当归阿魏酸范文
当归阿魏酸范文（精选8篇）
当归阿魏酸 第1篇
1 材料与仪器
1.1 试剂及药材
甲醇、乙腈均为色谱纯;纯净水, 杭州娃哈哈集团有限公司。芍药苷对照品20mg∕支 (中国药品生物制品检定所, 批号:110736-200933) ;阿魏酸对照品50mg∕支 (中国药品生物制品检定所, 批号:773-9001) ;中药饮片购自市药材公司。
1.2 仪器设备
日本岛津公司高效液相色谱仪:VP-ODS C18色谱柱;FCD-238GS型冷藏冷冻冰柜 (青岛海尔股份有限公司) ;AL104/01型电子分析天平 (梅特勒托利多仪器上海有限公司) ;真空干燥箱DZF-200型 (上海浦东容丰科学仪器有限公司) , 电热恒温水浴锅 (上海医疗器械五厂) , 旋转蒸发仪等。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:VP-ODS C18色谱柱4.6mm150mm, 5μm;流动相:乙腈-0.5%磷酸水溶液 (16∶84) 。流速1m L/min;检测波长230nm;进样量20μL;柱温:室温。
2.2 供试品溶液的制备
2.2.1 水提取法
取当归3g, 芍药16g, 川芎8g, 茯苓4g, 泽泻8g, 白术4g, 加水浸泡60min, 煎煮2次, 第1次2h, 第2次1.5h, 加水倍数分别为10倍、8倍。合并煎液, 滤过, 浓缩, 定容至50m L容量瓶, 浓度为0.86g生药/m L, 精密量取10m L水浴浓缩至稠膏, 加75%的甲醇溶液定容于50m L容量瓶中超声提取40min, 再取4m L定容于10m L容量瓶中, 最终浓度为68.8mg∕m L, 用0.45μm滤膜过滤, 取续滤液为供试品液。
2.2.2 水提醇沉法
精密量取上述10m L浓缩液, 加95%乙醇至醇浓度为70%, 分次缓慢加入乙醇, 边加边搅拌。盖上保鲜膜冷藏24h。抽滤时再配相应浓度的乙醇冲洗沉淀和瓶壁, 然后在蒸发皿中挥干乙醇, 浓缩的浸膏加75%的甲醇溶液定容于50m L容量瓶中超声提取40min, 再取4m L定容于10m L容量瓶中, 浓度为68.8mg∕m L, 用0.45μm滤膜过滤, 取续滤液为供试品液。
2.2.3 乙醇回流法
取当归3g, 芍药16g, 川芎8g, 茯苓4g, 泽泻8g, 白术4g, 加50%乙醇浸泡60min, 回流提取2次, 第1次2h, 第2次1.5h, 加乙醇倍数分别为10倍、8倍。合并两次滤液, 滤过, 回收乙醇至无醇味, 水浴浓缩至稠膏, 加75%的甲醇溶液定容至50m L容量瓶, 浓度为0.86g生药/m L, 精密量取2m L加75%的甲醇溶液定容于25m L容量瓶中超声提取40min, 最终浓度为68.8mg∕m L, 用0.45μm滤膜过滤, 取续滤液为供试品液。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取芍药苷对照品1.5mg, 用75%甲醇定容25m L, 超声10min, 使成60μg/m L的溶液, 作为对照品溶液。精密称取阿魏酸对照品1.2mg, 用75%甲醇定容100m L, 超声10min, 使成12μg/m L的溶液, 作为对照品溶液。
2.4 阴性对照溶液
2.4.1 芍药苷阴性对照液
按照处方工艺制备不含芍药的阴性样品, 按供试液制备方法提取定容后过滤, 得阴性样品提取液。
2.4.2 阿魏酸阴性对照液
按照处方工艺制备不含当归和川芎的阴性样品, 按供试液制备方法提取定容后过滤, 得阴性样品提取液。
2.5 系统适用性试验
取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液20μL, 分别注入液相色谱仪, 按上述色谱条件进行测定, 记录色谱, 结果见图1图3。由图1图3可知, 芍药苷和阿魏酸的保留时间分别为13min和22min左右。阴性对照溶液的色谱图中, 在芍药苷和阿魏酸的出锋位置处无干扰, 即在试验条件下芍药苷和阿魏酸与其它组分完全分离。供试品达到基线分离, 且样品峰与相邻的两峰分离度均大于1.5, 所以此条件可用于芍药苷和阿魏酸的含量测定。
2.6 方法学考察
2.6.1 线性关系考察
精密称取芍药苷对照品3mg于10m L容量瓶中, 用75%甲醇溶液溶解并稀释至刻度, 摇匀;分别制成30μg/m L、60μg/m L、120μg/m L、180μg/m L、240μg/m L、300μg/m L6份对照品溶液, 再分别精密吸取续滤液20μL进样, 记录色谱图, 以峰面积Y对浓度X进行线性回归, 得YX标准曲线方程为:Y=17509X+11939 (r=0.9997) , 结果表明, 芍药苷在30~300μg/m L内线性关系良好。
精密称取阿魏酸对照品1.6mg于10m L容量瓶中, 用75%甲醇溶液溶解并稀释至刻度, 摇匀;分别制成2μg/m L、4μg/m L、8μg/m L、10μg/m L、12μg/m L、16μg/m L6份对照品溶液, 再分别精密吸取续滤液20μL进样, 记录色谱图, 以峰面积Y对浓度X进行线性回归, 得YX标准曲线方程为:Y=62720X-9668.2 (r=0.9999) , 结果表明阿魏酸在2~16μg/m L内线性关系良好。
2.6.2 稳定性试验
取“2.2.1”项下的水提液组溶液1份于0、2、4、6、8、12、20、24h, 分别精密量取20μL进样, 记录峰面积, 结果芍药苷的RSD为1.34%, 阿魏酸的RSD为0.75%, 表明溶液的稳定性良好。
2.6.3 精密度试验
取“2.3”项下的芍药苷和阿魏酸组溶液各1份重复进样6次, 每次进样20μL, 记录峰面积, 结果芍药苷RSD=0.99%, 阿魏酸RSD=0.72%。
2.6.4 重复性考察
取本品1批, 平行制备6份供试品溶液分别按含量测定方法测定, 结果芍药苷RSD=1.65%, 阿魏酸RSD=1.53% (n=6) 。结果表明本方法重复性好。
2.6.5 回收率试验
采用加样回收法, 精密吸取已知含量的同一批当归芍药散供试品溶液9份, 每份1m L, 分3组各加入芍药苷对照品溶液2.8m L、3.35m L、4.2m L和阿魏酸对照品溶液0.8m L、1m L、1.2m L分别置于10m L容量瓶中, 加75%甲醇溶液至刻度, 摇匀。其总浓度分别相应于测定浓度的80%、100%、120%, 用0.45μm滤膜滤过, 精密吸取20μL续滤液注入色谱仪, 在确定的色谱条件下进样分析, 测定含量, 计算回收率, 结果见表2。
2.7 样品含量测定
精密吸取3批“2.2”项下制备的供试品溶液各20μL, 按上述色谱条件, 注入高效液相色谱仪, 测定峰面积, 按外标峰面积法, 计算芍药苷和阿魏酸的平均含量, 结果见表3。
2.8 干浸膏得率的测定
按“2.2”供试液制备法平行制备2份各样品溶液, 置于已干燥至恒重的蒸发皿中, 水浴蒸干溶剂后放入烘箱中于105℃干燥5h取出, 移至干燥器中, 冷却30min, 迅速准确称重, 计算干浸膏得率, 结果见表3。
由表可知:50%的醇提溶液中芍药苷和阿魏酸的含量为最高, 50%醇提﹥水提﹥70%醇沉。
3 讨论
3.1 流动相的选择
考察了乙腈-0.1%磷酸溶液 (14:86) 、 (26:75) 、 (17:83) 、 (16:84) 流动相体系下当归芍药散中阿魏酸、芍药苷和其它组分的分离情况, 最终确定乙腈-0.1%磷酸溶液 (16∶84) 为最佳流动相系统, 各峰分离效果较好, 其它成分无干扰, 且分析时间较短。进一步改变此体系中-0.1%磷酸的比例, 调整阿魏酸和芍药苷的保留时间, 并改善两者及其它组分间的分离程度确定乙腈-0.05%磷酸溶液 (1684) 为最佳流动相系统, 此时不仅出峰时间短, 而且上述组分完全达到基线分离。
3.2 检测波长的选择
该研究方法为同时测定2种成分的含量, 阿魏酸的检测波长多数设定为320nm左右, 而芍药苷在230nm处有最大吸收, 但在320nm附近却基本无吸收。故本文选择230nm作为检测波长, 在此测定波长下, 阿魏酸回收率测定, 精密度考察, 线性关系都能达到满意的测定结果。
3.3 提取方法的比较
从实验结果来看, 50%醇提液中芍药苷和阿魏酸的含量﹥水提液﹥水提醇沉液, 而水提醇沉液的干浸膏得率最低, 说明提取液经过乙醇沉淀后, 有效成分会降低, 这可能跟杂质在沉淀过程中吸附或包裹了部分有效成分有关。所以50%醇提液优于水提液, 提示当归芍药散的醇提液能保留更多的有效成分, 为传统散剂采用现代醇提取工艺的合理性提供了依据, 同时为当归芍药散的制备工艺优化提供了理论指导。因此, 建议当归芍药散的提取采用乙醇回流法。
摘要：目的:对不同提取方法所得的当归芍药散中芍药苷和阿魏酸成分含量进行比较研究。方法:采用RP-HPLC法, 比较了水提法、水提醇沉法、乙醇回流法3种处理方法对芍药苷和阿魏酸含量的影响。结果:乙醇回流法﹥水提法﹥水提醇沉法。结论:3种提取法中, 乙醇回流法提取当归芍药散中芍药苷和阿魏酸的含量为最高。
关键词：当归芍药散,芍药苷,阿魏酸,提取方法
参考文献
[1]张志耘, 胡志洁.当归芍药散研究的新进展[J].中草药, 2000, 31 (7) :8-9.
