胶原Ⅲ型范文

胶原Ⅲ型范文（精选7篇）

胶原Ⅲ型 第1篇

讨论

Ⅲ型胶原肾小球病(collagen typeⅢglomerulonephropathy),又名胶原纤维性肾小球病(collagenofibrotic glomerulopathy),临床罕见,由日本学者Arakawa1979年首先报告[1]。其病理特点为肾小球内有大量Ⅲ型胶原沉积。临床表现为大量蛋白尿或高血压、进行性肾功能衰竭。迄今国内外包括日本、法国、意大利、加拿大、美国、中国等累计报道30余例[2]。至今对本病尚无有效的治疗方法。顾菲菲等[3]报道,对于治疗Ⅲ型胶原肾小球病,药物吗替麦考酚酯能够抑制免疫反应,且不良反应小,许多皮质醇激素难以控制的肾炎吗替麦考酚酯有确切的疗效,可以试用于临床。为提高对本病的认识,寻求治疗该病的有效方法,根据中医“外治之理即内治之理”和内病外治的理论,药物可经皮肤吸收的机制,将药物施于局部,通过皮肤经穴的透入吸收,进入血络经脉,输布全身或局部靶器官,发挥药效作用。中药通过肾区血管进入全身,扩张全身的周围血管,改善全身微循环,促进全身血液循环畅通,改善全身因肾疾病导致的不良状态,减轻中毒症状[4]。用现代医学药物导入仪的低频及红外线能加速药液的渗透和利用[5],皮肤吸收药物直接进入血液及肾脏周围,减轻对消化道的不良刺激,减轻在消化过程中药性的减弱和改变,充分利用药效,可以提高疗效。中药活性物质进入体内,合成扩血管作用的NO,合成后的NO弥散到血管平滑肌细胞内,使血管平滑肌舒张[6],解决毛细血管狭窄的问题,即增加受损肾小球的有效灌注量,改善局部微循环障碍,缓解缺血缺氧,延缓肾脏纤维化的进展,为修复肾小球提供有氧环境;中药外敷治疗肾病通过活血通络、祛瘀清毒作用,降解细胞外基质,尤其是对胶原性物质(其中包括Ⅲ型胶原纤维)的降解,极大地改善了肾脏内环境,有利于对肾小球基底膜免疫复合物的排除及损伤的修复。本病例提示在治疗Ⅲ型胶原肾小球病时,除常规激素和免疫抑制剂等药物治疗外,可考虑运用中药肾区渗透疗法,以达到治疗疾病的最佳效果。

参考文献

[1] Arakawa M,Fueki H,Hirano H,et al.Idiopathic mesangiodegenerative glomerulopathy;a proposal of new disease entity[J].Nichi Jin Shi(Japanese),1979,121:914-915.

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[3] 顾菲菲,商惠萍.胶原Ⅲ肾小球病1例[J].辽宁医学杂志,2007,21(1):45-46.

[4] 孙春华,王有,吴凡,等.中药肾区渗透并常规治疗复发性IgA肾病61 例疗效观察[J].中国现代医药杂志,2008,10(6):116-117.

[5] 南登崑.康复医学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2006:136-139.

胶原Ⅲ型 第2篇

单位

职务

姓名

一、填空题（共20分，每空1分）1．

CRTSⅢ型板式无砟轨道由钢轨、弹性扣件、轨道板、（自密实混凝土层）、（隔离层）、以及具有限位结构的钢筋混凝土底座等部分组成。

2．路基地段轨道结构高度为（842mm），桥梁地段、隧道地段轨道结构高度为（742mm）。3．自密实混凝土主要原材料主要包括：水泥、粉煤灰、磨细矿渣粉、细骨料、粗骨料、（减水剂）、引气剂、膨胀剂、（粘度改性材料）、拌合水。

4．路基地段底座板宽度为（2900mm），厚度为（284mm），曲线地段根据具体超高确定。5．隧道变形缝处底座配筋应加强，同时底座板下设置（PE滑动膜），纵向长（1m）与底座板同宽的。

6．轨道板铺设中线、高程位置允许偏差（2mm），相邻承轨面平面、高程允许偏差（1mm）。7．路基线间排水通道处，底座板下搭板沿线路纵向长（2m），横向与底座板同宽，表面设置（2%）的横向排水坡。

8．每罐自密实混凝土灌注前，应检测混凝土拌和物的温度、（坍落扩展度）、（含气量）和泌水情况等，只有拌合物性能符合要求时方可灌注。

9．轨道板采用专用设备，根据（设计给定）的位置依次铺设。铺设前核对轨道板编号与底座标示号是否一致，应注意特殊轨道板位置的安放，轨道板接地端子应位于（线路外侧）。10．自密实混凝土灌注前应采用压紧锁定装置固定轨道板，曲线超高段还应设置防侧移固定装置，以确保轨道板上浮或偏移满足设计要求。一般情况下，直线区段轨道板沿纵向压紧装置不少于（5）道，防侧移固定装置不少于（3）道。

二、选择题（共20分，每题2分）1．无砟轨道结构设计动轮载为（C、）。

A、250kN

B、300 kN

C、350 kN 2．路基的工后沉降不得大于（B、）mm，不均匀沉降不得大于20mm/20m.A、B、C、3．

CPⅢ控制点高程测量工作应在CPⅢ平面测量完成后进行，并起闭于（B、）。

A、一等水准点

B、二等水准点

C、三等水准点

4．底座施工中应重点控制底座横向排水坡，排水坡坡度为(C、)，曲线地段底座横向排水坡应加强控制，防止坡度不足。

A、3%

B、5%

C、7%

5．底座伸缩缝所使用的材料为；（D）.A、普通泡沫板

B、柏木板

C、聚乙烯泡沫塑料板 6．底座伸缩缝宽度为（B、）mm。

A、B、C、25

7．混凝土底座上、下两层钢筋净保护层厚度分别为（B、）

A、30mm 40mm

B、40mm 30mm

C、20mm 30mm

8．CPⅢ是沿线路布设的三维控制网，起闭于基础CP1或CⅡ，一般在线下工程施工完成后施测，为无砟轨道铺设和运营维护的基准，即（C）控制网。A、基础平面

B、线路

C、轨道

9．自密实混凝土灌注厚度允许偏差为（A、）A、±10mm

B、±15mm

C、±8mm

10．根据《

C、RTSⅢ型板式无砟轨道工程施工质量验收指导意见》混凝土底座外形尺寸允许偏差为(A、)

A、顶面高程±5mm，宽度为±10mm，中线位置3mm，底座排水坡1%

B、顶面高程±10mm，宽度为±5mm，中线位置5mm，底座排水坡2%

C、顶面高程±3mm，宽度为±10mm，中线位置5mm，底座排水坡1%

三、判断题

（共20分，每题2分）

1.底座钢筋焊网安装前，应清除梁体、隧道底板或仰拱填充层预埋套筒浮渣，浮浆，套筒内拧入连接钢筋，连接钢筋拧入预埋套筒23mm,外露螺纹不应超过2P, 拧紧力矩不小于100N•m。（√）

