表皮细胞生长因子受体

表皮细胞生长因子受体（精选7篇）

表皮细胞生长因子受体 第1篇

1材料与方法

1.1材料

中国仓鼠卵巢细胞CHO-S, 建好的Anti EGFR表达载体, DMEM/F12培养基, FBS, HRP标记的抗体等。

1.2方法

1.2.1 Anti EGFR重轻链重组质粒电转染CHO-S细胞。选取T-75培养瓶培养生长状态好的CHO-S贴壁细胞, 胰酶消化细胞, 离心1000rpm, 5min, 弃去培养基, 用无菌的PBS重悬细胞。将线性化的质粒DNA与重悬后的细胞混匀后加入到电转杯中, 冰水冷却1min。180V, 电击2次, 每次电击后冰水冷却1min。在培养碟中加入37℃预热的8ml DMEM/F12+10%FBS, 将电击后的细胞转移其中, 37℃培养。

1.2.2 Anti EGFR重组工程细胞株的筛选。Anti EGFR重组工程细胞的筛选过程是将重轻链基因分别构建到带有Neo筛选标签的高表达载体上, 共转染到CHO-S细胞中后, 使用G418进行筛选, 筛选条件为1.5-1.8mg/ml。大部分细胞在筛选过程死亡, 少量带有G418抗性的重组细胞生长成克隆簇后, 捡取到96孔板中培养, DOT BLOT进行表达量的检测。经过三次克隆筛选后, 获得可用于生产的高表达细胞株。通过显微镜观察电转后的细胞, 引入外源基因的CHO-S细胞形态无明显变化。

1.2.3 Anti EGFR的一次克隆筛选。单细胞长成克隆簇后, 进行一次单克隆的挑取。用移液器将每个培养碟中的单克隆捡取到一个96孔板中, 共捡取8个96孔板。3-6天后, 细胞在96孔板中生长至单层覆盖面积达60-80%, 每孔换为100μl无血清DMEM/F12培养基过夜培养后, 取5ul培养液点在杂交膜上, 用鼠抗人Fc抗体作为一抗, 偶联有辣根过氧化物酶的兔抗鼠Ig G抗体作为二抗, 进行DOT BLOT检测。经过显影曝光后, 以标准品阳性信号的强弱梯度作为标准, 根据样品阳性信号的强弱估算出样品中目的蛋白含量。

1.2.4 Anti EGFR的二次克隆筛选。选取16个高表达一次克隆, 每个克隆取100-300个细胞加入到一个含8ml有血清培养液的培养碟, 当细胞贴壁后, 加入维持浓度的G418 (通常为筛选浓度的一半) , 持续培养, 待克隆长出后, 将克隆挑取到96孔板中, 共挑取8个96孔板。

培养3-6天后, 细胞在96孔板中生长至单层覆盖面积达80-90%, 每孔换为100ul无血清DMEM/F12培养基培养4h后, 取5ul培养液点在杂交膜上, 用鼠抗人Fc抗体作为一抗, 偶联有辣根过氧化物酶的兔抗鼠Ig G抗体作为二抗, 进行DOT BLOT检测。经过显影曝光后, 以标准品阳性信号的强弱梯度作为标准, 根据样品阳性信号的强弱估算出样品中目的蛋白含量。将每个细胞每天的蛋白产量用pg/cells·day表示, 即PCD。

1.2.5 Anti EGFR的三次克隆筛选。选取6个高表达二次克隆, 每个克隆取100-300个细胞加入到一个含8ml有血清培养液的培养碟, 当细胞贴壁后, 加入维持浓度的G418 (通常为筛选浓度的一半) , 持续培养, 待克隆长出后, 将克隆挑取到96孔板中, 共挑取3个96孔板。

培养3-6天后, 细胞在96孔板中生长至单层覆盖面积达80-100%, 每孔换为100ul无血清DMEM/F12培养基培养4h后, 取5ul培养液点在杂交膜上, 用鼠抗人Fc抗体作为一抗, 偶联有辣根过氧化物酶的兔抗鼠Ig G抗体作为二抗, 进行DOT BLOT检测。

2结果

2.1 Anti EGFR的一次克隆筛选

将每个细胞每天的蛋白产量用pg/cells?day表示, 即PCD。经检测, 一次克隆株PCD最高的为5.51。

2.2 Anti EGFR的二次克隆筛选

选取在96孔板中检测蛋白产量相对较高的细胞克隆孔, 胰酶消化后转移至24孔板进行备份, 经检测, 克隆株PCD最高为16.875。二次克隆共备份5个24孔板, 随后进行三次克隆的筛选。

2.3 Anti EGFR的三次克隆筛选

经过显影曝光后, 以标准品阳性信号的强弱梯度作为标准, 根据样品阳性信号的强弱估算出样品中目的蛋白含量。将每个细胞每天的蛋白产量用pg/cells?day表示, 即PCD。经检测, 克隆株PCD最高为20.83。

选取在96孔板中检测蛋白产量相对较高的细胞克隆孔 (如图18黄色箭头所指) , 胰酶消化后转移至24孔板进行备份。三次克隆共备份3个24孔板, 随后进行三次克隆的T25培养瓶放大。

