肺动脉平滑肌细胞

肺动脉平滑肌细胞（精选7篇）

肺动脉平滑肌细胞 第1篇

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

胎牛血清 (FBS) 和DMEM培养液购自美国HyClone公司, 法舒地尔购自天津红日药业股份有限公司, 胶原收缩试剂盒购自美国Cell Biolabs公司, Boyden Chamber迁移小室购自美国BD公司。

1.2 细胞培养及分组

采用组织块贴壁法分离培养大鼠PASMCs, 选取体重250g~300g, 雄性SD大鼠, 麻醉后于无菌条件下分离肺动脉, 仔细剥除外膜1mm3的纤维脂肪层及内皮细胞, 用眼科剪将肺动脉中膜剪成约1mm3的组织块, 接种于培养瓶中, 用含有15%FBS的DMEM培养液, 于37℃, 5%CO2培养箱中静置培养。当大部分组织块长出细胞晕, 吸弃培养液和组织块, 胰酶消化混匀细胞, 进行传代培养。采用α-肌动蛋白免疫细胞化学染色法对PASMCs纯度进行鉴定, 选用 (4~6) 代生长良好, 纯度98%以上的PASMCs细胞进行实验, 当其生长达到80%~90%融合后, 换无血清培养液静息培养24h使细胞周期同步化, 胰酶消化混悬后, 以一定浓度接种于细胞培养板中。细胞随机分为正常培养对照组和不同浓度法舒地尔处理组 (10μmol/L, 30μmol/L, 50μmol/L) , 作用不同时间后分别进行不同的生物学检测。

1.3 胶原凝胶法检测大鼠PASMCs收缩

取处于对数生长期的PASMCSs, 饥饿培养使细胞同步化后, 胰酶消化混匀, 计数, 配成3×106个/L的细胞混悬液, 按1∶4比例将细胞悬液与冷的胶原溶液配成细胞-胶原混合物。于24孔板每孔中加入0.5mL细胞-胶原混合物, 37℃, 5%CO2培养箱中孵育1h, 当胶原凝集成型后, 于其上加入1mLDMEM细胞培养液。孵育2d后, 胶原中形成了足够的张力, 于不同的孔中分别加入不同终浓度的法舒地尔, 用灭菌小铲将胶原从培养皿底面撬起以使其自由收缩, 分别培养不同时间 (24h, 48h) 后, 扫描仪记录胶原面积大小, 采用Quantity One图像分析软件分析胶原面积。

1.4 Boyden Chamber法检测大鼠PASMCs迁移

采用Boyden Chamber迁移小室测定PASMCs的迁移能力, 该小室底面为均匀分布有直径8μm孔洞的聚酯薄膜 (PET膜) 。取对数生长期的PASMCs, 饥饿培养使细胞同步化后, 用含0.1%FBS的DMEM制备成浓度为5×105个/L的细胞混悬液, 取300μL混悬液加入Boyden Chamber小室的上室, 于下室加入500μL含1%FBS的DMEM, 上下室中均加入不同终浓度 (10μmol/L, 30μmol/L, 50μmol/L) 的法舒地尔。37℃, 5%CO2培养箱中培养12h后, 将小室取出, 90%酒精常温固定30 min, 0.1%结晶紫常温染色10min, 清水漂净, 用棉签除膜上侧面未迁移的细胞, PBS清洗后, 10%乙酸100μL, 抽提10min, 于560nm处测定OD值。

1.5 统计学处理

所有实验均重复3次, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 应用SPSSS 13.0软件分析, 比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 法舒地尔对大鼠PASMCs收缩胶原能力的影响

胶原凝胶细胞收缩分析结果表明, PASMCs培养24h、48h后, 与对照组相对比, 法舒地尔处理组PASMCs收缩胶原能力显著降低 (P<0.01) , 并呈浓度依赖性, 法舒地尔浓度为50μmol/L, 处理时间48h时, 对PASMCs收缩胶原能力的抑制达到最大 (见图1、图2) 。

2.2 法舒地尔对大鼠PASMCs迁移能力的影响

Boyden Chamber迁移小室法分析结果表明, PASMCs培养12h后, 与对照组相对比, 法舒地尔处理组PASMCs的胶原收缩能力, 显著降低 (P<0.01) , 并呈浓度依赖性, 当法舒地尔浓度为50μmol/L对PASMCs胶原收缩能力的抑制达到最大 (见图3) 。

3 讨论

肺动脉高压的主要表现是肺血管阻力增加, 肺血管重构, 原位血栓形成, 最终导致右心室肥厚, 右心功能衰竭, 肺血管重构是主要的病理变化特征。平滑肌细胞是肺动脉的主要细胞成分之一, 其向收缩表型的转化、过度迁移及增殖导致中膜增厚、无肌细动脉肌化、管腔狭窄, 是肺血管重构和肺动脉高压的重要原因。因此, 抑制PASMCs的收缩和迁移, 可能对于肺动脉高压的治疗具有重要意义。法舒地尔最初被用于改善和预防蛛网膜下腔出血后脑痉挛及其引起的脑缺血症状, 是目前临床使用的唯一一种选择性ROCK抑制剂, ROCK激酶的活化, 对于平滑肌细胞的一系列细胞生物学功能, 包括收缩、迁移、增殖及基因表达等均具有重要调节作用[4,5]。法舒地尔具有潜在的抗肺动脉高压作用。长期应用法舒地尔能够降低野百合碱所致大鼠肺动脉高压, 减轻右心室肥大程度, 同时可抑制血管平滑肌增殖, 减少巨噬细胞浸润, 促进血管内皮细胞凋亡, 改善肺血管壁重构[6]。法舒地尔对高血流量引起的小鼠肺动脉高压及血管重构具有抑制作用[7]。法舒地尔对于重度肺动脉高压患者可以起到迅速舒张肺血管的作用[8]。尽管已有较多体内研究证据显示, 法舒地尔具有潜在的抗肺动脉高压作用, 但其细胞水平上的作用机制如何, 目前的研究还很不充分。本课题组在前期研究中, 通过体外细胞实验证明, 法舒地尔能够通过上调p27Kip1蛋白表达抑制血小板衍生生长因子诱导的PASMCs的增殖[9], 而法舒地尔对PASMCs收缩及迁移的影响作用, 尚不完全清楚。

本研究采用体外分离培养大鼠PASMCs, 在细胞水平上探讨法舒地尔对PASMCs收缩及迁移能力的影响。胶原凝胶收缩实验证明, 法舒地尔对PASMCs收缩胶原的能力有显著的抑制作用, 并具有浓度依赖性, 当法舒地尔浓度为50μmol/L, 处理时间为48h时, 其抑制作用达到最大。此外, Boyden Chamber法检测结果还显示, 法舒地尔对PASMCs胶原收缩能力也有显著抑制作用。本研究结果表明, 法舒地尔可以显著抑制PASMCs的收缩和迁移能力, 这可能是法舒地尔抗肺动脉高压的又一重要机制。