2.自密实混凝土配合比选定后，应开展现场灌揭板试验，并根据揭板试验结果调整并最终选定施工配合比。（√）

3.隔离层用土工布宽度2900mm，允许偏差-0.5%。（×）

4.混凝土强度达到5MPA、以上时，方可拆模，拆模的具体时间以拆模时不损伤混凝土表面和棱角为准。在混凝土未达到设计强度的75%之前，严禁各种车辆在底座上通行。（√）5.自密实混凝土应检查拌合物性能，出机扩展度700mm-750mm为宜、含气量3%-6%为宜，并检验离析和泌水情况，符合要求方可装车（×）

6.当自密实混凝土运输至现场，发现坍落扩展度小于施工要求时，往自密实混凝土内加水稀释。（×）

7．对伸缩缝内进行基面清理并安装聚乙烯泡沫塑料板后，直接灌注密封胶。（×）8.轨道板临时平放时，轨道板层数不超过4层，临时存放时间不超过7天（√）9.轨道板精调合格后应立即压紧锁定，压紧锁定装置应有足够的强度、刚度和稳定性，确保自密实混凝土灌注时轨道板横向移位及上浮不超限。（√）10.沈丹客运专线

C、RTSⅢ型轨道板配套使用的钢轨扣件为WJ-8型。（×）

四、简答题（共40分，每题10分）

1．无砟轨道精确调整的分类？

答：⑴ 静态调整：在无缝线路铺设完成，长钢轨应力放散、锁定后，通过精调小车对钢轨进行静态数据的采集，通过精调处理软件对采集数据进行分析，并由模拟适算表，确定调整位置和调整量，对钢轨进行调整。

⑵ 动态调整：通过轨道检测车对钢轨动态检测报告和波形图的分析，找出影响行车安全和旅客舒适度的区段，通过用精调小车，塞尺，弦线动轨道进行测量评价，确定调整位置和调整量，对钢轨进行调整。

2．在无砟轨道路基沉降评估工作施工单位的主要职责是什么？

答：（1）负责线下工程变形的观测；（2）参与制订变形观测和评估工作实施细则；（3）变形监测网的建立；（4）根据建设、勘察设计等单位和评估技术指南提出的相关要求，设置变形观测点，进行观测，并及时提交观测数据；（5）负责观测设施的保护，确保施工过程中不受扰动或破坏。

3．简述自密实混凝土灌注时排气孔及防溢管安装要求

答：模板安装时，应在轨道板四角和（或）中部设置排气孔，设置排气孔的位置及其数量等应通过工艺性试验确定。轨道板的灌注孔处应设置灌注自密实混凝土用硬质下料管，观察孔处应设置防止自密实混凝土溢出的硬质防溢管。直线段轨道板上设置的下料管露出轨道板上表面的高度不宜小于70 C、m，防溢管露出轨道板上表面的高度不宜小于30 C、m；曲线段轨道板上设置的下料管露出轨道板上表面的高度不宜小于100 C、m，防溢管露出轨道板上表面的高度不宜低于超高一侧轨道板上表面最高处高度。4．请叙述

CPⅢ轨道控制网的布设？

答：⑴ CPⅢ点应沿线路设置于路基两侧的接触网杆基础或独立基础上，桥梁防撞墙上；桥梁上的CPⅢ控制点应设置于桥梁固定支座上方的防撞墙上。

⑵CPⅢ点沿线路布置的纵向间距宜为60m左右，最大纵向间距不宜超过70m。同一对CPⅢ点的纵向里程差不宜大于1m。

⑶ 各CPⅢ控制点应设于轨道设计顶面以上30cm处，并应大致等高。

胶原Ⅲ型 第3篇

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及饲养

SPF级健康SD大鼠70只, 雄性, 体重 (220±10) g, 由中国食品药品鉴定所提供, 实验动物质量合格证明书编号:scxk (京) 2011-0012。适应性饲养1周后进行染毒, 期间大鼠进食饲料由中国食品药品鉴定所提供。实验室环境:温度22~26℃, JP相对湿度40%~70%, 空气压力梯度维持20 Pa。每周进行1次彻底消毒, 每天喷雾消毒2次。所有进入实验室的物品全部进行消毒处理。饲养期间实验大鼠均正常饮食、饮水, 无意外伤害及死亡。

1.1.2 试剂及仪器

1.1.2. 1 试剂

Nd2O3 (购自包头市瑞鑫稀土冶炼厂, 经包头市稀土研究院火法实验室检测, D50=0.11μm, 粒径<0.29μm占97%, 纯度为99%) , 无放射性;无水乙醇 (分析纯, 天津市开通化学试剂有限公司) ;甲醛 (天津市风船化学试剂科技有限公司) ;戊巴比妥钠, 磷酸盐缓冲液 (PBS) , 0.9%生理盐水;天狼猩红, 苦味酸, 树胶;酶联免疫吸附试验 (ELISA) 试剂盒 (美国Thermo公司Pierce BCA Protein Assay Kit) 。

1.1.2. 2 仪器

切片机, 光学显微镜, 恒温水浴箱, 离心机, 微量加样器 (德国Eppendorf公司) , 电子天平 (AR224CN, CP3102, 奥豪斯仪器上海有限公司) , LDZM-SOKCS立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂) , DW-HL388超低温冰箱 (-86℃, 中科美菱低温科技有限责任公司) , 酶标仪 (伯乐550型酶标仪, 美国)

1.2 方法

1.2.1 实验分组与动物模型的制备

SPF级健康成年SD雄性大鼠按体重随机分为5组, 染尘剂量分别为25、50、100和150 mg/kg, 每组实验动物为15只, 由于染毒时间相同, 不同剂量设同一对照组, 对照组实验动物为10只。染毒后第28天后处死, 取大鼠全肺肺泡灌洗液及肺组织。灌洗液离心后分装标记, 肺组织甲醛乙醇溶液固定。

1.2.2 BALF的收集

染毒大鼠经腹主动脉放血处死, 暴露气管, 经口插入7号腰穿针, 细线固定, 用灭菌生理盐水25 ml, 在无菌条件下进行支气管肺泡灌洗, 收集所有的灌洗液, 4℃, 1 500 r/min离心15 min (离心机离心半径=12.3 cm) , 吸取上清液, 用1.5 ml EP管分装标记。

1.2.3 肺组织的染色

天狼猩红染色液的配制:0.5 ml天狼猩红和500 ml饱和苦味酸溶液;酸化水的配制:5ml冰醋酸和1 000ml蒸馏水;切片恒温干燥箱63℃13 min;85%、90%、95%乙醇各脱水1 min;苏木精重度复染20 min, 自来水冲洗返蓝10 min;在0.1%苦味酸-天狼猩红染色液中染色1 h, 酸化水洗2 s2次, 无水乙醇1 min3次, 二甲苯透明2 min2次;中性树胶封片。