[2]郑虎占, 董泽宏, 佘靖, 等.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版社, 1997, 第一卷:629-672.
碱解玉米秸秆制备阿魏酸 第2篇
【摘要】本文以玉米秸秆为原料，利用碱水解法制备阿魏酸。提取玉米秸秆中阿魏酸的最佳工艺条件为：氢氧化钠浓度为0.75mol/L，固液比（玉米芯-g/碱液-mL）为1：60，提取温度为50℃，提取时间为12 h，最佳的保护剂是亚硫酸钠，亚硫酸钠的最适浓度是2.5%，在此条件下，阿魏酸的提取量最高可达26.06mg/g。
【关键词】阿魏酸；玉米秸秆；碱水解
秸秆是成熟农作物茎叶（穗）部分的总称。通常指小麦、水稻、玉米、薯类、油菜、棉花、甘蔗和其它农作物（通常为粗粮）在收获籽实后的剩余部分。目前世界秸秆年产量约29亿吨，玉米秸秆占世界秸秆年产量的35%，中国每年产生的玉米秸秆约7亿吨，玉米秸秆占全国秸秆年产量56.6%。我国玉米秸秆的产量也相当之大，但是其经济系数低，资源化利用率低。目前我国大量秸秆被闲置浪费或就地焚烧，不仅造成了资源的浪费，也造成了环境的污染。秸秆大量废弃，将导致其富含的氮、磷、钾等营养物质随雨水进入地面和地下水，与农田营养物质一起造成水体的富营养化；秸秆露天焚烧会导致大气污染，引发火灾，破坏土壤结构，危害人体健康等。因此如何丰富秸秆资源的利用已经成为当前研究的热点话题。玉米秸秆的主要是成分是纤维素、半纤维素、木质素，在其收获和加工过程中会产生很多副产品，其主要成分是富含酚酸的细胞壁物质，近年来，来源于秸秆中的多种具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等重要生理活性物质被广泛研究，如阿魏酸、对香豆酸、低聚木糖等，故富含酚酸的生物质原料可作为酚酸的主要来源。
阿魏酸（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）是广泛存在于当归、川芎、红花等中药材的有效成分之一。阿魏酸具很多有益的生理作用，有抗氧化、抗血栓、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗菌消炎、降低血清和肝脏中的胆固醇、提高精子活力以及抑制肿瘤等特性。因此，阿魏酸被广泛应用于食品、保健品、医药等领域，具有较大的市场应用前景。阿魏酸可以用化学合成，但反应时间较长，溶剂用量大，转化率低，成本高；也可以从中药阿魏、当归、红花等中药材中提取，但是成本也较高。植物细胞壁中的阿魏酸的羧基通过酯键与多糖链接，酚羟通过醚键与植物细胞壁的木质素交联在一起。通过强碱处理秸秆，可以使得酯键断裂，从而释放出阿魏酸。探索利用碱解法提取玉米秸秆中阿魏酸的工艺，提高玉米秸秆的附加值，不仅能够产生可观的经济利益，而且能够解决废弃物影响环境问题。
1、材料与方法
1.1材料、仪器和试剂
玉米秸秆：购于山东青岛农贸市场。试剂：阿魏酸标准品（纯度>98%）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：ROE公司；氢氧化钠、亚硫酸钠、磷酸、冰乙酸均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2 实验方法
⑴玉米秸秆的预处理：将购买的玉米秸秆粉碎烘干至恒重，过20目筛，装入密封袋放在干燥器备用。
⑵碱法制备阿魏酸的工艺流程：预处理的秸秆→碱浸提→离心→调pH至中性→定容→HPLC检测。
⑶高效液相色譜分析条件：色谱柱选用phenomenex Luna C18柱（150*4.6mm，5um），以甲醇：水：冰乙酸（30：69.3：0.7）为流动相，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长320nm，进样量20 ul。
⑷氢氧化钠浓度对阿魏酸提取量的影响：称取2.5g预处理玉米秸秆，在固液比1：40的条件下，室温静置10h，比较碱质量浓度分别为0.2mol/L、0.5mol/L、0.75mol/L、1.0mo/L、1.5mol/L、 2.0mol/L对阿魏酸提取量的影响，从而确定最佳碱浓度，每个样品做三个重复。
⑸提取时间对阿魏酸提取量的影响：称取2.5g预处理玉米秸秆，在固液比1：40，氢氧化钠浓度为0.75mol/L的条件下，室温静置，分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h取样，确定最佳提取时间，每个样品做三个重复。
⑹固液比对阿魏酸提取量的影响：称取2.5g预处理玉米芯，选用0.75mol/L的NaOH，在室温条件下静置12h，研究固液比为1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80对阿魏酸提取量的影响，每个样品做三个重复。
⑺提取温度对阿魏酸提取量的影响：称取2.5g预处理玉米秸秆，选用0.75mol/L的NaOH，在固液比1：60的条件下，研究温度分别为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃对阿魏酸和香豆酸提取量的影响，在12h取样，确定最佳提取温度，每个样品做三个重复。
⑻不同保护剂对阿魏酸提取量的影响：称取2.5g预处理玉米秸秆，在固液比1：60，NaOH浓度0.75mol/L，提取温度50℃的条件下，比较焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠四种保护剂对提取量的影响，四种保护剂的浓度为2.5%，以不加保护剂的为空白对照，每个样品做三个重复。
⑼保护剂浓度对阿魏酸提取量的影响：称取2.5g预处理玉米秸秆，在固液比1：60，NaOH浓度0.7mol/L，提取温度50℃的条件下，比较亚硫酸钠终浓度分别为0.5%、1%、2.5%、5%对阿魏酸提取量的影响，每个样品做三个重复。
⑽阿魏酸提取量的计算：阿魏酸的提取量以每克烘干的玉米秸秆最终得到的阿魏酸的质量来表示。式中：C为HPLC法测定的阿魏酸的质量浓度（ug/ml）；m为玉米芯的质量（mg）；Y为HPLC法测定的阿魏酸的峰面积（mAU）；V为NaOH的体积（ml）。
2、结果与讨论
2.1氢氧化钠浓度对提取量的影响
阿魏酸上的羧基通过酯键与多糖类链接，酚羟基通过醚键与木质素链接，形成了木质素/酚酸-多糖的复合物。碱解可以有效水解断裂酯键，因此碱浓度对于秸秆中阿魏酸等酚酸类物质的释放具有显著的影响。实验表明，随着NaOH浓度的增加阿魏酸提取量逐渐增大，当NaOH浓度从0.2mol/L增加到0.5mol/L时，提取量增加了54%；当碱浓度从0.5mol/L增加到0.75mol/L，阿魏酸的提取量增加了26%，当氢氧化钠增加到1mol/L时，阿魏酸提取量比0.75mol/L时增加了1.5%，幅度较小。当NaOH浓度增加到2mol/L时阿魏酸提取量为17.77mg/g，是0.75mol/L时提取量的1.2倍，但是氢氧化钠用量是2.7倍，同时实验中发现，氢氧化钠用量越大，提取液的粘度增大，离心效果不佳，从节约成本的角度考虑，选择较优的碱浓度为0.75mol/L。
2.2提取时间对阿魏酸提取量的影响
实验证明，在2h到12h的范围内，随着时间的延长，阿魏酸提取量变化比较明显，超过12h以后，随着阿魏酸提取量随着时间延长也逐渐增大，但是增加幅度较小，所以从节省时间的角度考虑，选用较优的提取时间为12h。
2.3固液比对阿魏酸提取量的影響