参考文献

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肺动脉平滑肌细胞 第2篇

关键词：@保肺定喘汤/药理学,肌, 平滑, 血管/药物作用,肺动脉,小牛

肺动脉高压属于肺循环疾病, 其病理生理改变主要包括肺血管收缩反应和肺血管重构两个方面, 而PASMC的异常增生是肺血管重构的重要基础[1], 因而阻止PASMC的异常增生成为目前防治肺动脉高压的重要课题。本文选用全国名老中医王会仍主任医师的经验方保肺定喘汤 (BFDCT) , 应用中药血清药理学方法及体外细胞技术探讨该方防治肺动脉高压的作用机理。

1材料与方法

1.1 新生小牛PASMC原代和传代培养

无菌取出新生小牛 (取自杭州四季青生物工程材料研究所) 1～2级肺动脉, D-Hanks液清洗后, 剪开血管, 剥除血管内膜和外膜, 将中膜肌层剪成1mm3小块, 贴块法接种于培养瓶中, 待贴壁后加入含15%胎牛血清的MEM培养液, 置于培养箱内培养10天左右, 待细胞爬满瓶底壁表面积80%后, 0.25%胰酶消化传代培养, 实验用4～6代细胞。

1.2 主要试剂和仪器

胎牛血清:Gibco。MEM培养液:Gibco。0.25%胰蛋白:美国Sigma公司。MTT:美国Sigma公司。Bio-Rad550酶标仪。

1.3 保肺定喘汤制备

党参30g、黄芪30g、当归12g、桔梗10g、甘草6g、地龙15g、仙灵脾10g、丹参15g、熟地15g, 由浙江中医药大学中药制剂室制成流浸膏, 含生药3.1g/ml。

1.4 药物血清提取

将32只健康雄性大鼠 (清洁级) , 体重 (200±20) g, 随机分成4组, 即正常对照组、阳性对照组 (硝苯地平10mg/kg) 、BFDCT高剂量组 (6.2g/kg) 和BFDCT低剂量组 (3.1g/kg) , 每组8只, 给药途径均采用灌胃, 连续灌胃3天, 于第3天禁食不禁水, 末次给药后1小时下腔静脉取血, 置30分钟待血清析出后, 3000r/min低温离心10分钟, 无菌分离血清后56℃水浴30分钟灭活补体, -20℃冰箱保存。

1.5 PASMC增殖的测定

将4～6代PASMC以1104/ml, 200ml/孔接种培养24小时后换不含胎牛血清的MEM, 静止同步培养24小时后, 换含10%胎牛血清的MEM培养液, 随机分成常氧组和缺氧组两大组。常氧组随机再分为BFDCT高剂量组、BFDCT低剂量组、正常对照组、阳性对照组, 共4组;缺氧组亦随机分成上述4组。上述各组分别加入相应药物血清, 均为20μl/孔。常氧组置5%CO2培养箱培养, 缺氧组在95%N2-5%CO2三气培养箱中培养, 48小时后, 加MTT组液 (5mg/ml) , 继续孵育5小时, 终止培养, 小心吸尽瓶内溶液, 加入二甲基亚砜150μl/孔, 振荡10分钟, 酶标仪490nm处测定光吸收度 (OD值) , 进行MTT法计数。

1.6 统计方法

全部数据皆以均数±标准差undefined表示, 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析, 两样本使用独立样本t检验, 多样本使用F检验和LSD检验。

2结果

2.1 保肺定喘汤药物血清对常氧条件下PASMC增殖的影响

见表1。

与正常对照组比较*P<0.05, **P<0.01;与阳性对照组比较△P<0.05, △△P<0.01

2.2 保肺定喘汤药物血清对缺氧条件下PASMC增殖的影响

见表2。

与对照组比较*P<0.05, **P<0.01;与阳性对照组比较△P<0.05, △△P<0.01

3讨论

肺血管重构在肺动脉高压发生、发展中起关键作用, 而PASMC的异常增生是肺血管重构的重要基础。PASMC可以直接感受缺氧, 缺氧可以使PASMC的钙内流, 并增强PASMC的胶原合成[2], 同时可激活Na～+/H～+交换体-1通过NF-κB通路引起肺动脉平滑肌细胞增殖[3,4], 本实验得出的结果亦说明缺氧对PASMC有促进增殖作用。

中医认为本病为肺脏久病, 肺肾两虚, 病邪由气入血而病络, 或邪气直接扩散入于肺络, 络气亏虚, 气虚无力推动血及津液的正常运行而致血停成瘀, 津聚为痰, 痰浊、瘀血有形之邪阻塞肺络, 致肺络改变, 其病理因素主要仍是“痰”和“瘀”。保肺定喘汤系全国级名老中医王会仍主任医师的经验方, 具有益气活血、行滞通络, 又能兼顾脾肾、清肺化痰, 从而达到气行血行, 痰瘀同化, 肺络得畅的作用, 恰中肺动脉高压肺血管重构从气虚到血瘀、痰阻再致局部肺络不通的病机, 达到扶正固本、祛邪通络目的。

中药血清药理学作为一门新兴的实验方法学, 已经广泛用于各个领域, 对提高中药复方的药理研究水平具有重要作用[5]。本实验采用血清药理学方法研究发现BFDCT高、低剂量组药物血清对常氧和缺氧条件下培养的PASMC增殖均有明显抑制作用, 说明BFDCT对缺氧和非缺氧性肺动脉高压肺血管重构均有一定防治作用, 进一步扩大了其临床适用范围。

参考文献

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[4]Yao W, Qian GS, Yang XJ.Roles of NHE-1in the proliferaton and ap-optosis of pulmonary artery smooth muscle cells in rats.Chin Med J, 2002, 115 (1) :107.

肺动脉平滑肌细胞 第3篇

1 材料与方法

1.1 实验动物及标本制备

实验所用豚鼠(由新疆自治区疾病控制中心动物饲养科提供,动物质量符合一级标准)雌雄随机,重200～300 g,在麻醉状况下放血处死,迅速取出耳蜗,置于生理盐溶液中。生理盐溶液成分(mmol/L):Na Cl 138,KCl 5,Ca Cl21.6,Mg Cl21.2,Na-HEPES 5,HEPES 6,葡萄糖7.5,将pH调至7.4。在生理盐溶液中迅速取出耳蜗螺旋动脉及其分支。用于全细胞膜片钳记录的标本约0.4 mm长,直径在40～80μm之间,将截取好的标本放置于直径35 mm的培养皿中,两端用小铂金片固定在培养皿底部,在37℃温箱中用含有胶原酶A(1.5 mg/m L)的生理盐溶液处理15 min,然后用正常生理盐溶液置换2次去除残存的胶原酶A,在解剖显微镊下用精细镊子进一步去除微动脉外层的结缔组织[3,4]。

急性缺氧模型的制备:在室温条件下(22～25℃)对标本持续灌注无糖低氧的生理盐溶液(20%二氧化碳和80%氮混合气体充分饱和,pH6.5,氧分压PO2=0 mm Hg)5～15 min。

