病毒侵袭范文

病毒侵袭范文（精选3篇）

病毒侵袭 第1篇

1 材料和方法

1.1 材料

人胰腺癌细胞株Capan-2、293T细胞购自American Tissue Culture Collection(ATCC);TRIM28 c DNA购自美国thermo公司(MHS1011-60213 2906325);慢病毒质粒pGC-LV、包装质粒pHelper 1.0和pHelper 2.0购自上海吉凯基因化学技术有限公司;限制性内切酶Age I和Bam I、T4连接酶购自美国NEB公司;质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒均购自美国Promega公司;总RNA提取试剂盒购自Qiagen公司;Fugene HD转染试剂购自瑞士Roche公司;KAP-1定量PCR引物及qRT-PCR检测试剂盒购自美国GeneCopoeia公司;兔抗人TIF1β单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.2 Lv-eGFP-KAP-1的构建与鉴定

从购买的c DNA文库中,利用PCR方法钓取目的基因。将目的基因与线性化的慢病毒载体质粒pGC-FU-3FLAG-IRES-Puromycin连接。将连接产物转化感受态细胞DH5α,进行菌落PCR鉴定,阳性克隆鉴定,大量提取慢病毒载体质粒pGC-LV-KAP-1。以293T细胞为工具细胞进行目的基因KAP-1过表达转染;转染后36～48 h收集细胞,提取总蛋白行Western blot检测KAP-1(抗体工作浓度1∶200);次日在LB平板上各挑取3个单克隆菌落接种至5 m L含Ampicillin(终浓度50 mg/L)抗性的LB液体培养基中,置37℃摇床(200 r/min)培养16h。取鉴定正确的菌液,培养过夜后大量抽提慢病毒载体质粒。将抽提获得的慢病毒表达载体质粒、pHelper 2.0辅助质粒、pHelper 1.0包装质粒(VSVg,外壳蛋白)混合共转染HEK 293FT细胞48h后,收集上清液提纯病毒,按照说明书提供的梯度稀释法测定病毒滴度。将Capan-2细胞常规培养,感染复数(MOI)为5∶1,48 h后提取总m RNA和总蛋白,RT-qPCR和Western Blot法检测KAP-1的表达。RT-qPCR反应体系为20μL,其中SYBR Green/ROX qPCR Master Mix为10μL,2.5μmol/L的上下游引物各0.5μL,c DNA为1μL,ddH2O为8μL。反应程序为:预变性95℃,15 s;之后每一步变性95℃,5 s;退火延伸60℃,30 s;共进行45个循环,实验重复3次,由随机附带软件LCS480 1.5.039计算ct值和拷贝数,2-△△Ct分析法进行数值分析(GAPDH为内参)。KAP-1引物:上游5'-AAGTCTC GGGATGGTGAACG-3',下游:5'-CAGACACCTGGC GGATTGA-3',长度262 bp;GAPDH引物:上游:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3',下游:5'-CAC CCTGTTGCTGTAGCCAAA-3',长度121 bp(引物序列由软件Beacon designer 7设计,上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。Western Blot法参照文献[8],兔抗人TIF1β单克隆抗体工作浓度为1∶600,实验重复3次,条带密度采用QuantityOne Program(Bio-Rad)软件进行分析,目的蛋白的相对表达水平=目的蛋白的灰度值/β-actin蛋白的灰度值,取3次平均值,采用GAPDH为参照。

1.3 Transwell小室侵袭实验

生长状态良好的Capan-2细胞,Lv-eGFP-KAP-1感染48 h后GFP表达绿色荧光呈高峰。按说明书要求,从-20℃取出有基质胶的transwell小室(购自德国BD Biosciences公司)恢复至室温,将小室放入24孔培养板中,在上下室各加入500μL 37℃预温的无血清培养基,37℃5%二氧化碳培养箱放置2 h,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。上室种入500μL(细胞数2.5104个),下室加入750μL含20%FBS的DMEM培养液500μL,置于细胞培养箱中培养,48 h后取出小室,位于膜上层的非浸润细胞用棉签轻轻擦去,然后将膜经过甲醇溶液固定30min,结晶紫染液染色5 min,置于显微镜下观察,分别取5个视野计数。