1.2.4 肺组织胶原纤维含量检测

制作肺组织切片, 经天狼猩红染色后, 用偏振光显微镜观察, 采用ImagePro Plus Version 4.5 forwindows TM图象分析系统进行分析, 用颜色分割法将胶原纤维从背景色中分离出来。颜色分割原则:应用偏振光显微镜观察Ⅰ型胶原呈桔黄、橙红及亮红色, 其纤维较粗;Ⅲ型胶原呈淡绿色, 其纤维较细而弯曲。用阳性区域的面积百分比代表胶原含量。

1.2.5 BALF中上清液中IL-12含量的测定

用ELISA试剂盒测定BALF中上清液中IL-12的含量。按试剂盒说明进行相应操作, 终止反应后用酶标仪进行读数, 记录结果。

1.2.6 统计学分析

所有数据均采用 (±s) 表示, 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。用完全随机设计单因素方差分析, 均数间两两比较方差齐时采用LSD检验, 方差不齐时采用Dunnett T3检验;以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 对照组与各染尘组大鼠肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原天狼猩红染色镜下形态

对照组, 肺泡隔正常, 肺泡间隔仅有少量Ⅰ、Ⅲ型胶原 (图1-A) 。染稀土粉尘的实验组, 随着剂量的增加, Ⅰ、Ⅲ型胶原逐渐明显增加。25 mg剂量时, 肺泡轮廓模糊, 肺泡间隔出现少量呈桔黄I型胶原、淡绿色Ⅲ型胶原增加 (图1-B) 。50 mg/kg剂量时, 正常肺泡结构基本消失, 取而代之的是交织存在两种胶原, 一种较细, 为Ⅲ型胶原 (呈淡绿) , 另一种较粗, 为Ⅰ型胶原 (呈桔黄、深红色) (图1-C) 。100 mg/kg剂量时, 可见弥漫性、淡绿色弯曲的胶原呈网织状存在, 其间夹杂大量粗大的桔黄色纤维 (图1-D) 。150 mg/kg剂量时, 两型胶原弥漫性布满整个视野, 呈网织状交错存在, 粗大的桔红色胶原明显增多 (图1-E) 。

2.2 不同剂量染尘组大鼠肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原面积百分比的改变

研究结果显示, 染尘各剂量组大鼠肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原面积百分比随着染尘剂量的增加均呈现增加的趋势, 且均高于对照组, 经统计学检验, 在50、100和150 mg/kg剂量组Ⅰ型胶原面积百分比差异有统计学意义 (P<0.05) , 100和150 mg/kg剂量组Ⅲ型胶原面积百分比差异有统计学意义 (P<0.05) 。表明稀土粉尘能够导致大鼠肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加。见表1。

2.3 大鼠BLAF上清液中IL-12含量变化

研究结果显示, 稀土氧化钕粉尘染毒在剂量模型组中, 当染毒剂量为25 mg/kg时, 实验组大鼠BALF中IL-12的含量低于对照组, 其余各组均高于对照组, 经统计学检验, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。在相同染毒时间内, 随着染毒剂量的增加, IL-12的含量呈偏态分布, 于剂量为100 mg/kg时达到峰值。见表1。

注:BALF支气管肺泡灌洗液;IL-2白介素-12。经单因素方差分析LSD检验, 与对照组比较, aP<0.05, bP<0.01。

3 讨论

稀土氧化钕粉尘通过呼吸道进入人体肺部, 它对人体造成的危害主要是由于粉尘在肺内沉积导致肺组织发生炎症和纤维化。在肺组织发生损伤的过程中, 会引起肺内胶原沉积以及因子表达增加。肺内沉积的胶原主要是Ⅰ和Ⅲ型胶原, 肺内Ⅰ型胶原的含量最为丰富, 主要分布于支气管树和血管树的周围, Ⅲ型胶原主要见于肺泡间质内, 包括肺泡壁、小叶间隔, 构成肺间质胶原的主要成分, 其在组织内的分布非常紊乱, 构成了一个网络, 这种结构特征对于肺内组织, 特别是肺泡间隔保持良好的柔韧性非常重要[2]。胶原的沉积在肺纤维化发生进展过程中起着重要的作用[3], 同时有资料显示, 在肺纤维化发生发展过程中不同时期肺组织的Ⅰ和Ⅲ型胶原有不同变化[4]。本实验结果表明, 染尘后大鼠肺组织内早期可见少量的Ⅰ、Ⅲ型胶原的出现。随着剂量的改变Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的量均表现为逐渐增多、分布范围逐渐增大的特点。由此推断, 稀土氧化钕粉尘可能引起了肺组织的纤维化, 且剂量越大纤维化越明显。稀土氧化钕粉尘在引起肺纤维化过程中, 不仅肺组织中Ⅰ和Ⅲ型胶原的量发生变化, 同时也引起IL-12因子的表达发生变化。它们共同反映肺纤维化的过程。IL-12为多效性的细胞因子, 在增强细胞免疫和调节免疫应答类型中发挥重要作用, 有抑制肺纤维化的作用。本实验发现大鼠BALF上清液中IL-12含量随着染毒剂量的变化而变化, 陈南芳等[5]相关研究发现, 大鼠气管暴露法染矽尘28 d, 早期出现炎性细胞浸润, 后期肺组织结构破坏严重, 广泛纤维化。IL-12的含量随染毒剂量的变化可以看出机体自我调节的过程, IL-12的分泌起抗纤维化的作用[6]。在博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化模型中, IL-12基因敲除的小鼠与对照组相比肺内单核细胞的浸润减轻但肺纤维化程度加重, 提示IL-12能提高淋巴组织细胞的炎性反应以及能抑制肺纤维化的晚期发展[6]。Antoniou等[7]在用干扰素-1b (IFN-γ-1b) 或秋水仙素治疗特发性肺纤维化时发现, 治疗前后肺泡灌洗液中IL-12水平也无明显变化。因此检测IL-12可反映早期纤维化的趋势, 为早期判断肺损伤出现及其恢复提供依据。

综上所述, 稀土氧化钕粉尘通过呼吸道进入肺部后, 可造成对大鼠肺组织中Ⅰ和Ⅲ型胶原纤维面积百分比的改变及BALF中IL-12的升高。这些变化彼此间及同肺部纤维化之间的联系有待于进一步研究。

参考文献

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[3]Rimal B, Greenberg AK, RomWN, et al.Basic pathogenetic mechanisms in silicosis:current understanding[J].Curt Opin Pulm Med, 2005, 11:169-173.

[4]Lai CK, Wallace WD, Fishbein WC, et aI.Histopathology of pulmonary fibrosis disorders[J].Semin Respir Crit Care Med, 2006, 27:613-622.

