1、H3N2、H5N1、H9N2 4种亚型猪流感病毒的基因芯片技术，与PCR方法相比，该基因芯片技术显示了较高的灵敏度[22]。王慧煜等建立了能同时鉴别甲型H1N1及猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法[23]。

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2我國猪流感流行现状

近年来，我国很多学者分离到不同亚型的SIV[24]。李海燕等对黑龙江省、吉林省、辽宁省等地猪群进行了猪流感血清学、病原学调查研究，从1 306份猪鼻棉拭子样品及死亡猪肺、气管样品中分离到39株H3N2 亚型猪流感病毒、12株H1亚型猪流感病毒及其他亚型猪流感病毒[25]。辛晓光等进行了黑龙江省猪流感病原学及血清学调查，1997—2002年共采集到414份猪血清样品，经猪流感血清学检查出猪流感阳性血清57份，平均阳性率为14%；采集到猪的病毒材料275例，经技术处理后接鸡胚，分离出猪流感病毒26株，表明有些猪场污染情况比较严重，直接影响猪场的生存及发展[26]。王隆柏等于2005年8—12月对福建省猪群猪流感病毒感染情况进行调查，猪流感H1亚型抗体检测的平均阳性率为530%，猪流感H3亚型抗体检测的平均阳性率为23.7%，由此可知，福建省猪群不仅存在不同程度的H1、H3亚型SIV感染，而且感染较为普遍[27]。康文彪等在甘肃省11个市州的猪群中检出猪流感H3N2抗体阳性118份，平均阳性率为2789%，其中健康猪血清检出阳性42份，阳性率为2234%；患病猪血清检出阳性76份，阳性率为32.34%[28]。朱善德等对浙江省宁波市10个县（市、区）5个猪场的457份血清进行猪流感H3N2抗体检测，结果表明，猪场阳性率为2593%，全市猪群平均阳性率为16.41%；检测健康猪血清373份，阳性率达11%；检测发病猪血清84份，阳性率达4048%[29]。姚敬明等2010年6月至2011年11月在山西省采集了1 018份血样，用ELISA试剂盒检测猪流感血清抗体，阳性率为0.98%[30]。禹思宇等2010年6月采用间接ELISA及实时荧光RT-PCR技术，对湖南省规模化猪场采集的 1 065 份猪血清、16 796份猪棉拭子、360份肺脏样品进行检测，结果显示，SIV H1N1抗体阳性率达37.84%，H1N1猪流感病毒抗原阳性率为0.12%[31]。由此可知，SIV在我国不同地区均呈现地方性流行趋势，猪群普遍受H1亚型、H3亚型SIV感染。

参考文献：

[1]Shope R E. Swine influenza：Ⅲ. Filtration experiments and etiology[J]. The Journal of Experimental Medicine，1931，54（3）：373-385.

[2]Thacker E，Janke B. Swine influenza virus：zoonotic potential and vaccination stratefies for the control of avian and swine influenza[J]. Journal of Infectious Diseases，2008，197（1）：19-24.

[3]Shinde V，Bridges C B，Uyeki T M，et al. Triple-reassortant swine influenza A （H1） in humans in the United States，2005—2009[J]. The New England Journal of Medicine，2009，360（25）：2616-2625.

[4]Gaydos J C，Hodder R A，Top F H，et al. Swine influenza A at Fort Dix，New Jersey （January-February 1976）. Ⅰ. Case finding and clinical study of cases[J]. The Journal of Infectious Diseases，1977，136（Suppl）

：356-362.

[5]Gregory V，Lim W，Cameron K，et al. Infection of a child in Hong Kong by an influenza A H3N2 virus closely related to viruses circulating in European pigs[J]. The Journal of General Virology，2001，82（6）：1397-1406.

[6]Brown I H. The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs[J]. Veterinary Microbiology，2000，74（1/2）：29-46.

[7]Phipps L P，Essen S C，Brown I H. Genetic subtyping of influenza A viruses using RT-PCR with a single set of primers based on conserved sequences within the HA2 coding region[J]. Journal of Virological Methods，2004，122（1）：119-122.

[8]Lee C S，Kang B K，Lee D H，et al. One-step multiplex RT-PCR for detection and subtyping of swine influenza H1，H3，N1，N2 viruses in clinical samples using a dual priming oligonucleotide （DPO） system[J]. Journal of Virological Methods，2008，151（1）：30-34.

nlc202309042150

[9]杨焕良，乔传玲，陈艳，等. 猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立[J]. 中国预防獸医学报，2007，29（9）：714-718.

[10]Choi Y K，Goyal S M，Kang S W，et al. Detection and subtyping of swine influenza H1N1，H1N2 and H3N2 viruses in clinical samples using two multiplex RT-PCR assays[J]. Journal of Virological Methods，2002，102（1/2）：53-59.

[11]Wang R X，Taubenberger J K. Methods for molecular surveillance of influenza[J]. Expert Review of Anti-Infective Therapy，2010，8（5）：517-527.

[12]段廷云，陈红英，崔保安，等. 实时荧光定量PCR检测H1N1亚型猪流感病毒[J]. 畜牧兽医学报，2008，39（6）：752-756.

[13]张太翔，凌宗帅，岳志芹，等. 猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医，2012，39（6）：181-184.

[14]张鹏超，师小潇，哈卓，等. 猪流感病毒SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国预防兽医学报，2010，32（10）：768-772.

[15]陈艳，张春明，乔传玲，等. H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立[J]. 中国兽医科学，2009，39（10）：894-899.

[16]徐敏，李志强，黄元，等. 猪流感病毒一步法荧光定量RT-PCR诊断方法的建立[J]. 中国兽医科学，2011，41（10）：1021-1025.

[17]张春明，乔传玲，陈艳，等. 猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2008，30（10）：805-810.

[18]Kowalczyk A，Markowska-Daniel I，Rasmussen T B. Development of a primer-probe energy transfer based real-time PCR for the detection of swine influenza virus[J]. Journal of Virological Methods，2013，187（2）：228-233.

[19]Li J，Chen S，Evans D H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology，2001，39（2）：696-704.

[20]陈红军，侯义宏，白华，等. 猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用[J]. 畜牧兽医学报，2007，38（7）：708-712.

[21]杨林，马世春，苏增华，等. 猪流感病毒基因芯片检测技术的研究[J]. 中国兽医杂志，2008，44（7）：3-5.

[22]高淑霞，王文志，张伟. 猪流感病毒低密度分型芯片的试验研究[J]. 西南农业学报，2011，24（6）：2385-2388.

[23]王慧煜，梅琳，侯义宏，等. H1N1和H3N2亚型流感病毒基因芯片检测方法的建立[J]. 中国兽医科学，2011，41（12）：1234-1241.

[24]陈君彦，李海燕，申之义，等. H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化的研究[J]. 中国预防兽医学报，2005，27（1）：13-17.

[25]李海燕，于康震，辛晓光，等. 部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定[J]. 动物医学进展，2003，24（3）：67-72.

[26]辛晓光，霍庆贵，秦运安，等. 黑龙江省猪流感疫病的血清学及病原学调查[J]. 黑龙江畜牧兽医，2002（12）：22-23.

[27]王隆柏，魏宏，陈少莺，等. 福建省猪流感流行病学调查与分析[J]. 养猪，2006（5）：47-48.

[28]康文彪，宋建国，赵春玲，等. 甘肃省猪流感（H3N2）抗体的血清学调查研究[J]. 畜牧兽医杂志，2008（1）：14-15，17.

[29]朱善德，鲍伟华，卢黎明，等. 宁波地区猪流感（H3N2）抗体的血清学调查研究[J]. 兽医导刊，2009（5）：39-40.

[30]姚敬明，樊振华，杨裕，等. 山西猪流感分子流行病学调研[J]. 养猪，2012（2）：115-116.

[31]禹思宇，易征璇，孟芳，等. 湖南省规模化猪场H1N1猪流感流行病学调查[J]. 湖南农业科学，2011（5）：126-128.

王丹，吕小红，付立东，等. 不同收获期对水稻茎秆抗倒伏性状的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：61-63.