3结论

本研究经过三次单克隆筛选, 可以筛选出表达量最高的克隆株, 其PCD可以达到为20.83, 此细胞株可应用于日后的大规模生产。

摘要：目的:以中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞为宿主, 构建高表达抗表皮生长因子受体 (EGFR) 单克隆抗体的细胞株。方法:本研究将构建好的抗EGFR单克隆抗体轻链和重链的表达载体, 通过优化的电转方法转入CHO宿主细胞, 确定G418的工作浓度, 在含G418的化学成分已知的培养基中进行克隆筛选, 最后筛选后的转染库进行三次克隆筛选, 获得稳定高表达抗EGFR抗体的细胞株。结果:通过进行表达量稳定性分析后, 筛选出一株表达量较高的细胞株。结论:该克隆筛选方法可行, 为抗EGFR抗体的生产提供了稳定高产的细胞系。

关键词：表皮生长因子受体,转染,克隆筛选

参考文献

[1]甄玉萍, 裴世春, 高建伟.基于HTS-ELISA的单克隆抗体分泌杂交瘤细胞筛选技术进展[J].食品安全质量检测学报, 2014 (7) :1960-1964.

[2]李德山, 刘春香, 姜媛媛等.Anti-h EGFR轻、重链共表达及高表达细胞株快速筛选[J].东北农业大学学报, 2015 (10) :56-62.

表皮细胞生长因子受体 第2篇

1 对象与方法

1.1 对象

80例晚期非小细胞肺癌患者均为本院中医肿瘤科、肿瘤内科、呼吸内科2013年12月至2015年12月住院病人,按照随机数字表将患者分为实验组和对照组,其中实验组40例,男25例,女15例,平均年龄(62.36±9.45)岁,病程6个月～2年,平均病程(12.36±5.28)月;对照组40例,男27例,女13例,平均年龄(65.42±11.53)岁,病程7个月～2年,平均病程(13.16±6.37)月。两组患者的一般资料经统计学分析,差异不具有统计学意义(P>0.05),可对两组患者进行对比。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准:(1)经影像学诊断为Ⅲb～Ⅳ期肺癌;(2)经病理学或细胞学检查诊断为非小细胞肺癌;(3)经基因检测为EGFR野生型;(4)卡氏(Karnofaky)评分≥60分;(5)无其他重要脏器的功能障碍,血常规、肝肾功能及心功能基本正常。

排除标准:(1)年龄<18岁或>78岁;(2)合并有心、脑、肝、肾和造血系统等严重疾病;(3)精神病患者。

1.3 治疗方法

对照组:化疗方案均选自一线非小细胞肺癌化疗方案:吉西他滨+顺铂或紫杉醇+顺铂或多西他赛+顺铂或长春瑞滨+顺铂。

实验组:在化疗基础上予以加味金水六君煎加减口服。金水六君煎药物组成为:熟地黄24 g、当归24 g、陈皮12 g、半夏12 g、茯苓10 g、甘草10 g,在该方基础上,如患者神疲乏力、少气懒言症状明显,可加用黄芪、党参等;如患者自汗、盗汗症状明显,可加用浮小麦、鳖甲等。所有患者均治疗4个周期,以21天为1个化疗周期。

1.4 观察指标

1.4.1 瘤体大小变化观察

对比治疗前后的胸部CT变化,参照《中国常见恶性肿瘤诊疗规范》[1]第六分册原发性支气管肺癌化疗疗效评定标准进行评定,分为完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR)、无变化(no change,N C)及进展(progressive disease,PD),缓解率(response rate,RR)=CR+PR/可评价病例数×100%,治疗4个疗程后作疗效评价。

1.4.2 生活质量评定

按WHO制定的karnofsky计分标准[2]为依据,计算治疗前后两组的卡氏评分值。

1.4.3 不良反应观察

按WHO制定的抗癌药急性和亚急性毒副反应的表现和分级标准及WHO规定的静脉反应分级标准[3],评价治疗的毒副反应。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析,瘤体大小变化及不良反应为两分类等级资料,两组间比较采用秩和检验;卡氏评分为计量资料,以均数±标准差()表示,数据符合正态性及方差齐性,两组间比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义的界限。

2 结果

2.1 瘤体大小变化观察

实验组和对照组的RR分别为37.50%和35.00%,经秩和检验,两组差异无统计学意义(z=0.398、P=0.690)。见表1。

2.2 生活质量评定

治疗前,两组患者卡式评分比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,实验组患者卡式评分有所升高,比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组治疗前后比较,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

注:与对照组比较,aP<0.05;与同组治疗前比较,bP<0.01。

2.3 不良反应观察

80例患者均可评价毒副反应。经秩和检验,两组患者在白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少、恶心呕吐、转氨酶升高方面均有统计学差异,其P值分别为0.028、0.049、0.034、0.030、0.036,均小于0.05;两组患者在脱发、周围神经毒性方面无统计学差异(P>0.05)。见表3。

3 讨论

研究表明,化疗是EGFR野生型晚期NSCLC患者一线、二线首选的治疗方式,主要是含铂类的药物联合紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、培美曲塞、长春瑞滨等。目前并没有临床研究可以回答应用哪个化疗方案更好[4]。由于培美曲塞在张家口地区属于非医保目录药物,且价格较昂贵,因此限制了其在本地区的应用,故本研究仅采用其他四种药物联合铂类作为研究对象。