[5]陈南芳, 何文彤, 高宏生, 等.染尘大鼠Ⅰ和Ⅲ型胶原与相关细胞因子含量的变化关系[J].中国工业医学杂志, 2010, 23 (2) :89-91, 98.

[6]Sakamoto H, Zhao LH, Jain F, et a.l.IL-12p40 (-/-) mice trea-ted with intratrachealbleomycin exhibit decreased pulmonary inflam-mation and increased fibrosis[J].Exp Mol Pathol 2002, 72:1-9.

胶原Ⅲ型 第4篇

关键词：肺纤维化/中医药疗法,@化瘀濡肺汤/治疗应用,肺纤维化/病理学,转化生长因子β1,Ⅰ型胶原蛋白,Ⅲ型胶原蛋白,大鼠

肺间质纤维化是许多病因不同的肺间质疾病的最终结局,属于呼吸系统疾病中的难治病,属于祖国医学“咳嗽”、“喘证”、“肺萎”、“肺胀”等范畴。西医治疗本病主要是应用糖皮质激素、免疫抑制剂、细胞毒药物等,长期服用副作用明显。中药对本病的治疗多从补益肺肾入手,注重活血通络,对提高疗效、减轻毒副作用有明显的优势。但其根本的作用机制尚不明确。本实验以复制的肺纤维化动物模型为对象,观察化瘀濡肺汤对肺纤维化大鼠肺组织内转化生长因子β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响,以探讨化瘀濡肺汤治疗肺纤维化的合理性和可能的作用机理。

1 实验材料

1.1 实验动物

选用Wistar大鼠60只,雄性,体重(300±30)g,由山东大学动物实验中心提供。

1.2 实验药物

化瘀濡肺汤由黄芪20g、生地15g、玄参15g、丹参 15g、川芎10g、当归10g、百部10g、五味子6g等中药组成,由我院制剂室配制成水煎浓缩剂(中药常规水煎后隔水浓缩而成,生药含量为2g/ml)。博来霉素A5:天津太河制药有限公司。

1.3 主要试剂

兔抗鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白单克隆抗体、兔抗鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)多克隆抗体、鼠SABC试剂盒、DAB Kit均购自武汉博士德生物工程有限公司。

2 实验方法

2.1 动物分组与模型建立及给药

雄性Wistar大鼠60只,随机分为4组:正常对照组15只、模型组15只、中药高剂量治疗组15只、中药低剂量治疗组15只。4组动物饲养1周后,除正常组外其余各组均用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,仰卧固定于实验台上,颈部酒精消毒后逐层暴露气管,博来霉素A5(5mg/ml)一次性气管内注射(1ml),注射后立即将动物直立并旋转,使药液在肺内分布均匀。正常组在同样的条件下气管内注入相同体积的生理盐水。4组动物于气管内灌注后2小时开始灌胃;中药化瘀濡肺汤高、低剂量组予中药19.8g/kg、6.6g/kg,正常组及模型组予等量生理盐水,每天1次。

2.2 观察指标测定

2.2.1 取材

每组动物于灌药后第7、14、28天各处死5只,取右肺置于10%福尔马林液中固定。石蜡包埋。按6μm厚连续切片4张,1张HE染色,3张分别为TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原免疫组化染色。备以光学显微镜观察。参照Szapiel[1]等的方法确定肺泡炎、肺纤维化的程度。

2.2.2 TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白检测

采用SABC免疫组化检测技术,严格按照试剂盒说明书进行操作,以PBS替代一抗作为阴性对照。结果判定:每张切片随机选取5个高倍视野(400),用德国VIDAS图像分析系统定量测定肺内TGF-β1、Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达,计算其总的吸光度值,吸光度值越大,说明表达越多。

2.3 统计学方法

应用SAS统计软件对计数资料进行χ2检验,计量资料进行方差分析。

3 结果

3.1 一般情况

模型组大鼠造模后体重下降明显,同时进食减少,甚至出现停止进食,并出现脱毛,活动明显减少等症状和体征,中药治疗组大鼠进食情况改善明显,体重变化不明显,活动与正常对照组无明显差异。

3.2 病理组织学观察

正常对照组大鼠各期肺内结构均正常,肺泡间隔无水肿、炎症及纤维化表现,肺泡内无明显渗出。模型组第 7天肺泡炎明显,肺泡腔及间质内可见大量以巨噬细胞为主的炎性细胞浸润,部分肺泡缩小或消失;第14天,肺泡炎程度逐渐减轻,但仍有较多炎性细胞浸润,伴有大量的成纤维细胞增生,基质明显增多,可见胶原纤维聚集;第28天,仍有轻度肺泡炎,肺泡结构破坏,由胶原纤维和成纤维细胞占据,形成严重纤维化。中药高、低剂量组与模型组的病理变化有同一规律,但中药高、低剂量治疗组第7、14、 28天的病理变化均较同期模型组减轻,其中以中药高剂量治疗组最为显著。见表1。

3.3 各组大鼠肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的测定

Ⅰ、Ⅲ型胶原主要分布在细支气管上皮下组织、肺间质及血管平滑肌中。正常大鼠肺内Ⅰ、Ⅲ型胶原皆有一定数量的表达。模型组大鼠肺间质中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达呈持续增强,第7、14、28天肺内Ⅰ、Ⅲ型胶原含量均明显高于同期正常对照组,均为P<0.01。中药高剂量治疗组、中药低剂量治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均明显高于同期正常对照组,均为P<0.01。但均较同期模型组低,P<0.05或0.01。见表2。

3.4 各组大鼠肺组织TGF-β1表达的测定

模型组第7、14、28天肺组织内TGF-β1的表达均高于同期正常对照组,均P<0.01。中药高、低剂量治疗组第7、14、28天肺组织内TGF-β1的表达均高于同期正常对照组,均P<0.01。但明显低于同期模型组,均P<0.01。见表2。

与正常组比较△P<0.05,△△P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01(下同)

4 讨论

肺间质纤维化是由多种原因引起的弥漫性肺部炎性疾病,病变主要累及肺间质。其病理特点是肺部炎症导致肺泡持续性损伤及细胞外基质的反复破坏、修复、重建和过度沉积。以早期肺泡炎,晚期纤维化形成为特点。多种细胞因子参与了肺间质纤维化的病理过程,诱导纤维母细胞合成Ⅰ型和Ⅲ型前胶原增加,肺泡上皮细胞非正常增生,最终导致肺泡与肺间质一体化的纤维化[2],细胞外基质代谢紊乱与纤维化关系密切[3]。转化生长因子(TGF-β1)是一种多效性的细胞因子,是目前肺纤维化研究的热点和重要的药物作用靶点。TGF-β1对成纤维细胞作用主要表现在两大方面:一方面它能刺激成纤维细胞合成细胞外基质成分;另一方面抑制对新合成的基质蛋白产生的酶解作用,还具有抑制肺泡上皮细胞增殖的作用。