病毒学方法技术研究 第4篇

即时通信(Instant Messenger,IM)是指在公共电信系统以外也能够即时发送和接收互联网消息等的业务,特别是随着互联网、计算机、智能手机以及WIFI的普及,即时通信技术在交流、资讯、娱乐、教育、医疗、搜索、电子商务等方面得到了广泛的应用[1],因此也就和互联网、计算机一样容易受到各类病毒的攻击。那么,对于IM用户来说,对各种病毒入侵的防范方法和抵制措施必须进行了解和掌握,但是作为新一代用户来说,大部分对于IM的安全问题可以说是全然不知,对于如何使用和操作IM才是安全的,才不会出现信息的泄露和账户的入侵[2],要让用户有清楚的认识和了解,这就需要笔者进行研究分析,找到一套系统的适合IM用户防御和抵制病毒入侵的方法和措施供大家了解和掌握。

2 IM技术安全现状

随着互联网、计算机、智能手机以及WIFI的普及IM技术在交流、资讯、娱乐、搜索、电子商务、教育等方面得到了广泛的应用[1],所以IM技术安全问题对于每个用户来说是非常重要的,因为安全是IM得到可持续发展的重要条件,只有IM系统有了一套系统的防御和抵制病毒入侵的方法和措施,那么病毒才不会轻易的入侵IM终端和客户端。查阅相关的文献资料发现IM技术安全现状存在以下问题:

2.1 安全防护措施比较薄弱

IM技术广泛的应用到个人生活、单位、企业等各个领域,但是据有关统计数据发现,安全防护管理环节相当的薄弱,由于IM系统应用范围广,许多企业和单位都在通过IM系统进行业务处理和相关的义务办理,而且IM系统的安全性能比较低,所以这些企业如果不加强防护措施的管理,那么信息泄漏的危险系数更高。调查发现在美国有70%的企业或者公司都是通过IM系统进行业务办理或者业务的拓展,而只有10%的企业或者公司进行了IM系统的防护措施管理[3]。

管理的模式如图1所示:此模式是IM技术安全防护现阶段常用的实体模式,IM系统的参与者包括:IM服务器、IM客户端和病毒。IM服务器主要是通过Internet进行信息、文件、数据、音视频的输入和输出,通过此模式可以看出IM服务器系统的病毒侵入可能是任何人,有可能是外部的入侵者也可能的内部的侵入者,那么不管是外部病毒或者内部病毒入侵了服务器,服务器的信息、文件、数据、音视频资料都有可能被病毒截获、阻止或者窃听,所以防护措施较简单容易被病毒入侵。

2.2 使用者和操作者安全意识淡薄

IM作为新时代的产物,其自身的特点是方便、廉价、快捷,所以深受个人和企业的亲昧,但是安全问题对于大多数的使用者和操作者来说仍然是一个陌生的词汇,对于大多数个人用户来说对IM的安全级别要求不会太高,因为即使他们的IM系统被病毒入侵给他们带来的经济损失也是比较小的,所以大多数个人用户对IM的安全问题不太重视,这是不是意味着IM的安全对我们不重要了?答案肯定是否定的。从广域的层面来讲IM安全是一个体系,它包含防火墙,软件系统漏洞扫描,防毒网关等级,边界防御以及重要设备重大软件安全等方面,这个体系构成整个IM安全体系[4]。这套体系对于IM使用者和操作者来说是防御外部病毒入侵抵挡黑客攻击的第一道防御,也正是有这一套体系大多数用户能够安全放心的使用IM,但是另一方面来说,防御体系抵御外来入侵却无法抵挡来自客户端内部的安全威胁,因为对于相当一部分使用者和操作者来说都缺乏必要的防御措施,只要从IM终端登录就可以直接进入IM客户端,这种登录方式便捷但是存在一定的安全隐患,实践证明很多IM安全问题就是因为客户端出现了问题,对于用户来说再强的防御体系如果不能从自身抵挡病毒的入侵也达不到真正的安全。

3 IM安全威胁分析

3.1 欺骗性的软件使数据安全性降低

如图2所示,由于欺骗性的软件过多,例如:(1)MSN Messenger、Yahoo Messenger、QQ等广泛应用的IM系统对文本聊天的信息都是不加密的;(2)伪冒信息;(3)身份伪冒;(4)身份劫持;(5)蠕虫病毒与木马病毒恶意软件攻击等欺骗性的软件,而且防护措施不到位,导致IM终端(主机)、Internet、IM客户端A随时都可能被欺骗性的软件入侵,导致IM终端和IM客户端受到病毒的入侵导致服务器和客户端瘫痪[5]。

可以看出随着IM发展的速度加快,各种欺骗性的软件也是应运而生通过IM系统进行传播,这就产生了许多的安全问题,比如在传输数据的过程中由于安全性能低导致密码很容易泄露,比如铺天盖地的信息存在安全隐患,有些信息是病毒,一旦打开就会出现信息泄露,再比如用户在IM上进行电子阅读和进行电子商务的时候就容易出现一些非法信息的弹出,也就是我们常常听到的一个名词叫做钓鱼网站,尤其是随着IM的不断成熟出现了电子购物以后,各式各样的钓鱼网站开始入侵,这种钓鱼网站的最大特点就是通过假冒的IM链接诱骗用户访问这个假冒的钓鱼网站,在假冒的网站上输入一些个人的保密信息,如银行卡密码,身份证号码、网购的账号密码和支付宝密码等等[6]。

3.2 服务器区域没有进行独立防护

如图3所示,只有IM终端设置了独立的防火墙,而IM客户端A和IM客户端B都没有设置独立的防火墙,正因为客户端没有设置独立的防火墙,这就容易导致病毒入侵客户端最后传输给IM服务器,导致整个IM系统被病毒攻破。

IM的优点是可以通过IM平台进行交流、资讯、娱乐、搜索、电子商务等,其工作模式是IM的主机服务器可以连接多个分机[7],主机可以通过传输数据、文字、音视频等资源,虽然主机服务器已经装载了防御系统设置好了怎么抵御外部的入侵[8],这一系统的设置无论是从硬件上还是软件上都能完全抵御外部的入侵,但是对于连接到服务器的分机来说抵御外部入侵的防御措施基本为零,这样做的目的是为了访问更加便捷和快速,虽然给用户带来了方便但是也存在弊端,那就是一旦连接服务器中的分机有一个受到病毒的感染,其它访问服务器设备在进行IM资源共享的时候很容易受到感染,比较典型的例子就是在一家大型的电子设备生产企业通过一台服务器共享重要信息资源,但是由于一台终端设备被不慎接入带有病毒的程序,很快整个IM涉及到的所有设备都受到了影响,造成的损失是很大的。

3.3 IM病毒及恶意代码的威胁

IM病毒是一种能够识别的代码,它们在编程的过程中只是各自的目的不同而已,一种是合法的那么就会当作正确的命令,另一种是不合法的它们的目的是通过编译的程序破坏他人数据安全那么这就会被当作病毒[9]。那么,为了不让病毒入侵首先就要做好客户端的防毒装置和防御病毒设置工作,因为说到底,如果主机不连接外来设备是不会感染病毒的,将设备的病毒防护做好可以在源头上堵住病毒的传播,而在现实中操作者和使用者往往容易忽视这一问题,在日常操做和使用过程中往往忽视了及时修补操作系统的漏洞,而且在下载软件的过程中也不注意下载的软件是否带有病毒或者恶意插件,这就是存在的根本问题。有权威的数据表明,在实际的IM访问过程中有百分之二十的用户会在不知觉中下载安装了带有恶意插件,这些插件往往会引导用户访问IM的时候访问特定的网站,从而形成一定的利益链条[10]。

3.4 IM用户安全意识不强

IM安全问题成为了现阶段讨论的一个热点课题,这些问题的出现究其原因主要还是用户在使用和操作的过程中安全意识淡薄,总是存在侥幸心理认为偶尔一次的拷贝或者进行移动存储是安全的,也正是带着这种侥幸心理,在使用内部IM的时候私自使用外来存储设备[11],这很可能会被病毒和非法程序攻击。在实际的使用中存在一机多用,比如会有不同的人使用同一台IM,而期间也不会有必要的身份审查和存储设备审查,一旦该设备接入内部IM,受到病毒感染的外部设备内的程序代码很容易直接进入IM内部,破坏数据并在与设备相连接的服务器之间传播[11],造成的主要后果就是数据丢失或者是账号密码被盗等严重后果。

4 IM安全控制与病毒防治策略

4.1 IM安全控制策略

4.1.1 提高IM安全控制系统的防护措施

IM的安全控制系统核心在于对于客户端的安全防护,因为目前来说IM所出现的大多数问题都是IM内部的使用过程中的操作不当或者不正确使用造成的[12],而外界的IM入侵可通过可靠地安全防护措施进行保护,内部的终端设备的使用却具有更大的不确定性,规范使用和制定严格的使用条例是最为行之有效的方法,IM的安全运行需要内部和外部安全的同时运作,才能保证用户正常的使用,而想要达到完全防护的状态就要做到以下几点:

(1)入网控制,所谓入网控制就是设立用户和用户组的访问权限[13],也就是说,首先要确立权限也就是哪些用户可以做什么,哪些用户不可以做什么,设立权限的目的就是防止一旦用户的账号密码丢失或者被窃能够避免过高的操作权限而丢失更多的资源,也可以通过IM权限设置设定用户的访问时间。这样对用户的使用和操作做了进一步的规范。即使是IM用户进入IM内部也因为有权限设置只能进行权限内的用户操作。再有就是强制性的密码登陆,密码登陆能够有效的屏蔽掉非本机人员操作,设置密码要有相应的安全规范,更改口令需要经过控制台的确认,在发现不符合安全或者非正常的用户登陆可以在远程将与服务器的连接断开,这就大大的提高了整个IM内部的安全性[14]。

(2)防火墙的设立技术,所谓防火墙顾名思义就是起到隔离作用,与用户权限设置不同的是,防火墙是通过隔离IM内外进行防护的,在日常的使用过程中会体现为提示经过防火墙的所有程序是否能够被信任为安全程序,从外网进入内网都要经过防火墙的“询问”是不是用户同意入网,这种监测是强制性的,能够有效的抵御一些病毒的入侵,就目前来说比较成熟的防火墙技术有很多,以下就介绍为技术人员常用的几种方法:

1)访问IM进程跟踪,进程跟踪式防火墙技术的基本部分,在设立防火墙的同时就确立访问IM的合法性,判断该IM上的数据是否存在异常,如果存在非法的数据传输需要进行有效的拦截,发现长时间的非正常数据传输能够断开IM,使每一个程序的使用都能够“透明化”。

2)应用层闸通道型,这种方法就是设立协定标准,从头至尾控制连线动作,只要是不符合的程序马上就能发现,但是这种方法需要针对程序写出代理程序,实施起来工作量很大但是最安全同时也最为繁琐。

3)属性安全控制,属性安全是指用户对于终端设备内部的文件的删除,修改权限,也涉及到数据拷贝,隐藏文件,设置更改文件属性的权限是对内部文件的最为基本的保护。

4)专业杀毒软件检测,随IM的普及杀毒软件已经成为每台IM上必备的软件,作为作为基本的防毒措施,IM内部要选定合适的杀毒软件并统一安装,通常的做法是用强制安装的方法使每台IM都装有专业的杀毒软件。

5)IM入侵检测技术,一般来说未经过用户同意企图进入IM内部或者试图破坏内部系统的行为都属于IM入侵,这种行为往往存在着恶意的企图,入侵检测技术是要全面的检测与终端设备相关的IM行为,从内到外,对外是要检测出是否有用户在恶意的攻击IM,并针对攻击行为进行记录,而对内就是发现是否有内部用户进行不正当的文件拷贝或者信息传递,是最为重要的安全防护措施[16]。

4.1.2 加快基于PKI的即时通信身份管理的实施

IM系统具有移动性速度快、分布性比较广泛而且通信对象都是不确定的,所以利用PKI的证书身份认证进行IM身份管理是最佳的IM安全控制措施[15]。但是这个身份认证证书可以是由相关的独立颁发机构进行发布,也可以由即时通信服务开发商进行证书的发放。不管是谁发布这个证书都必须对登陆和使用这进行身份的验证,必须通过一种安全的方式将认证证书和私钥交给用户。这样就有利于对IM安全系统进行控制。

4.1.3 加强使用者和操作者的IM安全培训

IM是由人来操作和使用的,要解决IM的安全问题首先要加强人的培训尤其是IM的使用者和操作者,如果每个IM的使用者和操作者都能够按照正规的操作程序进行正常操作,这就能有效的控制IM遭遇病毒的入侵的概率[12],这就需要IM管理者在进行初始使用环节就进行相应的培训,那么使用者和操作者要如何做才能够有效的避免病毒的入侵,首当其冲的是需要使用者和操作者提高安全意识。因为数据安全无价,要设立完善的终端设备使用指南和使用规范条例,将病毒的感染几率降到最低,建立完善的IM安全防护软件系统,而针对IM内部的使用者的培训需要从以下两个方面进行:

(1)培养使用者和操作者的安全意识

要将这种安全意识深深的扎根于每一个使用者和操作者的潜意识中,让他们随时提高警惕,任何时候都能够按照一定的规范和方法进行操作和使用。

(2)培养使用者和操作者规范登录和使用IM

使用者和操作者在登录客户端的时候一定要设置身份认证协议,现阶段IM系统在登录与身份认证阶段基本都是使用的C/S模式,这种模式在现阶段使用的过程中是比较成熟的身份认证协议[17]。同时,还可进行数据加密与签名协议,因为数据加密有独立于IM的网络层/传输层加密和IM自带的应用层,所以也广泛的被应用。

在IM服务器上浏览的过程中一定要注意不要去访问一些非法网站,同时,还要掌握一些最基本的IM的安全常识,不要下载和安装一些软件,养成良好的使用和操作习惯,同时养成定期杀毒维护的习惯。这就要求使用者和操作者在日常的使用和操作的过程中不受虚假信息的诱惑,不去贪图小的便宜,以免造成不必要的损失。

4.2 IM病毒防治策略

4.2.1 即时信息输出/输入IM病毒防治方法

通过以上的分析可以发现,目前IM系统出现病毒的入侵主要是在操作过程中和信息的传输过程中造成的,所以笔者对IM的病毒种类进行了研究和分析,并且借助于已有的成功防护IM病毒的案例,根据笔者的实践经验和相关的技术方法设计出了相应的IM病毒防治策略。

为了保障IM系统的信息和数据在输出/输入的过程中不被病毒入侵,笔者将公钥基础设施(public key infrastructure,PKI)机制应用到了IM病毒防治方法中。PKI机制中一个很重要的概念就是公钥和私钥,每个用户都有其配对的公钥的数据进行加密和验证签名,私钥用于对数据进行解密和签名[18]。如图4所示。

即时信息输出/输入IM病毒防治方法具体防治模式是:A可以用B的公钥对输出消息进行加密得到G1,接着用自己的私钥对G1进行签名得到F,然后将G1+F输出给B,B接收到G1+F后用A的公钥进行验证签名,验证通过则说明G1+F在传输的过程中没有被篡改,此时B可以用自己的私钥对G1进行解密,并得出原始输出消息G[19]。通过对IM系统中输出/输入的信息进行加密、签名以及相应的验证签名、解密等安全处理,使这些输出/输入的信息得到有效的传输,不会轻易的被病毒入侵。

4.2.2 IM病毒防治的措施

如图5所示,要防护病毒的入侵,首先要对IM终端和IM客户端设置独立的防火墙,这样病毒就不会轻易的破环整个IM系统,即使IM客户端A受到了病毒的入侵,那么客户端B和终端自己独立的防火墙也不会被病毒轻易的攻破。

5 结束语

本文的IM病毒防治策略在自建的IM系统中已经实施两年了,通过以上的IM病毒防治效果统计表(表1)可以看出:在自建的IM系统没有实施病毒防治模式前2012到2013年IM病毒防治的措施不到位导致病毒入侵的有8次;病毒及恶意代码的入侵的有9次;IM用户由于安全意识导致病毒入侵的有8次。可以看出2012到2013年自建的IM系统每年至少要被各种病毒入侵12次IM系统出现故障或者瘫痪。而从2014年到2015年对自建的IM系统实施病毒防治模式后IM病毒防治的措施不到位导致病毒入侵的有1次;病毒及恶意代码的入侵的有3次;IM用户由于安全意识导致病毒入侵,;可以看出2014到2015年自建的IM系统每年被各种病毒入侵的只有2次导致IM系统出现故障或者瘫痪。这就证明了这些病毒防治策略是切实可行的。下一步的研究目标是把上述策略以适当的形式应用到目前主流的IM应用中去,以提高这些病毒防治策略的实际应用价值。

摘要：IM作为新时代的产物,越来越受到人们的亲昧,随着IM的不断成熟,它也慢慢的走进了个人生活、单位和企业,虽然给个人生活、单位和企业带来了廉价、快捷和方便;但是随之而来的IM安全问题也逐渐的凸显出来,这样一个新的课题摆在我们面前,我们究竟应该如何解决,是本文解决的根本问题,本文将重点分析IM的安全现状、在使用IM中常见的安全问题、安全控制与病毒防治策略方面的问题及防治方法所产生的效果。