1.2 全细胞膜片钳记录

在室温条件下(22～25℃)使用Axon 700B放大器(Axon公司,美国)进行全细胞膜片钳实验。记录电极尖端直径约为1μm,电极阻抗约为5 MΩ,由P-97拉制仪(Sutter公司,美国)拉制。电极内液成分是(mmol/L):K-gluconate 130,Na Cl 10,Ca Cl22.0,Mg Cl21.2,HEPES 10,EGTA 5,葡萄糖7.5,pH值调至7.2,渗透压290 m Osm/L。通过微操纵器接触到细胞后给予负压形成GΩ封接。补偿电极电容后给予瞬时较强负压或者电刺激击破细胞膜形成全细胞膜片钳。膜电流用5或10 kHz(-3 dB)低频滤过。生物电信号通过PC计算机记录(Axoscope 10.2软件,Axon公司,美国)。采样间隔为10、20或100μs。为了在线监测细胞膜参数和计算细胞Rinput、Cinput,不对细胞膜电容电流进行补偿。应用指数方程模拟膜电容充放电过程。微动脉段上平滑肌细胞的Cinput通过公式C=Q/V获得,其中Q通过多指数方程模拟由Vc(命令电压)引起的细胞膜电容充放电过程获得。由电极电阻(Ra)引起的实际钳制电压与命令电压误差通过公式Vm=Vc-IRa进行补偿,其中Vm是实际钳制电压。

1.3 实验所用药物

用灌注液配制所用药物,加药通过切换开关控制,能保持灌流速度、温度和其他成分不变。所用药物有:18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid,18βGA),四乙胺(tetraethylammonium,TEA)由美国Sigma公司提供,其余试剂均为国产分析纯。

1.4 统计学分析

应用SPSS 16.0分析软件完成,实验结果以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性缺氧抑制S MA微动脉段上平滑肌细胞间缝隙连接

急性缺氧显著减弱SMA微动脉段上平滑肌细胞Rinput、Cinput或增强细胞Ginput,急性缺氧对细胞Rinput、Ginput和Cinput的影响见附表。急性缺氧使一典型SMA微动脉段上平滑肌细胞Rinput从437 MΩ增加到1911 MΩ,Cinput从85.7 pF减少至12.4 pF(见图1)。此外,应用Clampfit 10.2软件对图1A和B细胞膜电容充放电用单指数方程分别进行拟合(见图1C和D中虚线部分),急性缺氧前拟合效果较差(r0.90),缺氧后拟合效果很好(r>0.98),同时细胞充放电的时间常数也由8.90 ms减少至0.78 ms。

此外,应用斜坡电压刺激发现,48%(15/31)急性缺氧净电流的I/V曲线几乎是线性(见图2),且翻转电位点(-32.6±2.5)m V与微动脉段上平滑肌细胞静息膜电位(-35.8±4.5)m V十分接近(P>0.05)。提示在这些细胞上急性缺氧主要抑制细胞间的缝隙连接,减少细胞的Ginput,而对其他电生理特性的影响很小。

注:覮与对照组比较,P<0.01

2.2 急性缺氧激活S MA微动脉上平滑肌细胞膜上大电导Ca2+激活K+通道

除抑制缝隙连接外,52%(16/31)急性缺氧引起净电流的I/V曲线如图3,在-140～0 m V区间,急性缺氧主要抑制微动脉平滑肌细胞间的缝隙连接,而在0～+40 m V区间急性缺氧电压依赖地增强平滑肌细胞的外向电流。实验中预灌注30μmol/L缝隙连接阻断剂18β-甘草次酸阻断微动脉段上平滑肌细胞间的缝隙连接后,进一步分析急性缺氧激活的外向电流,急性缺氧使0 m V激活电流幅度从(27.8±7.5)pA增加到(89.3±12.8)pA(n=9,P<0.01),+20 m V从(88.0±18.5)pA增加到(211.1±32.5)pA(n=9,P<0.01),+40 m V从(213.9±21.6)pA增加到(448.0±46.5)pA(n=9,P<0.01)。实验中背景灌流1 mmol/L四乙胺阻断大电导Ca2+激活K+通道(big conductance calcium-activated potassium channel,BKCa)后,急性缺氧对SMA微动脉段上平滑肌细胞外向电流的增强作用显著减弱(见图4)。

3 讨论

笔者的研究首次发现,急性缺氧可以抑制SMA微动脉段上平滑肌细胞间的缝隙连接,证明如下:(1)急性缺氧显著降低SMA微动脉段上平滑肌细胞的Ginput和Cinput,其数值接近单个平滑肌细胞水平[3]。(2)部分平滑肌细胞上急性缺氧引起净电流的Ⅰ/Ⅴ曲线几乎是线性,且急性缺氧净电流的翻转电位点与细胞静息膜电位十分接近。(3)急性缺氧前平滑肌细胞膜充放电的时间常数远大于缺氧后,应用单指数方程拟合细胞膜充放电过程,缺氧前拟合效果很差,缺氧后拟合效果很好;(4)缝隙连接阻断剂18β-甘草次酸可以阻断急性缺氧对SMA平滑肌细胞间的缝隙连接。以上结果提示急性缺氧可以抑制SMA微动脉段上平滑肌细胞间的缝隙连接,此结果与前期在豚鼠小脑前下动脉(anterior inferior cerebellar artery,AICA)和肠系膜动脉(mesenteric artery,MA)上的研究一致。相比于AICA,急性缺氧抑制SMA微动脉段上平滑肌细胞间缝隙连接的程度更明显。缝隙连接通道在维持组织器官的生理功能中扮演着关键角色,尤其在血管调节中尤为突出[5]。血管紧张度调节、血管平滑肌细胞和内皮细胞同步化都依赖细胞间缝隙连接的完整性[6]。在心血管系统中,心肌细胞及平滑肌细胞间存在着丰富的缝隙连接,因此缝隙连接的功能失常将引起各种心血管疾病。高血压、心律失常、动脉粥样硬化、缺血性心脏病等心血管疾病都与缝隙连接的异常改变有关[7]。前期有研究表明,在培养的冠状动脉内皮细胞上急性缺氧能够抑制内皮细胞间的缝隙连接[8]。

除抑制细胞间缝隙连接外,笔者研究结果还发现,急性缺氧可以电压依赖地增强部分平滑肌细胞外向电流,急性缺氧主要增强0～+40 m V电压区间的电流幅度,BKCa通道阻断剂四乙胺显著抑制急性缺氧对SMA微动脉段上平滑肌细胞外向电流的增强作用,提示急性缺氧激活的外向电流由BKCa通道介导,与前期在豚鼠AICA和MA上的研究相一致,相比于AICA和MA,急性缺氧激活电流的幅度要小很多。BKCa通道通过其开放和激活引起膜的超极化,调节细胞的兴奋性。膜去极化和[Ca2+]i浓度升高可以激活BKCa通道,通过对膜去极化和血管收缩的负反馈调节作用维持静息状态下血管的张力[9,10]。BKCa通道与疾病的发生、发展密切相关,在高血压、冠状动脉痉挛、心肌缺血等心血管疾病中均伴有BKCa通道的异常表达。对于循环系统缺氧,有研究表明肺动脉急性缺氧通过抑制BKCa通道使细胞去极化,增加[Ca2+]i,收缩血管[11]。也有报道急性缺氧可以激活股薄肌阻力血管内皮细胞上BKCa通道,引起内皮细胞和平滑肌细胞舒张[12]。此外,间断性缺氧引起的大鼠耳蜗螺旋动脉和脑动脉舒张是由BKCa通道的开放介导[13]。