中医认为肺纤维化多为慢性病程,其发病内因是正气虚,在疾病发展过程中,逐渐由肺气虚至肾气虚;由气虚至气阴两虚。补法是治疗的关键,只有扶正固本才能调节机体免疫状态,增强机体抗病能力是治疗的关键,以达到扶正祛邪的目的,此所谓“正气存内,邪不可干”。化瘀濡肺汤根据肺肾气阴两虚,肺络痹阻的病机,以补益肺肾之气阴为本,活血通络贯穿始终。方中选用能“补诸虚不足”的黄芪为君药,配伍生地、玄参以益气养阴。现代药理研究表明黄芪含黄芪甙、熊胆素、胆碱、甜菜碱、多糖、葡萄糖醛酸及微量叶酸,能有效增强肺脏免疫功能,促进细胞生长,对肺间质纤维化的恢复有积极意义[4]。川芎、当归、丹参为臣药,以活血化瘀为要务,使补中有通,通中有补,通补兼施。《类证治裁》曰“诸痹正气为邪所阻而不能宣行,因而留滞,气血凝滞,久而成痹。使瘀血消散,血运通畅,肺气得以宣降”。现代研究亦表明,肺纤维化的患者肺内凝血功能异常,存在血栓前状态,进而导致局部纤维沉积,活血化瘀不仅能够调控免疫反应,抑制纤维化的形成与发展,而且同时改善肺微循环,提高动脉血氧分压;此外尚能改善药物分布,促进药物吸收[5]。其中川芎具行气活血之功,善治气虚血瘀,已有大量研究显示在抗纤维化方面有较好疗效[6]。当归具有较强的自由基防护和抗脂质过氧化作用,可以明显减轻肺纤维化发病过程中急性肺泡炎和纤维化的发生[7],减轻胶原代谢失衡而起到治疗作用[8]。丹参可改善微循环和减少Ⅲ、Ⅳ型胶原纤维含量,促进已形成的胶原纤维降解和重吸收及改善肺部氧化等作用。茹永新等[9]证实含有丹参的中药方剂可以抑制肺纤维化动物肺组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积。本实验研究结果表明:高、低剂量化瘀濡肺汤治疗组大鼠血清中的TGF-β1表达,Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量较同期模型组均有明显降低 (P<0.01,P<0.05)。由此推测化瘀濡肺汤通过减少致纤维化关键性细胞因子(如TGF-β1)的合成与分泌,调整致纤维化细胞因子与抗纤维化细胞因子之间的平衡,减弱或阻断肺损伤后的异常修复过程,降低肺内胶原蛋白的生成,从而改善肺泡炎,延缓或阻断肺纤维化的发生与发展。

参考文献

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[8]刘卫敏,徐启勇,林宇辉,等.浓当归注射液对肺纤维化发生发展过程的影响.武汉大学学报(医学版),2001,22:325.

胶原Ⅲ型 第5篇

心肌梗塞后的心脏重构是发生心力衰竭的重要病理生理基础,目前已成为影响急性心梗近远期预后的主要因素之一[1]。心脏重构过程的具体机制不断得到阐明,其中炎症反应和细胞因子的作用越来越受到重视。HMGB 1是一种非组蛋白,它存在于几乎所有真核细胞的细胞核内,具有稳定核小体,促进DNA弯曲以及易化基因转录的作用[2,3]。HMGB 1可以作为一种内源性的损伤信号由坏死细胞被动释放,而凋亡细胞并不释放HMGB 1[4]。释放到细胞外的HMGB 1表现出炎症因子样的活性并且具有激活巨噬细胞的潜力[5]。同样,在炎症因子刺激下,巨噬细胞也可以分泌HMGB 1[6]。因此,HMGB 1的分泌具有独特的自我放大功能,尤其是在坏死组织中,大量坏死细胞释放的HMGB 1又促进了HMGB 1的释放。

以往的研究证实,在心梗后给予抗炎制剂虽然可以抑制炎症反应的扩大,但是却因为破坏了心脏自身的修复过程而使梗死区面积扩大[7,8],这也说明了适当的炎症反应对心梗后的心脏重构是有益的。但是另一方面,过度以及持续的炎症反应却造成了大量的炎细胞浸润及细胞外基质成分的改变,从而使梗死区面积扩大,加重心脏的重构[9,10]。近年来有研究表明,HMGB 1在心梗患者的血清中明显升高,在心梗后的12h达到峰值,并且其增高的水平与心脏的泵功能衰竭、心脏破裂以及院内的心源性猝死有相关性[4],这些都表明HMGB 1很可能参与了心梗后心脏重构的病理生理过程,并在其中起着重要调节作用[1113],但是,作为一种炎症相关因子,HMGB 1在心肌梗死后的心脏重构中扮演的角色尚不清楚。由于心肌梗死后心脏的重构主要是瘢痕组织代替正常心脏组织的过程,其病理水平主要表现为成纤维细胞的增生以及胶原水平的升高[14],因此,我们通过研究HMGB 1对大鼠心肌成纤维细胞的作用来探讨其在心梗后心脏重构过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

出生1日的新生SpragueDawley(SD)大鼠,雌雄不限,由第四军医大学实验动物中心提供。HMGB 1标准品(1mg,Sigma公司产品),高糖Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM)培养基(GIBCO产品),胰蛋白酶、四氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品,新生牛血清(杭州四季青公司),Trizol试剂(Invitrogen公司),SuperscriptⅡ逆转录试剂盒(Promega,美国),荧光定量PCR反应所用试剂为SYBRPremixExTaq(TaKaRa)。

1.2 方法

1.2.1 CFs细胞原代培养及分组

无菌条件下取新生SD大鼠心脏,磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,剪至(0.5~1.0)mm 3小块,0.125%胰蛋白酶37℃消化30min,每5min收集1次细胞,1 000r/min离心5min,将所得细胞置于含10%新生牛血清的DMEM培养液中,37℃、5%CO2孵箱中贴壁(60~90)min,差速贴壁法去除心肌细胞。生长近融合时按1:3传代,实验采用(2~4)代细胞。实验分为空白对照组和实验组,实验组分别以不同浓度的HMGB 1(0.01mg/L,0.1mg/L和1mg/L)干预。

1.2.2 Mtt法测定细胞增殖

将处于对数生长期的CFs细胞以1104个/mL密度接种于96孔板,每孔100μL。置于37℃、5%CO2孵箱中培养,24h后换无血清DMEM培养液,使细胞进入生长静止期。在37℃继续孵育24h,换用配制好的不同浓度含药培养液,培养至6h、12h、18h、24h、48h每孔加入5mg/mL的MTT 20μL。继续培养4h后,吸弃培养液,各孔加150μL的DMSO,平板摇床振摇10min。待结晶充分溶解后,用酶标仪检测490nm波长吸光度。