由图1可知，当固液比分为1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、时，阿魏酸提取量分别为13.93、14.82、15.29、15.87、16.91mg/g，随着固液比的增加，阿魏酸的提取量不断增加。当固液比继续增加到1：70和1：80时，阿魏酸的的提取量趋于稳定。考虑到提取液体积增加会增加成本，并且会增加离心的能耗，所以固液比选用1：60。
2.4温度对提取量的影响
由图2可知，在10-50℃的范围内，随着温度的升高阿魏酸的提取量逐渐增加，50℃时阿魏酸的最高提取量可达24.20mg/g是10℃提取量的1.71倍，这是因为温度升高，加速阿魏酸与木质素之间酯键断裂，有利于阿魏酸的释放。当提取温度超过50℃时阿魏酸提取量开始下降，这是由于在高温作用下，虽然阿魏酸的释放量增加，但是释放的阿魏酸在高温条件下会被氧化或者分解。
2.5保护剂对阿魏酸提取量的影响
由图3可知，在碱液中添加不同的保护剂对阿魏酸的提取量都略有提升，这是因为阿魏酸不稳定，尤其是在温度较高时，容易被氧化，这四种阿魏酸以亚硫酸钠的效果最好，添加2.5%的亚硫酸钠作为保护剂，阿魏酸的提取量为26.06mg/g，因此在提取阿魏酸时，选取亚硫酸钠作为保护剂。
2.6亚硫酸钠浓度对阿魏酸提取量的影响
由图4可知，当亚硫酸钠浓度在0.5-2.5%范围内，随着亚硫酸钠浓度的升高，阿魏酸的提取量逐渐增加，当亚硫酸浓度为2.5%时，阿魏酸的提取量26.06mg/g。
3、结论
利用玉米秸秆为原料，探索碱法提取阿魏酸的工艺条件，当氢氧化钠浓度为0.75mol/L，提取时间为12h时，固液比为1：60，提取温度为50℃，亚硫酸钠的浓度为2.5%时，阿魏酸的提取量可达26.06mg/g，此方法简便、快捷，可以用于以玉米秸秆提取制备天然阿魏酸。
参考文献
[1]ZENG X， MA Y，Ma L. Utilization of straw in biomass energy in China. Renewable and Sustainable Energy Reviews， 2007，11：976-987
[2]陈洪雷.玉米秸秆废弃物在在纸浆造纸，领域中的应用[D].济南：山东轻工业学院，2008.
[3]王舒娟.江苏省农户秸秆综合利用的实证研究[D].南京：南京农业大学，2012.
[4]赵阳阳.玉米芯中对香豆酸和低聚木糖的制备及分为成分分析检测的研究[D].广州：暨南大学，2011.
注：本文受
1.基金资助：泰州市社会发展项目（TS201337）
2.基金资助：泰州市社会发展项目（TS201516）
3.基金资助：南京师范大学泰州学院第二批精品课程《酶工程》
作者简介
当归阿魏酸 第3篇
1 材料
1.1 样品
多伞阿魏于2014年4—6月份采自石河子南山(由石河子大学阎平教授鉴定),洗净烘干,粉碎过60目筛,备用。
1.2 主要试剂
甲醇为色谱纯,其他试剂为分析纯,阿魏酸对照品(质量分数为99.6%),购自中国食品药品检定研究所。
1.3 主要仪器
高效液相色谱仪(型号为Agilent-1200)、XDB-C18柱(5μm,4.6 nm×150.0 nm)、DAD紫外检测器(型号为G1315D),购自北京京科瑞达科技有限公司;超声波清洗器(型号为SK-3200 H),购自上海科导超声仪器有限公司;旋转蒸发仪(型号为RE-85C),购自上海申生科技有限公司;离心机(型号为ANKEGL-20G-2),购自上海安亭科学仪器厂。
2 方法与结果
2.1 阿魏酸的提取
烘干、粉碎多伞阿魏,按照相应料液比称取阿魏粉末样品,加入Na OH浸提30 min后超声提取[7],5 000 r/min离心10 min,上清液经活性炭(60目)吸附后用50%乙醇洗脱(控制流速为0.2~0.3 m L/min),收集洗脱液,以0.45μm滤膜过滤后用HPLC法测定其含量。每个样品做2~3个重复。
2.2 阿魏酸含量的测定
2.2.1 色谱条件
以甲醇∶5%冰醋酸溶液=20∶80为流动相,流速为1.0 m L/min,柱温为30℃,检测波长为320 nm[8],进样量为20μL。
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称取阿魏酸标准品0.011 0 g,用少量流动相溶解后定容至25 m L容量瓶中,取1 m L于50 m L容量瓶中定容,即得浓度为8.8μg/m L的对照品溶液[9],4℃冰箱中避光冷藏,待用。
2.2.3 标准曲线的建立
精密吸取对照品溶液4,8,12,16,20μL,按照2.2.1中的色谱条件进行测定。以阿魏酸标准品进样量(X)为横坐标、峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得线性回归方程:Y=3 274.3X+2.014 3,R2=0.999 5,线性范围为0.035 2~0.176μg,表明进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。出峰时间在12.5 min左右。
2.2.4 精密度试验
取对照品溶液20μL,根据色谱条件测定峰面积,连续进样5次,测得阿魏酸峰面积的RSD为1.8%,表明仪器精密度良好。
2.2.5 稳定性试验
配制好的对照品分别放置1,2,4,8,16,24,48,96小时后取20μL,根据色谱条件测定峰面积,测得阿魏酸峰面积的RSD为0.66%,表明阿魏酸标准品稳定性良好。
2.2.6 重复性试验
称取相同质量的阿魏样品粉末,相同条件下提取后根据色谱条件测得峰面积的RSD为1.1%,表明试验重复性良好。
2.3 阿魏酸提取工艺考察
2.3.1 碱浓度的考察
精密称定阿魏样品粉末0.25 g,置5 m L离心管中,加入1%、2%、3%、4%、5%氢氧化钠5 m L,其余条件同2.1。根据色谱条件测定峰面积,参照标准曲线计算阿魏酸含量,结果见图2。
由图2可知:碱浓度为4%时,阿魏酸提取量最大,为0.155 9 mg/g;碱浓度为3%和5%时,提取量相差不大且有所降低。因此,正交试验的碱浓度水平设置为2%、3%和4%。
2.3.2 超声提取时间的考察
精密称取阿魏样品粉末0.25 g,置5 m L离心管中,加入4%氢氧化钠5 m L,其余条件同2.1。根据色谱条件测定峰面积,参照标准曲线计算阿魏酸含量,结果见图3。
由图3可知:在碱浓度为4%、超声提取20分钟时阿魏酸提取量最大,为0.221 1 mg/g,随后随着时间的延长含量开始下降,至50分钟时趋于平缓。因此,正交试验的超声提取时间设置为10 min、20 min和30 min。
2.3.3 料液比的考察
按照料液比为1∶20,1∶40,1∶60,1∶80,1∶100分别精密称定阿魏样品粉末0.250 0 g、0.125 0 g、0.083 3 g、0.062 5 g、0.050 0 g,置5 m L离心管中,加入4%氢氧化钠5 m L,其余条件同2.1。根据色谱条件测定峰面积,参照标准曲线计算阿魏酸含量,结果见图4。
由图4可知:4%氢氧化钠超声提取20 min,料液比为1∶60时阿魏酸提取量最大,为0.233 3 mg/g;料液比1∶20时提取量最低,仅为0.072 8 mg/g。料液比在1∶40与1∶60之间,阿魏酸提取量变化较大,1∶60后则是缓慢降低。因此,正交试验的料液比设置为1∶40,1∶60,1∶80。
2.4 正交试验设计