近40年来,中西医结合治疗恶性肿瘤已取得较好的进展,特别是对放化疗减毒增效作用,对肿瘤预防,控制肿瘤转移和促进康复等,均取得较好的成绩,以中西医结合的综合治疗模式和方向是治疗晚期恶性肿瘤不可缺少的重要手段之一。临床研究[5,6,7,8]显示,中西医结合治疗中晚期肺癌总缓解率明显高于单纯化疗组,并能提高患者免疫系统功能、改善症状、减少毒副反应、提高造血功能、提高生活质量。因此充分发挥中医药在肺癌综合治疗中的特色和优势,积极开展中医药的临床和基础研究,应用中药配合化疗治疗中晚期肺癌,扬长避短,相互补充,既能发挥化疗对肿瘤病灶癌细胞的直接杀伤作用,又能发挥中药扶助正气、调理和提高患者的免疫功能、预防和降低化疗的毒副反应的功效,保证化疗过程顺利完成,达到祛邪而不伤正,标本兼治的目的。两者结合,相得益彰,不失为一种综合治疗晚期肺癌的较好疗法。在本研究中,用加味金水六君煎随症加减联合化疗治疗晚期EGFR野生型NSCLC,提高了患者的生活质量,减轻了化疗所致的毒副反应。单纯化疗组的骨髓抑制发生率可达70%以上,联合加味金水六君煎以后,骨髓抑制发生率不到60%,且多为轻度,患者易耐受,而患者恶心呕吐及肝功能损害等方面亦明显减少,值得临床推广应用。

金水六君煎出自明代医家张景岳的《景岳全书》,其药物组成为:陈皮、半夏、熟地黄、当归、茯苓、甘草,主要功效为养阴化痰。在金水六君煎养阴化痰的基础上加益气及温阳药物,可以对肺癌的治疗起到增效的作用。顾梦飚[9]通过分析480例原发性肺癌中医证型与国际TNM分期的关系,认为气阴两虚型是中晚期肺癌的主要证型。本研究显示,化疗联合加味金水六君煎治疗EGFR野生型晚期NSCLC可以明显提高患者的生活质量,且毒副作用及不良反应明显降低。然而,由于中药基础方面的研究不足,尤其是在抗瘤的作用机制方面研究不够深入,且本研究病例数仍较少,因此期待今后应用更大样本、前瞻性、多中心的临床研究,获得更全面的数据,以便更好地服务于临床。

摘要：目的 观察加味金水六君煎治疗晚期表皮生长因子野生型非小细胞肺癌的临床疗效。方法 将80例患者随机分为实验组和对照组各40例。实验组以加味金水六君煎加减联合化疗,对照组单纯化疗,比较两组瘤体大小变化、生活质量改善情况及不良反应。结果 实验组在肿瘤瘤体大小变化方面与对照组无显著差异,但在生活质量的改善方面优于对照组(P<0.05),治疗组的卡氏评分明显高于对照组,且不良反应较对照组明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 加味金水六君煎联合化疗治疗晚期EGFR野生型非小细胞肺癌能提高患者的生活质量,且毒副反应较低,疗效显著。

关键词：金水六君煎,表皮生长因子受体,野生型非小细胞肺癌,生活质量,临床观察

参考文献

[1]全国肿瘤防治研究办公室,中国抗癌协会.中国常见恶性肿瘤诊疗规范(第六分册原发性支气管肺癌)[M].北京:中国协和医科大学联合出版社,1990.

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[3]周彩存,王禄化,周道安.肿瘤学[M].上海:同济大学出版社,2010.

[4]郭紫薇,梁莉.表皮生长因子受体野生型晚期非小细胞肺癌化疗方案的选择[J].中国全科医学,2015,18(6):707-710.

[5]于宏杰,朱晏伟.中医学治疗中晚期非小细胞肺癌临床研究的Meta分析[J].环球中医药,2015,8(4):500-502.

[6]程星,陈萍,谢启超.联合逐瘀补肾汤加减治疗骨转移恶性肿瘤临床分析[J].环球中医药,2015,8(1):89-90.

[7]师林,柯斌,李永浩.加味龟鹿二仙胶对非小细胞肺癌化疗患者免疫功能的影响[J].新中医,2012,44(8):74-76.

[8]吴迪,李卫东,邹青峰.六君子汤预防晚期非小细胞肺癌化疗后不良反应临床观察[J].广州医学,2010,41(2):68-70.

表皮细胞生长因子受体 第3篇

表皮因子受体(EGFR)是一种跨膜受体型酪氨酸激酶,在NSCLC中存在过表达并促进肿瘤生长[1]。p53抑癌基因是一种多功能蛋白,在调节细胞周期、细胞凋亡、基因转录、应激反应和细胞DNA修复等肿瘤演变过程中发挥重要作用[2]。ERCC1基因在胞内DNA复制及损伤修复环路中起关键作用。本研探讨EGFR、ERCC1、P53在NSCLC中的相互关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

标本由河西学院附属张掖人民医院病理科提供,并经医院伦理委员会审查批准,取得患者同意,符合伦理标准,均是外科2011年6月一2014年10月间住院接受手术的60例NSCLC患者,手术切除、经病理学证实为NSCLC病例。

1.2 方法

免疫组化采用Elivision TM plus二步法,鼠抗人EGFR单克隆抗体(EGFR/113)、鼠抗人ERCC1蛋白单克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体和Elivision TM plus试剂盒。

1.3 判断标准

EGFR阳性表达为胞质和胞膜着色,ERCC1阳性表达为胞核着色,结果判断如下:按照半定量积分方法,每张切片随机观察5个高倍视野,每张切片计数不少于1000个细胞,用各视野中阳性细胞数的平均百分数进行计分:0%～24%为1分,25%～49%为2分,50%～74%为3分,≥75%为4分。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件,用χ2检验及确切概率法分析EGFR、ERCC1、p53阳性率与NSCLC患者临床生物学特征的关系,用Spearman等级相关分析分析ERCC1、EGFR、p53的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 EGFR、ERCC1及p53在NSCLC中的表达