病毒学方法技术研究 第5篇

【关键词】马铃薯纺锤块茎类病毒;生物学鉴定法

0.前言

马铃薯种薯退化的主要原因是感染病毒病和类病毒，病毒是造成马铃薯品质下降和产量降低的主要原因。

马铃薯纺锤块茎类病毒是世界上一类检疫病害，对于严格的植物检疫而言，类病毒是相当重要的，它也是育种和遗传资源保存中的一种棘手的病原。大田中，PSTVd可以造成严重减产，在中国，一些感病的地方品种的减产幅度高达80%,PSTVd和其他病毒复合侵染可能引起更严重的病害。

为了摸清马铃薯纺锤块茎类病毒在我省发生分布情况，我们于2008年开展了本项目的研究工作。

1.材料与方法

1.1材料

用来实验的品种—米拉、早大白、花525、克851、克新12号、东农303、克新1号、克新2号、克新3号、克新4号。上述品种分别来自于哈尔滨、齐齐哈尔、嫩江、扎兰屯、牙克石、绥化、依安、讷河、克山马铃薯种植区。

用于进行生物学鉴定所需设备：防虫温室、铁架子、花盆（大号、中号、小号）、黑土（必须用筛子筛才能用）、马粪（必须发酵后用筛子筛完后才能用）、大铁桶（储存水）、大衣盆、刷子、洗衣粉（这三样用来清洗花盆，花盆每年用前必须刷干净）。筛子、铁锹、筐、推车、喷壶、塑料管、遮阳网、尿素（用来促进植珠生长）、金钢砂、研钵。

用来进行生物学鉴定的指示植物，植物种类：黄苗榆烟、白肋烟、大千豆、心叶烟、伯尼烟、香料烟、三生烟、黄花烟、紫花球果蔓陀罗、白花剌果蔓陀罗、毛蔓陀罗、洋球浆、假酸浆、黄姑娘、小圆椒、指尖椒、千日红、Saco、S41956、直房丛生番茄、鲁特格尔斯番茄、天蓬子、莨菪、黑龙葵、黄龙葵、野生马铃薯（sdanam.Berthaulthii）。

1.2方法

1.2.1指示植物种子的培育

将以上列举的指示植物播种于花盆中，花盆中事先浇透水，播完种子后上面覆0.5cm厚土。

1.2.2指示植物的移栽

在指示植物长至2-4叶子并有较强的根系时可将植珠带土定植到另一花盆中。

1.2.3指示植物摆组接种鉴定

将上述提到的指示植物摆组，每组中包括上述提到的每种指示植物，每组中系统侵染的植株摆一盆，局部侵染的植珠摆两盆。接种前，将接种叶掐尖，每个指示植物掐4-6片叶子，然后三天后调查马铃薯纺锤块茎类病毒侵染各种指示植物的情况，仔细记录各个指示植物的症状表现。

从7月1日至7月23日前往哈尔滨、齐齐哈尔、嫩江、扎兰屯、牙克石、绥化、依安、讷河、克山马铃薯种植区，采取有病植珠叶片，每个种植区按照“X”路线，采取5个点采样法，每点采20个样品，每个种植区共采100个样品。每份样品剪碎后放入研钵中，加入1：10倍的磷酸缓冲液充分研碎成糊状。接种前，将接种叶掐尖，每个指示植物掐4-6片叶子，然后在叶片上用喷粉器喷上金钢砂，用一个手指蘸病毒汁液在接种叶上轻轻主摩擦，再用清水冲洗接种叶上的杂物（多余金刚砂和植物组织）。三天后调查马铃薯纺锤块茎类病毒侵染各种指示植物的情况，仔细记录各个指示植物的症状表现。

当从种植区采取的植珠叶片的汁液接种在鲁特格尔期番茄上在室温25-37℃和光照16小时强光条件下，接种半月后蕃茄中，上部叶片变窄小和扭曲时，植珠中含有马铃薯纺锤块茎类病毒病，无症状的或其它症状的不能证明该植珠中含有马铃薯纺锤块茎类病毒。

当从种植区采取的植珠叶片的汁液接种在莨菪(scorolio sinensis)上，在室温20-22℃和弱光条件下，接种3-5天或10-15天接种叶片沿脉，出现褐小坏死斑点时，该植珠含有马铃薯纺锤块茎类病毒，无症状的或其它症状的不能证明该植珠中含有马铃薯纺锤块茎类病毒。当从种植区采取的植珠叶片的汁液接种在天蓬子上，接种5-7天，温度在20℃弱光条件下，接种叶片沿脉出现褐色坏死点时，该植珠含有马铃薯纺锤块茎内病毒，无症状的或其它症状的不能证明该植珠中含有马铃薯纺锤块茎类病毒。

2.结果与分析

用生物学鉴定法分析黑龙江省马铃薯纺锤块茎类病毒的发生情况。

将2008年通过生物学鉴定法，鉴定黑龙江省马铃薯纺锤块茎类病毒的发生情况，见表1马铃薯品种含PSTVd的鉴定情况。

表1 马铃薯品种含PSTVd的鉴定情况

从上表看出：以黑龙江省主要马铃薯产区的马铃薯病株1000份作为被分离鉴定材料，共接种3000次。

2008年生物学的鉴定结果表明：哈尔滨、齐齐哈尔、嫩江、牡丹江、扎兰屯、牙克石、绥化、依安、讷河、克山均有马铃薯纺锤块茎类病毒病的发生。从表1中看出：哈尔滨PSTVd发病率4.6%、齐齐哈尔PSTVd发病率1.3%、嫩江PSTVd发病率2.6%、牡丹江PSTVd发病率6.0%、扎兰屯PSTVd发病率8.1%、牙克石PSTVd发（下转第285页）（上接第327页）病率4.8%、绥化PSTVd发病率6.1%、依安PSTVd发病率7.9%、讷河PSTVd发病率1.0%、克山PSTVd发病率2.3%。

3.结论

通过用生物学鉴定法，分析黑龙江省马铃薯纺锤块茎类病毒的发生情况，表明哈尔滨、齐齐哈尔、嫩江、牡丹江、扎兰屯、牙克石、绥化、依安、讷河、克山均有PSTVd存在，平均发病率在1.35～8.1％。应当积极研究防治马铃薯纺锤块茎类病毒的措施。

【參考文献】

［１］李芝芳,等.我省马铃薯退化及其防治的研究.黑龙江省农业科学,1980,1.

［２］k·A fernow.用番茄作为鉴定马铃薯纺锤块茎病弱系的试验植物.phgtophologg·vol·st(1967)pb47.

［３］r p sing.马铃薯纺锤块茎病毒的寄主范围.Amer potato J vol 50 No4.

局域网蠕虫病毒检测方法研究 第6篇

研究对象为利用采用TCP协议的应用系统漏洞进行传播并采取随机IP地址选择的快速蠕虫病毒。由于TCP协议是面向连接的协议,因此利用TCP协议漏洞传播的蠕虫病毒,在发现和感染网络中其他计算机时,必须建立TCP连接。目前已发现的TCP蠕虫病毒中有99%以上的蠕虫病毒都采用全连接或SYN扫描,因此TCP蠕虫病毒爆发网络中会出现大量的SYN数据包,我们可以通过对主机发出SYN数据包的频率和SYN数据包本身的规律来判断该主机是否正对网络进行扫描。当网络上的主机向外发出的SYN数量达到一定的数量时,考虑当前是不是有蠕虫病毒爆发。

传统的基于SYN扫描检测的蠕虫病毒检测系统通常采用阈值检测方式,即如一段时间内主机向外发出的SYN扫描包个数超过了阈值即报警,发现蠕虫病毒扫描行为。这种检测方式阈值不好确定,阈值设置高了即使蠕虫病毒爆发也无法作出预警,导致漏报,阈值设置低了,会产生误报,降低检测工具的可用性。比如当网络中服务器出现故障时,客户端会不断发送SYN连接导致网络中SYN数据报增加,这种正常网络行为也会被认为是蠕虫病毒行为,导致误报。

要想准确的对蠕虫病毒进行预警,首先要分析其产生的SYN流量与正常网络中SYN流量的差别,由于蠕虫病毒是尽可能多的感染网络中其他主机,因此其SYN包通常都是发往不同IP的,当网络出现故障时也会引起SYN数据包数量变化,但通常这种SYN包是由客户机发往服务器的,其目的IP通常是同一个。

连接度是指在一定时间t内,把一台主机i向不同的IP地址发出TCP SYN数据包的个数n定义为主机i的相对于时间片为t的连接度。由连接度的定义可以看出,连接度的大小反映了主机对外连接的发散程度,与以往只检测主机向外发出的SYN数据包个数进行检测相比,连接度是对向不同主机发出的SYN数据包数量进行检测。相同两个主机之间的连接异常也会引起SYN数据包数量的变化,但并不影响连接度的变化,连接度的定义排除了因两台计算机之间因通讯异常导致的SYN数据报变化对检测系统的影响。蠕虫病毒在爆发时通常会尽最大努力发现和感染网络中的其他计算机,因此其向不同主机发出的SYN连接请求会比正常网络应用大很多,会引起连接度的异常。