在单因素试验基础上,采用正交试验对料液比(A)、碱浓度(B)、超声提取时间(C)3个因素进行考察,各因素均确定为三个水平。选用L9(34)正交表进行试验,以阿魏酸含量为指标,优化阿魏酸的碱提-醇洗脱提取工艺参数。试验因素及水平设计见表1;试验结果用SPSS 16.0统计学软件进行方差分析,结果见表2和表3。
根据方差分析结果,各单因素水平下的料液比、碱浓度、超声提取时间对阿魏酸提取量无显著性影响,因此可进行直观分析[10]。根据表2的R值,各因素对提取量影响的大小顺序为A>B>C,得出最佳提取工艺条件为A1B2C3,即料液比为1∶40,碱浓度为3%,超声提取时间为30 min。
2.5 验证试验
精密称定5份阿魏样品粉末,每份0.125 g,置5 m L离心管中,加入3%氢氧化钠5 m L,浸提30 min后超声提取30 min,其余条件同2.1。根据色谱条件测定峰面积,参照标准曲线计算阿魏酸含量,平均结果为0.299 8 mg/g,均高于正交试验结果。
2.6 多伞阿魏不同时期地上部分含量的测定
根据正交试验得出的最佳工艺条件,对4,5,6月份采集的石河子南山地区多伞阿魏地上部分和地下部分的阿魏酸含量分别进行测定。自第一个时期开始选取8~10株长势比较旺盛的多伞阿魏植株进行采集,每个时期采集几根地上部分的基生叶茎和少许地下部分的块根,以保证不影响其长势,将不同时期采集的样品混合后进行测定,结果见表4。
mg·g-1
由表4可知,多伞阿魏生长初期的根中阿魏酸含量明显低于后期,而叶片中阿魏酸含量则呈现递减趋势,表明在阿魏生长过程中,阿魏酸的运输是由地上部分转入地下部分。
3 结论
通过正交试验设计对石河子南山地区多伞阿魏地上部分的阿魏酸提取条件进行优化,得出料液比为1∶40、3%氢氧化钠溶液超声提取30分钟时,阿魏酸提取量最高。经5次重复试验验证最佳工艺条件,获得阿魏酸含量为0.299 8 mg/g,均高于单因素及正交试验结果。在最佳提取工艺条件下对4,5,6月份不同时期采集的多伞阿魏植株地上部分和地下部分中阿魏酸含量进行测定,结果表明:4月中旬的阿魏叶片中阿魏酸含量最高,为6月份的1.6倍,随着生长时间的延长,阿魏酸含量递减;相反,根中阿魏酸含量则是6月份最高为0.415 1 mg/g,比4月中旬根的阿魏酸含量高出0.269 7 mg/g。从植株整个生长发育来看,后期多伞阿魏植物全株中阿魏酸含量明显高于其他两个时期。
结合植物生理变化进行分析[11,12],早期多伞阿魏合成的阿魏酸主要产生于地上部分基生的叶和叶脉中,随着生长期的延长,逐渐运送到根中,因此地上部分的阿魏酸含量呈现递减的趋势。在生长后期,由于地上部分开始枯萎,光合作用制造的养分大大降低,植株处在逆境生长中,反而刺激了根中次生代谢产物阿魏酸的形成。因此,在实际生产应用中,可以通过在适当时期采集多伞阿魏的地上部分提取阿魏酸,这样可以避免其重蹈新疆阿魏和阜康阿魏的覆辙,达到合理利用自然资源的目的。
摘要：为了优选多伞阿魏中阿魏酸的最佳提取工艺,试验在单因素试验基础上,以碱浓度、提取时间、料液比为考察因素,以阿魏酸含量为考察指标,采用正交试验法优选阿魏酸的提取工艺并对结果进行验证。结果表明:阿魏酸最佳提取工艺为料液比1∶40,3%氢氧化钠溶液提取30 min,此条件下多伞阿魏中阿魏酸含量达0.299 8 mg/g,均高出单因素提取量。说明优选工艺的提取量高,稳定性好。
关键词：多伞阿魏,阿魏酸,含量,提取工艺,正交,优选
参考文献
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当归阿魏酸 第4篇
肉桂酸(CA)和阿魏酸(FA) (结构见图1)是两种广泛存在的羧酸类植物活性组分。CA是中药肉桂的有效成分之一, 具有抑菌、消炎、利胆等药理作用。近几年研究表明[2], CA还具有抗血栓、抗肿瘤等作用。FA则是川芎、当归及阿魏等药材重要的有效成分之一。FA不仅具有抗菌、抗肿瘤、增强免疫机能及镇痛、解痉作用,还具有改善血液流变性, 调节血脂等作用[3,4]。
研究药物与血清蛋白间的相互作用常用的方法有荧光光谱等各种光谱技术以及电化学、高效液相色谱、表面等离子共振(SPR)、毛细管电泳(CE)等[5,6]。CE因其消耗样品量少、分析过程快速灵敏、自动化程度高等优点,被广泛地应用在药物与蛋白质等生物分子间相互作用的研究中。常用的研究相互作用的CE方法有亲和毛细管电泳法(ACE),毛细管区带电泳法(CZE),前沿分析法(CE-FA)和动态电泳法(KCE)[7]。ACE由于简单、准确而成为方法中常用的一种研究分子间非共价作用的方法[7,8,9]。
近年来利用荧光方法研究CA、FA与血清蛋白的作用已有一些报道[10,11,12]。采用毛细管电泳研究的较少,周飞濛等[13]运用ACE和SPR对比研究了FA与BSA之间的相互作用。而同时分离检测以及从系统研究比较CA、FA与BSA之间相互作用以及热力学性质的却未见报道。本文运用CE分离并同时研究了CA、FA与BSA 相互作用,利用Scatchard方程求出各自的结合常数,根据不同温度的结合常数计算得到热力学参数并推测了CA、FA与BSA分子间作用力类型。进而从分子结构角度讨论了活性组分-血清蛋白的作用规律,为羧酸类药物筛选、新药设计、以及临床合理应用提供理论参考和试验基础。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Beckman P/ACE MDQ型高效毛细管电泳系统,配有二极管阵列检测器(PDA),Beckman公司;未涂层熔融石英毛细管柱,51 cm(有效长度40 cm)×75 μm i.d.,河北永年锐沣色谱器件有限公司;0.45 μm微孔滤膜,上海新亚净化仪器厂。
BSA(生化试剂), 美国Sigma公司;CA与FA,中国药品生物制品检定所;Mili-Q18.2 MΩ超纯水,美国Millipore公司;其他试剂均为分析纯。
1.2 实验过程
1.2.1 溶液配制
缓冲溶液的配制:准确称取硼砂、磷酸二氢钠并配制成试验所需溶液,分别用1 mol/L盐酸、磷酸以及NaOH调节pH值,选择合适缓冲体系后,依次配制BSA浓度为0,4,8,10,15,20,30 μmol/L的缓冲体系,各自混匀后用0.45 μm滤头过滤,备用。
样品溶液的配制:精确称取CA、FA各0.65～0.75 mg于5 mL 容量瓶中,加入相应缓冲溶液溶解,分别配制成如下浓度的储备液:CA浓度为0.37 μmol/L,FA浓度为0.27 μmol/L。取出1 mL样品溶液,进样前加入1%的二甲基亚砜(DMSO)作为中性内标,混匀即可。
1.2.2 CE测定条件
毛细管在使用前分别用1 mol/L NaOH 溶液、去离子水及运行缓冲液冲洗毛细管各10 min;压力进样0.5 psi×5 s;分离电压: 15 kV。两次进样之间分别用去离子水,0.1 mol/L NaOH 溶液,去离子水及运行缓冲液冲洗毛细管各2 min。PDA检测器三个通道波长分别设在214,254和280 nm,以254 nm作为CA和FA的检测波长。
1.2.3 计算方法