1.4 统计分析

统计学方法:数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 17.0对数据进行统计,计数资料采用两个或多个样本的t检验,P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 Lv-eGFP-KAP-1的构建与鉴定

构建的慢病毒载体质粒pGC-LV-KAP-1阳性克隆测序结果显示重组质粒中插入的KAP-1与基因数据库提供的人TRIM28基因(Genbank NM_005762.2)mRNA全长序列一致,没有碱基缺失或替换等,部分测序结果见(图1),转染293T细胞显示融合绿色荧光蛋白的表达(图2),重组慢病毒载体质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒。根据公式计算慢病毒滴度为2108TU/mL。成功包装的慢病毒命名为Lv-e GFP-KAP-1,感染Capan-2细胞,RT-qPCR和Western Blot检测结果显示KAP-1表达明显升高(图3、4),表明Lv-siRNA-KAP-1构建成功。

2.2 Transwell小室侵袭实验

Transwell小室侵袭实验检测Lv-eGFP-KAP-1对Capan-2细胞侵袭能力的影响,结果显示:实验组侵袭细胞数目为(128.3±4.6)个,阴性对照组为(36.2±3.4)个,空白对照组为(45.3±2.6)个,表明过表达KAP-1能增强Capan-2细胞的侵袭能力(P<0.05),见图5。

3 讨论

KAP-1(又称TIF1β或TRIM28等)是一个97kD的核磷蛋白。人KAP-1基因位于19号染色体,位置是19q13.4,共16个外显子;小鼠KAP-1基因位于7号染色体,位置是7 A2,共17个外显子。KAP-1具有TIF1家族中常见的保守结构域:N端的RBCC(RING-B box-coiled-coil)结构域、C端保守的PHD型锌指和紧随其后的Bromodomain(BrD)结构域,中部是该家族内保守度最低的区域,一般情况下富含脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸[9]。KAP-1是一种转录中介因子,在诸多转录调控复合体中起桥梁作用[9]。它通过其N端RBCC结构域与含KRAB结构域的锌指蛋白、MDM2、MM1和C/EBPβ等相互作用;通过C端的PHD及BrD结构域与SETDB1和Mi-2α等分子相互作用,参与形成具有组蛋白甲基化酶或组蛋白去乙酰化酶活性的复合体;通过中间的HP1BD区域与HP1蛋白相互作用,进而与组蛋白相结合。

许多研究表明,KAP-1在肿瘤细胞中高表达且与肿瘤的侵袭转移相关。HO等[10]采用蛋白质组学技术筛选KAP-1在乳腺癌中高表达,且与乳腺癌侵袭转移相关。TAKESHI等[11]证实KAP-1在胃癌中高表达,且和胃癌的腹腔播散及不良预后相关。此外,KAP-1参与EMT发生,与肿瘤的侵袭转移相关。VENKOV等[12]以SJL/J小鼠肾近端小管上皮细胞株MCT(mIMCD)为研究对象,采用凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)和DNA亲和层析法,及后续的质谱分析,在纤维母细胞特异性蛋白1(FSP1)的近端顺式作用子元件(FTS-1)域绑定的蛋白复合物中鉴定出两个蛋白质,分别为CBF-A和KAP-1。FSP1在人肿瘤细胞中称为S100A4,在EMT发挥重要作用;S100A4能增加肿瘤细胞的运动和侵袭能力,导致转移瘤的发生。最近有研究表明[13]:在人畸胎瘤细胞系NTera2D1中,KAP-1能在m RNA水平上激活许多EMT相关基因,如:ACTA2、S100A4、SNAI2、TJP1、TJP2、TWIST1和VIM等。上述这些研究充分表明KAP-1不仅在肿瘤的发生发展中发挥重要作用,而且与肿瘤的侵袭转移能力密切相关。本实验结果显示慢病毒介导KAP-1转染Capan-2细胞能增强其侵袭能力。

