ELISA检测鸡肉中磺胺喹恶啉的残留

ELISA检测鸡肉中磺胺喹恶啉的残留（精选5篇）

ELISA检测鸡肉中磺胺喹恶啉的残留 第1篇

ELISA检测鸡肉中磺胺喹恶啉的残留

本研究采用间接竞争ELISA方法,对吉林某肉鸡鸡场的23个样品进行了磺胺喹恶啉(SQX)的残留检测.检测结果表明该场23个样品的.磺胺喹恶啉(SQX)残留量在国家许可的范围内,未超标.

作 者：张晓轩 高云航 ZHANG Xiao-xuan GAO Yun-hang 作者单位：吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118刊 名：吉林畜牧兽医英文刊名：JILIN ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：30(10)分类号：S859.84关键词：酶联免疫吸附试验 磺胺喹恶啉 残留 肉鸡

ELISA检测鸡肉中磺胺喹恶啉的残留 第2篇

1测量方法和数学模型

1.1材料与试剂

上海市2014年农产品质量检测抽查任务中于市场抽样鸡肉样品。

乙腈(色谱纯,CNW Technologies Gmb H,德国),正己烷(色谱纯,CNW Technologies Gmb H,德国),正丙醇(色谱纯,CNW Technologies Gmb H,德国)。

1.2仪器与设备

液相质谱-串联质谱联用仪XEVO-TQ(Waters,美国),离心机(D-37520,Thermo Fisher,德国),微波炉(M1-211A,美的,中国),旋转蒸发仪(2034,Welch,美国)。

1.3前处理方法

1.3.1提取

精确称取鸡肉2.00 g置于玻璃研钵中,再称取6.00 g C18填料加至试样上用玻璃杵轻轻研磨,使样品与填料混合均匀,装于50 m L具螺旋盖聚四氟乙烯离心管中,加入25 m L乙腈-水溶液,涡旋震荡1 min,放入家用微波炉中在光波模式下微波辐照30 s,3 000 r/min离心5 min,将乙腈层移入100 m L棕色分液漏斗中。离心后的沉淀物再加入25 m L乙腈摇匀,微波辐照提取30 s,3 000 r/min离心5 min,合并乙腈提取液,待净化。

1.3.2净化

提取液中加入25 m L乙腈饱和正己烷溶液,振摇5 min,将底层乙腈溶液移入150 m L棕色鸡心瓶中,加入10 m L正丙醇,用旋转蒸发仪于45℃水浴中减压蒸发至近干,氮气流吹干。准确加入1 m L乙腈-水溶液,超声30 s溶解残渣,将溶解液移入10 m L棕色离心管中,加0.5 m L乙腈饱和正己烷,涡旋震荡2 min,于3 000 r/min离心5 min,弃去正己烷溶液,取下层乙腈-水溶液过0.22μm微孔滤膜,供高效液相色谱-质谱/质谱测定。

1.4液相色谱条件

色谱柱:BEH C18(100 mm×2.1mm×1.7μm);柱温:30℃;流动相及配比:0.1%甲酸水+乙腈;流速:0.3 m L/min。

样品中磺胺醋酰的含量按公式(1)计算:

式中:X—试样中磺胺醋酰的含量,μg/kg;

C—标准溶液中磺胺醋酰的含量,μg/m L;

V—试样溶液定容体积,m L;

m—试样溶液所代表的质量,g。

2测量不确定度的来源

鸡肉中磺胺醋酰的测量不确定度的来源包括:试样溶液中磺胺醋酰浓度的相对标准不确定度u(c0);样品提取物溶液体积的相对标准不确定度u(V);试样溶液所代表的质量m的不确定度u(m)。

3测量不确定度的计算

3.1试样液中磺胺醋酰浓度的相对标准不确定度u(c0)

用99.5%磺胺醋酰标准物质配制成10μg/m L的标准贮备液,然后用该贮备液分别配制磺胺醋酰浓度为0.1、0.2、0.4、1.0μg/m L和2.0μg/m L的标准工作液,每种标准工作溶液测定1次,并通过线性拟合得出校准曲线和相关系数。C0的不确定度有三个来源:(1)拟合校准曲线引入的标准不确定度u1;(2)标准溶液配制引入的不确定度u2;(3)重复测量产生的不确定度u3。

3.1.1拟合校准曲线引入的标准不确定度u1

由于仪器系统的限制,只能选取1次响应的参与曲线拟合,因此不确定度包含两个因素:(1)仪器稳定性带来的不确定度us(C0);(2)相关系数带来的不确定度u1(r)。仪器稳定性的不确定度在磺胺醋酰含量重复性检测引入的标准不确定度评定中进行评估,在这里只评定相关系数带来的不确定度u1(r)。

样品测得的浓度C0=200μg/kg

相对标准不确定度为:

u1(CX)/CX=0.002/201=0.00001

3.1.2标准溶液引入的相对标准不确定度分量u2

标准溶液和标准曲线各点配制过程如下:用天平准确称取0.0043 g含量为99.5%的磺胺醋酰标准物质于25 m L容量瓶中,定容,配制浓度为171μg/m L磺胺醋酰标准贮备液。然后用移液枪准确移取1.462 m L浓度为171μg/m L的磺胺醋酰标准储备液于25 m L容量瓶中,定容,配制成浓度为10μg/m L磺胺醋酰标准储备液。用时先用0~1 000μL移液枪吸800μL浓度为10μg/m L磺胺醋酰标准储备液到5 m L样品瓶中,取3 200μL甲醇定容到4 m L,配制成浓度为2μg/m L磺胺醋酰标准工作液。再分别准确移取100、100、200μL和500μL浓度为2μg/m L磺胺醋酰标准工作液于2 m L样品瓶,吸1 900μL甲醇定容到2 m L,吸取900μL、800μL和500μL甲醇定容到1 m L,得到浓度为0.1、0.2、0.4、1.0μg/m L和2.0μg/m L的磺胺醋酰标准工作溶液。稀释时使用0~1 000μL移液枪,经校准移液枪100μL时误差为1.2%,500μL时误差为0.3%,1 000μL时误差定度为0.9%。