ACE中, 常将蛋白质(或药物)作为缓冲溶液添加剂, 利用样品溶液中药物(或蛋白质)电泳淌度变化测定药物与蛋白质的结合常数Kb。相对于血清蛋白,药物作为添加剂成本较高,但将蛋白质作为添加剂加入缓冲溶液会引起缓冲溶液粘度的变化, 势必改变药物和药物-蛋白复合体的电泳淌度, 对测定结果造成影响。这就需要在药物溶液中加入中性化合物作为电渗流(EOF)的标记, 利用药物淌度和中性标记物淌度之比(简称淌度比)的变化值代替药物淌度变化进行计算,从而可消除粘度的影响。Gomez 等[14]首次在ACE中引入淌度比,计算了碳酸酐酶B和万古霉素之间的结合常数,试验证明应用该方法计算时,电压、缓冲溶液粘度等因素变化对Kb没有影响。周飞濛等[13]运用淌度比和淌度变化得出FA在25 ℃结合常数Kb分别为5.6×104 L/mol和26.1×104 L/mol,通过与SPR的结果[(5.1±0.6)×104 L/mol]对比,认为采用淌度比所得结果更准确可靠,原因是淌度比克服了缓冲溶液粘度变化对Kb的影响。本文运用双倒数分析原理,在Gomez[15]的基础上稍加变化,方程如式(1):
这里ΔM
2 结果与讨论
2.1 缓冲体系的离子强度和pH值的影响
试验考察了不同离子强度和不同pH值的硼砂缓冲体系对试验的影响。如图2所示,在pH=7.8时,使用15 mmol/L的硼砂溶液时二者无法分离,随着硼砂缓冲体系浓度(即离子强度)的增加,CA和FA完全分离,DMSO和样品峰的迁移时间也随之增加,在试验中选取中等离子强度的25 mmol/L的硼砂作为缓冲体系,可以有效地减小蛋白质与毛细管壁的作用[15]。
峰1、峰2、峰3分别是DMSO、CA和FA的电泳峰,电压:15 kV,进样:5 s×0.5 psi.
缓冲液的pH对蛋白质、药物等化合物的分子形态有着明显的影响。缓冲液的pH值不仅影响迁移时间,同时对蛋白质的性能有较大影响。以25 mmol/L硼砂缓冲液为背景电解质,考察pH从7.0到10.0对分析的影响。随着硼砂缓冲溶液pH的增加,DMSO和样品峰的迁移时间逐渐增加,分离效果越来越好。但为了尽可能处于一种模拟生理环境体系和减少蛋白质管壁吸附,同时考虑到BSA的pI=4.7,试验采用弱碱性pH=7.8,离子强度适中的25 mmol/L的硼砂缓冲体系作为缓冲溶液。
2.2 结合常数的测定
如前所述,保持CA和FA的浓度一定,配制不同BSA含量的硼砂缓冲体系,使用DMSO来研究CA和FA迁移时间的变化。图3是CA和FA在含有0、4、8、10 μmol/L等不同浓度BSA的缓冲液中的电泳图。从图可以直观看出,BSA浓度越大,分析物迁移时间亦越大,在高BSA浓度时,分析物峰形变宽和不对称。在15 μmol/L BSA时FA与CA峰形均有所变宽。在30 μmol/L BSA时二者明显变宽。图4为25 ℃时CA和FA与BSA相互作用的Scatchard分析图,1/ΔM
为了进一步研究药物与BSA之间的相互作用,在20～37 ℃ 之间选取了不同温度来研究CA、FA与BSA的Kb。表1为通过Scatchard分析计算得到的不同温度的CA、FA与BSA的Kb。发现随着温度的升高,Kb数逐渐减小,如FA在20 ℃时Kb为9.3059×104 L/mol,当温度达到37 ℃时则减小到4.5839×104 L/mol。
2.3 热力学参数测定
一般情况下, 药物与蛋白的非键作用力主要包括氢键、范德华力、库仑力或静电作用、疏水相互作用等。反应的热力学参数ΔH、ΔS、ΔG对预测和确定药物-蛋白之间的作用模式是非常重要的。根据反应前后的焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小,可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型[14]。通常当温度变化不大时, 结合反应的ΔH可看作一个常量,根据热力学公式(2)、(3)、(4)可计算ΔH、ΔS、ΔG。
式中R为气体常数。在不破坏蛋白质结构的温度范围内选择293、298、303和310 K来进行药物和BSA相互作用研究。如式(2)所示,lnKb vs. 1/T作图即可得到反应的ΔH,而ΔG和ΔS则可通过式(3)和(4)计算得到。
如图5所示,CA和FA与BSA结合,lnKb vs. 1/T均呈线性的Van't Hoff关系。表2提供了298 K时CA、FA与BSA相互作用的ΔH、ΔS和ΔG。由于ΔG、ΔH和ΔS均为负值,因此可以判断CA、FA与BSA之间的反应为自发放热反应。根据Ross和Subramanian[16]提出的热力学参数与作用力的相互关系,认为CA、FA与BSA的作用主要为氢键作用和范德华力作用。由于FA和CA均为羧酸类化合物,与BSA的氨基酸部位会形成氢键作用。FA比CA多1个-OH和1个-OCH3,增加了氢键作用和范德华力作用,增强了FA和BSA相互作用强度,所以结合常数亦比CA大。
3 结 论
本文采用ACE方法同时分离并研究了CA、FA与BSA之间的相互作用,根据热力学参数推测了作用力类型。这种方法在高通量研究中药活性组分与蛋白相互作用以及药物快速筛选、药代动力学等方面具有一定的意义。
摘要：采用亲和毛细管电泳法,研究了牛血清蛋白(BSA)与两种结构相似的羧酸类化合物肉桂酸(CA)和阿魏酸(FA)间的相互作用。采用淌度比计算得到25℃时CA与FA的结合常数分别为3.5318×104L/mol、8.0158×104L/mol,并根据不同温度的结合常数计算了ΔS、ΔH、ΔG等热力学参数。热力学参数表明,CA、FA与BSA体系间的相互作用力以氢键作用力和范德华作用力为主。
当归阿魏酸 第5篇
1 影响阿魏酸在药物制剂中含量的因素
1.1 品种及产地因素
原材料中阿魏酸含量的高低直接决定制剂中含量的高低。原材料产地、种植方式、生存环境的不同均会对药材中的阿魏酸含量产生影响, 从而影响到制剂中的阿魏酸含量。有研究显示[3], 岩昌、武山等产地药材中的阿魏酸含量较高, 山东、内蒙等产地药材的阿魏酸含量则较低。
1.2 原材料组合方式
由于中药材所含成分复杂, 所以在提取药物成分时, 可能因成分性质不同而对其溶解度产生影响, 造成药材中有效成分溶出。据国内文献报道, 在补气生血方中, 4味药材组合方式的不同, 会对阿魏酸提取量产生一定的影响, 当归与黄芪煎服、枸杞与人参煎服, 所提取出的阿魏酸含量显著升高。
1.3 提取方法
阿魏酸是一种弱有机酸, 其性质十分不稳定, 提取工艺不同, 也会造成制剂中阿魏酸含量的不同, 影响最大的是提取工艺中的乙醇浓度。据大量临床试验证实[4], 提取阿魏酸的最佳条件是:以浓度为70%的乙醇 (8倍量) 提取两次, 每次1.5h。提取当归中的阿魏酸, 提取溶剂宜选用酸性甲醇。
1.4 炮制因素
中药的效益多样, 在炮制过程中, 会使药物的物理化学性质产生变化, 减少药物部分性能, 从而达到治疗效果。据国内文献报道, 对应用了不同炮制品甘草、干姜的4种生化汤样本, 采用反相液相色谱法检测阿魏酸含量, 结果表明经过适当炮制的干姜、甘草, 可明显增加阿魏酸提取量。
2 药物制剂中阿魏酸含量的质量表征
2.1 高效液相色谱法
采用高效液相色谱 (HPLC) 法检测阿魏酸在药物制剂中的含量, 具有方法简单、用时短、精密度高、结果准确、专属性好的特点, 其可结合其他分析技术进行检测, 配置各种检测器, 且所需样品量小, 是检测阿魏酸含量的常用方法。通常来说, 会选用C18液相色谱柱, 流动相为水和甲醇, 利用冰醋酸控制p H值。有研究表明, 采用反相液相色谱法检测阿魏酸在乌梅透骨口服液中的含量, 阿魏酸的回收率可达97.0%~101.6%。阿魏酸是一种弱酸, 采用弱酸性流动相能较好地抑制电离作用, 提高峰形分离度, 并保持稳定的峰形, 所以多采用酸性系统提取阿魏酸, 如甲醇+冰醋酸+四氢呋喃、甲醇+水+磷酸、甲醇+水+冰醋酸等。有文献报道, 流动相选用甲醇+水+磷酸, 从归芍药汤中提取芍药苷、阿魏酸, 色谱图中的芍药苷、阿魏酸特征峰均均分离较好且峰形较好。
2.2 高效毛细管电泳