以时间为横坐标以连接度大小为纵坐标对主机连接度进行间隔采样,从图形中可以看出,主机在一个采样周期内总的连接度就是图形曲线与横坐标围成的图形的面积,也就是连接度函数f(t)在采样周期内的积分值。为了去除采样周期和采样频率的影响,主机连接度的大小通常用平均值Avg来表示。

在一个采样周期[T,T+T0)内主机连接度f(t)的平均值为Avg,如果把T取为时间原点(T=0),则:

为了方便程序实现,在编程实现时,通常在该周期上致密地取m个样本点,Avg的离散化形式可以表示为:

Avg的值从总体上反映了主机i在某一周期上的连接度大小情况,它对于局部的连接度流量变化反应不是很灵敏,但是如果该主机被蠕虫病毒感染,变化最剧烈的就是Avg值,根据近几次蠕虫病毒爆发时积累的资料数据显示,当主机感染蠕虫时,其连接度均值Avg的值可以改变为平时的30倍以上甚至更高。

针对TCP蠕虫病毒建立了完整的网络连接度流量模型,定量地描述了一个特定网络。利用连接度的大小和连接度流量的曲线形状结合来发现异常。可以对蠕虫病毒的爆发做出准确预警。基于连接度异常的蠕虫病毒检测算法同样也存在缺点需要改进,比如对隐蔽性比较强的慢速蠕虫病毒无法进行检测,应结合模式匹配技术,使系统的应用范围更广。由于本系统同样是属于基于统计的蠕虫病毒检测算法,需要一定的时间来采集和分析数据,不能实现实时的蠕虫病毒检测。

摘要：针对TCP蠕虫病毒建立了完整的网络连接度流量模型,定量地描述了一个特定网络。利用连接度的大小和连接度流量的曲线形状结合来发现异常。可以对蠕虫病毒的爆发做出准确预警。

基于免疫原理的病毒检测方法研究 第7篇

1 计算机免疫学的概述

“免疫”原由拉丁字“immunis”而来,其原意为“免除税收”(exception fromcharges),也包含着“免于疫患”之意。免疫学(Immunology)研究机体免疫系统的组成(免疫器官、免疫细胞和免疫分子),识别(自己、异己)并消除(异己)有害生物(体外入侵,体内产生)及其成分的应答过程及机制的科学。

计算机免疫学(Computer Immunology)[1]一词最早由Forrest等人提出,他认为计算机免疫学是一门基于生物免疫学、人工免疫、以及计算机科学等的交叉学科,主要利用最新计算机科学技术,研究有关人工免疫的理论、规则、算法、模型等,并将这些理论应用于具体的应用系统中,解决实际的应用课题。目前国内还没有统一的说法,现在计算机免疫学的同义词有很多。例如计算机免疫系统、免疫计算、免疫计算机、人工免疫、基于免疫的系统等。总之,计算机免疫学是一门多学科领域的、边缘交叉学科。

2 计算机免疫学研究的现状

1974年,丹麦学者Jerne提出了免疫系统的第一个数学模型,奠定的免疫计算的基础。由于在免疫学上的杰出贡献,1984年,Jerne因此获得诺贝尔奖。

1994年,美国学者Forrest,Perelson等人提出了否定选择算法,用来生成检测器,完成了检测器的耐受过程,提出了计算机免疫系统的概念。

在国内,有关计算机免疫的相关研究刚起步不久。2002年,武汉大学的梁意文教授利用免疫原理对大规模网络入侵检测和预警技术进行了研究。

2002年6月,IEEE Transaction on Evolutionary Computation出专刊报道了有关人工免疫系统(Artificial Immune System,AIS)的研究进展,2002-2004年,国际上举办有关人工免疫的学术会议达20多次。

2003年,中国科学技术大学研制了一个“基于人工免疫的入侵预警系统”,该系统具有较好的未知入侵检测能力。

2004年,四川大学计算机网络安全与研究所提出了基于免疫的大规模网络入侵动态取证,以及网络安全风险检测与控制技术[2]。

武汉大学提出了基于多代理的计算机安全免疫系统检测模型及对Self集构造和演化方法,并在“Self”、“Non-self”的识别规则上进行研究,提出了用演化挖掘的方法提取规则;武汉大学与北方交通大学合作,提出了基于主机安全扫描的计算机免疫系统检测;北方交通大学提出了一种基于免疫入侵检测模型,并将随机过程引入计算机免疫研究;南京航空航天大学对利用免疫机理进行抗病毒技术进行了研究;北京理工大学自动控制系从控制论的角度论述了计算机免疫和生物免疫的相似性,提出计算机防病毒领域中应用多代理控制技术构筑计算机仿生物免疫系统[3]的可行性和实用性。

3 基于免疫原理的病毒检测方法概述

建立计算机免疫系统的基本问题是确立生物免疫系统和计算机免疫系统之间的基本元素对应关系,主要模拟生物免疫系统中有关抗原处理的核心思想。包括抗体的产生、自体耐受、克隆的扩增、免疫记忆等。

人工免疫理论在病毒检测中的基本原则:计算机系统(网络系统)看作“自体”,把病毒(或入侵)看作“非自体”或者“抗原”,与已知病毒相应的可以生成“抗体”,该抗体能够识别“抗原”,“抗体”按照一定的算法进行变异和进化,可以实现免疫应答(即一次应答识别新“抗原”,二次应答识别旧“抗原”),并保持自适应性和自稳定性的特征。总的来说,基于人工免疫理论的反病毒方法能够自适应识别新病毒。文章结合生物免疫原理构建了基于免疫技术的计算机病毒检测模型,并重点讨论了病毒检测体系的部分模块的算法设计及技术实现。

4 基于免疫原理的病毒检测模型研究

4.1 自体和非自体

生物免疫系统的基本功能就是识别自体和非自体。免疫系统不仅能识别已知抗原,同时还能够识别未知抗原,并且对再次入侵的抗原发生快速反应,即二次免疫应答。可以看出如何定义自体和非自体对免疫系统能否正常工作至关重要。

众所周知,生物免疫系统的自体和非自体是形态不同的蛋白质链。在其他领域其定义有所不同,如计算机领域是不同的01-字符串。经过抗原提取和检测器生成,问题空间P被分为连个子集S和T,自体集S∈P,非自体集T∈P,S和T具有相同的结构,都是01-字符串。

4.2 匹配规则

我们知道,匹配规则是确保系统高效工作的重要方面。因为在产生检测器时要用到匹配规则,在进行入侵检测时也要用到匹配规则。病毒检测系统中有两种常用的匹配规则:汉明距离匹配规则和r-连续位匹配规则。本模型选择r-连续位匹配规则。对于任意两个长度为L的字符串a和b,如果两个字符串a和b在相应位置上至少r连续相同,则这两个字符串是r-位连续匹配的。在r-连续位匹配规则下,如果存在一个连续匹配的子串,其位数之和≥r,则入侵检测系统认为被检测字符串属于非自体,即是病毒。

4.3 自体耐受

免疫系统的功能就是检测并消除外界病原体的入侵,免疫系统能否正确区分自体/非自体的能力是至关重要的。自体耐受[4]模拟免疫细胞在胸腺中的成熟过程。在自我与非我区分算法中,新墨西哥大学的Stephanie Forrest提出的否定选择算法[5]得到了学术界广泛的认可,此算法主要应用在检测器生成过程中。其机理如图1所示。

4.4 检测器

系统使用检测器(Detector)模拟生物免疫系统淋巴细胞的功能。它融合了B细胞、T细胞和抗体的性质,用于检测和识别病毒。在生物免疫系统中对免疫起关键作用的是抗体,在入侵检测系统中起关键作用的是检测。能否检测出病毒关键在于检测器的优劣。故对检测器的设计是整个检测系统最为关键的部分。文章的检测器采用的是常用检测器和记忆检测器相结合,分别放在表tb_dc和tb_dm中,具体功能结构如图2所示。

我们知道,检测器集的规模越大,它作为一个群体的多样性就越高,算法陷入局部最优的危险性就越小。所以,从群体多样性出发,检测器规模应该较大,但是检测器规模过大又会严重影响算法的性能。因此本系统最终限定Dc规模为102数量级。同时本系统在检测器生成更新方面采取了比较好的解决策略,这样做可以使系统检测器不断更新。具体的流程如图3所示。