标准溶液的不确定度分量u2分为两部分,外购标准物质的不确定度u(bw);和标准工作液配制过程中引入的不确定度u(pz)。

3.1.2.1外购标准物质带来的不确定度u(bw)

本实验使用的外购磺胺醋酰标准物质,其纯度为(99.5±0.5)%,引用的不确定度假定为矩形分布。

标准不确定度

相对不确定度u(bw)/99.5%=0.0029

3.1.2.2配制标准工作液引入的不确定度u(pz)

(1)标准物质称量引入的相对不确定度

(2)移液枪引入的相对不确定度

移取1 462μL、3 200μL和1 900μL时不确定度以0.9%计,移取100μL时不确定度以1.2%计,移取200μL、2个500μL、800μL和900μL时不确定度以0.3%计。按均匀分布,

相对不确定度为:

(3)容量瓶定容引入的相对不确定度

将标样溶液移入经鉴定为A级的25 m L容量瓶中,国家计量检定规程《常用玻璃量器检定规程》(JJG196-90)中规定,该容器的允许误差为±0.03 m L,按均匀分布评定;水的膨胀系数为2.1×10-4,均匀分布评定:

相对标准不确定度为:

u(V25)/V25=0.0009

配制标准工作液引入的不确定度u(pz):(0.0132+0.0142+0.00092)1/2=0.019

标准溶液引入的相对不确定度分量u2:

u2=(0.00292+0.0192)1/2=0.019

3.1.3重复测量产生的相对不确定度u3

样品溶液重复测量2次,测定结果及相对误差见表1。

按矩形分布,由表1数据计算重复测量产生的相对不确定度u3:

将上述不确定度分量合成得:

3.2定容体积产生的相对不确定度u(V)/V

样品净化时,氮吹干后,准确加入1 m L乙腈-水溶液,超声30s溶解残渣,将溶解液移入10 m L棕色离心管中,加0.5 m L乙腈饱和正己烷,涡旋震荡2 min,于3 000 r/min离心5 min,弃去正己烷溶液,取底层乙腈-水溶液过0.22μm微孔滤膜,供高效液相色谱-质谱/质谱测定。经校准移液枪1 000μL时误差定度为0.9%,500μL时误差定度为0.3%,按均匀分布,相对不确定度为:

3.3称量样品产生的相对不确定度u(m)/m

4合成标准不确定度u(X)及扩展不确定度U

取包含因子k=2,则扩展不确定度为:

U=u(X)×2=8.4μg/kg

5结果报告

液相色谱法测定水产品中磺胺醋酰含量,称样量2g时,测量结果为(200±8.4)μg/kg,k=2。

6结语

由计算结果可以看出,用液相色谱-质谱/质谱法测定鸡肉中磺胺醋酰含量的测定过程中,有证标准物质、检定合格的玻璃仪器、样品称量和测量重复性所带来的不确定度分量均远小于由拟合直线求样品溶液浓度和标准溶液配制所带来的不确定度分量,因此由拟合直线求样品溶液浓度和标准溶液配制是该方法不确定度的主要来源。

摘要：根据《动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》(GB/T21316-2007)[1]规定的测量步骤对鸡肉中磺胺醋酰的含量进行了测定,根据测量不确定度的评定理论,分析整个测试过程中的不确定度来源,结果表明拟合直线求样品溶液浓度和标准溶液配制是该方法不确定度的主要来源。

关键词：磺胺醋酰,液相色谱-串联质谱法,不确定度

参考文献

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ELISA检测鸡肉中磺胺喹恶啉的残留 第3篇

关键词：液相色谱-串联质谱；负离子模式；鸡肉；磺胺硝苯

Abstract： A method for the determination of sulfanitran in chicken was developed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Samples were extracted with formic acid-ethyl acetate （2：98， V/V）， and the extract was defatted by hexane extraction and cleaned up by liquid-liquid partitioning. The analyte was separated on a C18 colum using a mobile phase consisting of methanol and 5 mmol/L ammonium acetate solution with gradient elution. The mass spectrometry was operated in negative ion mode using multiple reaction monitoring （MRM） for qualitative and quantitative analysis. The calibration curve of the method was linear in the range of 2.0–100.0 μg/L， with correlation coefficient more than 0.99. The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 0.5 μg/kg and 2.0 μg/kg， respectively. At spiked levels of 2.0， 5.0， 10.0 μg/kg， the recoveries ranged from 76.0% to 83.4% with relative standard deviations （RSD） less than 8.7%. This method proved to be convenient and suitable for the determination of sulfanitran residues in chicken.