1.2.4 荧光实时定量PCR检测目的基因mRNA表达

常规Trizol法提取细胞总RNA,测RNA纯度,A 260/A 280在1.82.0之间,随机引物反转录合成cDNA。引物序列如下:I型胶原(COL1),上游5′-CAC TCA GCC CTC TGT GCC T-3′,下游5′-ACC TTCGCTTCCATA CTC G-3′,扩增产物大小为121bp;Ⅲ型胶原(COL3),5′-AAC CCTGCTCGG AAT TGC AG-3′,下游5′-TCT GTC CAC CAG TGC TTC CG-3′,扩增产物大小为165bp;β-actin,上游5′-CCA CTG CCG CATCCTCTT-3′,下游5′-GCA TCG GAA CCG CTC ATT-3′,扩增产物大小为89bp。使用ABIPRISM 7000实时定量PCR仪进行PCR扩增,扩增条件为:95℃预变性10s,95℃变性5s,60℃退火延伸20s,循环40次,反应体系为20μL。反应结束后,使用ABIPRISM 7000自带分析软件得到目的基因Ⅰ、Ⅲ胶原mRNA相对表达量(以同一样本目的基因和管家基因β-actin含量的比值作为评价目的基因表达水平)。

2 统计学处理

采用SPSS 12.0软件进行统计分析,实验数据用X±S表示,进行单因素方差分析及LSD-t检验进行组间的两两比较。P<0.05为有统计学差异。

3 结果

3.1 不同浓度的HMGB 1对SD大鼠CFs的MTTOD值的影响

0.01、0.1、1mg/LHMGB 1分别干预6h、12h、18h、24h、48h后,成纤维细胞存在不同程度的增殖(表1)。在48h后,HMGB 1药物干预的大鼠CFs的OD值显著高于空白对照组(P<0.05),且HMGB 1浓度为0.1mg/L时,大鼠CFs的OD值最高(图1),1mg/L浓度组较0.1mg/L浓度组OD值降低(P<0.05)(图1)。

注:n=3,表示三次单独的培养细胞样本;*p<0.05,HMGB 1vscontrol;△p<0.05,0.1mg/L vs 1mg/L HMGB 1;□p<0.05,0.1mg/Lvs 0.01mg/LHMGB 1。

3.2 Realtime-PCR结果显示

0.01、0.1、1mg/LHMGB 1分别干预SD大鼠心肌成纤维细胞48h后,与空白对照组相比SD大鼠CFsⅠ、Ⅲ型胶原蛋白的mRNA水平均显著增高,在0.1mg/L浓度时mRNA水平最高(图2,图3)。

4 讨论

心肌梗死后梗死区及周边组织发生一系列的病理变化,成纤维细胞以及细胞外基质在梗死部位及周边大量增生、浸润,取代了死亡的心肌细胞,即心肌组织发生了重构[15],这个过程是引起心功能由代偿转向失代偿和心衰的重要因素之一。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白由心肌成纤维细胞分泌,是构成心脏细胞外基质的主要成分。在心肌梗死的病理条件下,Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维病理性增生,造成了心肌组织实质与间质的比例失调,心肌细胞作为工作细胞其数量相对下降,在大体上表现为机体心脏功能不全。

HMGB 1是一种普遍存在并于进化过程中高度保守的染色质蛋白,可与双链、单链和扭曲的DNA结合,维持核小体结构、调节DNA的构象,从而促进某些转录因子包括类固醇激素受体等的结合;HMGB 1可以由坏死或损伤细胞被动释放,作为潜在促炎细胞因子,诱导巨噬细胞和单核细胞合成分泌多种炎症因子[16]。HMGB 1在不同的组织中发挥着不同的作用。有研究表明,HMGB 1与细胞膜上的受体(TLR 4,TLR R 2,RAGE等)结合后可以引起人和鼠类肝脏及肾脏组织的纤维化、引起慢性炎性反应最终导致肝脏及肾脏的慢性损伤[1721]。

目前关于HMGB 1对心血管系统的作用还存在很多争议。LiW[22]等发现,HMGB 1一旦释放入细胞间隙,则表现出晚期炎性因子的特点而参与动脉粥样斑块的形成。AndrassyM等[23]曾经报道在缺血再灌注损伤中,HMGB 1通过与其受体RAGE结合,激活了炎症反应通路从而介导了心脏的损伤。但是,TakahashiK等[24]发现,给予心梗区局部注射外源HMGB 1,可以通过减少树突状细胞的聚集减轻炎症反应,同时减轻由炎症引发的一系列的纤维化和心肌细胞肥大症状,可以改善整个心脏功能。LimanaF等[25]认为HMGB 1可以通过促进心脏组织中C-kit干细胞的分化从而促进心肌细胞的再生;KitaharaT等[26]对过表达心肌特异性HMGB 1的转基因小鼠进行研究,发现HMGB 1具有促进血管生成以及改善心功能的作用。而KohnoT等[4]研究发现,HMGB 1在心肌梗死后的患者血清中高水平表达,并且与心梗患者的危险临床事件(如心脏泵功能衰竭、心脏破裂以及院内心脏猝死)发生率呈正相关。TakahashiM[27]认为HMGB 1在缺血性心脏病中的作用可能与HMGB 1作用浓度有关,他分析了前述实验中的不同实验条件,发现低浓度的HMGB 1有助于心功能的恢复而高浓度的HMGB 1却对心功能有害。

HMGB 1作为一种炎症相关因子,在心脏缺血性损伤中能够诱导细胞因子的产生及粘附,但是其对心梗后心脏成纤维细胞及细胞外基质是否具有直接的调节作用尚未完全明了。我们的实验模拟心梗后HMGB 1被动释放、心脏组织中HMGB 1表达显著增高的外环境,通过体外给予不同浓度的HMGB 1来观察其对CFs的生长、增殖以及对Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平的影响。发现不同浓度的HMGB 1对SD大鼠的CFs具有一定的促增殖作用,这与之前研究报道的HMGB 1对其他组织(如肝、肺及肾脏等)成纤维细胞的作用相似[17,28,29],其中HMGB 1在0.1mg/L浓度时,CFs增殖水平最高。这些都表明了HMGB 1除了可以作为心梗后各种危险临床事件的标志物外,还能够通过直接促进成纤维细胞的增殖水平对心脏重构产生影响。

心脏的重构不仅涉及成纤维细胞的变化,还包括细胞外基质,尤其是胶原水平的改变。为了验证是否HMGB 1能够直接影响胶原的表达,我们的实验通过实时荧光定量PCR法测定I、Ⅲ胶原mRNA的水平,发现不同浓度的HMGB 1作用于SD大鼠CFs48小时后,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的水平均高于空白对照组,HMGB 1在0.1mg/L浓度水平时,胶原表达水平最高。实验中发现终浓度0.1mg/LHmgb1对CFs细胞的增值和胶原分泌的表达作用影响最强。这说明HMGB 1在影响成纤维细胞的同时也改变了胶原的表达,进一步验证了HMGB 1可以直接作用于胶原而对心脏的重构直接发挥调节作用。