对于具体的检测器的产生、更新过程,本系统采取的方式是利用四个线程来实现,分别是:

1)InitDcRandThread:初始Dc线程主要是随机产生24位字符串,经自体耐受成功后加入tb_dc;

2)ControlVatiateThread:可控变异定义一种变异形式,即从tb_dm中随机取出一个记忆检测器,取首尾各两个字符随机变异然后经自体耐受,成功后加入tb_dc;

3)RandVariateThread:负责从tb_dc中随机取出一个常用检测器,然后从中取出四个字符进行变异,经自体耐受成功后加入tb_dc;

4)ImmuneStudyThread:免疫学习线程不定时扫描tb_dc,若发现匹配次数大于等于进化阈值,将其加入tb_dm,同时删除在tb_dc中的该记录。

四个线程运行都有条件限制:1)数据库已正确连接;2)检测器规模未达到预定size。由于四个线程都要访问数据库,同时人工导入时也要涉及数据库的操作,为了保持数据的完整性,必须对两个方法同时加上synchronized关键字,这样可以保证其查询和更新数据库方法具有互斥限制的作用。

5 算法设计及技术实现

5.1 设计思想

将正常的程序代码集合定义为自体集,用随机生成的初始检测元和自体集中的代码匹配,利用负选择算法将初始检测元中与自体集匹配的检测元删除,剩下的则为成熟检测元(即抗体)。任意一个入侵抗原,将和所有成熟检测元进行匹配,如果匹配成功,则将抗原删除;对于与抗原亲和力很高的抗体,通过克隆选择算法进行繁殖再生;对于低亲和力[6]的抗体将在其达到生命周期时删除。对于与抗原有较高亲和力的抗体可进行遗传变异,以提高它的亲和力。由于抗体之间也有亲和力,因此对于每一个新产生的抗体都要与所有抗体进行亲和力的测试,期间对于与其他抗体有高亲和力的抗体要将其删除。

5.2 具体设计

以十六进制字符集G={0,1,,9,a,,f}表示代码集合,自体集S为正常程序代码集合,以观察3～5天的计算机运行状态未出现异常情况为正常程序代码集合,非自体集T为病毒程序代码集。满足:S U,T U,S∩T=φ,S∪T=U其中U=∪+∞i=16Gi。检测元用长度为24位的十六进制的病毒基因码来表示。设检测元为b,病毒为v,b对v的识别可通过计算两者之间的亲和力来控制:亲和力越高,b和v之间就越匹配,当亲和力达到一定阈值时,就说b识别了v。在成熟的检测元集合中,对抗原表现出高亲和力的检测元将被克隆,其中克隆的一部分检测元被转入记忆检测元集合,另外一部分继续留在成熟检测元集合中。生物免疫系统可以记忆以前入侵过的抗原,在下次入侵时可以进行快速的反应。计算机免疫系统也是一样。由于检测元的个数是有限度的,因此设定了每个检测元的生命周期。当那些成熟检测元中的“惰性”检测元达到生命周期时将被删除,这样就可以达到检测元不断被更新的目的,从而使得系统对病毒新品种及新变种具有恒久的检测识别的能力。

6 结束语

针对计算机病毒新品种及已知病毒新变种的难以检测问题,该文首先分别阐述了免疫学和计算机免疫学,然后结合生物免疫原理构建了基于免疫原理的计算机病毒检测模型,最后重点讨论了病毒检测体系的部分模块的算法设计及技术实现。并且该文提出的病毒检测方法具有自体耐受和检测器更新、进化,它克服了传统的病毒检测系统只能检测已知病毒的缺点,解决了新病毒及病毒新变种不能被识别的问题,是病毒检测方法中一种新的探索。

摘要：随着计算机及其因特网的飞速发展,信息资源得到了充分的共享,但随之而来的网络安全问题日益突出,特别是计算机病毒的泛滥,不仅给人类的正常工作和生活造成了影响,而且还严重扰乱了社会秩序。计算机免疫系统(Computer Immune System,CIS)是受生物免疫系统(Biological Immune System,BIS)启发而产生的,该免疫系统是目前计算智能研究的新领域,它已在网络入侵检测、病毒检测方面显示了其优异的信息处理能力。

关键词：病毒检测模型,自体耐受,检测器,亲和力

参考文献

[1]李涛.计算机免疫学[M].北京:电子工业出版社,2004

[2]朱思志.基于免疫原理的脚本病毒的检测方法[J].电脑与电信,2010(3).

[3]姚亮.计算机免疫学[J].哈尔滨理工大学,2007(6)

[4]陆阳,陈蕾,杨文泉.计算机免疫方法研究[J].计算机工程,2003(3).

[5]Forrest S,Hofmeyr S,Somayaji A.Computer Immunology[J].Communications of the ACM,2002,40(10):88-96.

几种检测计算机病毒的方法研究 第8篇

1 外观检测法

外观检测法是在病毒防治过程中起着重要辅助作用的一个环节。当病毒侵入计算机系统后，会使计算机系统的某些部分发生变化，出现一些异常，如屏幕显示的异常现象、系统运行速度的异常、打印机并行端口的异常、通信串行口的异常等现象。可以根据这些异常现象来判断病毒的存在，及时地发现病毒，并作相应处理。

2 特征代码法

将各种已知病毒的特征代码串组成病毒特征代码数据库。这样，可以在通过各种工具软件检查、搜索可疑计算机系统时，用特征代码数据库中的病毒特征代码逐一比较，就可以确定被检计算机系统感染了何种病毒。

在很多著名的病毒检测工具中广泛使用特征代码法。专家认为，特征代码法是检测已知病毒的最简单、最适用的方法。

一种病毒可能感染很多文件或计算机系统的多个地方，而且，在每个被感染的文件中，病毒程序所在的仿造也不尽相同。但是，计算机病毒程序一般都具有明显的特征代码，这些特征代码，可能是病毒的感染标记特征代码，不一定是连续的。只要是同一种病毒，在任何一个被该病毒感染的文件或计算机系统中，总能找到这些特征代码。

3 虚拟机技术

多态性病毒或多型性病毒，即俗称变形病毒。多态性病毒每次感染后都改变其病毒密码，这类病毒的代表是幽灵病毒。多态和变形病毒的出现，让传统的特征值查毒技术无能为力。之所以造成这种局面，是因为特征值查毒技术是对于静态文件进行查杀的，而多态和变形病毒只有在开始运行后才能够显露原形。

虚拟机技术是种软件分析器，在机器的虚拟内存中，用软件方法来模拟和分析不明程序的运行。在执行过程中，从虚拟机环境内截获文件数据。如果含有可疑病毒代码，则杀毒后将其还原到原文件中，从而实现对各类可执行文件内病毒的查杀。

4 启发式扫描技术

病毒和正常程序的区别可以体现在许多方面。一个运用启发式扫描技术的病毒检测软件，实际上就是以特定方式实现的动态高度器或反编译器，通过对有关指令序列的反编译逐步理解和确定其蕴藏的真正动机。

在具体实践上，启发式扫描技术是相当复杂的。通常这类病毒检测软件要能够识别并探测许多可疑的程序代码指令序列，这些功能操作将被按照安全和可疑的等级进行排序，并且根据操作特点赋予不同的加权值。如果对于一个程序的加权值的总和超过一个事先定义的数值，那么，病毒检测程序就可以声称“发现病毒”。为减少谎报，最好把多种可疑功能操作同时并发。另外，目标代码的前后逻辑关系也是启发式扫描需要注意的问题。

对于蠕虫病毒来说，蠕虫的传播技术是其本质。一个蠕虫病毒可以以文件的形式独立存在，清除这样的蠕虫病毒比较简单，只需要删除其可执行文件就可以了。当然，蠕虫病毒也可以感染文件，但那是与传统病毒技术相结合的产物。清除技术并不只是删除蠕虫可执行文件那么简单，要把蠕虫病毒对系统所作的修改尽量恢复回来。对于已知病毒，人们可以通过对路径详细剖析来得知蠕虫所做的修改行为，再把系统恢复过来，但这仅限于已知蠕虫。对于未知蠕虫病毒，各种关键技术还不成熟。要对系统进行恢复，就要知道蠕虫究竟对系统做了些什么。以前，都是通过人工的方法，由反病毒工程师完成这项工作。现在，如果改由程序自动实现，其难度很大。