60例非小细胞肺癌的EGFR、ERCC1及p53蛋白的阳性表达率分别为58.3%(35/60)、63.3%(38/60)和51.7%(31/60)。

2.2 EGFR、ERCC1及p53表达与NSCLC临床病理特征的关系

EGFR阳性染色定位于肿瘤细胞膜和胞浆,呈棕黄色。EGFR表达与NSCLC病理分型、患者年龄有关(P<0.05),而与肿瘤分期、细胞分化程度、淋巴结转移、肿瘤远处转移及性别均无明显相关性(P>0.05)。

P53阳性染色定位于肿瘤细胞核中,呈棕黄色。P53表达随着NSCL肿瘤分期、细胞分化程度的升高而增多(P<0.05),并且在有淋巴结转移或远处转移的病例中表达明显增多(P<0.05),而与肿瘤病理分型及患者年龄,性别无关(P>0.05)。

2.3 P53、ERCC1及EGFR在NSCLC中表达的相关性

60例NSCLC患者中,EGFR阳性表达35例,其中ERCC1阳性表达24例(68.6%),p53阳性表达21例(60%)在EGFR阴性表达25例中,其中ERCC1阳性表达14例(56%),p53阳性表达10例(40%)

3 讨论

EGFR在NSCLC中的表达为58.3%,在肺癌的各种病理类型及有或无淋巴结转移者中均有较高的表达率,提示肺癌的生长发展与EGFR的过度表达及活性增强有关,EGFR阳性的癌细胞可能具有更强的分裂增殖活性及浸润性。

p53在NSCLC中的表达为63.3%,与肿瘤分期、淋巴结转移、肿瘤远处转移及肿瘤细胞分化程度有关。

ERCC1蛋白表达阳性率51.7%,其表达阳性率与肿瘤分期、肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移、肿瘤远处转移及年龄、性别等临床特征有明显关联,而与病理类型无关。

Spearman等级相关分析分析ERCC1、EGFR、p53的相关性,发现EGFR与p53正相关(P=0.038),而与ERCC1无相关性(P>0.05)。

参考文献

[1]Yoshida T,Ishii G,Goto K,et al.Solid predominant histology predicts EGFR tyosine kinase inhibitor response in patients with EGFR mutation-positive lung adenocarcinoma[J],Cancer Res Clin()ncol 2013,139(10):1691-1700.

表皮细胞生长因子受体 第4篇

目前有研究资料表明,卵巢中EGFR通过与EGF的结合,可调节卵巢的多种功能活动,如促进卵泡发育、卵母细胞成熟、其他细胞增殖、分化和类固醇的产生等[2]。但未见关于EGFR蛋白在卵巢中各个部分的具体的定位和表达对比研究,另外,在卵母细胞发育的不同时期EGFR蛋白表达量的变化情况也未见具体报道。本研究旨在通过系统研究EGFR蛋白在卵巢中的分布情况,及其表达量与卵母细胞程度的关系来系统阐述表皮生长因子对绵羊生殖的作用,为促进绵羊繁殖育种和体细胞克隆相关研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 卵巢的收集

从屠宰场收集刚屠宰的新鲜绵羊卵巢,其年龄、遗传背景、妊娠与否不详。采集的卵巢置于20~38℃加有100 IUmL-1青霉素、100 μgmL-1链霉素的生理盐水的保温瓶中,2 h内运至实验室。随后用含青、链霉素的等温生理盐水冲洗卵巢2~3次至无血水,备用。

1.2 免疫组织化学

保持采集卵巢的正常形态,Bouin S固定液迅速固定,50%、75%、80%、95%、100%梯度酒精脱水,二甲苯透明后石蜡包埋切片,切片厚度为7 μm,备用。

切片经二甲苯和100%、95%、80%、75%、50%梯度乙醇脱蜡至水;含10%马血清封闭,37℃孵育1 h;用第一抗体(兔抗人EGFR,1∶100)4℃孵育16 h;1PBS洗3次;加入1∶200生物素标记的山羊抗兔IgG抗体,25℃孵育30 min; 1PBS洗3次;加入碱性磷酸酶标记的链亲合素三抗1∶200, 25℃孵育30 min;1PBS洗3次;用美国Vector Laboratory公司提供的Vector Red碱性磷酸酶底物试剂盒25℃显色20 min,阳性结合部位显红色;苏木精对染2 min;中性树脂封片;显微镜下观察及拍照。另外,用兔IgG代替兔抗人EGFR抗体作为阴性对照。

1.3 结果判定

根据切片中绵羊卵巢组织中免疫组化着色强弱,分为以下几级:阴性、弱阳性、中等强度、强阳性和特别强。

2 结果与分析

2.1 EGFR蛋白对卵母细胞的成熟具有重要的作用

卵母细胞在体外可自发地完成第一极体的排出,但这些体外成熟的卵子缺少使雄性染色体形成雄原核的能力[3]。EGF可以加快卵母细胞进入MII期,使卵母细胞成熟过程中蛋白质合成增加,这些说明EGF可能直接通过与EGFR结合作用于卵母细胞。