肺动脉平滑肌细胞 第4篇

1 材料

1.1 动物

Wistar雄性大鼠,体重(180±20)g,甘肃中医学院SPF级实验动物中心提供。

1.2 药物

稳心草全草采自甘肃宕吕,稳心草黄酮类化合物由甘肃中医学院生药研究室提取。

1.3 试剂

DMEM培养基、胰蛋白酶粉、Ⅱ型胶原酶(1:250):美国Gibco公司;谷氨酰胺、新生牛血清磷酸盐缓冲液(PBS)、噻唑蓝:Sigma公司;台盼蓝、十二烷基硫酸钠(SDS):购于兰州鹏程生物公司;青霉素钠(批号:A051212006)、链霉素(批号:050408):石药集团产品;大鼠TGF-β定量ELISA试剂盒:杭州联科生物公司。

1.4 仪器

奥林巴斯IX71型倒置相差光学显微镜、日本Olympus公司;JEM-1230透射电镜:日本;LKB-V超薄切片机:瑞典;XL型流式细胞仪:美国Coulter公司;RT2100型酶标仪:美国雷杜;DG-5031型酶标仪:国营华东电子管厂。

2 方法

2.1 血管平滑肌细胞培养方法

采用Wistar大鼠动脉平滑肌细胞贴块法培养。按照文献方法[5,6]进行原代及传代细胞培养。

2.2 细胞鉴定

2.2.1 倒置显微镜观察细胞形状

将培养瓶直接放在相差显微镜下观察平滑肌细胞形状、胞浆、胞质、核仁、细胞排列形状等。

2.2.2 电子显微镜超微结构分析

培养的细胞经电镜放大10000、12000、15000、20000、25000倍进行超微结构分析,可与培养液中其它非平滑肌细胞鉴别[1]。用生长良好的3～8代细胞消化、吹打成悬浮液,离心、吸弃上清液,加入固定液,封口,置4℃冰箱12小时后按照电镜常规标本制作方法制成超薄切片,于透射电镜下观察并拍照。

2.3 实验药物浓度和时间确定

采用四唑蓝(MTT)比色实验[5,6]。用含10%新生牛血清的DMEM配制成5104个/ml的细胞悬液,在37℃、5%CO2及饱和湿度CO2孵箱中培养,细胞贴壁后,分为不同剂量稳心草黄酮组、单纯培养液组以及阴性对照组,分别加入药物,培养24、48、72、96小时,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,继续孵育4小时,终止培养。吸弃上清液,每孔加入SDS溶液150μl,振荡10分钟,用预热15分钟的酶标仪进行检测。选择490nm波长测定各孔光吸收值(OD值),记录结果,计算抑制率。抑制率=[(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值]100%。MTT法测定在100～800μg/ml浓度范围内,当稳心草黄酮类化合物作用PASMCs 24、48、72、96小时,均有抑制增殖作用,而且抑制率与药物剂量成依赖关系。选择100、200、400μg/ml作为低、中、高剂量组。抑制率比较提示48小时抑制增殖效果最明显。

2.4 细胞计数

取少许细胞悬液加在计数盖玻片一侧,在显微镜下用10物镜观察四角大方格中的细胞数,将计数代入公式,得出细胞密度。细胞密度(细胞数/毫升)=(4大格细胞数之和/4)104。

2.5 细胞周期检测

用生长良好的3～8代细胞,按照分组分别按培养液体积的10%加入相应剂量(100、200、400μg/ml)的药物,在37℃、5%CO2及饱和湿度CO2孵箱中,培养相应时间(48小时)后取出,在超净工作台内消化、吹打、悬浮、计数、离心,使离心后所得细胞数量约为1.0107个/管,吸弃上清液,加入PBS约1.5ml,再次悬浮、离心,吸弃上清液,加入75%乙醇1.5ml固定,置4℃冰箱保存,检测前30分钟内取出,吸弃乙醇,再用PBS洗涤2遍,送检,流式细胞仪检测。

2.6 TGF-β检测

用生长良好的3～8代细胞,按照分组,加入培养液体积10%的药物,培养相应时间(48小时)后取出,在超净工作台内按照各组标示分装,置-20℃冰箱保存待检。按照TGF-β检测说明操作,置酶联检测仪测定光密度(OD)值,在492nm处测OD值,TGF-β浓度与OD值成正比,以OD值对样品稀释度作图,通过绘制标准曲线,比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中的TGF-β浓度。

2.7 统计学处理

所有实验数据均采用均数±标准差undefined表示,用SPSS12.0统计软件处理,两组均数的比较用t检验;多组间的均数比较用方差分析。

3 结果

3.1 动脉平滑肌细胞生长状态

贴块培养7～14天时细胞从血管组织块周围游出,呈梭形、长条形和不规则形,数量由少到多,逐渐融合成片,平行排列,呈显出平滑肌细胞特有的“峰-谷”状生长。台盼蓝染色观察共计1000个细胞,无着色细胞占95%以上,表明培养细胞生长状态良好。

电镜下观察:平滑肌细胞胞浆内可见较丰富的肌丝(myofilaments)和肌丝上电子密度较高的致密体(dense bodies)。除骨骼肌细胞以外,这是平滑肌细胞所特有的收缩成分,可与其它非平滑肌细胞鉴别。本实验对待测细胞随机观察了20个,有19个细胞鉴定为平滑肌细胞。

3.2 稳心草黄酮类化合物对动脉平滑肌细胞增殖及其TGF-β含量的影响

见表1。

与空白组比较△P<0.05

3.3 稳心草黄酮类化合物对动脉平滑肌细胞细胞周期的影响

见表2。

与空白组比较△P<0.05

4 讨论

稳心草植物为藤黄科植物赶山鞭(Hypericum attenuatum Choisy.)的全草,稳心草性平和缓,适合肺为娇脏,不耐寒热的特点,味苦能降能泄,有助于肺之肃降,下行通调水道,有清热解毒、活血消肿功能,针对湿热瘀毒阻滞消除痰热瘀血;化痰通乳可以促进痰液分泌,有利于痰液排出。一药兼有“菌毒并治,活血化痰”之能。从而降低血管压力,缓解咳、痰、喘、肿四大症状,体现了宏观辨证与微观辨病相结合的中西医结合思想。本文结果显示稳心草黄酮类化学物可明显减少肺动脉平滑肌细胞数目,抑制细胞周期进程,使G0/G1其细胞数增多,S期和G2/M期细胞数减少;说明该药物可有效阻止细胞的有丝分裂。TGF-β是目前已知作用最强的致纤维化细胞因子之一[7],还具有免疫调节即抑制炎症的效应。心血管系统中的TGF可促进内皮再生和血管生长;促进成纤维细胞和血管平滑肌细胞增生;使胶原和蛋白多糖等细胞外基质合成和分泌增加,抑制细胞外基质蛋白降解;刺激细胞外基质受体与整合素的结合,从而增加细胞外基质和细胞骨架的结合[8]。TGF-β的过度表达被认为与肺动脉高压所致细胞增殖和血管硬化有密切关系,为肺动脉高压的治疗提供了新的靶点[9]。本实验观察表明稳心草黄酮类化合物(高中剂量)对细胞TGF-β表达水平有明显的减少作用。由此推测文稳心草黄酮类化合物能够抑制肺动脉平滑肌细胞增殖,调节细胞分泌TGF-β水平可能是其具体作用机制之一。