Key words： liquid chromatography-tandem mass spectrometry； negative ion mode； chicken； sulfanitran

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.08.007

中图分类号：TS251.7 文献标志码：A文章编号：1001-8123（2016）08-0035-04

磺胺硝苯属于磺胺类的一种抗球虫药物，此药抑制球虫体内的二氢叶酸合成酶阻碍叶酸合成导致核酸合成受阻从而使虫体繁殖受到抑制，该药作用是在球虫无性繁殖阶段抑制第二代裂殖体的发育，对第一代裂殖体也有一定抑制作用，主要用于家禽球虫病的治疗与预防[1]。研究表明，磺胺类药物在体内的作用时间和代谢时间较长，人体长期食用含有此类药物的食品会在体中蓄积，进而对人体机能产生危害[2-4]，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血[5]，并导致病原体产生抗药性，发生过敏反应[6-7]。为保障食用者的安全我国及欧盟规定肉类食品中的磺胺类药物的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）为：单一磺胺类药物25.0 μg/kg，磺胺类药物总量100.0 μg/kg[8-14]。

目前使用现代分析仪器对动物源性食品、化妆品及饲料中磺胺硝苯检测的方法文献报道很多，主要有液相色谱法[15-18]和液相色谱-串联质谱法[19-25]。液相色谱-串联质谱抗干扰能力强、选择性好检测灵敏度高，已被广泛应用于磺胺类兽药残留检测。文献所报道的液相色谱-串联质谱法检测磺胺硝苯的方法均是正离子监测模式，尚未有使用负离子监测模式的方法报道。本实验分别优化了正、负离子监测模式下的仪器方法。通过实验验证，使用负离子监测模式的灵敏度高于正离子监测模式，降低了磺胺硝苯的检测限，更好地保障消费者的安全。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡肉样品购于淮安苏果超市。

磺胺硝苯（纯度为98%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯 美国默克公司；正己烷、甲酸均为色谱纯 美国天地公司；无水硫酸钠为分析纯 南京化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.2 仪器与设备

TSQ Quantum Ultra EMR串联质谱仪（配有电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源）、Surveyor液相色谱系统（包括自动进样器Autosampler 1.3）、MS Pump 2.0质谱泵 美国Thermo Fisher公司；ZORBAX SB-C18色谱柱 美国Agilent公司；氮吹仪 美国Organomation

公司；超纯水器 美国Millipore公司；离心机 美国Sigma公司；超声波清洗仪 宁波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

准确称取磺胺硝苯标准品10.00 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L标准储备液，于冰箱中冷冻避光保存，实验中根据需要用甲醇稀释至适当质量浓度的标准工作液。

1.3.2 样品提取

准确称取（5.00±0.05） g样品于50 mL离心管中，加入10 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V），于涡旋混合器上混匀1 min，超声波提取10 min；以8 000 r/min的速率离心3 min，转移上层有机溶液至20 mL氮吹管中；再用8 mL甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）重复提取残渣1 次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，涡旋混匀，10 000 r/min离心3 min，下层溶液经0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪分析。

1.3.3 HPLC-MS/MS条件

HPLC条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；进样量：25 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～4 min 70%A；4.1～6.5 min 20% A；6.6～8.5 min 70% A；流速：250 μL/min。

MS/MS条件：采用ESI源；负离子方式扫描；喷雾电压：2 500 V；离子源温度：400 ℃；鞘气：40 bar，辅助气：15 bar；毛细管温度：350 ℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式检测；优化质谱条件见表1。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

磺胺类药物为弱碱性，结构式中具有仲氨基或者叔氨基的化学电离性质，文献[26-28]报道的都是选用ESI+作为离子化模式。本实验在已有文献[29-30]报道的基础上，采用注射泵直接进样的方式，将质量浓度为1 μg/mL的标准物质，以5 μL/min的流速注入离子源中。首先在正离子模式下进行一级质谱分析，得到m/z 336.0分子离子峰，通过对辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数优化获得m/z 336.0，最高响应值为3.69×105，仪器响应强度较低；对磺胺硝苯在负离子模式下进行一级质谱扫描分析，得到m/z 334.0分子离子峰，通过优化辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数获得m/z 334.0最高响应为1.3×106，是正离子模式响应强度的3.5 倍，选定负离子模式进行监测，再对m/z 334.0准分子离子峰进行二级质谱分析，得到其相应的碎片离子信息。然后对每种物质的二级质谱进行碰撞能量、碰撞气、透镜补偿电压等参数优化，使每种物质的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳，得到m/z 136.5、270碎片离子。实验结果发现，相同进样量的磺胺硝苯用Q1扫描ESI（-）比ESI（+）具有更高的响应值（图1），灵敏度大幅度提高，所以磺胺硝苯采用负离子模式监测。

2.2 流动相的选择

磺胺硝苯采用ESI（-）离子模式监测，在流动相中未添加甲酸或者乙酸等酸性供质子体物质。本实验考察了甲醇-水、乙腈-水混合溶剂作为流动相对磺胺硝苯的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明，甲醇-水为流动相时仪器响应值、色谱峰面积高于乙腈-水为流动相时仪器响应值、色谱峰面积。实验还比较了在水相加入5 mmol/L乙酸铵对色谱峰的影响，研究表明，流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵时，峰形优于甲醇-水为流动相，因此选择甲醇-5 mmol/L乙酸铵为流动相。

