肺部铜绿假单胞菌

肺部铜绿假单胞菌（精选10篇）

肺部铜绿假单胞菌 第1篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年7-12月笔者所在ICU收治的存在肺部铜绿假单胞菌感染症状的100例患者, 以上患者均为行气管插管或气管切开的患者, 男64例, 女36例, 年龄45~68岁, 平均 (55.6±2.1) 岁, 69例患者行气管插管, 31例患者行气管切开。自痰液标本当中分离100株铜绿假单胞菌。

1.2 方法

对患者在ICU治疗期间, 各类抗菌药药物的使用情况进行回顾性分析, 并对药物敏感性的试验分析。痰液标本的采集方法为:采取一次性封闭式吸痰管, 晨起自患者气管导管内吸取痰液, 参照《全国临床检验操作规程》中的相关规范[3], 制取标本并送检。敏感性试验过程当中, 所选取的常见抗菌药药物包括以下几类: (1) 哌拉西林/他唑巴坦; (2) 头孢哌酮/他唑巴坦; (3) 亚胺培南; (4) 左氧氟沙星; (5) 丁胺卡那霉素; (6) 替考拉宁; (7) 头孢噻肟。采取HX-21型细菌鉴定药敏分析仪, 对所采集患者痰液标本相对于以上七类抗菌要药物的敏感性水平进行试验, 记录相应的结果并加以分析。

1.3 统计学处理

所得数据采用SPSS 17.0统计学软件进行处理, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验, 计数资料采用X2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

ICU肺部铜绿假单胞菌感染患者对哌拉西林/他唑巴坦药物的敏感性水平最高, 为78.00%, 对头孢噻肟药物的敏感性水平最低, 为2.00%。患者对哌拉西林/他唑巴坦药物的敏感性水平与患者对其他药物的敏感性水平比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 详见表1。

株 (%)

3 讨论

ICU病房患者由于自身病情比较危重, 导致全身抵抗力以及免疫功能明显变差, 再加上治疗期间存在大量的侵入性操作[4], 一旦广谱抗菌药药物的使用不够合理, 则会导致铜绿假单胞菌的侵入, 引发感染。特别是对于肺部感染而言, 一旦感染, 则病原菌难以做到及时且彻底的清除。同时还可能由于患者抵抗力的下降, 导致感染发作出现反复性、加重性的趋势。对于本文所选取的患者而言, 由于均为气管插管或气管切开的患者, 导致上呼吸道的过滤功能无法保留, 气管纤维毛细血管的活动也受到了明显的抑制[5], 由此导致患者的肺部保护功能及其功效被大大地削弱, 最终导致此类患者发生铜绿假单胞菌感染的可能性明显较大。

本次研究结果证实:ICU肺部铜绿假单胞菌感染患者对哌拉西林/他唑巴坦药物的敏感性水平最高, 为78.00%, 对头孢噻肟药物的敏感性水平最低, 为2.00%。患者对哌拉西林/他唑巴坦药物的敏感性水平与患者对其他药物的敏感性水平比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。这一研究结果显示:铜绿假单胞菌对青霉素类以及头孢菌素类药物所呈现出的敏感性水平较低, 耐药性水平较高, 这一研究结果与国内外相关报道基本一致[6,7]。相关临床研究证实:对于头孢类抗菌药药物而言, 之所以会导致敏感性水平降低, 耐药性水平较高, 其最根本性的原因在于细菌产生超广谱β-内酰胺酶[8]。而对于头孢吡肟药物而言, 之所以能够取得良好的敏感性水平, 分析其原因多在于头孢吡肟给药后能够迅速的与体内蛋白成分结合, 同时由于铜绿假单胞菌所生成的β-内酰胺酶亲和力水平较低, 因此促使头孢吡肟能够保持较高的敏感性。

因此在临床有关ICU患者进行抗菌药药物干预的过程当中, 对铜绿假单胞菌药物敏感性水平较低的药物长期使用, 会导致药物效能持续降低, 耐药菌株不断增加。这显然是不合理, 并亟待改进的。而改进的基础就在于, 通过敏感性试验的方式, 研究具体的敏感性、耐药性情况。

综上所述, 笔者所在ICU肺部铜绿假单胞菌感染患者在耐药性方面存在一定问题, 在临床应用中需要医务人员结合对患者药物敏感性的试验结果, 对各类抗菌药药物进行合理的应用, 对肺部铜绿假单胞菌感染耐药加以有效控制。

参考文献

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[2]张瑞琴, 陈灿, 王凤芝, 等.医院内科系统铜绿假单胞菌耐药与抗菌药物的使用的相关性研究[J].中国抗生素杂志, 2012, 37 (7) :539-544.

[3]文细毛, 任南, 吴安华, 等.864例次耐亚胺培南铜绿假单胞菌医院感染特征分析[J].中华医院感染学杂志, 2010, 20 (16) :2416-2418.

[4]蓝锴, 罗强, 张伟铮, 等.医院内铜绿假单胞菌感染的临床分布及耐药性变迁[J].广东医学, 2011, 32 (18) :2398-2400.

[5]解春宝, 肖代雯, 杨永长, 等.利用Au蛋白芯片技术快速鉴定铜绿假单胞菌的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2011, 31 (5) :462-466.

[6]韩学贞.2860例肺部感染患者病原菌的分析[J].中国医学创新, 2010, 7 (34) :121-123.

[7]李永斌.矽肺患者院内肺部感染病原菌及耐药性分析[J].中国医学创新, 2011, 8 (24) :172-173.