试验显示,EGFR蛋白在卵巢皮质的免疫染色集中出现在各级卵泡周围,而在其他区域如结缔组织和黄体中,未观察到阳性免疫染色位点。EGFR蛋白在成熟卵泡周围,距离卵母细胞越近的颗粒细胞中的表达量越大。实验结果间接说明了,EGF对促进绵羊卵母细胞的成熟具有重要的作用。

2.2 EGFR与其配体(EGF)结合具有促进颗粒细胞增殖与分化的功能

已有研究表明,EGFR与其配体(EGF)结合,激活ras-MAPK途径刺激细胞的增殖与分化,加速卵丘细胞之间缝隙连接的消失,并能够有效克服细胞的凋亡[4]。在本试验中,EGFR蛋白在各级卵泡周围颗粒细胞中的免疫染色强度,随卵泡发育而迅速增强。而卵泡从初级卵母细胞到成熟卵泡的发育过程中,首先伴随的是周围颗粒细胞的增殖与分化。

本试验结果表明,EGFR蛋白在各级卵泡周围颗粒细胞的免疫染色强度随卵泡的不断成熟而迅速增强,在原始卵泡周围只有很弱的阳性反应,当卵泡发育到初级卵泡后,免疫反应强度迅速增强,当达到成熟卵泡阶段后,EGFR蛋白免疫染色强度达到最大。这说明,在绵羊卵巢中各级卵泡周围,EGFR蛋白的大量出现,是与颗粒细胞的增殖、分化卵泡腔的形成相适应的,EGFR与其配体(EGF)结合具有促进颗粒细胞增殖与分化,刺激卵丘扩展,加快卵母细胞成熟过程的功能。

2.3 EGFR与其配体(EGF)结合具有促进产生雌性激素的功能

雌性动物的卵巢具有产生雌性生殖激素的功能,在生长发育的卵泡颗粒细胞和内膜细胞上,EGFR等与细胞增殖有关因子的受体,它们通过与相关配体的结合可产生芳香化酶,还可将内膜产生并弥散转运至颗粒细胞的雄激素(主要为雄烯二酮)转变为雌激素[5]。

在试验中,EGFR蛋白表达特异性位点,主要存在于次级和成熟卵泡的卵泡内膜颗粒细胞以及卵丘颗粒细胞上,卵丘颗粒细胞的EGFR的染色强度大于卵泡内膜上的颗粒细胞,而卵泡内膜的EGFR的染色强度大于卵泡外膜的染色强度。透明带无免疫染色;在各级卵母细胞的胞质中有隐约可见的染色阳性反应。卵巢髓质、卵泡膜和颗粒细胞EGFR的大量表达也说明,在成年雌性绵羊卵巢可以促进产生大量的雌性激素,对于绵羊生殖功能有重要的调节作用。

3 结论

结果表明,在绵羊卵巢中EGFR蛋白的表达具有时空特异性,它集中分布在发育各阶段的卵泡颗粒细胞中,并随卵泡的发育程度表现出表达量的差异。证明EGFR与其配体EGF结合具有刺激颗粒细胞增殖分化和促进卵母细胞成熟的功能,另外也可以促进产生大量的雌性激素调节绵羊的生殖功能。

通过对EGFR的研究将深入了解EGFR对卵泡发育的调节机理,从而可以人为调节卵泡发育,对提高卵母细胞体外成熟率,推进绵羊体外受精和克隆的研究提供理论基础。同时,对控制绵羊超数排卵,治疗卵巢疾病具有实践和应用前景。

摘要：收集成年绵羊卵巢标本,采用免疫组织化学的方法检测EGFR蛋白在绵羊卵巢组织中的表达情况。研究结果表明,在绵羊卵巢中EGFR蛋白的表达具有时空特异性,它集中分布在发育各阶段的卵泡颗粒细胞中,并随卵泡的发育程度表现出表达量的差异。本研究说明EGFR与其配体EGF结合具有刺激颗粒细胞增殖分化、促进卵丘扩展和刺激卵母细胞成熟的功能。

关键词：表皮生长因子受体,绵羊,卵母细胞,卵巢

参考文献

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[2]Chen P,Xie H,Sekar C,et al.Epidermal growth factor recep-tor-mediated cell motility:Phosphlipase C activity is requiredbut mitogenactivated protein kinase activity is not sufficient forinduced cell movement[J].J.Cell Biol.,1994,127:847-857.

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[4]Wang Y,Ge W.Cloning of epidermal growth factor(EGF)andEGF receptor from the zebrafish ovary:evidence for EGF as apotential paracrine factor from the oocyte to regulate activin/follistatin system in the follicle cells[J].Biol Reprod,2004,71(3):749-760.

表皮细胞生长因子受体 第5篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集了佳木斯大学附属第一医院普外科2011-02~2012-12期间正常健康对照组21例,结肠癌患者术前组A期15例、B期19例、C期26例、D期8例,术后组41例。患者年龄42~75岁,平均(56±8.50)岁,无统计学差异,资料齐全。所有的患者术前均未经过放疗、化疗、激素类药物治疗等。

1.2 主要试剂及仪器

酶联免疫表皮生长因子受体试剂盒,北京恒达生物科技有限公司冰箱,日本三洋公司TGW16离心机,上海手术仪器厂;Aliei全自动酶免疫分析仪,奥林巴斯BX51日本;超速低温离心机,美国Beekman公司;全自动酶标仪,美国Thermo Scientific Revco公司;Wellwash 4 MK2洗板机,美国Beekman公司。