由于中药复方制剂的成分复杂, 应用HPLC检测阿魏酸含量, 易因杂质污染色谱柱而降低柱效, 缩短色谱柱寿命。高效毛细管电泳 (HPCE) 法的毛细管具有易冲洗再生的特点, 所以采用HPCE法进行药物成分检测, 可保持色谱柱高效, 且成分特征峰分离效果好, 所以在中药成分分析中, 特别是对复方制剂成分的分析, 具有明显优势, 其已成了重要成分检测的一个主要手段。应用HPCE检测药物制剂中的阿魏酸含量, 通常选用硼砂缓冲溶液 (p H值8.2~9.5, 20~50mmol/L) , 分离电压12~24k V。据相关文献报道, 采用HPCE法测定四物汤中的阿魏酸含量, 回收率可达110.1%。
2.3薄层扫描法
薄层扫描法 (TLCS) , 是将测试样品置于适当的溶剂中进行提取, 挥干溶剂后, 以甲醇溶解残渣。把供试品溶液和获得的样品溶液分别滴于由0.5CMG-Na溶液和硅胶G制成的薄层板 (厚0.5mm) 上, 展开15cm并取出晾干。然后使用紫外灯 (波长365mm) 进行检识定位, 以双波长反射法做锯齿扫描, 用外标两点法测定阿魏酸含量。
3 小结
近年来, 随着医学及科技的不断发展, 各种药物鉴定、分析方法也日趋完善。在进行阿魏酸含量检测时, 不仅应注重检测的准确性、便捷性, 还应注意阿魏酸的易分解、不稳定的特性, 在进行含量检测时, 应充分考虑到这一点。
关键词：质量表征,含量分析,阿魏酸
参考文献
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散偏口服液中阿魏酸的含量测定 第6篇
1 仪器与试药
1.1 仪器:
HX-03超声波清洗器 (武汉恒信世纪科技有限公司) ;Waters510高效液相色谱仪;N2000色谱工作站;B03001-004在线脱气机 (上海笛柏实验设备有限公司) ;Waters2487可变波长检测器;ABS220-4分析天平 (德祥科技有限公司;722s分光光度计 (上海精科有限公司) ;制冷和加热循环槽 (上海汗诺仪器有限公司) ;奥豪斯Explorer专业型分析天平 (奥豪斯仪器上海有限公司) ;XSYF-D实验室废水处理设备 (北京湘顺源科技有限公司) ;RE-52AA旋转蒸发仪 (东莞康润仪器设备有限公司) ;p HS-2C型精密酸度计 (上海精科雷磁厂) 。
1.2 色谱柱:
安捷伦C18色谱柱 (218 mm4.6mm, 5μm) 。
1.3 对照品:
阿魏酸购自中国药品生物制品检定所。
1.4 试剂:
甲醇 (上海同方精细化工有限公司) 、乙腈 (上海同方精细化工有限公司) 、冰醋酸 (上海信合化工公司) 、磷酸 (兖州市天成化工有限公司) 、三乙胺 (上海信合化工公司) 。
1.5 试药:
散偏口服液
2 测定方法确定
2.1 色谱条件
依据查阅文献及考查的结果, 确定色谱条件如下[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13]。流动相:甲醇-乙腈-水-冰醋酸 (15:6:79:0.01) , 检测波长:324nm, 流速:1.0mmin-1。柱温:30℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不得低于2000。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取阿魏酸对照品适量, 置容量瓶中, 加流动相制成每1m L含30μg的溶液, 即得。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取散偏口服液适量, 加水10ml, 混匀, 用乙酸乙酯振摇提取3次, 每次20ml, 合并乙酸乙酯液, 水浴蒸干, 残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中, 加流动相至刻度, 摇匀, 用微孔滤膜 (0.45μm) 滤过, 即得。
2.4 专属性试验
在处方中去川芎, 按方中比例和制备工艺方法制成阴性制剂。照2.3项下供试品溶液的制备方法制成阴性液, 依上述方法测定, 结果在阿魏酸出峰处阴性液无色谱峰, 结果阴性试验没有干扰, 表明本方法专属性良好。
2.5 精密度试验
精密称取阿魏酸对照品适量, 加流动相使溶解, 制成浓度为30μgm L-1的供试品溶液。照上述色谱条件, 精密吸取10μl, 连续进样6次, 记录峰面积。结果, RSD=0.65%, 表明本方法精密度良好。
2.6 对照品的线性考察
精密称取阿魏酸对照品10mg, 置250ml容量瓶中, 加入甲醇溶液使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 分别精密吸取1.5、2.5、3.0、3.5、4.5m L, 置于5m L量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL, 注人液相色谱仪, 依照2.1项下的色谱条件测定, 记录色谱峰。以峰面积 (Y) 为纵坐标, 对照品进样量 (X) 为横坐标, 绘制标准曲线, 计算回归方程。结果表明, 阿魏酸在12~40μgm L-1范围内呈良好的线性关系。
2.7 重现性试验
称取同一批的散偏口服液样品6份, 按测定方法项下的方法制备供试品溶液, 测定含量, 并计算样品的RSD值, 结果RSD为0.62%, 结果表明此方法的重现性良好。
2.8 准确度试验
精密称取已知含量的样品6份, 分别加入一定量的阿魏酸对照品, 上述方法进行测定, 计算回收率, 平均回收率为99.3%, RSD=0.56%。结果表明此方法的回收率良好。
2.9 样品稳定性试验
取同一批散偏口服液样品, 按2.3项下的供试品制备方法制备供试品, 将供试品置室温下放置, 分别于第0、2、4、6、8、10小时, 精密吸取供试品溶液20μl注入液相色谱仪中, 记录色谱图。测定散偏口服液中阿魏酸的RSD=0.63%。结果表明供试品10小时内稳定。
3 结论
分别考察甲醇-冰乙酸-水 (31∶1∶68) , 甲醇-乙腈-水-磷酸 (20:5:75:0.1) , 乙腈-磷酸-水 (15:0.1:75) , 甲醇-乙腈-水-三乙胺 (20:10:70:0.1) , 甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺 (10:15:75:0.01:0.01) , 甲醇-乙腈-水-冰醋酸 (20:5:75:0.1) , , 甲醇-乙腈-水-冰醋酸 (15:6:79:0.01) 不同比例的流动相, 结果以甲醇-乙腈-水-冰醋酸 (15:6:79:0.01) 为流动相, 供试品各峰分离效果最好, 故选用甲醇-乙腈-水-冰醋酸 (15:6:79:0.01) 为流动相。依照上述含量测定方法, 结果三批样品的含量分别为0.075、0.076、0.075mgml-1。散偏口服液中阿魏酸的含量为每毫升不低于0.070mg。
摘要：散偏口服液具有活血祛瘀、散结止痛之功效。本实验对散偏口服液中阿魏酸的含量进行测定。方法流动相为甲醇-乙腈-水-冰醋酸 (15:6:79:0.01) , 检测波长为324nm, 流速为1.0ml/min, 柱温为30℃。结论:本法简便、准确, 可用于散偏口服液中阿魏酸的含量测定。
当归阿魏酸 第7篇
关键词：川芎,阿魏酸,高效液相色谱法
1 材料与方法
1.1 实验仪器与试剂