肺部铜绿假单胞菌 第2篇

整合子是与细菌耐药性传播有关的基因系统，整合子通过捕捉和整合细菌耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散中起了重要的作用。整合子通过位点特异性的基因重组可整合多种耐药基因对细菌多重耐药的形成起着重要作用职称论文。

本文对158株铜绿假单胞菌进行分析，以探讨铜绿假单胞菌整合子与其多重耐药性之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

10月～5月从我院临床标本中分离的铜绿假单胞菌158株。标本分别来自老年病房(53株)、呼吸科病房(49株)、普外科病房(28株)、泌尿科病房(16株)和内分泌病房(12株)。菌株分别分离自痰标本(68株)、脓汁(42株)、咽拭子(18株)、尿标本(12株)、伤口分泌物(10株)和血液(8株)。标准质控菌株为铜绿假单胞菌(ATCC27853)。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。

1.1.2 鉴定卡片

全自动微生物分析仪(VITEK-AMS)采用的GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司,GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、头孢噻肟、亚胺培南11种抗菌药物职称论文。

1.1.3 PCR试剂

TaqDNA聚合酶,4种dNTP混合液,DNA分子标准参照物购自Takara公司;琼脂糖,溴化乙啶等常用分子生物学试剂购自上海生工公司。

1.1.4 主要仪器

VITEK-AMS自动鉴定系统购自法国Biomerievx公司;PCR扩增仪、DNA/RNA/protein analyzer分析仪和高速低温离心机购自德国eppendorf公司;PCR电泳仪为北京崇文东方仪器厂产品;DGW-99型台式高速微型离心机为宁波新芝科器研究所产品。

1.2实验方法

1.2.1 菌株鉴定

所有菌株都用VITEK AMS 分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。体外药物敏感试验：采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株铜绿假单胞菌的MIC值，操作方法按照VITEK AMS规定的方法进行。

1.2.2加热裂解法制备DNA模板

:用Luria-Bertani液体培养基200r/min振荡培养8h获得对数生长期菌株。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。

1.2.3筛选1型整合子阳性菌株

用PCR方法扩增整合子可变区，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可变区下游引物aagcagacttgacctgat，进行PCR扩增。50ulPCR反应体系为:DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反应循环参数设置如下94℃预变性4分钟;94℃45秒，55℃，45秒，72℃3分钟，循环35次;最后72℃延伸10分钟。

1.2.4 PCR反应结束后取产物琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照记录结果。

1.2.5 统计学处理

采用χ2检验，P<0.05有显著差异。统计软件为SPSS10.0。

2 结果

2.1 1类整合子基因检测结果

全部158株铜绿假单胞菌的`DNA上有42株检测到I类整合子，占细菌总数的26.6%。1类整合子的大小分别为600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。根据各株细菌质粒DNA上检测到1类整合子的大小和数目，细菌质粒NDA上的整合子可分为5种整合子谱。

2.2 1类整合子阳性菌株与耐药性的关系

对比1类整合子阳性菌株与阴性菌株对抗菌药物的耐药率，并做统计分析，结果见表1。

1类整合子阴性菌株对11种抗菌药物完全敏感率为54.4%(86/158)。1类整合子阳性菌株更易表现出对青霉素、喹诺酮类、磺胺类药物的耐药。耐药率最高的是复方新诺明(100%)其次为氨苄青霉素(90.5%)和庆大霉素(85.7%)，丁胺卡那也表现出较高的耐药率(76.7%)。1类整合子阳性菌株对6种药物的耐药率显著高于阴性菌株，P<0.05。

2.3 1类整合子与多重耐药率的相关性

多重耐药率(耐4种以上抗生素)为62.0%(98/158)，其中1类整合子阳性菌株多重耐药率占85.7%(36/42)，阴性菌株多重耐药率为20.7%(24/116)。1类整合子阳性菌株多重耐药率明显高于阴性株，差异有统计学意义(χ2=18.23，P<0.01)。

3 讨论

肺部铜绿假单胞菌 第3篇

近年来，食品安全方面取得了明显进步，总体合格率水平保持在95%左右。值得一提的是，在不合格食品中，饮用水产品不合格率偏高，铜绿假单胞菌超标，饮料及冷冻饮品的合格率均为94.10%，不合格率近6%，排在抽检食品种类的最末。

北京公众健康饮用水研究所常务所长赵飞虹在接受记者采访时表示，铜绿假单胞菌在地表水中存在较多，属于致病菌，摄入到人体后，容易引起人腹泻发烧等症状。目前要求水与饮料中这种菌的检出率必须为零。

饮料、冷冻饮品垫底

据了解，铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，在自然界分布广泛，为土壤中最常见的细菌之一，易在潮湿的环境存活，对消毒剂、紫外线等具有较强抵抗力。

记者注意到，从2009年开始实施的《饮用天然矿泉水新国标》中，铜绿假单胞菌被列入新增加的3种致病菌之一。但近期多地多家企业的饮用水、矿泉水、桶装水等被检测出铜绿假单胞菌。此次饮料及冷冻饮品的合格率在抽检食品种类中垫底。

2015年底北京市食药监局就通报，北京“清圣源”包装18L/桶饮用水与北京樱桃泉矿泉水厂生产的18.9L/桶的饮用天然矿泉水就因被检出铜绿假单胞菌而被勒令停售。而在当年12月，佛山市3家饮用水企业生产的饮用水，也因铜绿假单胞菌超标进入黑榜，分别是佛山市好水箱饮用水有限公司生产的规格为18.9L/桶的甘峰山泉饮用纯净水、规格为18.9L/桶的百淳氏饮用纯净水，以及南海区里水浩浪饮用水厂生产的规格为18.9L/桶的缘泉饮用纯净水。

“水和饮料中是坚决不能检出铜绿假单胞菌的，检出率必须为零。”赵飞虹说，从地区来看，南方地区因为潮湿，铜绿假单胞菌的检出率相对北方较高。其实，消灭这种菌并不难，一些企业被检出，就说明整个工艺、生产管理方面有问题。

赵飞虹进一步解释，在生产饮料时，最主要的要求就是高温消毒，一经高温铜绿假单胞菌就被消灭了。于水而言，是要经过臭氧消毒的。一些问题水中检测出铜绿假单胞菌，说明臭氧的量放得不够。