2.3 提取溶剂的选择

磺胺硝苯具有较强极性，pKa为14.5，易溶于酸性溶液和乙腈、乙酸乙酯、甲醇等极性有机溶剂。本实验考察了乙腈、甲酸-乙酸乙酯（1∶199、1∶99、2∶98、3：97、4∶96、5∶95，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。结果表明，上述几种溶剂对磺胺硝苯均有较好的提取效果，乙腈对肌肉组织渗透能力较强，沉淀蛋白的效果较好，提取的脂肪含量较少，但是提取的基质干扰较大，磺胺硝苯受基质效应影响较强，添加回收率较低；乙酸乙酯提取的基质干扰较少，但提取出较多的脂肪，可以通过正己烷脱脂净化处理去掉脂肪，添加回收率明显优于乙腈；磺胺硝苯易溶于酸性溶液，使用酸性乙酸乙酯提取回收率高于乙酸乙酯，实验对甲酸的用量进行优化，当随着甲酸体积分数加大，磺胺硝苯的回收率逐渐提高，当其体积分数大于2%时回收率增加不明显，加大甲酸用量可以加强沉淀蛋白的效果，但是随着甲酸体积分数的提高，提取的基质干扰较多，因此，采用甲酸-乙酸乙酯（2∶98，V/V）混合溶液作为提取溶剂。

2.4 基质效应、准曲线线性范围及定量限

2.5 方法的回收率和精密度

选取阴性鸡肉样品，添加磺胺硝苯标准品，添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg，每个水平进行5 次平行实验，按上述优化的实验方法测定各组分的回收率和相对标准偏差，结果见表2。

3 结 论

本实验建立了负离子监测模式测定鸡肉中磺胺硝苯残留的高效液相色谱-串联质法，较正离子监测模式仪器灵敏度大幅度提高，采用基质标准曲线来减弱基质效应对磺胺硝苯定量分析的影响。该方法操作简便快速，灵敏度较高，回收率较好，满足实际检测工作的需要。

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ELISA检测鸡肉中磺胺喹恶啉的残留 第4篇

磺胺类药物在体内代谢缓慢, 因此, 磺胺类药物的残留也日益引起人们对食物安全的关注。食物中磺胺类药物的残留可引起过敏性体质人的过敏反应, 使病原菌产生抗药性等, 因此, 许多国家对食品中磺胺类药物的最大残留量作了严格的限定, 如欧洲和美国肉类产品的最大残留量为100 ng/g, 牛奶中为10 ng/g[1]。

鸡肉是磺胺类药物残留的靶组织, 研究鸡肉组织中磺胺类药物残留分析方法对其残留的监控具有重要的价值。目前对于SAs残留分析的报道很多, 主要是各种高效液相色谱法 (HPLC) , 采用恒溶剂或梯度分离的方式, 通过直接紫外法 (UV) 、荧光衍生化法或比色法进行检测, 这些方法通常需要多个液-液分配 (LLF) 、浓缩等步骤[2], 操作比较复杂, 并且针对鸡肉组织样品的残留分析资料较少。本试验选择国内较常见的7种磺胺类药物与磺胺氯哒嗪钠作为比照对象[3], 以碱性氧化铝柱固相萃取 (SPE) 和恒溶剂洗脱HPLC为基础[4], 建立了鸡肉组织中的磺胺氯哒嗪钠的残留分析方法, 对控制鸡肉组织中该药的残留、保证鸡肉的正常出口、保障人类身体健康具有重要意义。

1材料与方法

1.1试验材料鸡肉样品由沈阳市商检所提供, 4℃保存待用。

1.2试验方法

1.2.1色谱条件色谱柱:C18柱, 250㎜×4.6㎜i.d.

流动相:乙腈-磷酸 (0.017 mol/L) (20+80)

流速:1.0 m L/min

检测波长:270 nm

进样量:20μL

保留时间:14.653~15.128 min

1.2.2标准溶液的制备

1.2.2.1磺胺嘧啶钠准确称取将磺胺嘧啶钠标准品10 mg, 置于100 m L容量瓶中, 用甲醇溶液定容、摇匀, 作为储备液。C=105ng/m L。

1.2.2.2磺胺二甲基嘧啶准确称取将磺胺二甲基嘧啶标准品10 mg, 置于100 m L容量瓶中, 用甲醇溶液定容, 摇匀。作为储备液。C=105ng/m L。

1.2.2.3磺胺间甲氧嘧啶准确称取将磺胺间甲氧嘧啶标准品10 mg, 置于100 m L容量瓶中, 用甲醇溶液定容, 摇匀。作为储备液。C=105ng/m L。

1.2.2.4磺胺甲恶唑准确称取将磺胺甲恶唑标准品10 mg, 置于100 m L容量瓶中, 用甲醇溶液定容, 摇匀。作为储备液。C=105ng/m L。

1.2.2.5磺胺二甲氧嘧啶准确称取将磺胺二甲氧嘧啶标准品10 mg, 放入100 m L容量瓶中, 用甲醇溶液定容, 摇匀。作为储备液。C=105ng/m L。