摘要：目的:研究稳心草黄酮类化合物对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMs)增殖和TGF-β表达水平的影响,探讨其防治肺动脉高压的疗效及作用机制。方法:组织帖块法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞,MTT法确定高、中、低剂量分组及作用时间。MTT法进行细胞计数,流式细胞仪进行细胞周期测定,ELISA法进行细胞培养夜TGF-β含量测定。结果:贴块培养的细胞经电镜鉴定为动脉平滑肌细胞;台盼蓝染色倒置显微镜观察表明细胞生长状态良好。黄酮类化合物高、中剂量组细胞计数明显减少、细胞周期G0/G1期细胞增多,S期、G2/M期细胞减少;细胞TGF-β含量明显降低,与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05);低剂量组与空白对照组比较无统计学意义(P>0.05)。结论:稳心草黄酮类化合物可抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖,延缓细胞周期进程,调节细胞分泌TGF-β水平。

关键词：稳心草黄酮类化合物/药理学,肺动脉平滑肌细胞/药物作用,体外研究

参考文献

[1]温进坤,韩梅.血管平滑肌细胞.北京:科学出版社,2005:1.

[2]江苏新医学院.中药大辞典.下册.上海:上海人民出版社,1823.

[3]顾丽贞,张宏彬.稳心草化学成分的研究.植物学报,1980,22(2):151.

[4]董建勇,贾忠建.赶山鞭中黄酮类化学成分研究.中国药学杂志,2005,12(40):897.

[5]肖欣荣,陈文彬,程德云.大鼠肺动脉平滑肌细胞的分离及鉴定.华西医科大学学报,1998,29(3):241.

[6]周晓莉,雷寒,柳青.血管平滑肌细胞的培养及鉴定.重庆医学,2005,6(34):877.

[7]王新华,朱渊红,王真,等.丹参合参麦注射液对肺纤维化大鼠的干预作用及对TGF-β1表达的影响.中国中医药科技,2009,16(6):441.

[8]任鹏,吴秀珍,赵静.转化生长因子-β与肺纤维化.中国煤炭工业医学杂志,2006,9(6):535.

肺动脉平滑肌细胞 第5篇

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠40只, 体重350 g±20 g, 购自山西医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂及器材

增殖细胞核杭原 (PCNA) 免疫组化试剂盒, 上海肯强仪器有限公司;衰老相关性β半乳糖 (senescence-associated-β-galactosidase, SA-β-Gal) 免疫组化试剂盒, 江苏海门市碧云天生物技术研究所; 全反式维甲酸片, 山东良福制药有限公司;经皮冠状动脉球囊成形球囊导管, Cordis公司; 显微摄影系统, 日本OLYMPUS公司; MIAS-2000图像分析系统, 四川川大智胜软件股份有限公司。

1.3 大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立

术前动物禁食12 h, 2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉。沿颈前正中线切开皮肤, 在颈前三角区暴露左颈总动脉及颈内外动脉。自颈外动脉向近心端插入气囊导管至颈总动脉起始部, 球囊充水0.1 mL, 自远心端慢速回拉至颈内外动脉分叉处, 重复3次, 完成后结扎颈外动脉[2]。喂食普通饲料, 自由饮水。实验组20只大鼠注射全反式维甲酸4 μg/ (g·d) [3]。分别于2 d、1周、2周、4周、6周时各处死4只。对照组为造模成功后不注射药物。

1.4 取材

分别于术后2 d、1周、2周、4周、6周给实验大鼠腹腔注射过量10%水合氯醛, 取出损伤部位的左颈总动脉约1.0 cm, 石蜡包埋。

1.5 免疫组织化学染色

采用SP法实验:①脱蜡、水化, PBS洗2次或3次, 每次5 min;②3%H2O2 (80%甲醇) 滴加在TMA上, 室温静置10 min;③PBS洗2次或3次, 每次5 min, 抗原修复;④PBS洗2次或3次, 每次5 min, 滴加正常山羊血清封闭液, 室温20 min。甩去多余液体;⑤滴加一抗50 μL, 室温静置1 h或者4 ℃过夜或者37 ℃ 1 h, 4 ℃过夜后需在37 ℃复温45 min;⑥PBS洗3次, 每次5 min, 滴加二抗40 μL～50 μL, 室温静置, 或37 ℃ 1 h;⑦二抗中可加入0.05%的tween-20。PBS洗3次, 每次各5 min;⑧DAB显色5 min～10 min, 在显微镜下掌握染色程度;⑨PBS或自来水冲洗10 min;苏木精复染2 min, 盐酸酒精分化;⑩自来水冲洗10 min～15 min;脱水、透明、封片、镜检。

1.6 图像处理

采用MIAS-2000图像分析系统分析免疫组化染色切片, 每张切片随机选择3个视野, 在高倍镜下计算其目标平均灰度 (GO) 、视场平均灰度 (GV) 、面积密度 (AAR Area Ratio 目标面积与视场面积的比值) , 求阳性单位 (PU) 值, PU=︱GO-GV︱×100/﹙1-AAR﹚×Gmax (Gmax=255) 。

1.7 统计学处理

用SPSS 11.5软件处理, 指标数据用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 进行方差分析, 检验水准取α=0.05。

2 结 果

各个观察点实验组与对照组相比PCNA的PU值显著下降 (P<0.05) ;在损伤后的两周时内膜PCNA阳性率达最大值, 后随着时间推移逐渐降低 (见表1) ;各个观察点实验组与对照组相比SA-β-Gal的PU值显著下降 (P<0.05) , 随着时间的推移, SA-β-Gal的PU值逐渐升高 (见表2) 。

3 讨 论

血管损伤后的修复反应是介入后血管再狭窄的根本原因, 血管平滑肌细胞 (VSMC) 的过度增殖是主要的机制之一[4,5,6,7], 但增生一定程度后, 表现增生性衰老, 两种不同变化之间的消长关系可能决定血管修复反应的最终结局。增殖与增生性衰老是细胞的两种相反的生长反应状态, 动脉损伤后平滑肌细胞同时表现这两种相反的现象, 揭示动脉损伤后平滑肌细胞增殖与增生性衰老的因果关系或相互消长关系对血管再狭窄机制的阐明有重要意义。

血管平滑肌细胞的病理性增殖在动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄的发生、发展及动脉粥样硬化脂质斑块的沉积过程中起至关重要的作用[8,9,10]。血管内皮损伤后, VSMC移行入动脉壁内膜层, 并在生长因子及细胞因子的作用下, 从静止状态重新进入细胞周期[11,12]。经皮冠状动脉成形术 (PTCA) 使血管内皮损伤, 内弹力层遭到破坏, 中膜断裂, 血小板聚集到损伤部位, 形成血栓并释放多种血管活性因子及有丝分裂生长因子, 导致血管痉挛及平滑肌细胞增殖并向内膜下迁移, 最终导致血管内膜增生, 管腔再狭窄[13,14,15,16,17]。Walker等[18]研究表明, 从球囊导管损伤后动脉内膜的粥样硬化斑块中分离所得的VSMC , 其增殖速度比未损伤侧平滑肌细胞增殖快得多。Ross 等[19]提出的损伤反应学说指出, 对血管内膜的各种损伤 (主要依据球囊导管损伤动脉血管内膜的观察) 引起VSMC 从血管中膜迁移至内膜并发生表型变化, 增殖并合成、分泌细胞外基质, 最终与其细胞成分一起逐渐形成动脉粥样硬化病灶妨碍血流。Faxon等 [20]亦报道, 在球囊导管损伤正常血管的动物模型中, 可见内膜VSMC 增殖, 导致明显的新内膜增生。