除了杀菌不彻底原因外，据桶装水生产业内人士透露，桶装水出现该菌的原因主要有原料水体受到污染，或生产过程中卫生控制不严格，比如从业人员未经消毒的手直接与矿泉水或容器内壁接触等。

将加强安全性检验频次

值得注意的是，婴幼儿配方羊奶粉的不合格率也较高；网购、小杂食店、小吃店等场所不合格率偏高。

食药监总局副局长滕佳材表示，导致上述问题主要原因是农产品环境污染、食品产业薄弱、企业自律的意识和能力不高，以及从农田到餐桌的法规标准和监管体系还不健全等。今年食药监总局将加大对网络食品的抽检频次。

其中，针对婴幼儿配方羊奶粉不合格率偏高，食药监总局食品监管二司司长张靖表示，从羊奶粉抽检的情况来看，不合格的批次确是略高于其他奶粉，但是婴幼儿配方羊奶粉主要的不合格是不符合产品包装的标签明示值，不符合质量标准的情况并不是太多。也就是说，生产企业标签标识不规范。这与婴幼儿配方羊奶粉生产企业的企业规模比较小有关。

对于今年抽检工作的部署，食药监总局表示，重点更加突出，首先加强安全性指标检验，主要以农兽药残留、食品添加剂滥用和非法添加、致病菌、重金属、污染物质等安全性指标和舆情监测、监管发现的问题项目作为重点。

同时，加强高风险品种检验频次，如油、肉、乳、饮料等高风险加工食品每季度抽检，婴幼儿食品每月抽检，蔬菜、水果、畜禽肉等鲜活食用农产品每周抽检。

滕佳材表示，要加强对市场占有率高的企业的抽检。总局锁定全国流通、规模以上、市场份额大的生产企业，省级局锁定除总局抽检对象以外的省域内规模较大的食品生产企业。

肺部铜绿假单胞菌 第4篇

1 仪器与试药

1.1 动物与菌株

选用清洁级健康雄性Balb/c小鼠56 只, 6~8 周龄, 体重18~20 g, 由上海交通大学附属第六人民医院动物房提供。 铜绿假单胞菌 (ATCC27853) 购于中国科学院微生物研究所。

1.2 药物试剂与仪器

盐酸氯胺酮注射液 (福田古田药业) , 低熔点琼脂糖 (Bio Basic, 加拿大) , 引物设计与合成 (上海生物工程) , 小鼠IL-6、IL-17 ELISA试剂盒 (R&D, 美国) , 一步法Prime Script RT-PCR试剂盒 (大连宝生物工程) , 7500 real time PCR仪 (ABI, 美国) , Wellscan MK3 全自动酶标仪 (Labsystem Dragon, 芬兰) 。

2 方法

2.1 包被PA琼脂糖悬液的制备

参照朱松雷等[4]的方法将冻存的标准菌株制作成包被PA的琼脂糖珠后, 取微量的PA琼脂糖悬液以10的倍数稀释液接种到羊血琼脂板上, 37℃ 5%CO2孵育24 h后观察菌落进行计数, 以做参照调整琼脂糖悬液浓度至5×108CFU/m L。

2.2 动物模型制作

将56 只健康小鼠随机分成两组, 其中, 感染组34只, 经气管接种含有PA的琼脂糖悬液, 对照组22 只小鼠接种无菌的琼脂糖悬液。 参照文献[4]的方法将50 μL PA琼脂糖悬液和无菌琼脂糖悬液分别接种感染PA组小鼠和对照组小鼠气管内, 伤口予酒精消毒, 不做缝合。 此操作过程中感染组和对照组分别有4 只和2 只小鼠术后死亡。 每日观察小鼠饮食情况、呼吸状况及体重变化等生理特征。 接种后第1、3、5、7、10 天各处死对照组小鼠4 只, 感染组6 只。

2.3 标本收集与处理

2.3.1标本的制备

分别于各时间点取小鼠肺泡灌洗液 (BALF) 1.5 mL, ELISA法检测BALF中IL-6、IL-17的变化。取小鼠右上肺称重研磨培养, 计数肺组织菌落;右下肺置于10%中性甲醛溶液中固定, 制成石蜡切片, 采用苏木精-伊红 (H-E) 染色。取左肺置-80℃冰箱保存, 用于检测肺组织中TLR-2 mRNA和TLR-4 mRNA的含量。根据表1标准对病理切片进行评分[5]。

2.3.2实时荧光定量PCR

提取肺组织RNA采用RNAsio Reagent, 操作过程参照说明书, 采用SYBRRGreenⅡ荧光免疫法测定肺组织中TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的量。一步法实时定量PCR反应条件:42℃5 min, 95℃10 s, 1个循环;95℃5 s, 58℃34 s, 95℃15 s, 60℃30 s, 40个循环。TLR4的上游引物为5′-CTTCTCCCACTTCAGGCTCTT-3′, 下游引物为5′-CCAGGTAGGCTCTGGTGTTCA-3′, 扩增产物为166 bp;TLR2上游引物为5′-GAGCCGTTGGTGTATCTTTGA-3′, 下游引物为5′-CTCCCATTCCAGGTAGGTGTT-3′, 扩增产物为134 bp;GAPDH上游引物为5′-GGT-GAAGGTCGGTGTGAACG-3′, 下游引物为5′-CTCG-CTCCTGGAAGATGGTG-3′, 扩增产物为233 bp。在ABIR7500 real time PCR仪上进行PCR反应。将GAPDH作为内参比较目的基因的相对mRNA水平。

2.4 统计学方法

应用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析, 符合正态分布的计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验;不符合正态分布的计量资料数据采用秩和检验;以P < 0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠的生理状况