病毒侵袭 第2篇

进程是当前运行的执行程序。可执行病毒同样以“进程”形式出现在系统内部，我们可以通过打开系统进程列表来查看哪些进程正在运行，通过进程名及路径判断是否有病毒，如果有则记下它的进程名，结束该进程，然后删除病毒程序即可。

一、查看进程列表的方法

在WIN98/ME中查看进程列表的操作:依次单击“开始”->“程序”->“附件”->“系统工具”->“系统信息”->“软件环境”->“正在运行的任务”，打开的进程列表。

在WIN2000/XP中除了用以上方法查看之外还可以按“ALT+CTRL+DEL”组合键打开“任务管理器”，在“进程”页查看。

二、判断那些是正常进程

系统进程名表，系统进程一般包括:基本系统进程和附加进程。基本系统进程是系统运行的必备条件，而附加进程则是可以按需运行或结束。

1、基本系统进程:

Csrss.exe:这是子系统进程，负责控制Windows创建或删除线程以及16位的虚拟DOS环境。

Lsass.exe:管理 IP 安全策略以及启动 ISAKMP/Oakley (IKE) 和 IP 安全驱动程序。。

Explorer.exe:资源管理器。

Smss.exe:这是一个会话管理子系统，负责启动用户会话。

Servi.exe:系统服务的管理工具，包含很多系统服务，

system: Windows系统进程

System Idle Process:这个进程是作为单线程运行在每个上，并在系统不处理其它线程的时候分派处理器的时间。

Spoolsv.exe:管理缓冲区中的打印和传真作业。

Svchost.exe:系统启动的时候，Svchost.exe将检查中的位置来创建需要加载的服务列表，如果多个Svchost.exe同时运行，则表明当前有多组服务处于活动状态;多个DLL文件正在调用它。

winlogon.exe: 管理用户登录

以上这些进程都是对运行起至关重要的，千万不要随意“杀掉”，否则可能直接影响系统的正常运行。

2、附加进程

除了基本系统进程，其它就是附加进程了， 例如wuauclt.exe(自动更新程序)、 systray.exe(显示系统托盘小喇叭图标)、ctfmon.exe(微软输入法)、mstask.exe(计划任务)、winampa.exe等等，附加进程可以按需取舍，不会影响到系统核心的正常运行。

3、应用程序的进程

当前运行的应用程序也会显示在进程列表中，当要查毒时最好将已运行的程序全部按正常方式关闭，病毒一般不随应用程序关闭而结束的。

当我们发现“不明的进程名”不在的系统进程名表中，就应当列为可疑进程。

三、处理

1、试验法:将可疑进程结束后，通过“开始文件或文件夹用可疑进程名作为关键字对整个搜索”，找到对应的程序后，记下它的路径，将它移到软盘或U盘上，然后对电脑上的软件都运行一遍，如果都能正常运行，说明这个进程是多余的或者是病毒，就算不是病毒把它删了也可给系统减肥。如果有软件不能正常运行则要将它还原。

2、请教法

病毒侵袭 第3篇

据台湾联合新闻网4月9日报道, 由于一种前所未见的病毒来袭, 专家目前还不知道这种病毒如何传染、如何抑制。美国猪肉生产面临威胁, 价格已上涨10%以上。有经济学家估计, 全美27个州的600多万头小猪已因这种病毒而死亡。

据美国《华尔街日报》网站报道, 中国已要求美国农业部进行相关检测, 并提供相应认证, 显示进口至中国的生猪来自没有发生猪流行性腹泻的猪群。报道说, 一些美国畜产品出口商4日表示, 中国此前已停止对进口自美国的生猪发放许可证, 直至美国农业部落实上述检测和认证手续。