1.3 试验方法

采集正常健康对照组21例,结肠癌患者术前组A期15例、B期19例、C期26例、D期8例,术后组41例血清标本样本。入院后术前各组在未经任何治疗下,清晨空腹采集外周静脉血5m L,术后组在术后第3日采集外周静脉血5m L,离心机以2000r/min离心20min,后取上清分别装于无菌干燥的试管,置于-20℃储存备用。

1.4 统计学分析

应用SPSS13.0汉化版统计软件,数据用均数±标准差(±s)表示。各组间比较选用随机区组方差分析;t检验;相关分析采用了Pearson直线相关析。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

结肠癌患者术前组、术后组及正常健康对照组血清中表皮生长因子受体表达水平,见表1。

注:1术前与正常差异有统计学意义(t=3.153,P<0.05)。2术后与术前差异有统计学意义(t=7.271,P<0.05)。三组间差异有统计学意义(F=4431.23,P<0.05)。

结肠癌术前各组间血清中表皮生长因子受体表达水平,见表2。

注:1B期与A期差异有统计学意义(t=6.31,P<0.05)。2C期与B期差异有统计学意义(t=7.41,P<0.05)。3D期与C期差异有统计学意义(t=7.91,P<0.05)。各组间差异有统计学意义(F=4464.15,P<0.05)。

3 讨论

结肠癌为胃肠道常见的恶性肿瘤之一,近年来在我国的发病率有明显的增高趋势,其好发年龄在40~50岁。结肠癌早期不容易被发现,其病情发展也较缓慢,大多数结肠癌患者发现时成为中晚期[4]。目前认为发病原因与遗传因素、慢性炎症性病变、自身免疫系统、结肠腺瘤、息肉病、精神因素、环境因素(化学、物理、生物等各种致癌物)、少纤维、高脂肪饮食和不良生活习惯等因素有一定的关系,严重危害人们的健康及生命[5]。现多个研究小组报道中表明,肿瘤的发生、发展和转移是一个较复杂的过程,许多细胞间信息传递分子参与了该过程[6]。肿瘤的转移与扩散是恶性肿瘤重要的生物学的特点,也是其死亡的重要的原因。

表皮生长因子受体为表皮生长因子家族的成员之一,其在很多的上皮性肿瘤中可以被异常的活化,在人类的很多肿瘤中呈高表达[7]。表皮生长因子受体具有氨酸激酶活性,当其与配体结合时,可以通过激活酪氨酸蛋白激酶途径,参与了激活一系列的复杂的细胞信号传导。在正常的组织中调控细胞的生长、分化、分裂等重要的生理过程。在发生异常时可引起癌变,其在肿瘤的发生、发展和转移中发挥了极其重要的作用。现在各种的研究中表明表皮生长因子受体在卵巢癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌、大细胞肺癌、胃癌及脑恶性胶质瘤等中呈高表达与本实验研究相一致(P<0.05)[8,9]。各研究中表明表皮生长因子受体与卵巢癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌、大细胞肺癌、胃癌及脑恶性胶质瘤等多种的肿瘤的分期、转移、术后复发及预后的情况是密切相关的。近几年来初步的研究也已经证实适当的应用拮抗表皮生长因子受体可阻断了其自泌环,抑制了生长因子及其受体的分泌和阻断生长因子和受体的结合,可以有效地抑制瘤细胞的生长。近期研究中显示表皮生长因子受体在结肠癌组织中的发生和发展过程中有过表达,其可能有助于预测结肠癌的发生、发展、治疗及预后判断情况,可成为有效的生物学指标[10]。在本实验研究中结肠癌术前各组患者的血清中的表皮生长因子受体均有明显上升,且恶性程度越高,其表达水平越高,与本研究相一致。现国内外对结肠癌组织中表皮生长因子受体的表达水平的研究还很少,而且对于结肠癌患者血清中的表皮生长因子受体的检测尚未见报道。

本实验研究中发现,表皮生长因子受体在结肠癌患者血清中呈高表达,可认为表皮生长因子受体在结肠癌肿瘤的发生发展中起到十分重要的作用。因此研究表皮生长因子受体在结肠癌血清中的表达,可以为结肠癌的发病机制、诊断、治疗及其预后等提供了一定的实验依据。

摘要：目的:本实验的目的是研究表皮生长因子受体在结肠癌患者血清中和正常健康对照组血清中的表达水平及临床意义。对结肠癌患者的发病机制、诊断、监测、治疗、预后等提供一定的良好的依据。方法:收集了佳木斯大学附属第一医院普外科2011-02～2012-12期间正常对照组21例,结肠癌患者术前组A期15例、B期19例、C期26例、D期8例,术后组41例。患者年龄无统计学差异,资料齐全。应用酶联免疫的方法检测样本血清中表皮生长因子受体的表达水平。结果:表皮生长因子受体在正常健康对照组、术前组、术后组均有表达。术前组、术后组的表达水平明显高于正常健康对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:通过检测结肠癌患者血清中的表皮生长因子受体表达水平,可作为临床上判断结肠癌良恶性程度高低的有效指标。对其诊断、监测、治疗及预后的情况等提供了一定的实验依据。

关键词：结肠癌,表皮生长因子受体,酶联免疫

参考文献

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表皮细胞生长因子受体 第6篇

1 材料与方法

1.1 材料

pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR质粒载体、阴性对照pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRNC(Invitrogen);pLenti6.3-MCS/V5 DEST慢病毒表达载体(Invitrogen);大肠杆菌DH5α、293细胞株(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库);LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT(Invitrogen);AXYGEN胶回收试剂盒;AXYGEN质粒抽提试剂盒;基因测序由上海Invitrogen公司完成。慢病毒包装质粒Packaging Mix、POLOdelivererTM 3000 Transfection Reagent(Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 miRNA干扰表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-EGFR的构建