感染组小鼠呛咳反应严重, 活动量显著减少, 精神萎靡伴体重下降。 对照组小鼠术后第1 天活动稍差, 第2 天基本恢复正常活动和饮食。

3.2 肺组织细菌负荷

感染组各时间点处死的小鼠中, 肺组织匀浆细菌培养均培养出PA菌落, 第10 天时仍大于103cfu/g, 并且单胺氧化酶试验均为阳性, 对照组的小鼠均未培养出PA菌落。

3.3 肺组织的病理学变化

对照组小鼠肺组织初期肺泡有少量渗出, 结构较清晰完整, 第7 天已经恢复正常, 肺泡腔已无渗出, 肺间质未见明显的炎症浸润表现。 感染组小鼠的早期病理表现为肺泡内有大量渗出并伴有出血, 肺间质内有大量炎症细胞浸润;第10天时表现为远端肺泡结构有塌陷, 有纤维增生, 仍伴有大量炎症细胞。见图1。对两组病理评分采用秩和检验, 其中, 感染组30例, 秩和为1065, 秩均值为35.5, 对照组20例, 秩和为210, 秩均值为10.5, 差异有统计学意义 (Z=6.853, P<0.05) 。

A:感染组第3天;B:感染组第10天;C:对照组第7天

3.4 小鼠肺泡支气管灌洗液中细胞因子水平

感染组IL-6、IL-17 水平在术后第3 天达到峰值, 随时间迁移有所下降, 但仍然维持在较高的水平, 与对照组相比较有显著增加趋势, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 。 对照组各个时间点IL-6、IL-17 均表现为低水平。 见表2、3。

3.5 肺组织中TLR2、TLR4 m RNA表达水平

肺组织中TLR4 m RNA表达情况:感染组各个时间点小鼠的TLR4 m RNA的表达均明显高于对照组, 且差异有统计学意义 (P < 0.05) , 见表4。 感染组小鼠TLR2 m RNA表达与对照组之间差异无统计学意义 (P > 0.05) , 见表5。

4 讨论

PA慢性肺部感染是临床上常见的慢性肺部疾病, 常见于囊性纤维化、弥漫性泛细支气管炎和支气管扩张等, 由于肺组织长期感染, 导致炎症迁延和肺部结构损伤, 患者往往出现严重的呼吸道症状和肺功能障碍。随着肺组织损伤程度加重, 患者可出现临床症状恶化, 严重影响了患者的生活质量和生存寿命[6], 寻找新的PA感染治疗位点一直是医学界探索目标。

注:与对照组比较, *P < 0.05

注:与对照组比较, *P < 0.05

注:与对照组比较, *P < 0.05

注:与对照组比较, *P > 0.05

TLRs是一类病原模式识别受体 (pattern recognition receptors, PRRs) , PRRs识别病原体相关分子模式 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) , 即病原体的基本成分或病原体的产物, 进而产生一系列的生物学反应。 TLR4 是最早发现的TLRs, 通过识别脂多糖, 向胞内传导信号, 通过髓样分化因子88 (My D88) 介导下游的信号转导, 导致NF-κB等转录因子活化, 激活IL-1、IL-6、IL-8、β-干扰素以及肿瘤坏死因子-α 等下游炎症介质, 诱导调节多种细胞因子基因的转录, 最终引起相应炎症介质合成和释放[7,8,9], 启动针对病原微生物的固有和获得性免疫。

近年来研究显示, TLR4、TLR2 与很多肺部感染性疾病发展相关[10,11], 感染后, 与对照组相比较肺组织中TLR4、TLR2 均高表达, 其通过参与中性粒细胞的上调而参与机体炎性反应。 Nathan等[12]发现, 在敲除TLR2、TLR4 基因的C57BL/6 小鼠和野生型小鼠比较得出:在感染肺炎链球菌性角膜炎时, 敲除TLR2 基因的小鼠不能有效地招募中性粒细胞来协助角膜清除细菌, 同时证实敲除TLR4 基因小鼠无法启动固有免疫反应。 目前对TLR2、TLR4 在PA慢性肺部感染中的作用了解还不甚全面。 本研究发现小鼠在感染PA后, 与对照组小鼠相比, 肺组织TLR4 m RNA显著上升, 第7 天时达高峰, 可能机制是TLR4 受体在PA感染刺激后被全面激活, 第10 天仍然维持高水平表达, 同时肺组织HE切片也有大量的炎症细胞浸润, 说明TLR4 在小鼠肺部慢性感染PA时被激活。 既往也有研究证实, TLR4 和PA感染角膜炎密切相关, 野生型小鼠感染PA时, 与对照组相比较感染组角膜TLR4 m RNA水平显著上调, 表明TLR4 信号在感染PA时被激活, 参与细菌性角膜炎反应[13]。 本研究显示, TLR2 m RNA在两组中表达没有差异 (P > 0.05) 。推测原因可能是:①TLR2 与对照组相比无变化与Ramphal等[14]的发现部分相一致, TLR2 与PA肺部感染并无关联;②TLR2 主要识别革兰阳性菌, 与革兰阴性菌不相关[15]。

IL-6、IL-17 与PA感染密切相关, PA刺激人角膜上皮细胞后, 可导致IL-6 等其他相关炎症因子的大量分泌[16]。 有研究证实, IL-6 是TLR4 信号转导的下游因子, 当PA刺激TLRs, 较对照组PA组IL-6 的上升程度显著高于对照组[17]。 Ann等[18]发现, 慢性感染PA的囊性纤维变性患者的痰液中IL-17 m RNA和蛋白都是高于非PA感染的囊性纤维变性患者。 本研究与上述发现相符合, 本研究发现小鼠感染PA后BALF中的IL-6 和IL-17 水平各个时间显著高于对照组 (P < 0.05) , 第3 天表达量比第10 天高, 可能原因是第3 天时形成急性感染, 为急性细菌感染的高峰, 后来演变成慢性感染。 感染组呈上调表达的IL-17 可能提示IL-17 参与PA感染后的局部免疫应答。目前有研究发现, IL-17 与TLR4 也有着密切联系, 关节炎患者外周血单核细胞TLR4 通过诱导Th17 细胞分化参与关节炎疾病发生发展[17]。 本研究发现TLR4 和IL-17 都在感染组中呈高表达, 但PA慢性感染时TLR4 是否参与IL-17 的分泌, 其机制并不十分清楚, 在今后研究中可以进一步探索。