1.2.2.6磺胺喹恶啉准确称取将磺胺喹恶啉标准品10 mg, 放入100 m L容量瓶中, 用甲醇溶液定容, 摇匀。作为储备液。C=105ng/m L。

1.2.2.7磺胺氯吡嗪准确称取将磺胺氯吡嗪标准品10 mg, 放入100 m L容量瓶中, 用甲醇溶液定容, 摇匀。作为储备液。C=105ng/m L。

1.2.2.8磺胺氯达嗪钠准确称取将磺胺氯达嗪标准品10 mg, 放入100 m L容量瓶中, 用甲醇溶液定容, 摇匀。作为储备液。C=105ng/m L。

1.2.2.9 8种药物的混合液从已配制好的上述8种溶液各吸取1 m L置于100 m L容量瓶中, 用流动相溶解, 定容, 摇匀。

1.2.3样品处理将鸡肉组织解冻、绞碎, 用分析天平准确称取鸡肉组织5.0 g, 量取乙腈25 m L, 加入4.0 g无水硫酸钠, 一起置于匀浆杯中, 用玻璃棒搅拌。匀浆机匀浆后, 将样液倒入50 m L离心管中, 3 000 r/min离心5 min;将分离后的残渣再用25 m L乙腈处理, 玻璃棒搅拌, 振荡10 min后, 3 000 r/min离心5 min;合并两次上清液置于分液漏斗中, 加入正己烷30 m L, 同向手动振荡10 min后, 取下层液体, 置于旋转蒸发瓶中, 再加入正丙醇10 m L, 在54℃下用旋转蒸发仪浓缩, 残留物用3 m L 95%的乙腈溶解。摇动1 min后, 过Sep-Pak氧化铝柱 (需预先用95%的乙腈10 m L平衡柱体) , 残留物再加95%的乙腈5 m L溶解, 摇动1 min后过柱, 不收集样液。用70%的乙腈10 m L洗脱, 收集洗脱液并加入5 m L正丙醇。于54℃条件下用旋转蒸发仪浓缩干燥。残留物用2 m L已超声过的流动相溶解, 溶解后的液体用带过滤膜的注射器收集。所制样液用高效液相色谱仪进行检测。

11.3标准曲线

1.3.1绘制标准曲线的原理由磺胺氯达嗪钠的系列浓度与图谱显示的峰面积绘制标准曲线, 浓度与峰面积成正向关系 (线性关系) 。本试验的药物添加浓度在标准曲线线性范围之内, 说明本试验方法可行。

1.3.2储备液的稀释及进样稀释过程

1.3.2.1磺胺氯达嗪钠C=500 ng/m L的配置从磺胺氯达嗪的原液中用刻度吸管各吸取1 m L放入200 m L容量瓶中, 用流动相溶解, 摇匀, 定容至刻度。所得样液为所要稀释的浓度。

1.3.2.2磺胺氯达嗪钠C=400 ng/m L的配置从磺胺氯达嗪的原液中用刻度吸管各吸取1 m L放入250 m L容量瓶中, 用流动相溶解, 摇匀, 定容至刻度。

1.3.2.3磺胺氯达嗪钠C=200 ng/m L的配置从C=400 ng/m L的容量瓶中, 用25 m L的移液管吸取25 m L的溶液放到50 m L的容量瓶中, 用流动相溶解, 摇匀, 定容至刻度。

1.3.2.4磺胺氯达嗪钠C=100 ng/m L的配置从C=500 ng/m L的容量瓶中, 吸取5 m L的溶液置于25 m L容量瓶中, 用流动相溶解, 摇匀, 定容至刻度。

1.3.2.5磺胺氯达嗪钠C=50 ng/m L的配置从C=500 ng/m L的容量瓶中, 吸取5 m L溶液置于50 m L容量瓶中, 用流动相溶解, 摇匀, 定容至刻度

1.3.2.6磺胺氯达嗪钠C=20 ng/m L的配置从C=400 ng/m L的容量瓶中, 吸取5 m L的溶液置于100 m L的容量瓶中, 用流动相溶解, 摇匀, 定容至刻度。

1.3.2.7磺胺氯达嗪钠C=10 ng/m L的配置从C=500 ng/m L的容量瓶中, 吸取1 m L的溶液置于50 m L的容量瓶中, 用流动相溶解, 摇匀, 定容至刻度。

1.3.3标准曲线的绘制根据磺胺氯达嗪钠的系列浓度与相应图谱的峰面积 (S) 确定标准曲线, 建立回归方程。

1.4样品添加回收率的测定按照样品处理方法进行制备样液, 用高效液相色谱仪进行检测。在0.05~0.5 mg/kg添加浓度范围内, 每个浓度梯度的样品设置5次重复。

1.5变异系数的测定将空白组织中添加磺胺氯达嗪钠 (浓度为500 ng/m L) 标准品, 按此浓度的50%、100%、200%添加, 按标准各测定3次 (每次5个平行) , 由测出的回收率进行检测其变异系数, 变异系数=标准差/平均数×100%。

2结果与分析

2.1 8种药物标准溶液的色谱检测结果8种药物混合标准液经高液相色谱仪检测, 图谱显示, 磺胺氯达嗪钠与其他7种磺胺类药物的图谱峰形互不重叠 (图1) 。说明磺胺氯达嗪钠与其他7种磺胺类药物的添加可以明显区分, 各药物互不干扰。

药物保留时间顺序:磺胺嘧啶钠;磺胺二甲基嘧啶;磺胺间甲氧嘧啶;磺胺氯达嗪钠;磺胺甲恶唑;磺胺氯吡嗪;磺胺二甲氧嘧啶;磺胺喹恶啉。

药物保留时间:磺胺嘧啶钠5.550 min;磺胺二甲基嘧啶7.275 min;磺胺间甲氧嘧啶12.453 min;磺胺氯达嗪钠15.128 min;磺胺甲恶唑19.840min;磺胺氯吡嗪35.607 min;磺胺二甲氧嘧啶38.143 min;磺胺喹恶啉41.445 min。

2.2线性回归方程根据磺胺氯达嗪的系列浓度与相应图谱的峰面积确定标准曲线, 建立回归方程 (表1) 。

2.3样品添加回收率与相关数据的结果分为添加样和阴性样 (不含磺胺氯达嗪钠) 两组, 在阴性样中按50%、100%、200%添加磺胺氯达嗪钠对照品, 按标准各测定3次 (每次5个平行) (表2) 。磺胺氯达嗪钠的平均回收率在55.0%~81.3%之间, 阴性样响应值为0, 说明其组织成分无干扰, 方法可行。