本组实验采用LC-10ATvp液相色谱仪 (日本岛津) , N2010色谱工作站 (中国科学院生产) , 微型旋涡振荡器WH-1 (上海沪西分析仪器厂) , 离心机80-2 (上海手术器械厂) 。除甲醇为色谱纯外, 其余均为分析纯试剂。
1.2 实验材料
标准品:阿魏酸 (纯度>99.9%) , 以上标准品均由上海市产品质量监督检测院提供。标准储备液:称取阿魏酸0.1000g, 用超纯水溶解稀释至10ml, 于冰箱保存。标准使用液:取一定量上述标准储备液混合, 用超纯水逐级稀释, 配成阿魏酸浓度为1.0mg/ml的混合标准使用液。
1.3 实验条件
C18色谱柱, 5μm, 250×4.6mmi.d;柱温:25℃;流动相:甲醇:5mmol/L Tris缓冲溶液 (pH4.5, 5∶95, V/V) ;流速:1.2ml/min;紫外可见检测器, 检测波长205nm。
1.4 样品处理及测定
川芎样品加水研磨成溶液, 通过0.45μm膜过滤后作为样液。样液与标准应用液均取10μl进样, 以保留时间定性, 峰面积增量法确认, 标准曲线法定量。
川芎中待测组分计算公式:Xy=Cs×Va
注:Xy为川芎样品中酸性剂的含量 (μg) ;Cs为由标准曲线查出的样液中酸性剂浓度 (pg/ml) ;Va为川芎样品体积 (ml) 。
2 结果与分析
2.1 柱温的选择
固定其他条件, 控制色谱柱温分别为20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃进行实验。实验结果表明, 当色谱柱温为30℃和35℃时, 阿魏酸的色谱峰发生拖尾或者重叠;柱温为25℃时, 阿魏酸分离度大于1.5, 有较好的峰形和响应值。故本实验选择色谱柱温为25℃。
2.2 流速的选择
在色谱分离时, 流动相的流速主要影响溶质与固定相和流动相的相互作用, 从而引起待分离组分的保留时间改变。流速太快, 柱压较高;流速太慢, 两种待测化合物的保留时间则延长, 容易造成色谱峰变形和拖尾现象。固定其他条件, 改变流动相的流速为0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3 ml/min进行实验。结果表明, 超过1.3ml/min时, 柱压升高, 六通阀进样口出现漏液;低于1.0ml/min时, 分离时间较长。综合考虑分析时间和分离度, 最终选定1.2ml/min, 两种酸性剂能在19min内完成分析。
2.3 精密度实验
本组实验按选定的HPLC色谱条件, 在同一天内连续5次测定混合标准溶液, 以各组分的峰面积, 计算日内精密度 (以相对标准偏差RSD表示) 。本法变异系数为1.02%~1.16%, 符合测定要求的2%以内。见表1。
2.4 准确度实验
本组实验还同时使用了标准样品进行了加标回收试验, 分别加入高、低两种浓度水平的混合标准溶液, 根据样品含量和加标后测定值计算加标回收率。由实验结果可知, 阿魏酸的回收率为98.6%, 均有较好的回收率。见表2。
3 讨论
高效液相色谱法 (HPLC) 是发展较快也较成熟的分析方法。盛旋等测定磺胺类人工合成酸性剂, 采用超声波提取, 阴离子交换固相萃取柱净化, 使用甲醇水先后预淋洗后, 加超声波提取滤液过柱, 再用流动相中缓冲溶液洗脱萃取柱并收集滤液用以测定。详细探讨了提取液p H、洗脱溶剂和用量, 不需衍生等前处理, 方法快捷, 对阿魏酸的检出限低至10pg。
首次采用离子对色谱法同时检测川芎中阿魏酸的含量, 不需衍生, 方法快速、简便, 在药物检验中具有实际应用价值。
参考文献
[1]邹汉法, 张玉奎, 卢佩章, 著.离子对高效液相色谱法[M].河南:科学技术出版社, 2010.
[2]林炳承, 邹雄, 韩培帧, 主编.高效液相色谱在生命科学中的应用[M].山东:科学技术出版社, 2009.
[3]李方实, 俞斌, 主编.无机与分析化学实验[M].南京:东南大学出版社, 2002.
当归阿魏酸 第8篇
1 仪器与材料
美国Waters2695-2996高效液相色谱仪, Empower色谱工作站;电子天平:BP211D电子天平 (d=0.1mg/0.01mg, max=210g/80g, Sautoris, 德国) ;KQ5200DB型超声波清洗器 (昆山市仪器有限公司) , 咖啡酸对照品 (批号:110885-200102, 中国食品药品检定研究院) ;阿魏酸对照品 (批号:110773-200611;中国食品药品检定研究院) ;色谱级甲醇、乙腈 (迪马公司) ;水为重蒸水, 其它试剂均为分析纯。川芎和川芎配方颗粒均由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供 (批号:1303102、1302090、1304306、1312091、1312092、1312093) 。
2 方法与结果
2.1 咖啡酸、阿魏酸含量测定方法建立
2.1.1 检测波长选择
实验分别对咖啡酸、阿魏酸对照品溶液在200~400nm波长进行扫描, 均在323nm处咖啡酸、阿魏酸有最大吸收且灵敏度最高, 因此确定咖啡酸、阿魏酸的检测波长为323nm。
2.1.2 对照品溶液制备
精密称取咖啡酸、阿魏酸对照品适量, 加70%甲醇制成每1mL含咖啡酸20μg、含阿魏酸30μg的混合溶液, 即得。
2.1.3 提取溶剂考察
取本品颗粒 (批号1312091) 4份, 每份0.5g, 研细, 精密称定, 置100mL锥形瓶中, 分别精密加入不同溶剂甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇25mL, 称重, 加热回流30min, 取出, 放冷, 再次称定重量, 用相应溶剂补足减失重量, 滤过, 取续滤液进样。测定咖啡酸、阿魏酸总含量。见表1。
(n=2)
结果表明, 提取溶剂为70%甲醇的咖啡酸、阿魏酸总含量最高, 且杂质峰少无干扰, 因此确定提取溶剂为70%甲醇。
2.1.4 提取方法考察
取本品颗粒 (批号1312091) 2份, 每份0.5g, 研细, 精密称定, 置100mL锥形瓶中, 精密加入70%甲醇25mL, 称重, 分别超声 (功率200W, 频率25kHz) 和回流30min, 取出, 放冷, 再次称定重量, 用甲醇补足减失重量, 滤过, 取续滤液进样。测定超声、回流所得咖啡酸、阿魏酸总含量分别为1.38、1.45mg/g, 结果表明, 回流提取比超声提取总含量更高, 所以确定提取方法为回流提取法。
2.1.5提取时间考察
取本品颗粒 (批号080601) 4份, 每份0.5g, 研细, 精密称定, 置100mL锥形瓶中, 精密加入70%甲醇25mL, 称重, 分别加热回流10、20、30、40min, 取出, 放冷, 再次称定重量, 用70%甲醇补足减失重量, 滤过, 取续滤液进样。测定10、20、30、40min提取时间下咖啡酸、阿魏酸总含量分别为1.37、1.42、1.46、1.46mg/g, 故确定回流提取时间为30min。
从以上可知, 确定供试品制备方法:取本品颗粒0.5g, 研细, 精密称定, 置100mL锥形瓶中, 精密加入70%甲醇25mL, 称重, 加热回流30min, 取出, 放冷, 再次称定重量, 用70%甲醇补足减失重量, 滤过, 取续滤液, 即得。
2.1.6 阴性样品溶液制备
取本品缺川芎的阴性样品0.5g, 照供试品的制备方法制成阴性样品溶液。
2.1.7 色谱条件