本研究通过铜绿假单胞菌致使小鼠感染, 检测慢性感染PA小鼠肺组织TLR4 m RNA的表达量明显高于对照组, 并且TLR4 信号传导下游因子IL-6 及相关炎症因子IL-17 在BALF中水平也显著高于对照组, 而TLR2 m RNA的表达量在感染组和对照组之间差异并无统计学意义, 提示TLR2 与PA慢性感染并无关联, TLR4 信号在PA肺部感染时被激活, 参与机体的免疫病理损伤, 加重慢性肺部感染病情, 如果能采取一定措施来抑制TLR4 的免疫应答, 将为以后了解PA肺部感染的发病机制和治疗方案的探索提供思路。

摘要：目的 探讨Toll样受体 (TLR) 2、4 mRNA在铜绿假单胞菌慢性感染小鼠肺内的动态改变及其作用。方法 56只雄性Balb/c小鼠随机气道接种含有铜绿假单胞菌 (PA) 琼脂糖珠 (感染组, 34只) 和无菌琼脂糖珠 (对照组, 22只) 。于第1、3、5、7、10天处死小鼠, 取肺组织细菌培养, 行肺组织病理观察, ELISA法检测肺泡灌洗液 (BALF) 中白介素 (IL) -6和IL-17的含量, 采用Real-time PCR检测TLR2 mRNA及TLR4 mRNA表达。结果 感染组在接种后第3天IL-6和IL-17水平均达高峰, 分别为 (154.83±12.51) ng/L和 (601.05±25.53) ng/L, 均显著高于对照组 (40.05±2.98) ng/L和 (213.75±9.25) ng/L, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 且两者在接种后第10天仍处于高水平。感染组中TLR4 mRNA的相对表达量第7天达高峰 (4.09±0.25) , 与对照组第7天 (0.97±0.05) 比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;而TLR2 mRNA在感染组和对照组各时间相比变化均不明显 (P>0.05) 。结论 TLR4与小鼠肺部慢性感染PA的发生发展密切相关, 其机制可能与TLR4在肺的免疫损伤中起到重要作用有关。

肺部铜绿假单胞菌 第5篇

铜绿假单胞菌对阿米卡星和妥布霉素耐药率最低，仅为1.15%～3.02%，对头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南、阿米卡星、妥布霉素耐药率小于10%，对亚胺培南和美洛培南的耐药率呈上升趋势，分别从的8.45%、8.09%上升到的13.10%、11.16%;而对阿莫西林/克拉维酸和氨苄西林/舒巴坦的耐药率高(>90%)。见表3。

2.4 鲍曼不动杆菌的耐药率

鲍曼不动杆菌对妥布霉素、阿米卡星耐药率较低，为6.18%～14.6%，对替加环素的耐药性增长迅速，从年的2.20%上升到20的24.00%;对头孢吡肟、亚胺培南、美洛培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、四环素和庆大霉素具有一定的耐药性，耐药率为19.36%～32.80%，而对氨曲南、头孢曲松的耐药率高(>90%)。见表4。

3 讨论

3.1 铜绿假单胞菌感染的临床分布及耐药性

铜绿假单胞菌是一种需氧革兰阴性杆菌，对周围生存繁殖环境和营养要求不高，在医院内潮湿环境和人体肠道可定植，引起抵抗力受损患者发生院内感染，可导致人体局部器官及全身性、多发性医院感染[1]。近年来由于广谱抗菌药物、激素及免疫抑制剂的广泛应用，各种侵入性诊断与治疗操作的不断普及，铜绿假单胞菌已成为医院感染的重要病原菌之一，给临床抗感染治疗带来了极大困难[2]，在免疫力低下的医院获得性肺炎患者中尤其多见[3]。患者感染了铜绿假单胞菌，尤其是多重耐药或者广泛耐药菌株后，由于对抗菌药物的敏感性差，治疗困难，病情常常迁延不愈，严重时可导致铜绿假单胞菌脓毒症，具有重症性、难治性、持续反复性等特点，已经引起国内外专业人士的关注。

本研究结果显示，铜绿假单胞菌最常见分离自呼吸道标本(68.35%)，其次为分泌物(16.95%)，与国内的报道一致[4-5]。科室分布内科以呼吸内科和ICU为主，分别占17.65%和15.98%，这些科室的患者多为老年患者或患病严重、住院时间长、免疫力低下，同时大量使用广谱抗菌药物造成菌群失调，致使铜绿假单胞菌继发感染，药物敏感的铜绿假单胞菌被杀灭，耐药性菌株得以存活并成优势菌群。外科则以普外科、肿瘤科、神经外科为主，分别占12.43%、6.40%和6.19%，因此加强消毒灭菌制度的落实，减少侵入性操作及合理使用抗菌药物是预防铜绿假单胞菌的有效措施。

肺部铜绿假单胞菌 第6篇

关键词：脑梗死,益气健脾化痰法,多重耐药菌,铜绿假单胞菌,肺部感染

临床中常遇到脑梗死患者,有的因意识障碍、肺部感染行气管切开,有的既往有慢支炎、肺气肿病史的老年患者,因长时间卧床,排痰困难,咯痰无力,致肺部感染后发热、痰多,经抗感染治疗后,发热消失或低热,但仍痰多,痰培养显示:多重耐药菌铜绿假单胞菌。抗菌药物治疗此类多重耐药菌肺部感染的老年患者,临床医生总感棘手,而此类肺部感染更易导致中风患者心肺功能衰竭而死亡。本研究旨在观察益气健脾化痰法治疗脑梗死后多重耐药铜绿假单胞菌肺部感染的临床效果。