本研究通过建立大鼠颈总动脉球囊导管损伤模型, 对动脉损伤后不同时期血管内膜的增殖、增生性衰老现象进行了系统观察。

PCNA又称周期蛋白, 是一种与细胞增殖周期有关的核内糖蛋白, 是DNA 复制的必需成分, 其表达与细胞增殖活性有关, 静止细胞中PCNA 含量相当少, G1 期开始明显增加, S 达到高峰, G2期和M期明显下降。检测PCNA 是评价细胞增殖状态的可靠指标。从损伤后动脉壁的增生过程来看, PCNA表达阳性率在术后2周达到高峰, 以后随着时间推移逐渐降低。实验组使用了全反式维甲酸以后, 与对照组相比PCNA阳性率明显下降 (P<0.05) 。增生性衰老细胞表现为细胞形态增大, 不可逆的生长抑制, 在pH 6.0时表达SA-β-Gal;在实验室条件下, 增生性衰老细胞可以保持不分裂状态很长时间;人与一些动物的大多数细胞均可发生这种现象, 包括活体组织细胞。观察本试验中损伤后血管平滑肌细胞SA-β-Gal的变化可发现, 在损伤的初期 (前2周内) SA-β-Gal阳性率并不高, 随着时间推移, SA-β-Gal阳性率逐渐升高。实验组使用了全反式维甲酸后, 与对照组相比, SA-β-Gal阳性率有所下降 (P<0.05) 。全反式维甲酸本身对细胞增生性衰老不会产生作用, 但因为它抑制了细胞内膜的增生, 从而导致了增生性衰老现象的继发性减少。

临床患者经皮冠状动脉腔内成形术 (PTCA) 术后再狭窄发生时间主要在 (3～6) 个月, 其中发生在1个 月内的占13%, 4个月内者占53%, 1 年后仅占3.4%。这一规律与在大鼠动物模型上观察到的内膜增生具有相同的趋势, 即内膜增生在术后早期就已达到高峰, 这也提示若在患者接受PTCA 后在早期积极给予抑制内膜增生的防治措施, 可能对控制再狭窄有较大帮助。

摘要：目的通过研究颈动脉球囊损伤的大鼠模型血管平滑肌细胞的增生性衰老现象变化特点, 为防治血管再狭窄提供新的理论依据。方法雄性Wistar大鼠40只, 随机分成两组, 每组20只, 建立大鼠颈动脉球囊损伤模型, 实验组为造模后使用抑制血管内膜增生的试剂, 对照组为造模后未使用抑制内膜生长的试剂。每组再随机分为5个亚组, 每组4只, 分别测量损伤后2d、1周、2周、4周、6周时的增值细胞核抗原 (PCNA) 值、衰老相关性β半乳糖 (SA-β-Gal) 值。结果各个观察点实验组与对照组相比PCNA、SA-β-Gal的阳性单位 (PU) 值显著下降 (P<0.05) ;两组在不同时相点的PCNA、SA-β-Gal的PU值有统计学意义 (P<0.05) 。结论损伤后早期以血管内膜增生为主, 中后期以细胞增生性衰老为主。血管平滑肌细胞增生性衰老的现象可能是对抗血管再狭窄的一个重要原因。

肺动脉平滑肌细胞 第6篇

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

HEPES液:NaCl 144 mmol/L, KCl 5.8 mmol/L, MgCl21.2 mmol/L, CaCl2 2.5 mmol/L, HEPES 5 mmol/L, Glucose (NaOH调节pH 7.4) 10 mmol/L。分离液:NaCl 60 mmol/L, Na-Glutamate 85 mmol/L, KCl 5.6 mmol/L, MgCl22 mmol/L, Glucose 10 mmol/L, HEPES (NaOH调节pH 7.4) 10 mmol/L。酶液1为含木瓜蛋白酶 (Sigma) 0.5mg/mL, 二硫苏糖醇 (DTT, Sigma) 1 mg/mL的分离液。酶液2为含胶原酶F (Sigma) 0.7 mg/mL, 胶原酶H (Sigma) 0.3 mg/mL和0.1 mmol/L CaCl2的分离液。全细胞膜片钳记录的浴液:NaCl 145 mmol/L, KCl 6 mmol/L, MgC123 mmol/L HEPES 5 mmol/L, Glucose (NaOH调节pH 7.36) 5 mmol/L。电极内液:K-Asparate 110 mmol/L, KCl 20 mmol/L, Na2ATP 3 mmol/L, MgCl23 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, EGTA (KOH调节pH 7.2) 10 mmol/L。

1.2 单个冠状动脉平滑肌细胞的分离

雄性SD大鼠, 体重200 g～250 g。断头处死、放血, 迅速打开胸腔, 取出心脏置于4 ℃通氧的HEPES液中。立体显微镜下小心分离冠状动脉左前降支, 将其剪成长约1 mm～2 mm的小段, 置于0 ℃分离液中10 min后置入酶液1中, 37 ℃水浴消化25 min后, 移入酶液2中37 ℃水浴消化10 min。用吸管轻轻吸出酶液, 保留血管段, 沿管壁缓慢加入 0 ℃分离液冲洗 2次或3 次以终止消化。用光滑的细头吸管轻轻吹打即可得到大量长形或梭形的单个平滑肌细胞。将分离好的细胞悬液置于 4 ℃冰箱中, 选择边缘清晰的细胞8 h内完成膜片钳实验。

1.3 全细胞膜片钳实验

1.3.1 细胞贴壁

将一滴细胞悬液滴于倒置显微镜实验台上的标本槽内 (容量约1 mL) 的盖玻片上。静置20 min使细胞贴壁后用浴液灌流以除去细胞分离液对通道电流的影响, 室温 (20 ℃～24 ℃) 下进行膜片钳实验。

1.3.2 电极制备

实验用玻璃电极由外径1.5 mm的玻璃毛细管经微电极拉制器 (PP-830, Narishige, 日本) 于实验前拉制。电极尖端经热抛光。充以高钾电极内液后的电极入水后电阻为5 MΩ～8MΩ。

1.3.3 全细胞记录状态的形成

膜片钳操作按照EPC-10 (HEKA, 德国) 膜片钳放大器操作手册要求进行。在细胞贴附式 (on-cell) 模式下给予轻微正压使电极入水。给予测试脉冲 (5 mV, 5 ms的方波) , 检查电极尖端阻抗及观察封接形成过程。校正基线后利用三维推进器使电极尖端靠近细胞。当电极与细胞表面接触后可见测试脉冲减小。放掉正压, 略施负压持续吸引使电极与细胞逐步形成高阻封接 (封接电阻大于2 GΩ) , 即细胞贴附式。进行快电容 (C-fast) 补偿后给予电脉冲 (ZAP) 破膜形成全细胞记录模式。进行慢电容 (C-slow) 补偿和串联电阻 (Rs) 补偿。在电压钳下, 将膜电位钳制在-70 mV, 给予一系列阶跃方波脉冲 (-60 mV～+60 mV, step=10 mV, 时长500 ms) 刺激, 观察记录钾电流。一般选用串联电阻小于12 MΩ的细胞在获得全细胞模式2 min～3 min后开始进行记录。本实验漏电流未减除。