色谱柱:DiamonsiL ODS-C18 (4.6mm250mm, 5μm) ;流动相:乙腈-0.1%磷酸 (14∶86) ;检测波长:323nm;流速:1.0mL/min, 理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4 000。
在此条件下, 川芎配方颗粒中咖啡酸、阿魏酸的分离度好, 理论塔板数较高, 峰形对称性好。结果见图1。
2.1.8 方法学考察
(1) 标准曲线。分别精密吸取上述咖啡酸、阿魏酸混合对照品溶液 (咖啡酸0.0276mg/mL、阿魏酸0.0392mg/mL) 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μL, 注入液相色谱仪, 测定峰面积, 以咖啡酸、阿魏酸的峰面积值 (Y) 为纵坐标, 以咖啡酸、阿魏酸的进样量 (X) 为横坐标, 计算得咖啡酸回归方程为Y=5106X-34640, r2=0.999 2, 阿魏酸标准曲线方程为Y=5106X-64562, r2=0.999 3, 咖啡酸在0.0276~0.552μg范围内, 阿魏酸在0.0392~0.784μg范围内, 对照品峰面积与进样量有良好的线性关系。
(2) 精密度试验。精密吸取上述对照品溶液10μL, 连续进样6次, 测定峰面积。计算得RSD%为0.96 (n=6) , 结果表明仪器精密度良好。
(3) 重复性试验。称取同一批样品 (批号1312091) , 精密称定, 按上述测定方法制备样品供试品溶液, 共6份, 测定峰面积, RSD%为0.79 (n=6) , 结果表明该方法重现性良好。
(4) 稳定性试验。精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μL, 置室温下放置, 分别于0、2、4、6、8、10h进样, 按上述色谱条件测定咖啡酸、阿魏酸的峰面积, 计算得对照品RSD%为0.72 (n=6) , 供试品RSD%为1.04 (n=6) , 结果表明对照品溶液和供试品溶液在10h内稳定性良好。
(5) 加样回收试验。取已知含量的样品 (批号1312091, 咖啡酸含量为0.501mg/g, 阿魏酸为1.01mg/g) 0.25g, 精密称定, 共6份, 分别精密加入咖啡酸、阿魏酸适量对照品溶液, 按正文供试品溶液制备方法和色谱条件, 制备加样回收供试品溶液, 注入液相色谱仪, 测定, 计算回收率。咖啡酸平均回收率为99.44%, RSD为1.90%, 阿魏酸平均回收率为99.03%, RSD为2.13%, 样品加样回收率在95%~105%之间。表明样品回收率良好。结果见表2、表3。
(6) 样品测定。分别取不同批号的川芎配方颗粒约0.5g, 精密称定, 按上述方法制备供试品溶液, 分别进样10μL, 按上述色谱条件测定咖啡酸、阿魏酸峰面积, 计算咖啡酸、阿魏酸总含量, 分别为1.33、1.28、1.41、1.35、1.26、1.37mg/g, 6批川芎配方颗粒中每1g咖啡酸、阿魏酸的总含量为1.26mg~1.41mg, 故暂定本品每1g配方颗粒含咖啡酸 (C9H8O4) 、阿魏酸 (C21H18O12) 总量不得少于1.0mg。
2.2 川芎配方颗粒剂提取制备工艺条件筛选
2.2.1 正交试验
传统中药汤剂多用水煎煮, 目前国内已生产的配方颗粒的提取溶剂均为水, 因此本文选用水作为提取溶剂。根据影响的因素, 固定浸泡的时间为0.5h, 选择加水量、提取时间、提取次数为考察因素。以咖啡酸、阿魏酸含量和总出膏率为主要考察指标, 对川芎配方颗粒剂的提取工艺进行正交试验, L9 (34) 正交试验安排见表4, 以下部分的HPLC法测定各工艺下干膏率和制得浸膏中咖啡酸、阿魏酸含量, 结果见表5。
综合评分的计算方法为:以得率最大者为100%, 将其它组别结果换算为最高值的百分比, 再以咖啡酸、阿魏酸、出膏率含量权重分别占35%、35%、30%的比例进行相加后所得的值。
对表5直观分析表明, 各影响效果依次为C>A>B;因此因素C (提取次数) 有显著性影响。加水量和提取时间影响不明显。经表5、表6分析得出的最佳提取工艺条件为A3B2C3, 即加12倍量水, 浸泡0.5h, 每次1h, 提取3次。从大生产节约成本因素考虑, 优化工艺方案为A2B2C3, 即加10倍量水, 浸泡0.5h, 每次1h, 提取3次。
2.2.2 实验验证
为确定工艺的优劣和稳定性, 以A2B2C3组合进行了3批验证试验, 试验证明, 3批该工艺下的综合评分达到96%以上, 证明该工艺稳定可靠, 合理可行。
2.3 配方颗粒制备
按上述确定的工艺提取川芎饮片, 合并煎液, 浓缩和干燥制成干浸膏粉, 粉碎, 加入适量辅料, 混匀, 制粒, 整粒, 即得川芎配方颗粒。
分别取不同批号的川芎配方颗粒约0.5g, 精密称定, 按上述方法制备供试品溶液, 分别进样10μL, 按上述色谱条件测定咖啡酸、阿魏酸峰面积, 计算咖啡酸、阿魏酸总含量, 分别为1.33、1.28、1.41、1.35、1.26、1.37mg/g, 6批川芎配方颗粒中每1g咖啡酸、阿魏酸的总含量为1.26mg~1.41mg, 故暂定本品每1g配方颗粒含咖啡酸 (C9H8O4) 和阿魏酸 (C21H18O12) 总量不得少于1.0mg。
3 讨论
川芎配方颗粒的水提工艺直接关系到配方颗粒的质量, 以总干膏量和咖啡酸、阿魏酸的含量作为衡量指标, 初步评价工艺的提取效果。提取工艺研究表明, 煎煮时间和加水量对工艺的影响较小, 为次要因素, 而煎煮次数对咖啡酸、阿魏酸的含量和出膏率有显著的影响, 是该饮片提取工艺的重要因素。综合分析比较最终确定提取工艺为加10倍量水、浸泡0.5h、煎煮1h、提取3次, 再次验证表明工艺及结果合理比较稳定。
由于川芎饮片中含有挥发油成分, 但在煎煮过程中损失掉了。为了保持与传统中药汤剂煎煮一致的原则, 故未采取单独提取挥发油再加入到颗粒中的方法。
该实验用《中国药典》2010年版一部川芎药材的流动相甲醇-1%冰醋酸 (70∶30) , 经证明阿魏酸的分离度好, 对称性高, 保留时间适中, 而咖啡酸对称性不好, 且基线高, 易出现拖尾, 达不到分离要求, 综合考虑阿魏酸和咖啡酸, 故未采用药典2010年版的流动相。本实验采用流动相乙腈-0.1%磷酸 (14∶86) , 实验证明咖啡酸、阿魏酸对称性分离度好, 理论塔板数高, 达到实验的要求。
由于条件有限, 川芎配方颗粒样品数量较少, 有待在进一步试验中积累数据, 对咖啡酸、阿魏酸含量制订一个限量范围, 使其质量更加稳定可靠。通过本实验, 建立HPLC测定川芎配方颗粒中咖啡酸、阿魏酸含量方法, 各项研究符合含量测定方法的要求, 可有效控制川芎配方颗粒质量, 进一步保证临床疗效。
摘要：目的:优选川芎配方颗粒提取工艺, 建立咖啡酸和阿魏酸含量的测定方法。方法:以正交试验优选川芎配方颗粒的提取工艺, 采用HPLC建立其咖啡酸、阿魏酸含量测定方法。结果:优选出川芎配方颗粒提取工艺为10倍量水, 浸泡0.5h, 每次1h, 提取3次;咖啡酸和阿魏酸HPLC测定方法为:流动相:乙腈-0.1%磷酸 (14∶86) ;检测波长:323nm;流速:1.0mL/min, 理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4 000。结论:该提取工艺有效成分提取效率高, 质量控制方法稳定可行, 可作为川芎配方颗粒生产和质量控制的科学依据。
关键词：川芎配方颗粒,咖啡酸,阿魏酸,含量测定
参考文献
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