1资料与方法

1.1一般资料选择2010年1月—2013年12月我院神经内科的住院患者92例。中医诊断为中风、咳嗽,西医诊断经头颅CT或磁共振成像(MRI)证实为脑梗死,胸片、痰培养确诊为多重耐药菌铜绿假单胞菌肺部感染。将92例脑梗死后多重耐药菌铜绿假单胞菌肺部感染患者随机分为观察组和对照组,每组46例。治疗组男24例,女22例,年龄58.32岁±10.54岁;对照组男25例,女21例,年龄59.46岁 ±10.82岁。所有患者均符合细菌性肺炎的中医诊断标准和西医诊断标准,两组患者在年龄、性别等一般资料方面比较,差异均无统计学意义(P >0.05)。

1.2诊断标准中医诊断标准参照《中医内科学》[1]。 西医诊断标准:细菌性肺炎参照《实用内科学》[2];脑梗死参照1995年中华医学会第四次全国脑病学术会议修订的《各类脑血管疾病的诊断要点》[3];多重耐药菌定义参照2011年卫生部《多重耐药菌感染预防和控制技术指南(试行)》。

1.3方法

1.3.1基础治疗两组患者均给予脑梗死常规治疗 : 抗血小板 、 降脂 、 调控血压 、 血糖 、 改善脑循环 、 营养脑细胞 、 康复治疗等 。

1.3.2对照组给予亚胺培南西司他丁钠(泰能,默沙东制药有限公司,亚胺培南500mg和西司他丁500 mg,批号:国药准字J20130123)0.5g(以亚胺培南剂量计)加入100 mL生理盐水中静脉输注,每日3次, 持续7d。

1.3.3治疗组在对照组基础上联用中药益气健脾化痰法,口服益气健脾化痰中药。药物组成为:党参25g,白术10g,法半夏10g,陈皮6g,茯苓15g,木香5g,砂仁5g,杏仁10g,细辛3g,五味子6g,干姜10 g,款冬花10g,紫菀10g,炙甘草5g。胸闷加瓜蒌、薤白各10g,便秘加大黄5g~10g。每日1剂,连服14 d,14d为1个疗程。1个疗程结束后,观察比较两组患者症状积分改善情况、血降钙素原的变化,并评价药物疗效。

1.4观察指标重点观察患者咳嗽、咯痰、胸闷、喘促、纳呆等症状,按无症状、轻度、中度、重度分别计为0分、1分、2分、3分,比较治疗前后积分的变化;并在治疗前后分别测定血降钙素原。

1.5疗效评价标准[4]根据《中医病症诊疗标准与方剂选用》评定,治愈:体温正常,临床症状消失,体征消失,各项生化指标正常,经X线检查肺实质病变基本消失;显效:体温正常,临床症状基本消失,但仍存在肺部啰音或湿啰音,X线检查肺实质病变明显消失;有效:体温正常,临床症状减轻,肺部体征有所改善,X线检查肺实质病变部分消失;无效:治疗后,病情无变化或恶化。

1.6统计学处理采用SPSS17.0软件进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验,计数资料采用χ2检验。

2结果

2.1两组患者症状积分比较(见表1) 两组治疗前后症状积分比较,差异有统计学意义(P <0.05);两组治疗后症状积分差异有统计学意义(P <0.05)。

分

2.2两组患者血降钙素原比较(见表2) 两组治疗前后血降钙素原比较,差异有统计学意义(P <0.05); 两组治疗 后血降钙 素原差异 有统计学 意义 (P< 0.05)。

ng/mL

2.3两组患者临床疗效比较(见表3)

3讨论

随着抗菌药物在临床上的广泛运用,细菌常会出现耐药性。细菌可通过一种或多种机制对一种或多种不同类的抗菌药产生耐药性,或一种耐药机制可能导致细菌对几种不同类的抗菌药耐药[2]。细菌耐药性机制极为复杂,无论质粒体或染色体介导的耐药性,一般只发生于少数细菌中,很难与占压倒优势的敏感菌竞争,故其危害性不大;只有当广泛使用抗菌药后,敏感菌因抗菌药物被大量杀灭后,耐药菌才能得以大量繁殖而成为优势菌,并导致各种感染的发生。因此,细菌耐药性的发生和发展是抗菌药广泛应用,特别是无指征滥用的后果[2]。

临床上脑梗死患者,尤其是脑干梗死、大面积脑梗死患者,因长时期卧床,有的患者本身有慢性支气管炎、肺气肿等慢性肺部疾病,吞咽功能障碍,极易并发脑梗死后坠积性肺炎、吸入性肺炎等肺部感染,出现咳嗽、痰多、痰难咯出、发热等症状。经使用广谱抗生素治疗一段时间后发热消退,患者肺部敏感菌被大量杀灭,肺部少数耐药菌得以大量繁殖而成为优势菌,故患者发热消退,但仍咳嗽、痰多,痰培养显示:多重耐药菌,包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌、耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌(CR-AB)、多重耐药/泛耐药铜绿假单胞菌(MDR/PDR-PA)等。其中铜绿假单胞菌是常见多重耐药菌之一,一般对泰能敏感,故选用泰能作为两组患者的抗菌药物。

在临床中对脑梗死后多重耐药铜绿假单胞菌肺部感染运用敏感药物泰能治疗,同时运用中医辨证施治。 临床中发现此类患者咳嗽,痰多色白,无发热。中医学认为:脑梗死后多重耐药铜绿假单胞菌肺部感染患者, 多发生在使用头孢类抗生素之后,头孢类抗生素属苦寒之药,清泻肺胃之火,能使发热消退,但苦寒伤胃,致脾胃亏虚,脾虚失运,痰湿内生,上干于肺,久则肺脾气虚,气不化津,痰浊更易滋生,故咳嗽、痰多。故对此类患者,中医当以益气健脾化痰之法,予陈夏六君汤加减。方中党参益气健脾,补脾肺之气;白术、茯苓、法夏、陈皮健脾化痰降浊,木香、砂仁温中健脾;干姜、细辛、五味子温肺化痰;杏仁、款冬花、紫菀止咳;甘草调和诸药。诸药合用,益气健脾,温肺化痰,理气止咳。