1.3.4 数据处理

实验数据采集、记录和分析均使用Pulse v8.67 (HEKA, 德国) 软件。低通滤波为2.9 kHz, 采样频率2 kHz。

1.4 统计学处理

计量资料用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示。用SPSS 11.0进行重复测量的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠冠状动脉平滑肌细胞形态

用两步法急性酶分离可得到大量单个细动脉平滑肌细胞, 细胞种类单一, 细胞呈长形、椭圆形或梭形, 极少呈圆形, 易于分辨。台盼蓝染色成活率高。细胞轮廓清晰, 细胞膜光滑而完整、贴壁较快。在分离后的8 h～10 h内, 细胞活性好, 完全可满足实验需要。

2.2 大鼠冠状动脉平滑肌细胞电压依赖性钾电流 (Kv电流) 电生理特性

在本实验条件下, 分离所得大鼠冠状动脉平滑肌细胞易于形成高阻封接 (成功率约67%) 。平均串联阻抗为11.37 MΩ±1.96 MΩ;膜电容为16.63 pF±1.27 pF。

电极内液中不含Ca2+, 而加入Ca2+络合剂EGTA (10 mmol/L) , 最大限度地减小Ca2+激活钾通道的作用。在此条件下记录的电流在膜电位正于-40 mV时被激活, 500 ms内无明显失活 (图1A) 。细胞内用CsCl (130 mmol/L) 取代K-Asparate 和KC1后, 该电流几乎完全消失 (n=4, 图1B) , 说明该电流主要成分为钾离子。4-AP对该电流有明显抑制作用。+60 mV, 3 mmol/L 4-AP使电流密度从17.11 pA/pF±1.1 pA/pF减少到5.43 pA/pF±0.98 pA/pF (n=11, P<0.01, 图1C) 。以上特征提示该电流为Kv电流[2]。

3 讨 论

分离得到独立完整、表面光滑、存活时间长的单个平滑肌细胞是膜片钳全细胞记录技术成功的关键。酶分离法自Kono等[3]首先报道以来, 不少作者[4,5,6] 在酶的选用、酶浓度、酶消化时间等方面作了尝试, 经不断改进, 越来越显示出它的优越性, 但仍有不尽如人意之处。我们建立的急性分离方法是参照文献[7]经过改进实现的。本方法操作简单, 分离过程短, 从取材到获得单细胞仅需要约1 h, 获得的细胞数量多, 成活率高, 成活时间可达到20 h以上。该法还主要具有下面几方面优势:本实验只需在 37 ℃恒温水浴箱内进行, 实验过程简单。所需酶易购买, 用量少, 消化时间短。同培养平滑肌细胞相比, 分离的细胞不受生长过程中多因素影响, 可随时分离使用。

Kv是影响细胞膜静息电位的主要钾通道, 对平滑肌细胞电生理调控具有重要意义, 在血管、食道等多种平滑肌中均有分布[8,9,10,11]。本研究通过改进分离技术, 建立了大鼠冠状动脉平滑肌细胞急性酶分离法, 并成功记录到其Kv电流。

在用此方法分离动脉血管平滑肌细胞的实际操作过程中, 需要注意以下问题:分离血管和细胞的液体最好新鲜配制, 或配好后分装, 放置在-20 ℃冰箱内保存, 使用前调定pH值。消化时温度控制在36.5 ℃～37 ℃, 以保证消化酶发挥最好的活性。在用胶原酶消化时, 要时刻注意观察血管的消化程度, 一般情况下消化10 min已经足够, 但有时可能需要延长或者缩短消化时间。酶的不同来源及放置时间及气温变化均对酶活性有一定影响。应注意严格控制酶的用量、酶消化时间温度, 这些条件均是分离成功的关键。酶的用量过大可导致细胞膜上的通道蛋白质变性受损, 通道活性改变。延长酶消化时虽然可以获得更多的细胞, 但同时细胞膜容易受损, 时间过长导致细胞膜不完整, 难以形成高阻封接, 破膜形成全细胞后也易脱落, 且通道活性极差。而消化时间短, 细胞数量少, 质量也差。

肺动脉平滑肌细胞 第7篇

关键词：原花青素,人冠状动脉平滑肌细胞,细胞凋亡

原花青素是植物中广泛存在的一大类多酚类聚合物的总称,为双黄酮的衍生物,由不同数目的黄烷醇聚合而成。它在自然界中广泛存在,主要存在于植物的果实、种子、花和外皮中,也存在于某些饮料(茶叶、啤酒)、蔬菜、水果和粮食中。研究发现,原花青素具有抗氧化、清除自由基、心血管保护、抗肿瘤、抗炎、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等广泛的生物活性[1,2,3,4,5]。本实验观察原花青素对人冠状动脉细胞增殖及凋亡的影响,并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

PC(含量>95%)购自天津尖峰公司,用无菌三蒸水溶解至所需浓度,过滤除菌后保存;Medium 231培养基购自Gibco公司;新生牛血清购自杭州四季青公司;MTT、碘化丙啶、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;Caspase活性定量检测试剂盒购自R&D公司。

1.2 细胞株

人冠状动脉平滑肌细胞(human coronary artery smooth muscle cells,HCASMC)购自美国CASCADE公司(上海博升生物科技有限公司)。培养于10%新生牛血清的Medium 231培养基中,在37℃、5% CO2的条件下培养。0.25%胰酶消化传代,每2～3天传代1次,实验均选用对数生长期细胞。

1.3 实验分组

细胞生长至对数生长期,更换新鲜培养基,加入原花青素,终浓度为0、200、400、800μg/ml(分别称为对照组,实验组1、2、3),作用24h。以加入浓度为100μmol/L的普罗布考为阳性对照。

1.4 MTT实验

取对数生长期细胞,0.25%胰蛋白酶消化,调整细胞浓度,以0.5×104/孔接种于96孔培养板中。培养24h后加入原花青素或普罗布考,吸弃含药物的上清液,更换为含10%新生牛血清Medium 231培养液,每孔加MTT 20μl(5mg/ml),培养4h,小心吸弃上清液,每孔加DMSO 150μl,震摇15min,酶联免疫仪490nm测吸光度值(A值),调零孔不加细胞,余与处理孔相同,计算细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A490均值/对照组A490均值)×100%。实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

分别收集经原花青素和普罗布考处理的细胞,经PBS(pH 7.2)离心洗涤2次,预冷70%乙醇固定12h,PBS洗涤2次,加入碘化丙啶(10mg/L)染色,15min后上机检测。