按照检测限的定义, 磺胺氯哒嗪钠的检测限为0.005 mg/kg, 定量限低于0.01 mg/kg, 50%浓度添加的变异系数 (RSD) 为4.17%~7.35%, 100%浓度添加的变异系数为4.60%~7.96%, 200%浓度添加的变异系数为2.32%~7.28%。

3讨论

3.1样品的选取空白鸡肉组织的选取对试验的成功起重要的作用。如果鸡肉组织中含有磺胺类药物, 那么试验得出的图谱就无法进行有效区分。故而在添加药物之前, 必须确保鸡肉空白样品不含有任何磺胺类药物, 以免影响试验结果。

3.2样品处理方法SAs属于碱性两性药物, 主要呈弱酸性, 等电点范围为p H 3~5, 极性较高, 一般采用极性溶剂提取和碱性溶液与溶剂反萃取净化的方法处理样品。曾用氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯做提取溶剂, 0.1 mol/L氢氧化钠和溶剂反萃取净化, 但大部分参试的SAs回收率低 (低于60%) , 并且样品干扰和乳化严重。

3.3测定方法的选择食用畜产品中磺胺药物残留的分析检测方法有多种, 包括滴定法[5]、气相色谱[6]、液相色谱、毛细管电泳[7]及生物分析方法[8]等, 最常用的是液相色谱法, 液相色谱常用的检测方法有紫外吸收[9]、荧光[10]、电化学检测[11]及质谱法[12]等方法。最终试验选择HPLC法。HPLC是SAs最常用、最方便的测定方法。采用C18柱分离和直接紫外法检测。试验表明, 该方法同样适合肠衣、肝、肾中磺胺类药物残留量的测定, 如改变色谱分离条件, 该方法可推广应用到磺胺间氧哒嗪等其他磺胺类药物残留量的检测。

3.4流动相的选择根据SAs的理化性质, 有机溶剂和p H都对SAs的保留有重要的影响。为便SAs获得有效保留和分离, 并且防止固定相表面残余的硅醇基导致SAs色谱峰脱尾, 一般采用酸性流动相 (离子抑制) 。8种磺胺类药物的出峰顺序和保留时间依次为:磺胺嘧啶钠、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯达嗪钠、磺胺甲恶唑、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹恶啉。

3.5检测波长的选择利用二极管阵列检测器检测, 得到8种成分的吸收光谱图, 判断出各成分的最大吸收波长, 为了兼顾8种成分的同时测定, 选择紫外检测法进行检测, 检测波长为270 nm, 利用保留时间进行定性。

4结论

4.1本试验建立了鸡肉组织中磺胺氯达嗪钠的提取、净化方法。

4.2本试验建立了鸡肉组织中磺胺氯达嗪钠的HPLC法色谱条件;色谱柱为C18柱 (250㎜×4.6㎜i.d) 、流动相为乙腈-磷酸 (0.017 mol/L) (20+80) 、流速为1.0 m L/min、检测波长270 nm、进样量20μL, 保留时间为14.653~15.128 min。

4.3本试验建立的鸡肉组织中磺胺氯达嗪钠的HPLC检测法最低检测限为0.005 mg/kg, 定量限低于0.01 mg/kg, 变异系数为2.32%~7.96%。此法适用于磺胺类药物的残留检测, 并为磺胺类药物残留检测的进一步研究奠定了基础。

摘要：本试验通过引入磺胺嘧啶钠、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺氯吡嗪等7种磺胺药与磺胺氯达嗪钠进行高效液相色谱残留对比分析, 建立了一种在鸡肉组织中磺胺氯达嗪钠的高效液相色谱检测法。这对控制鸡肉组织中磺胺类药物残留、保障人类健康具有重要意义。

关键词：磺胺氯达嗪钠,鸡肉组织,高效液相色谱法,检测

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ELISA检测鸡肉中磺胺喹恶啉的残留 第5篇

摘 要：建立鸡肉中22种磺胺及其增效剂多残留检测的液相色谱-串联质谱法。样品经过甲酸-乙腈（1∶199，V/V）溶液提取，正己烷脱脂，液-液分配净化后，C18柱分离，甲醇、水-甲酸水溶液（体积分数0.1%）为流动相梯度洗脱，采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）正离子多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）模式检测，外标法定量。结果表明：药物在2.0～100.0 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，方法的检出限和定量限分别为0.5 μg/kg和2.0 μg/kg，在添加量为2.0、5.0、10.0 μg/kg时回收率为61.8%～88.3%，相对標准偏差小于11.3%。该方法简便快捷，可用于鸡肉中磺胺类药物及其增效剂的多残留检测。

关键词：液相色谱-串联质谱；鸡肉；磺胺；增效剂

Determination of Residues of 22 Sulfonamides and One Sulfonamide Potentiator in Chickens by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WEI Yunji1，ZHU Zhenyi1，FENG Min1，ZHANG Ke1， WANG Xiaojin1，HE Jian1，WEI Bin1，DING Tao2

（1.Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huaian223001，China；2.Animal，Plant and Food Inspection Center（APFIC）， Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China）

Abstract： A multi-residue analytical method for the determination of 22 sulfonamides and 1 sulfonamide potentiator in chicken was developed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS）. The sample was extracted with formic acid-acetonitrile （1：199， V/V）， and the extract was defatted with n-hexane and cleaned up by liquid-liquid partition. The analytes were separated on a C18 column using a mobile phase consisting of methanol and water containing 0.1% （V/V） formic acid with gradient elution. The anaysis of the 23 analytes was performed by electrospray ionization （ESI） mass spectrometry under the positive mode using multiple reaction monitoring （MRM） and quantified by external standard method. The calibration curves showed good linearity. The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 0.5 and 2.0 μg/kg， respectively. At the spiked levels of 2.0， 5.0 and 10.0 μg/kg， recoveries ranged from 61.8% to 88.3%， with relative standard deviations （RSD） less than 11.3%. This method is convenient and suitable for the determination of residues of sulfonamides and the potentiator in chicken.