铜绿假单胞菌医院感染分析 第7篇

1材料与方法

1.1 菌株来源

选择2010年9月-2011年10月我院门诊及住院患者送检细菌培养的PA共计57株, 同一患者同一部位连续检出PA以1株计算。

1.2 培养与鉴定方法

遵照《全国临床检验操作规程》第2版方法进行鉴定, 部分菌株经法国生物梅里埃微生物快速鉴定 (API) 确证。以PA ATCC27853标准菌株进行质控。培养基为MH培养基, 由贵州阳光生物有限公司提供。

1.3 药敏试验

用K-B纸片琼脂扩散法, 操作及结果判断均严格按贵州阳光生物有限公司规定执行, 并进行质控, 结果均在规定范围。

2结果

2.1 分离率与感染分布特点

标本来自呼吸科39株 (68.4%) ;神经外科11株 (19.3%) ;骨科4株 (7.0%) ;门诊部3株 (5.3%) 。检出标本分别为痰和支气管吸出物及咽拭子39株 (68.4%) , 创口分泌物15株 (26.3%) , 中段尿3株 (5.3%) 。

2.2 易感因素

(1) 年龄:51～70岁患者分离16株 (28.1%) , 70～83岁41株 (71.9%) ;高龄患者为易感人群。 (2) 易感疾病:肺部感染患者分离35株 (61.4%) , 脑梗死后遗症10株 (17.5%) , 气管切开12株 (21.1%) 。 (3) 长期应用抗菌药物:所有病例在感染PA前均应用≥2种抗菌药物治疗, 其中应用过第3代头孢菌素患者分离39株 (68.4%) , 应用过第4代头孢菌素患者分离18株 (31.6%) 。

2.3 药敏试验

57株PA中多重耐药菌株40株 (70.2%) , 其敏感药物依次为亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、头孢吡肟、氨曲南、妥布霉素、环丙沙星、 替卡西林/克拉维酸、头孢他啶。

3讨论

PA广泛存在于自然界, 可引起人体多部位的感染。由于其对数抗生素不敏感, 呈现明显的固有耐药性, 即使对原为敏感的抗生素也可以产生耐药, 给抗菌治疗带来困难。传统分型方法包括血清学、抗菌谱、质粒图谱、噬菌体等[2]。目前国内多采用2种以上的联合分型方法来描述其流行病学特征, 但仍存在许多不足之处。近年创立的随机扩增的多态性DNA (RAPD) 指纹法基因分型技术, 从基因水平研究菌株间的差异, 分辨率高, 操作简单、快速, 结果直观, 可作为细菌初次分型的方法。不足之处在于其重复性受多种因素的影响, 且未对其进行标准化和统一化, 因而难以对不同实验室之间的RAPD检测结果进行比较。

PA属于假单胞菌属, 是一种非发酵的革兰阴性杆菌, 为专性需氧菌, 在自然界中广泛分布, 为土壤中存在的常见细菌之一。正常人皮肤, 尤其潮湿部位如腋下、会阴部及耳道、呼吸道和肠道内均可存在, 具有低致病性、低检出率的特点。其对外界抵抗力较强, 对紫外线不敏感而不易被灭活[3]。

医院内的多种管路、设备及器械上均曾分离到本菌, PA可通过各种途径传播给患者, 包括操作、患者与患者、患者与医护人员之间的传播。PA多侵袭患血液系统疾病、恶性肿瘤、大面积烧伤、各种术后插管、合并多种慢性疾病尤其呼吸系统疾病和免疫缺陷的患者, 可以明确存在细菌选择低免疫力宿主的因素。本次送检呼吸道分泌物标本的病例多为高龄, 且具有肺气肿、支气管扩张、陈旧性结核等肺病, 还有部分为肺部肿瘤或脑卒中、心力衰竭合并肺内感染的患者, 其呼吸道及全身免疫力低下, 致使患者的免疫功能及机体的自我修复力明显减弱, 细菌得以入侵引起局部或全身感染。宿主免疫力低下为出现条件致病感染的一个重要原因。

PA耐药率高, 给临床经验用药带来困难, 增加了患者的病死率。要解决其多重耐药的问题, 首要步骤是加强对细菌耐药性变迁的动态监测, 有助于及时有效地提高抗菌药物选择的合理性, 延缓和降低耐药性的产生, 尽可能地避免多重耐药的发生。同时, 要根据PA的生物学特征合理选用抗生素。联合应用大环内酯类抗生素可起到协同作用;哌拉西林联合庆大霉素、妥布霉素或阿米卡星具协同作用, 而亚胺培南属强内酰胺酶诱导剂, 对哌拉西林有拮抗作用, 两者不宜联用。另外, 要避免在医疗单位内长期使用单一品种抗生素, 可根据细菌药敏的动态监测采取循环用药策略。避免同一药物治疗疗程过长或不充足剂量下的预防性治疗, 具有重要临床意义。

摘要：目的 分析该院铜绿假单胞菌 (PA) 感染情况。方法 以PA ATCC27853标准菌株进行质控。培养基为MH培养基, 对57株PA进行分析。采用K-B纸片琼脂扩散法进行药敏分析。结果 标本主要来自呼吸科、神经外科、骨科、门诊部。检出标本分别为痰和支气管吸出物及咽拭子、创口分泌物、中段尿。易感因素有高龄、疾病、长期应用抗菌药物。57株PA中有40株 (70.2%) 为多重耐药菌株。结论 PA院内感染较常见, 临床应予以防治。

关键词：铜绿假单胞菌,院内感染,药敏试验

参考文献

[1]景莉, 范开华, 蒋燕, 等.铜绿假单胞菌医院感染38例细菌耐药率与抗菌药物应用分析[J].中日友好医院学报, 2010, 24 (6) :343-346.