5 防范计算机病毒的基本方法

目前，反病毒的主流技术还是以传统的“特征码技术”为主，以新的反病毒技术为辅。因为新的反病毒技术还不成熟，在查杀病毒的准确率上，与传统的反病毒技术还有一定的差距。特征码技术是传统的反病毒技术，但是，“特征码技术”只能查杀已知病毒，对未知病毒则毫无办法。所以，很多时候都是计算机已经感染了病毒，并且对机器或数据造成很大破坏后才去杀毒。防范计算机病毒的基本方法有以下几种。

(1)不轻易上一些不正规的网站。在浏览网页的时候，很多人有猎奇心理，而一些病毒、木马制造者正是利用人们的猎奇心理，引诱大家浏览他的网页，甚至下载文件，殊不知这样很容易使计算机染上病毒。

(2)提防电子邮件病毒的传播。能发送包含Active X控件的HTML格式邮件可以在浏览邮件内容时被激活，所以，在收到陌生可疑邮件时，尽量不要打开，特别是对于带有附件的电子邮件更要小心。很多病毒都是通过这种方式传播的，甚至有的是从你的好友发送的邮件中传到你机器上感染你的计算机的。

(3)对于渠道不明的光盘、软盘、U盘等便携存储器，使用之前应该查毒。对于从网络上下载的文件同样如此。因此，计算机上应该装有杀毒软件，并且及时更新。

(4)经常关注一些网站、BBS发布的病毒报告，这样可以在未感染病毒的时候做到预先防范。

(5)对于重要文件、数据做到定期备份。

(6)不能因为担心病毒而不敢使用网络，那样网络就失去了意义。只要思想上高度重视，时刻具有防范意识，就不容易受到病毒侵扰。

摘要：随着网络技术的迅猛发展, 人们日常生活和工作已经越来越离不开计算机网络, 这使得计算机的安全问题显得特别重要。基于这些原因, 目前在反病毒技术中, 最重要的就是“防杀结合, 防范为主”。文章介绍了几种检测计算机病毒的方法。

关键词：计算机病毒,检测,防范

参考文献

[1]孟宏涛.计算机病毒的危害及防范[J].科技情报开发与经济, 2006, (16) .

雏番鸭细小病毒检测方法的研究进展 第9篇

1 传统的实验室检测方法

1.1 病毒的分离鉴定

无菌采取病料后接种10~14日龄非免疫番鸭胚, 80%胚在3~7d死亡, 胚体呈弥漫性充血、出血。接种番鸭胚成纤维原代细胞72h可见细胞圆缩、聚团等变化。雏番鸭人工感染病毒后出现与临床发病者相似的症状, 并回收到病毒。病毒分离纯化后, 进行致病力试验, 确定毒力强弱。

病毒的分离鉴定对MDPV诊断比较确实, 但操作程序繁琐, 费用多, 耗时费力, 还需要熟练的技术。

1.2 血清学诊断方法

1.2.1 琼脂扩散 (AGP) 试验

此试验通常用病死番鸭的内脏悬液或番鸭胚尿囊液, 与MDPV标准阳性血清进行AGP试验, 或用标准的已知抗原与被检番鸭血清进行试验以检出被检番鸭的抗体。何海蓉等应用番鸭细小病毒鹅胚适应毒M91毒制成琼扩抗原, 可与MDPV和GPV的免疫血清有共同交叉反应, 可用于番鸭细小病毒疫苗的免疫检测 (何海荣等, 2000) 。

此法虽然简单易行, 便于在基层进行推广, 但是敏感性较差, 易出现假阳性。

1.2.2 胶乳凝集试验 (LPA方法)

乳胶凝集试验又称间接乳胶凝集试验。原理是将抗原或抗体结合在聚苯乙烯乳胶微颗粒表面, 然后与相应的抗体或抗原作用, 在有电解质存在的适宜条件下, 微粒发生凝集, 从而可以观察到反应的结果。程由铨等应用雏番鸭细小病毒单克隆抗体建立了LPA方法 (程由铨等, 1997) 。致敏抗体蛋白浓度为0.5g/L时, LPA方法可检出MDPV最小蛋白量为2μg/L。研究实验证明, LPA方法具有特异性强, 操作简便和判断直观等优点 (程晓霞等, 2003;胡奇林等, 2000) 。

1.2.3 中和试验 (NT)

NT试验是最敏感而特异的血清学方法, 只有抗体与病毒颗粒上的表面抗原相对应, 特别是与吸附到宿主细胞上的病毒表面抗原相对应, 才能在实验中取得满意的显示效果。以中和试验 (NT) 来鉴定或滴定雏番鸭细小病毒时, 程有铨用固定单抗稀释病毒方法, 即不同稀释度的病毒与等量的1:10稀释的腹水单抗充分混合后, 置37℃CO2培养箱作用60min, 接种细胞或番鸭胚, 37℃培养, 观察至第10d (程由铨等, 1993) 。按Karber氏法计算中和指数。

病毒中和实验操作繁琐耗时费料, 临床上几乎不用。但作为经典方法在病毒鉴定中起着重要作用, 许多新的检测方法都要以此作为标准进行比较。

1.2.4 免疫荧光技术 (IFT)

免疫荧光技术就是荧光抗体技术 (FAT) 。将疑似感染MDPV病毒的番鸭成纤维细胞或病变组织冰冻切片, 用丙酮固定后, 按常规方法操作。同时设非感染MDPV的正常番鸭成纤维细胞或正常组织切片的对照。最后通过荧光显微镜观察结果。如镜检出现特异荧光则证明细胞中有MDPV病毒存在, 即为MDPV阳性。1993年程由铨等在国内首次对应用免疫荧光抗体直接法和间接法快速检测MDPV进行了多方面的研究。该方法可直接检出组织中的病毒 (程由铨等, 1993) 。

FAT用于诊断具有快速、简便、敏感性好的特点, 而且费用较低。其敏感度同病毒的分离鉴定相当, 有时高于用番鸭胚进行的病毒分离。但是需要注意的是如何避免和降低标本中出现的假阳性 (非特异性荧光) 问题。

1.2.5 酶联免疫吸附法 (ELISA)

ELISA方法的特点是特异性、敏感性高。为了准确监测鸭群疫苗免疫后的抗体水平, 从而确定疫苗免疫时间, 胡奇林等通过实验比较发现ELISA检测鸭组织中MDPV抗原具有很强的特异性和敏感性;并且检出率略高于其他方法 (胡奇林等, 2000) 。但ELISA操作繁琐、复杂。

2 分子生物学检测方法

2.1 聚合酶链反应 (PCR)

PCR是近来发展成熟起来的一种体外基因扩增技术, 能在数小时内使DNA呈指数增加, 已成功地用于多种病毒的基因检测和分子流行病学调查等。其检测原理为:寻找传染性因子的特异DNA序列, 对待测样品进行PCR扩增。如果检测出了相应的扩增带, 则判为阳性反应;反之, 无扩增带则为阴性反应。Jestin V等报道建立了检测MDPV核酸PCR方法, 能检出MDPV DNA的最低量为1.6fg (Jestin V等, 1994) 。Chang-wang、娄高明等也报道了检测MDPV的PCR方法, 该方法可用于流行病学调查和致病机理的研究, 但不能区分是MDPV感染还是GPV感染的 (Chang-wang等, 1996;娄高明等, 1998) 。刘家森、季艳菊报道建立了可用于鉴别诊断GPV和MDPV的PCR方法 (刘家森, 2007;季艳菊, 2007) 。Sirivan P等应用PCR结合限制酶切片段分析来鉴别MDPV和GPV, 使对二者的鉴别诊断更加准确特异 (Sirivan P等, 1998) 。

2.2 核酸探针技术

核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一, 是定性和定量检测特异性DNA或RNA的有力工具。尤其适用于MDPV的早期诊断。

核酸探针技术的原理:在进行杂交时, 用一种预先分离纯化的已知DNA或RNA序列片段去检测未知的核酸样品, 对做检测用的已知DNA或RNA序列片段加以标记的片段就称为核酸探针。作为核酸探针的DNA或RNA是各种病原微生物基因的一部分;在变性分开的待检DNA或RNA单链中加入与其有互补作用的核酸探针;探针在一定条件下就能与原来变性分开的DNA或RNA单链上的互补区段形成氢键, 从而结合成杂交双链, 通过洗涤, 除去未杂交上的标记物 (如P32等) , 然后进行放射自显影, 即可确定原待检样品有无与探针互补的DNA或RNA序列。

Gall-Recule等报道建立了核酸探针检测MDPV核酸的方法。MDPV DNA的Hind III一Bgl II约1030bp片段, 用地高辛标记作探针, 能检出MDPV DNA的最低量为3fg, 与犬和猪细小病毒DNA没有交叉反应, 但与小鹅瘟病毒DNA有比较低的交叉反应, 此法可用于MPV的快速诊断 (Gall-Recule等, 1995) 。

3 小结

MDPV是危害世界养番鸭业的主要病毒之一, 随着养番鸭业的发展, 各国对其检测方法的研究也越来越重视, 相信随着科学技术的不断发展, 灵敏度高、特异性强准确而简便易行的诊断方法将会不断问世。

参考文献

[1]何海蓉, 等.番鸭细小病毒琼扩抗原研制及初步应用[J].中国预防兽医学报, 2000, 22 (1) :22-24.