1.6 DNA梯状条带检测

收集经原花青素和普罗布考处理的细胞于1.5ml离心管中,1000r/min离心5min,弃上清液,用1.0ml预冷的PBS(pH 7.4)离心洗涤,弃上清液,每组加入裂解液300μl,混匀,37℃水浴24h。加125μl平衡酚,混匀,10 000r/min室温离心10min,转移上清液于新离心管中重复上步。转移上清液于新离心管中,加氯仿:异戊醇(24∶1)125μl,混匀,10 000r/min室温离心10min。转移上清液于新离心管中,加3mol/L乙酸钠(pH 5.2)25μl及2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置1h,10 000r/min室温离心10min。弃上清液,用70%预冷乙醇洗涤,5000r/min室温离心10min,空气干燥20min。用含20μg/ml核糖核酸酶A(Rnase A)的TE30μl溶解DNA,取10μl进行1.5%(含EB 0.5μg/ml)琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统观察DNA条带拍照。

1.7 Caspase-3,9活性定量检测

根据Caspase活性定量检测试剂盒说明书进行。收集经原花青素和普罗布考处理的细胞,用裂解液(50μl,每升×106个细胞)冰上裂解细胞10min后4℃ 12 000g离心1min,取上清液5μl用Bradford法进行蛋白定量,然后测定OD595值。另外45μl裂解液加50μl 2X反应缓冲液及5μl Caspase作用底物,37℃孵育1h后测定OD405值,计算Caspase活性(OD405值,POD595值)。

1.8 统计学方法

计量资料以$\overline{x}\pm s$表示,所有数据经方差齐性检验后多组比较行方差分析,组间两两比较采用q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 原花青素对人冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响

原花青素可明显抑制人冠状动脉平滑肌细胞的生长(P<0.01),且其作用具有剂量依赖性,随着原花青素浓度增加,细胞抑制率逐渐增加(P<0.01)。见表1。

注:与对照组比较,*P<0.01;与阳性对照组比较,#P<0.01

2.2 原花青素诱导人冠状动脉平滑肌细胞凋亡

对照组凋亡率为(1.9±0.31)%,实验组1凋亡率为(8.5±0.29)%,实验组2凋亡率为(19.7±1.8)%,实验组3凋亡率为(32.3±1.5)%,阳性对照组凋亡率为(30.5±2.0)%。可以看出原花青素能显著诱导人冠状动脉平滑肌细胞的凋亡(P<0.01),而且随着药物剂量的增加,细胞凋亡率也逐渐升高(P<0.01)。

2.3 DNA梯状条带分析

原花青素200、400、800μg/ml作用24h均能引起人冠状动脉平滑肌细胞出现凋亡所特有的阶梯状排列的DNA条带。见图1。

DNA凝胶电泳图M:Mark;1:对照组;2:100μmol/L普罗布考;3、4、5:实验组3、2、1

2.4 Caspase活性定量检测

原花青素处理人冠状动脉平滑肌细胞24h后,Caspase-9,3的活性明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);且实验组1、2 Caspase-9,3的活性均低于阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

注:与对照组比较,*P<0.01;与阳性对照组比较,#P<0.01

3 讨 论

经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)作为治疗缺血性心脏病的重要方法,但是术后30%～50%的再狭窄率严重影响其远期疗效。而血管平滑肌细胞增殖是介入治疗后血管再狭窄的主要病理基础。因此,选择有效且不良反应小的药物抑制血管平滑肌细胞增生是减少介入治疗后再狭窄发生的关键。

研究证实原花青素对多种细胞(如乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌细胞等)都具有不同程度的抑制作用。25mg/L的葡萄籽提取物原花青素对人乳腺癌MCF-7细胞、人肺癌A-427细胞和人胃腺癌CRL-1739细胞具有细胞毒性,24、48、72h对MCF-7细胞的生长抑制率分别为7%、30%、43%。原花青素(10～100g/L)明显抑制DU145细胞的生长,呈现出剂量—时间—效应关系,并将细胞周期阻滞在G0期[6]。最近一项研究显示高浓度PC(200、400、800mg/L)对血管内皮细胞增殖有抑制作用[7]。上述研究结果表明,原花青素具有很强的抑制细胞增殖及促进凋亡作用。但是原花青素是否具有抑制人冠状动脉平滑肌细胞增殖及促进其凋亡的作用目前尚未见报道。

本结果显示,原花青素显著抑制人冠状动脉平滑肌细胞增殖,且具有剂量依赖性。同时,流式细胞术检测显示原花青素可以促进人冠状动脉平滑肌细胞凋亡,并且随着原花青素剂量增加细胞凋亡率也显著增高(P<0.01)。DNA裂解片段分析表明实验剂量的原花青素作用于人冠状动脉平滑肌细胞后呈现凋亡细胞特有的DNA梯状条带。而且细胞形态学观察也发现原花青素作用于人冠状动脉平滑肌细胞后细胞胞质及胞核浓缩,染色质向核膜偏移。因此,本实验结果表明实验剂量的原花青素可以诱导人冠状动脉平滑肌细胞发生凋亡。

细胞凋亡的信号传递途径十分复杂,除了Fas/FasL信号通路外,线粒体信号通路也参与凋亡信号的传递。笔者在实验中也发现,在原花青素诱导的人冠状动脉平滑肌细胞凋亡中Caspase-3的活性明显升高,而Caspase-3是Fas/FasL信号通路和线粒体信号通路的交汇点。同时也发现在原花青素诱导的人冠状动脉平滑肌细胞凋亡中,Caspase-9活性也明显升高,而Caspase-9是线粒体信号通路中重要的激酶,这提示线粒体信号通路参与原花青素诱导的人冠状动脉平滑肌细胞凋亡。在一些增对肿瘤细胞的研究中表明原花青素可以通过下调survivin、livin、bcl-2表达从而诱导细胞凋亡发生,是否原花青素也通过这些基因诱导人冠状动脉平滑肌细胞凋亡,或是通过上调某些促凋亡基因表达而促进人冠状动脉平滑肌细胞凋亡,有待进一步深入研究。

参考文献

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[2]Yamakoshi J,Kataoka S,Koga T,et al.Proanthocyanidinrich extract from grape seeds attenuates the developm ent of aortic atherosclerosis in chol-esterolfed rabbits[J].Atherosclerosis,1999,142(1):139-149.

[3]Packer L,Rimbach G,Virgili F.An tioxidant activity and biologic prop-erties of a procyanidin-rich extract from pine(Pinus mariti-ma)bark,py-cnogenol[J].Fre Radic Biol Med,1999,27(56):704-724.

[4]Dongmo AB,Kam anyiA,Anchang MS,et aI.An ti-inflammatory and an-algesic properties of the stem bark extracts of Ery.throphleum suaveolens(Caesatpiniaceae)[J].J Ethnopharmacol,2001,77(2-3):137-141.

[5]Ye X,Krohn RL,Liu W,et al.The cytotoxic effects of a novel lH636grape seed proanthocyanidin extract on cultured human cancer cells[J].Mol Cell Biochem,1999,196(1-2):99-108.

[6]Agarwat C,Sharma Y,Agarwat R.An ticarcinogenic effect of a polyphe-nolic fraction isolated from grape seeds in human prostate carcinoma DU145cells:modulation of mitogenic signaling and cell-cycle regulators and induction of G1arrest and apoptosis[J].Mol Carcinog,2000,28(3):129-138.