根据GenBank人EGFR基因序列(基因编号:NM_201283.1),通过Invitrogen公司的在线设计软件BLOCK-iTTMRNAi Designer设计并合成4对miRNA oligo序列(见表1),每对退火后与线性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,转化后接种于壮观霉素(Spe+)的LB培养基中,37℃摇菌过夜。次日用AXYGEN质粒抽提试剂盒提取纯化质粒,送测序。

1.2.2 EGFR基因4个干扰片段在293细胞中的干扰评价

根据目的基因EGFR序列信息设计并合成PCR引物(见表2)。质粒转染操作按LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT转染操作说明进行。转染48h后抽提RNA,反转录获得cDNA模板,用上述引物在Eppendorf Realplex4上进行SYBR Green法荧光定量PCR以分析各基因的表达。数据分析用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。

1.2.3 慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFR-miRNA的构建

设计引物(见表3),在目的片段上下游分别添加酶切位点Asc1和Pme1,以干扰效应显著的EGFR片段的干扰载体pcDNA6.2-EGFR-2为模板,PCR扩增。用Asc1和Pme1双酶切PCR扩增产物及载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST。回收酶切后的载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST及目的基因片段,用T4连接酶将目的片段与pLenti6.3-MCS/V5 DEST酶切产物连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,将转化菌液涂布于含Amp(氨苄西林)抗性的LB培养基,挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。将鉴定阳性的克隆在含Amp抗性的LB培养基中培养,提取质粒进行酶切鉴定。最终将菌落PCR和酶切鉴定均呈阳性的克隆送测序,并进行序列比对,保留测序验证正确的质粒。

1.2.4 EGFR基因干扰慢病毒包装

用AXYGEN质粒抽提试剂盒进行质粒抽提,将质粒DNA、慢病毒表达质粒、包装质粒Packaging Mix、POLOdelivererTM 3000 Transfection Reagent混合后按照说明书共转染293T细胞。培养72h收集病毒上清液,用荧光显微镜观察法测定慢病毒滴度。

2 结果

2.1 miRNA干扰表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-EGFR测序结果(见图1),干扰表达载体构建成功。

2.2 4个干扰片段干扰结果见图2。目的基因EGFR的干扰效应评价见图3,干扰效应最显著地干扰载体是pcDNA6.2-EGFR-2。

注:A EGFR干扰片段-1,B EGFR干扰片段-2,C EGFR干扰片段-3,D EGFR干扰片段-4,E EGFR干扰评价阴性对照

2.3 慢病毒表达载体构建结果 pLenti6.3-EGFR-miR重组载体菌落PCR鉴定见图4,pLenti6.3-EGFR-miR重组载体酶切鉴定见图5。

2.4 共转染结果 慢病毒滴度计算结果:ifu/ml=1.8×106。

图4注:泳道1:Marker DL2000(条带大小:2000、1000、750、500、250、100bp);泳道2:阴性对照(水);泳道3～5:EGFR全长引物对重组子PCR扩增

图5注:泳道1:Asc I和Pme I酶对重组质粒进行双酶切(目的条带:911bp+7.7kb);泳道2:p Lenti6.3-EGFR-mi R重组质粒;泳道3:Marker 15000(条带大小:15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)

3 讨论

恶性胶质瘤是最常见的一种成人颅内原发肿瘤。其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤患者,即使经过积极的治疗(如手术、放疗、化疗),5年生存率仍低于5%,中位生存期只有12～15个月[1]。其中EGFR扩增是最常见的基因变异,约50%的恶性胶质瘤存在EGFR异常, EGFR是最早被发现的具有络氨酸激酶活性的受体[2]。在许多的上皮肿瘤中EGFR往往有过表达[3]。过度激活的EGFR可以通过Ras-MAP激酶途径、PI3/Akt途径及STAT-3等信号传导途径把细胞外信号传到细胞内,并激活多种基因异常表达而导致细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进细胞迁移侵袭和促进管生成等改变。EGFR变异的肺癌患者应用抗EGFR治疗已被证实有效[4,5,6,7]。 EGFR特异性抑制剂也已被批准应用于治疗非小细胞肺癌。虽然EGFR抑制剂也进入胶质母细胞瘤治疗的临床试验[8,9,10],但是很多胶质母细胞瘤患者对EGFR抑制剂治疗效果不佳[3]。

microRNA(miRNA)是近几年发现和发展起来的新兴基因阻断技术,是继siRNA(small interfering RNA)之后发现的又一调节mRNA稳定和翻译的一类非编码RNA,可与互补mRNA全配对,降解靶mRNA或抑制其转录后翻译,从而达到沉默该基因的表达。本实验采用真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR,具有以下特点:方便表达追踪;可同时表达多个miRNAs;组织特异性表达广泛;可转入包括慢病毒在内的各种目标载体,且在任何细胞中稳定干扰。