以往的研究都集中在HMGB 1蛋白在心梗后患者的血清及梗死区的表达水平变化,并且通过使用HMGB 1阻滞剂来观察梗死区的梗死面积变化以及心脏重构程度,从而对HMGB 1的作用进行间接的观察。我们的实验独特之处在于直接使用HMGB 1来作用于心脏重构的物质基础,即成纤维细胞和胶原。在排除其他干扰因素的作用下观察HMGB 1的作用,证实了HMGB 1能够直接影响成纤维细胞增殖及胶原的表达。但是,我们的实验也存在着一些不足。首先,我们的实验观察到了HMGB 1对胶原在mRNA水平的表达影响,对胶原在蛋白水平的变化仍需进一步实验研究;第二,我们的实验作为体外实验,不能够模拟体内的复杂环境。虽然观察到了HMGB 1具有的促进及成纤维细胞及胶原的增生作用,但是对于HMGB 1在整体水平对心功能的作用是有益还是有害,还需要进行动物实验进行证实;第三,不同浓度的HMGB 1对成纤维细胞以及胶原的增生产生了不同的作用,且与作用时间有相关性,其具体分子机制尚不清楚,需要我们进行深入的探讨。

HMGB 1作为一种晚期炎性因子,其对心血管系统的作用的分子机制目前尚不明确,本实验发现了HMGB 1对心肌成纤维细胞增殖及胶原生成具有直接的促进作用。可以通过干预HMGB 1作为心梗后病理性重构的潜在治疗手段,但是仍需慎重,需进一步研究其综合效应,在考虑其促炎、促进不同系统组织纤维化以及在心脏组织中对离子通道等各方面的作用影响之后,才能为治疗提供更有力的依据。

摘要：通过观察HMGB1(High mobility group protein-B1)对新生SD(Sprague-Dawley)大鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖和胶原合成的影响,探讨HMGB1在心梗后心脏重构过程中的作用。以培养的新生SD(Sprague-Dawley)大鼠CFs为实验对象,分别给予0(对照组)、0.01、0.1、和1mg/L浓度的HMGB1进行干预,6、12、18、24和48h后进行四氮唑盐(MTT)比色法检测CFs增殖水平,采用荧光实时定量PCR法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达。结果:(1)与对照组相比,48h后,不同浓度的HMGB1组新生SD大鼠CFs增殖水平和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平均较对照组有所增高(p<0.05)。(2)HMGB1浓度为0.1mg/L时CFs增殖水平和I、Ⅲ型胶原mRNA表达水平较其他处理组均升高(p<0.05)。说明HMGB1能促进SD大鼠CFs增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达,其作用显示在低水平时可能呈浓度依赖性,并且浓度为0.1mg/L时效应最明显,显示HMGB1参与了心梗后的心脏重构过程并发挥了重要作用。

胶原Ⅲ型 第6篇

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究糖尿病患者均来自2005年3月至2006年7月我院内分泌科门诊就诊的人群。入选标准:所有患者半年内均未作过造影剂检查,未使用肾毒性药物,继往无慢性肾小球肾炎病史及明确诊断的肾小管性疾病史,2型糖尿病患者均符合ADA 1997年诊断标准,并且血糖控制良好,检测尿微量白蛋白排除糖尿病肾病。老年非糖尿病组来自健康体检人群。本研究共分3组,A组为老年2型糖尿病患者,96例,年龄65～78岁,平均(70.68±5.42)岁;B组为非老年2型糖尿病患者,90例,年龄48～56岁,平均(53.71±3.13)岁,C组为老年非糖尿病人,93例,年龄65～79岁,平均(74.50±4.11)岁。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集

所有患者均早晨空腹取静脉血测定尿素氮、血肌酐(SCr)、血脂、糖化血红蛋白(HbA1c)。同时收集晨尿以及24 h尿标本(加二甲苯防腐,混匀),准确记录尿量,留取5 ml尿标本放入-30 ℃冰箱保存,待测定尿Ⅳ型胶原、尿微量白蛋白。

1.2.2 尿Ⅳ型胶原

用ELISA法紫外发光测定,测定范围0.8～50 ng/ml。试剂盒购自上海森雄公司,按试剂盒说明书操作。尿Ⅳ型胶原浓度以尿肌酐(Cr)校正,单位以ng/(mgcr)表示。

1.3 统计学方法

数值以undefined表示,应用SPSS 11.0统计软件进行处理。组间比较采用F、t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本资料

3组间血压2组老年组高于非老年组,但无显著性差异(P>0.05)。糖尿病组低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平较老年非糖尿病组高,但经比较无显著差异(P>0.05),糖尿病组之间血糖无显著差异(P>0.05),收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、SCr在各组间无显著性差异(P>0.05),见表1。

2.2 3组尿Ⅳ型胶原及尿微量白蛋白水平比较

老年糖尿病组尿Ⅳ型胶原高于非老年糖尿病组及老年非糖尿病组,存在显著性差异(P<0.05)。而老年非糖尿病组与非老年糖尿病组之间无显著性差异。而比较3组之间尿白蛋白,无显著性差异,见表2。

2.3 糖尿病病程对尿Ⅳ型胶原的影响

糖尿病病程<10年组与10～15年组和>15年组均有显著差异(P<0.05),10～15年组和>15年组之间有升高趋势但是没有显著性差异,见表3。

注:与A组比较,*P<0.05,**P<0.01

注:与病程<10年组比较,*P<0.05

3 讨论

随着我国人口老年化趋势,老年人口增加迅速。随着年龄的增加,肾功能受损的发病率明显增加。据2006年统计北京地区老年人群肾小球滤过率受损有8.7%[1],而1999年同样在该地区仅有2.17%[2]。SCr在检测中受影响因素较多而且不易早期发现肾损害,而早期发现肾脏损害对于肾脏病的防治至关重要。

糖尿病在老年人中发病率高,其肾损害以往主要通过尿微量白蛋白检测作为糖尿病肾病的诊断标准,但是有研究显示,在其出现异常之前已存在肾脏病理性损害[3]。探讨更敏感的指标更有利于糖尿病肾病早期预测。

Ⅳ型胶原由2种不同的结构肽链组成,分别是α1和α2,每条α链富含赖氨酸和羟脯氨酸,2条α1链和1条α2链组成杆状的三股螺旋结构为其单体分子,分子量549.8～599.8 kU,编码α链的基因区域有6个,分别是α1～α6。Ⅳ型胶原含量约占基底膜干重的50%,且随年龄增长所占比例增加。Ⅳ型胶原是肾小球以及肾小管上皮细胞基底膜重要成分,它的变化能反映这些细胞的动态代谢变化[4]。糖尿病肾病的基本病理改变包括肾小球和肾小管上皮组织肥大、基底膜增厚和细胞外基质堆积。而Ⅳ型胶原蛋白在病情进展过程中合成增加和(或)降解减少,使之在肾组织内积聚,最终导致肾硬化[5]。尿中Ⅳ型胶原水平不仅与肾组织内表达程度相一致,而且与肾小球基质基膜面密度(反映肾小球硬化的半定量指标)、肾间质纤维化及间质细胞数呈正相关,并随着肾硬化程度加重,尿中浓度逐渐增加,表明尿Ⅳ型胶原水平同步反映了肾组织中该物质的水平,并在一定程度上反映了肾损伤的严重性[6]。