[2]程晓霞.两种方法检测雏番鸭细小病毒抗体效价的比较[J].福建畜牧兽医, 2003, 25 (3) :8.

[3]程晓霞.三种检测雏番鸭细小病毒抗原方法的比较[J].福建畜牧兽医, 2003, 25 (2) :9.

[4]胡奇林, 等.四种检测番鸭细小病毒抗原方法的比较[J].福建畜牧兽医, 2000, 22 (2) :4-6.

[5]Jestin V, et al.Deteetion of Museovy duck parvovirus DNA by the polymerase chain reaction.Immunobiology of viral infeetions.Proeeeding of the third Congress of the EuroPean Society for Veterinary Virology[J].Inrerlaken, 1994, 538-532.

[6]Chang-Kwang Limn, et al.Detection of goose parvovirus genome by polymerase chain reaction:distribution of goos parvovirus in Muscovy ducklings[J].Virus Research, 1996, 42:167-172.

[7]刘家森, 等.番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立[J].中国兽医科学, 2007, 6 (37) :469-472.

[8]季艳菊, 等.雏番鸭细小病毒病快速诊断方法的建立[J].家禽科学, 2007, 6:3-5.

[9]Sirivan P, et al.Detection of goose and Muscovy duck Parvoviruses using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis[J]Avi.Dis., 1998, 42:133-139.

病毒学方法技术研究 第10篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验标本血清

收集2009年3月至2009年4月杭州迪安医学检验中心PCR科室筛选的乙型肝炎病毒阳性的标本200例 (此标本由罗氏Lighting Cycler480高通量实时荧光定量PCR仪检测出HBV DNA>1×103 copy/ml) 。

1.1.2 基因提取、扩增和电泳主要试剂

血清DNA提取所用试剂购自上海克隆生物高技术有限公司;PCR反应体系由迪安科研部自备, 其中Taq酶与Mg Cl2购自Fermentas公司, d NTP则购自Keygene公司;引物由上海英骏 (invitrogen) 生物技术有限公司合成, 琼脂糖购自北京凌峰源生物科技有限公司。

某市成年男性脂肪肝高发原因及治疗

王波

(内蒙古满洲里扎煤公司总医院, 内蒙古满洲里021410)

【摘要】目的探讨满洲里市成年男性生活饮食习惯与脂肪肝的相关性及相应治疗方法。方法2010年~2012年在我院进行体检的成年男性2216人行彩色B超检查肝脏。结果脂肪肝检出率82.4%, 即1826人, 患病者明显高于健康者, 青壮年明显高于老年患者, 嗜酒者、喜食高脂饮食、生活不规律、不喜运动者远远高于无上述不良习惯者。结论脂肪肝的高发与生活方式, 生活环境, 年龄, 都存在密切关系, 如能积极改变生活方式, 调整心理因素, 、积极配合医生治疗, 则会有较好的预后。

【关键词】内蒙古满洲里市成年男性;脂肪肝;高发原因及治疗

中图分类号:R575.5文献标识码:B文章编号:1671-8194 (2013) 01-0078-02

随着满洲里市发展速度的日益加快, 固有生活习惯和现代节

1.1.3 主要仪器

HB-100恒温金属浴仪为杭州博日科技有限公司产品, PCR仪为杭州朗基科学仪器有限公司生产的Long Gene-MG96G型, 离心机为贝克曼 (Beck Man) 公司的Microfuge I6, 电泳仪为上海复生生物工程研究所生产的FS-600, 全自动数码凝胶成像分析仪为上海培清科技有限公司生产的JS-380C。

1.2 方法

1.2.1 标本准备

杭州迪安医学检验中P C R科室的对常规血清标本用罗氏Lighting Cycler高通量实时荧光定量PCR仪检测, 检测阳性标本送科研室进行乙型肝炎病毒分型实验。

1.2.2 血清DNA模板提取

按照试剂盒说明书进行, 主要步骤为:取50μL待测血清样本加入50μL核酸提取液A, 振荡混匀10min, 12000rpm离心10min, 弃去上清;再加入50μL核酸提取液B至沉淀中, 振荡混匀10s, 100℃金属浴10min, 12000rpm离心2 min, 取2μL上清液作为模板。

1.2.3 PCR扩增

P C R按N a i t o e t a l[2]方法进行稍作改动。首先用一对外引物 (P1、Ps) 进行第1轮PCR, 在0.2m LPCR管中依次加入通用引物P1 (10μmol/L) 0.8μL, Ps (10μmol/L) 0.8μL, d NTP (10m M) 0.8μLTaq聚合酶 (1μ/m L) 0.4μL, 10×PCR缓冲液 (含20 m M Mg2+) 2.5μL, 血清DNA提取物1μL。扩增条件为94°C预变性5min, 94°C变性60s, 55°C退火45s, 72°C延伸90s, 30个循环后72°C再延伸5 min。然后分别以B2、BA1R、BB1R、BC1R为内引物进行第2轮PCR, 分别检测A型、B型和C型乙型肝炎病毒。第二轮乙型肝炎病毒PCR反应体系中除引物外的其余成分同第1轮PCR, 扩增条件为95°C预变性10min, 94°C变性20s, 58°C退火20s, 72°C延伸30s, 40个循环后72°C再延伸10min。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳及数据分析

用微量加样器将DL2000 marker 5μL、PCR产物8μL及阴性对照和空白对照分别加样于1.5%琼脂糖凝胶, 进行电泳。

2 结果

用特异性引物可分出乙型肝炎病毒DNA片断分别为281bp和122bp的HBV DNA B型和C型, , 同时出现281bp和122bp条带者为BC混合型。

2.1 200例HBV DNA基因分型

奏生活习惯的交融与冲突, 脂肪肝检出率出现上升趋势, 现将

B型2 8例 (1 4%) , C型1 6 9例 (8 4.5%) , B、C混合型1例 (0.5%) , 两例基因型不明。

2.2 重复性试验

200份患者血清中随机挑选20份, 多次应用方法分型, 基因分型鉴定结果前后符合率为100%。

3 讨论

HBV基因型与乙肝的传染性、临床疾病预后判断及抗病毒药物治疗的选择具有一定的相关性, 因此对HBV基因型的检测意义重大。目前现有的分型方法尚有些许不足如直接测序法相对最为准确, 但测序时间长、成本高、需反复比较分析才能得出结论, 无法进行大样本量的流行病学研究[3];一般的PCR-RFLP分型法大多也是扩增后再测序比直接测序法也只稍微节省成本, 而且此法所需时间较长, 步骤多, 混合感染或酶切不完全时出现复杂条带, 结果难以判断[4]。微板核酸杂交ELISA法虽然特异性较高, 但杂交后需复杂的显色步骤, 杂交背景也很容易受各种因素的干扰。

本研究采用型特异性引物PCR扩增法进行基因分型, 在严格的PCR条件下根据产物片断的大小判断基因型别方法较为简便快速, 特异型高, 检测费用较低。但由于有些样本的HBV浓度较低或其他原因使结果呈假阴性而导致无法分型或会出现较复杂的带型从而不利于结果判断, 尤其当同一标本混有两种基因型时更无能为力, 另外由于HBV基因变异的多样性, 巢氏PCR分型法不能鉴定100%的样品。今后还需进行更多的临床研究和实验。

总之应用型特异性引物PCR方法进行HBV基因型检测, 方便, 准确, 成本低, 可用于大规模的流行病学调查。

参考文献

[1]陈钟先, 齐舒, 方勇.湖北地区乙型肝炎病毒基因型分布与临床的相关性[J].中华肝脏病杂志, 2006, 25 (2) :214-217.

[2]De Castro L, Araujo NM, Sabino RR, et al.Nosocomial spread of hepatitis B virus in two hemodialysis units, investigated by restriction fragment length polymorphism analysis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2000, 19 (7) :531-537.

[3]OkamotoH, Tsuda F, TanakaT, et al.Typing hepatitisB virusby ho-mology in nucleotide sequence:comparison of surface subtype[J].J Gen Virol, 1988, 69 (10) :2575-2583.