基因治疗需要优化载体系统、提高转染效率。以质粒为载体介导干扰的转染率低,靶基因抑制作用弱,维持时间短,只是瞬时地表达干扰RNA不容易得到稳定的转染,不适合体内实验。慢病毒载体是一种复制缺陷型反转录病毒载体,是在HIV-I病毒基础上改造成的病毒载体系统,具有可感染分裂期与非分裂期细胞、转移基因片段较大、表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点。与其他病毒载体,如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统反转录病毒载体相比,慢病毒可将目的基因整合至靶细胞基因组长期表达,同时扩大了载体感染细胞的范围,适于体内基因治疗。因此成为转染的理想工具[11,12]。尤其在神经细胞这种长期处于非分裂期的细胞中具有优势,实现稳定的RNAI。本实验慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST便具有高效、稳定、特异性强的特点。

在本研究中,我们成功构建了EGFR基因RNAi慢病毒载体,并包装成为慢病毒颗粒,可以很有效地感染胶质瘤细胞系。这为更深入地研究EGFR沉默后对其在胶质瘤相关信号通路中的作用奠定了基础,同时也为寻找胶质瘤基因治疗方法提供技术支持。

摘要：目的 构建表皮生长因子受体(EGFR)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法 合成EGFR基因的miRNA干扰序列,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-EGFR质粒,测序验证插入序列正确,连接到慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST中,获得pLenti6.3-EGFR-miRNA质粒,与慢病毒包装质粒Packaging MIX、POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent共转染293T细胞株,细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果 PCR和测序结果证实,EGFR miRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液滴度为1.8×106ifu/ml。结论 成功构建EGFR基因RNAi慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定基础。

表皮细胞生长因子受体 第7篇

1 EGFR TKI

小分子蛋白TKI以EGFR为靶点, 主要通过阻断细胞信号传导, 关闭位于下游的Ras系统等功能, 起到抑制细胞生长的作用;同时促使肿瘤细胞中p27的表达增高, 阻断细胞周期。由于EGFR家族RTKs在肺癌组织中过度表达或异常激活, 但是正常细胞中很少表达RTKs。所以阻断RTKs的信号传导可抑制肿瘤细胞持续生长, 同时对正常细胞造成很小的损伤。

2 目前停药标准的由来

目前是以肿瘤大小来决定TKI的使用, 这么决定的原因如下:TKI治疗与传统化疗有着很大不同, 但是在设计靶向治疗的临床试验时, 由于化疗药物临床试验设计的影响, 而忽视了靶向治疗的根本性的不同。在进行TKI治疗时, 基因表达变化对其疗效随时可能带来无法确定的影响。因此, 以肿瘤大小变化来确定EGFR抑制剂的适用与否就可以理解了。

3 选择新的停药时间段

如何选择合适的时间停药, 其实就是选择TKI治疗能获得最大疗效而不良反应又即将大于治疗效果的时间。

3.1 选择肿瘤进展前停药

选择肿瘤进展前停药其实就是选择TKI治疗刚好获得或者即将获得耐药性的时间。相关研究表明, 引起肿瘤细胞TKI耐药的因素主要有如下方面:受体突变和扩增, 配体的自分泌与旁分泌, EGFR下游通路和旁路激活。应用TKI治疗肺癌后, MET扩增较未使用该治疗方法的患者常见。同时在MET扩增的肿瘤细胞, 往往也伴随T790M突变, 这说明长期应用TKI可引起受体因子的扩增或突变而出现TKI耐药。当EGFR的配体高表达时, EFGR通路活性提高, 从而提高TKI的敏感性;同时TKI影响配体的表达, 使其表达下降, 造成TKI耐药。

3.2 肺癌进展后继续用药至死亡

TKI停药后3周左右, 患者出现症状加重和影像学变化。而3周时间约等于TKI药物的5个半衰期, 在这段时间里, 体内的剩余药物基本代谢干净。此时选择继续用药, 体内药物将重新达到一个新的平衡浓度, 可能会使药物更易于吸收转化从而更好的发挥疗效。更重要的是, 肿瘤细胞基因表达发生新的变化。以EGFRⅢ型变异体 (EGFRvⅢ) 为例, 使用TKI治疗的肺癌患者于12~13个月时, 检测出约有超过一半患者发生EGFRvⅢ耐药性突变, 而且离体细胞实验也直接证明EGFRvⅢ突变可以引起TKI耐药。但是, EGFRvⅢ突变的细胞在出现突变的肺癌患者体内, 可能仅仅只存在一小部分, 也就是说其他绝大部分的肿瘤细胞对TKI治疗仍然保持高的敏感性, 所以继续应用TKI仍然可以获得比较满意的疗效。同样的机制也可能发生于其他相关因子。所以肿瘤进展后继续应用TKI至死亡值得做进一步研究。

3.3 TKI停药标准研究必须建立EGFR相关通路的研究取得更大进展为前提和基础

首先完整把握EGFR通路网络及相关因子, 从而发现更多与产生TKI耐药相关的基因, 对其耐药性采取合理有效的干预。其次是准确地把握EGFR相关因子功能, 准确的筛选出相关耐药因子, 更高效的进行治疗。

4 结语

正如Eschenbach所提出的观点:肿瘤治疗手段在外科手术创立之时是“寻找和破坏”, 而在生物分子技术不断进步的将来是“靶向和控制”[3]。TKI治疗作为肺癌治疗的新兴疗法, 在临床治疗中, 已经取得了令人满意的疗效, 但是, 有关停药标准的研究还缺乏一个准确的定论。TKI停药标准需要改变并且在将来也一定会改变, 这个过程需要大量的深入的实验室研究和真实可靠的临床疗效对比观察来完善。

关键词：肺癌,表皮生长因子受体,酪氨酸激酶抑制剂,停药标准

参考文献

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