但是,Ⅳ型胶原相对分子质量较大,正常状况下不能从肾小球滤过,那么聚集在肾组织中的Ⅳ型胶原是如何从尿液中排出的?有人检测了IgA肾病患者尿Ⅳ型胶原分子大小,发现其相对分子质量为340 kDa,故推测可能由于病变肾小球的结构破坏、肾小囊断裂,使积聚在病变小球及间质上的Ⅳ型胶原分子直接进入尿囊腔随尿排出;但这类患者往往合并有明显的蛋白尿和血尿[7]。

但本研究中作为没有微量白蛋白尿的老年糖尿病组尿Ⅳ型胶原分子大部分不应是肾小囊断裂漏出[8],而它同时作为肾小管上皮基底膜固有成分,那么我们推测从胶原分布看本研究所监测的尿Ⅳ型胶原的增加应该是肾小管上皮基底膜脱落产生为主。

本研究中我们发现老年糖尿病患者相对非老年糖尿病患者以及老年非糖尿病患者尿Ⅳ型胶原显著性增高。可见年龄因素影响尿Ⅳ型胶原浓度,并且独立于血压、血糖、血脂的影响(2组间无差异)。糖尿病病程同样可以影响尿Ⅳ型胶原,随着病程延长,尿Ⅳ型胶原浓度增高,并且这一因素独立于年龄因素之外。推测糖尿病本身存在其他因素随着病程、年龄的增加损伤肾脏,如糖基化终产物、过氧化反应、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活。本研究中尿Ⅳ型胶原出现差异时尿微量白蛋白之间无显著差异,故在老年2型糖尿病患者中尿Ⅳ型胶原异常比尿微量白蛋白出现的早,可以作为更早期预测肾损害的指标。

参考文献

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鸡软骨Ⅱ型胶原蛋白的提纯与鉴定 第7篇

1 临床资料

1.1 一般资料

鸡胸软骨:取材于孵化场17d的雏鸡。CⅡ:Sigma公司 (来源于鸡) , 5mg/瓶。

1.2 主要仪器

离心机 (日立高速冷冻离心机) ;层析柜 (LKB2023, BROMMA minicoldlab) 。

1.3 主要试剂

胃蛋白酶 (Sigma 5g/瓶) ;DEAE-Sephadex A 50 (Amersham) ;Tris (sigma 100g/瓶) 。

1.4 CⅡ的粗提

将新鲜干净的鸡胸软骨捣碎成糊状, 用缓冲液和蒸馏水分别洗涤2遍, 然后将其悬浮于0.5mol/L的醋酸中 (调p H为2.5) , 加入胃蛋白酶, 4℃下消化72h, 低温离心, 取上清液-20℃保存。沉淀物再次悬浮于0.5mol/L醋酸中, 同样条件下胃蛋白酶重复消化, 离心2次。将3次上清液混匀, 用p H7.6, 0.05mol/L TrisH c l, 0.2 m o l/L N a C l溶液充分透析。

1.5 CⅡ的纯化

将透析平衡的上清液应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析[8], 收集到的CⅡ溶液中加入Na Cl反复盐析, 再用0.1mol/L醋酸进行透析, 将透析内液保存。

1.6 CⅡ的鉴定

采用SDS-PAGE电泳, 将自提的CⅡ与标准CⅡ进行比较。

2 结果

2.1 DEAE离子交换层析结果 (图1)

粗提的蛋白质溶液经DEAE离子交换层析后出现2个峰, 第1个蛋白峰在加样后用洗脱液A (0.05mol/L Tris-Hcl, 0.2mol/L Na Cl, p H7.6) 洗脱时出现, 为CⅡ峰, 第2个峰在用洗脱液B (0.05mol/L Tris-Hcl, 1.0mol/LNa Cl, p H7.6) [9]洗脱时出现, 为杂质蛋白峰。

2.2 SDS-PAGE电泳结果分析 (图2)

将自提CⅡ与CⅡ标准品采用SDS电泳, 条带一致。

3 讨论

CⅡ是软骨中细胞外基质的重要组成部分, 由3条相同的α链组成, 呈三螺旋结构, 分子量约为283000, 由于CⅡ与多种蛋白多糖紧密结合, 且溶解度很容易受PH值及盐浓度影响等特点, 用单纯的方法很难得到较纯化的CⅡ。提纯CⅡ的过程中有几点要注意: (1) 提纯的过程尽量在4℃进行, 温度过高会使蛋白变性。 (2) 多次尝试发现, 胃蛋白酶的浓度在4%左右时提取效果较好, 浓度过低会使消化溶解的胶原蛋白量大大减少, 浓度过高则又混入大量的胃蛋白酶, 影响以后的操作。传统的提取方法中, 加入的胃蛋白酶的量多为1∶50或1∶20 (胃蛋白酶:软骨湿重) , 不能充分将胶原蛋白消化溶解。 (3) 进行离子交换层析前, 应使粗提的胶原蛋白溶液透析平衡, 否则, 杂质蛋白便不能与DEAE-Sephadex A 50充分结合, 使离子交换不完全, 杂质不能最大限度的除去。

(左为自提CⅡ, 右为CⅡ标准品)

雏鸡胸软骨是一种透明软骨, 其中除主要含有CⅡ外, 还含有较多的蛋白多糖和少量的Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ型胶原蛋白, 这些物质是提纯CⅡ过程中需要除去的主要杂质。本试验用胃蛋白酶降解法, 除去三螺旋伸直端的尾肽, 保留了CⅡ分子的完整性, 而螺旋结构及性质不受影响。由于CⅡ不与DEAE结合, 应用DEAE-Sephadex A 50离子交换层析, 收集非结合部分, 便可有效除去蛋白多糖及与DEAE结合的蛋白肽链;再通过多次盐析和透析进一步除去非CⅡ杂质。

本方法提取的CⅡ纯度较高, SDS电泳时仅出现单一条带, 可作为进一步研究CⅡ相关疾病的原材料, 且本方法不用盐酸胍提取, 安全性高, 应用范围更广。

摘要：目的 探讨可溶性Ⅱ型胶原蛋白 (CⅡ) 的提纯方法。方法 以雏鸡胸软骨为原材料, 酸性条件下经胃蛋白酶消化, 离心后, 应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析, 透析, 盐析, 得到纯化的CⅡ。结果 自提的CⅡ样品与CⅡ标准品采用SDS-PAGE电泳显示条带一致。结论 本法提纯CⅡ具有材料丰富, 操作简便, 重复性好等优点。

关键词：Ⅱ型胶原蛋白,提取,纯化

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