Keywords： liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS）； chicken； sulfonamides； potentiator

中图分类号：TS251.7文献标志码：A 文章编号：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

磺胺类药物是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，用于预防和治疗细菌感染性疾病，具有抗病原体范围广、化学性质稳定、使用方便、易于生产等特点，能抑制大多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌，可单独使用，也常与抗菌增效剂甲氧苄氨嘧啶配伍，通过干扰细菌的二氢叶酸形成，影响细菌核蛋白合成而抑制细菌的生长繁殖。在畜牧业和兽医临床中，被广泛用于预防和治疗食源性动物疾病。磺胺类药物在体内的作用时间和代谢时间较长，长期使用可能导致在人体中蓄积，进而对人体机能产生危害[1-2]，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血，并导致病原体产生抗药性。近年来，动物源食品中磺胺类药物残留量超标现象十分严重，尤其是在猪、禽、牛等动物源食品中。欧盟规定肉类食品中的磺胺类药物的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）为单一磺胺类药物25.0 μg/kg，磺胺类药物总量100.0 μg/kg，甲氧苄氨嘧啶的最大残留限量50.0 μg/kg[3-5]。

目前用于检测磺胺类药物及其增效剂残留的方法有高效液相色谱法[6-11]、气相色谱法[12]、气-质联用法[13]、液-质联用法[14-20]、免疫测定法[21]等。液相色谱法、气相色谱法、气-质联用法、免疫测定法大多只能检测几种磺胺类药物，操作比较复杂，而且灵敏度低；液相色谱-串联质谱法具有较高的专属性和灵敏度，常用于药物的多残留分析，目前关于鸡肉中磺胺类药物检测的方法已有报道，但是测定的药物种类不多，连同磺胺增效剂同时测定的文献尚未有报道。本文经过不断的优化改进样品前处理提取方法与仪器方法，建立了鸡肉中22种磺胺和一种磺胺增效剂同时测定的分析方法。经过验证，该法具有快速、准确、检测限量较低，适用于鸡肉磺胺类药物及磺胺增效剂的残留量测定，满足日常检测工作的需要。

1 材料與方法

1.1 材料与试剂

鸡肉样品为市购。

23种药物标准品：磺胺胍（sulfaguanidine，SG）、磺胺二甲基异嘧啶（sulfisomidine，SMD）、磺胺醋酰（sulfacetamide，SA）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathazole，ST）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SPD）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SMR）、磺胺二甲基噁唑（sulfamoxol，SM）、磺胺二甲基嘧啶（sulfadimidine，SDMD）、磺胺对甲氧嘧啶（sulfameter，SMT）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ）、磺胺甲氧哒嗪（sulfamethoxypyridazine，SMPD）、磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺氯哒嗪（sulfachlorpyridazine，SCP）、磺胺邻二甲氧嘧啶（sulfadimoxine，SDX）、磺胺甲基异噁唑（sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺氯吡嗪（sulfaclozine，SCZ）、磺胺二甲异噁唑（sulfisoxazole，SIZ）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，SBZ）、磺胺间二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazolum，SP）、甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim，TMP），纯度均在98% 以上 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、正己烷、甲酸均为色谱纯；水为超纯水；无水硫酸钠为分析纯。

1.2 仪器与设备

TSQ Quantum Ultra EMR串联质谱仪（配有电喷雾离子（ESI）源）、Surveyor液相色谱系统（包括Autosampler 1.3自动进样器）、MS Pump 2.0质谱泵 美国ThermoFisher公司；C18柱（150mm×3.1mm，3.5 ?m） 美国Agilent公司；C18固相萃取小柱（3mL/500mg） 美国Supelco公司；氮吹仪美国Organomation公司；超纯水器 美国Millipore公司；离心机 美国Sigma公司；超声波清洗仪宁波新芝生物科技公司；Oasis HLB固相萃取小柱（3 mL/60mg）、Oasis MCX固相萃取小柱（3 mL/60mg） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 标准储备液的配制

分别精密称取上述23种标准品适量，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L标准储备液，于冰箱中冷冻避光保存。

1.3.2 混合标准溶液的配制

分别准确吸取上述储备液各适量，置同一容量瓶中，用甲醇稀释制成含有上述23种物质各1.0 mg/L的混和标准溶液。

1.3.3 样品提取

准确称取（5.00±0.05）g样品于50 mL 离心管中，加入10 mL甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液，于涡旋混合器上混匀1 min，超声波提取10 min；加10 g无水硫酸钠，以8000 r/min的速率离心3 min，转移上层有机溶液至20 mL氮吹管中；再用10 mL甲酸-乙腈（1∶199，V/V）溶液重复提取残渣1次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，涡旋混匀，于4 ℃、10000 r/min离心3 min，下层溶液经0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪分析。

1.3.4 仪器参数及测定条件

1.3.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；进样量：25 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为体积分数为0.1%甲酸-水溶液，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～2 min，流动相A为90%；2.5～4.5 min，流动相A为30%；6.3～10.5 min，流动相A为70%；11～14 min，流动相A为10%；流速：250 μL/min。

1.3.4.2 质谱条件

采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）源；正离子方式扫描；喷雾电压：3000 V；离子源温度：400℃；鞘气：45bar，辅助气：10 bar；毛细管温度：350 ℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式检测；优化质谱条件见表1。

2结果与分析

2.1 提取溶解的选择

本实验在查阅大量参考文献[15-17，22]的基础上比较了乙腈、甲酸-乙腈（1∶199，V/V）、甲酸-乙腈（1∶99，V/V）、甲酸-乙腈（2∶98，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。结果表明：上述几种溶剂对磺胺类药物及其增效剂均有较好的效果，使用乙酸乙酯提取时，会提取出较多的脂肪，后续的脱脂净化较难，影响色谱柱的使用寿命；乙腈和酸性乙腈都具有沉淀蛋白的效果，提取出的脂肪含量较低，有利于后续脱脂净化，由于磺胺类药物具有弱碱性，易溶于酸性溶液，采用甲酸-乙腈混合溶剂提取效率高于乙腈，同时实验对甲酸的用量进行优化，当随着甲酸浓度增加，大部分磺胺的回收率下降，因此采用甲酸-乙腈（1∶199，V/V）混合溶液作为提取溶剂。

2.2净化方法的比较

鸡肉样品中蛋白质和脂肪含量较高，提取过程中需要去除蛋白质、脂肪干扰物质，实验研究了液-液分配萃取净化结合冷冻高速离心脱脂除蛋白和固相萃取净化后的效果，同时结合磺胺类药物具有弱碱性的化学性质。本实验选取理论上适合其净化的C18、HLB和MCX小柱进行比较，结果表明：液-液分配萃取净化结合冷冻高速离心处理的方法回收率最高，HLB小柱净化效果优于C18和MCX小柱。样品经正己烷脱脂，高速冷冻离心后大部分脂肪和蛋白质被除去，固相萃取小柱对目标物可以净化和富集，但在操作过程中目标物会损失导致回收率降低，从实验周期、经济和环保方面考虑选取正己烷脱脂液-液分配净化。

2.3质谱条件的优化

磺胺类药物为弱碱性，结构式中具有仲氨基或叔氨基的化学电离性质，理论上选用ESI+作为离子化模式，在ESI+离子模式下容易得到H+形成较为稳定的[M+H]+准分子离子峰。实验采用注射泵直接进样的方式，将质量浓度为1μg/mL的每种标准物质，以5μL/min的流速分别注入离子源中在正离子模式下对每种物质进行一级质谱分析，得到每种分子离子峰，再对每种物质的准分子离子峰进行二级质谱分析，得到其相应的碎片离子信息，然后对每种物质的二级质谱进行碰撞能量、碰撞气、辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数优化，使每种物质的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳。

2.4 色谱条件的优化

实验同时测定的物质有23种，磺胺类药物存在多组同分异构体，特别是磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪，3种物质性质极为相似很难将其分离。实验中比较了Thermo Hypersil GOLD柱（150 mm×2.1 mm，5 ?m），Thermo Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，3 ?m），Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）和Agilent Polaris 5 C18-A柱（100 mm×2.0 mm，5 ?m）对正离子模式下23种物质的分离效果、响应强度和峰型。结果表明：23种物质在Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）上有最理想的分离效果、响应强度和峰型。磺胺类药物结构中含有氨基，水溶液中呈弱碱性，色谱峰易出现拖尾现象，当在流动相中加入一定量的甲酸，在酸性条件下促进磺胺类物质的电离，提高了离子化效率；同时甲酸有助于色谱柱内硅醇基的质子化，消除硅醇基与目标物之间的相互作用，减少色谱峰的拖尾，提高了分离效果。实验比较了在流动相中添加体积分数为0.02%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%甲酸对目标物的响应和峰型的影响，结果表明：选用0.1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相获得了最好的分离效果、响应强度和峰型。磺胺类化合物极性差异大和存在同分异构体现象，采用等度洗脱不容易将多组分磺胺分离，需要采用梯度洗脱进行分离。在梯度洗脱的开始阶段以10%甲醇作为流动相将极性较强的组分先洗脱出来，3 min后逐渐增加甲醇的比例，提高了同分异构体的分离度，使极性弱的组分逐一分离，实现了23种物质的有效分离。

2.5线性范围、检出限和定量限

为消除基质效应按照1.3.3节处理步骤提取阴性鸡肉样品，配制6个不同质量浓度的标准溶液，溶液中磺胺类及其增效剂质量浓度为2、5、10、20、50、100ng/mL；在本法所确定的色谱和质谱条件下进样测定，以标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，23种化合物的线性方程、相关系数如表1所示。

在空白鸡肉中添加混合标准品，以信噪比（S/N）≥3，确定方法的检出限为0.5 μg/kg；以信噪比≥10确定方法的定量限为2.0 μg/kg；鸡肉样品中添加2.0 μg/kg 23种混合标准物质的MRM色谱图见图1。

2.6方法的回收率和精密度

选取阴性鸡肉样品，添加23种磺胺及增效剂混合标准品，添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg，每个添加5次平行，按上述优化的实验方法测定个组分的回收率和相对标准偏差，结果如表5所示。

3 结 论

实验建立了鸡肉中22种磺胺及其增效剂残留量同时测定的高效液相色谱-串联质谱法。样品经过甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液提取，正己烷脱脂，液-液分配净化，无需固相萃取净化，高效液相色谱-串联质谱测定。方法的定量限为2.0 μg/kg，空白鸡肉添加回收率为61.8%～88.3%，本方法检测周期短，灵敏度较高，回收率较好，满足实际检测工作的需要，適用于鸡肉中22种磺胺及其增效剂残留量的定性定量分析及确证。

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