[2]施凯舜, 潘发愤.铜绿假单胞菌耐药研究进展[J].浙江医学, 2008, 30 (2) :199-201.

肺部铜绿假单胞菌 第8篇

关键词：铜绿假单胞菌制剂,胃肿瘤,MKN45

1 材料与方法

1.1 材料

铜绿假单胞菌制剂 (上海合睦佳医药科技有限公司) , MKN45高转移性胃腺癌细胞系 (北京大学临床肿瘤学院病因室邓大君教授馈赠) , Transwell侵袭小杯 (Corning Incorporated, Costar) , RPMI-1640 (GIBCO BRL Co., U.S.A) , 胰蛋白酶 (Tyrosine, Sigma Co., U.S.A) , 新生小牛血清 (Newborn calf serum, Hyclone Co., U.S.A) , RNase A (华美公司) , Argrose LMP (Promega Co.) , 青霉素 (Penicillin, 中国山东济南齐鲁制药厂) , 链霉素 (Streptomycin, 华北制药股份有限公司) , 酶标仪 (BioRad公司) , CO2孵箱 (日本HITACHI公司) , 倒置及普通显微镜 (日本Olympus公司) 。

2统计学方法

利用SPSS 13.0统计学软件包对所得实验数据进行均数±标准差 (x-±SD) 计算, 并进行t检验。

1.3 方法

1.3.1 流式细胞仪检测铜绿假单胞菌制剂对MKN45细胞细胞系细胞周期的影响

将进入对数生长期的MKN45细胞, 按每1106细胞加铜绿假单胞菌制剂 (1.6～2.0) 109的剂量处理24～48h[1]。常规收获细胞于1.5mLEP管中, 1000rpm离心10min收集细胞, 用冰预冷的PBS洗2次, 加入1mL预冷的70%乙醇, 于4℃固定过夜, 离心收集细胞, 以PBS洗细胞沉淀。加入200μLRNaseA (1mg/mL) , 37℃水浴30min。再加入800μLPI染色液 (50μg/mL) , 混匀, 至4℃避光30min。以标准程序用FACS (Becton-Dickinson, USA) 检测[4], 记录激发波长488nm处的红色荧光, 结果用细胞周期拟合软件进行分析。

1.3.2 软琼脂集落形成实验观察铜绿假单胞菌制剂对MKN45细胞系恶性程度的影响

在1106 MKN45细胞中加入铜绿假单胞菌制剂1支 (1.6～2.0) 109) 作用24h后, 常规收获细胞备用。利用0.6%的琼脂作为底层支持层, 上层用0.35%的琼脂作为培养介质, 血清浓度为10%。每孔接种500个上述待测细胞, 每种细胞设3个平行孔, 置于37℃孵箱培养2～3周时间, 肉眼可见集落形成, 在倒置显微镜下观察集落大小及数量[2]。计数细胞集落数并计算各种细胞的集落形成率 (集落形成率=形成的克隆数/接种细胞数500个细胞) , 并进行统计学分析, 由此来判断细胞的恶性表型[3]。

1.3.3 细胞侵袭实验检测铜绿假单胞菌制剂对MKN45细胞系侵袭能力的影响

细胞培养至对数生长期, 分别在1106 MKN45细胞中加入铜绿假单胞菌制剂 (1.6～2.0) 109、 (1.6～2.0) 108、 (1.6～2.0) 107作用24h后, 消化计数1105个细胞加入侵袭小杯。将400mLRPMI1640+0.1%BSA/孔加到24孔板中, 将侵袭小杯放入。在37℃5%CO2条件下培养16h, 取出侵袭小杯, 以PBS轻轻冲洗后, 用棉花棒轻轻擦去杯底膜上层的细胞, 膜下层的细胞为穿过膜的细胞, 以95%乙醇固定细胞10min, 以0.2%结晶紫染色20min, PBS冲洗, 风干镜检, 倒置显微镜下随机选择6个视野计数, 照相, 结果进行统计学分析。

A:对照组B:铜绿假单胞菌制剂 (1.6～2.0) 107组C:铜绿假单胞菌制剂 (1.6～2.0) 108组D:铜绿假单胞菌制剂 (1.6～2.0) 109组

2 结果

2.1 流式细胞仪

实验组处于G0/G1期的细胞明显增加, 由46.043%上升到54.822%, 而S期和G2/M期细胞减少, P<0.05, 有显著性差异.提示:铜绿假单胞菌制剂抑制了MKN45细胞的增殖, 阻滞其从G1期到S期的演进。

2.2 软琼脂集落形成实验

实验组形成的集落体积仅为对照组的1/3 (图1) 。对照组、实验组细胞集落形成率分别为:4.7%和2.0%, P<0.05, 有显著性差异, 说明铜绿假单胞菌制剂降低了MKN45细胞的恶性程度。

2.3 细胞侵袭实验

侵袭作用16h后, 铜绿假单胞菌制剂 (1.6～2.0) 107组与对照组穿过基膜的细胞数每100倍视野分别为3.333和20.167, 前者比后者减少了80%以上 (图2) 。

3 讨论

本研究分别从3个方面探讨了铜绿假单胞菌制剂对胃腺癌细胞的作用原理, 综合文献及本实验结果, 铜绿假单胞菌制剂可抑制MKN45细胞的增殖, 明显抑制MKN45细胞的侵袭转移能力, 降低了MKN45细胞的恶性程度, 认为铜绿假单胞菌制剂是较合适的腹腔免疫化疗生物制剂, 在腹腔免疫化疗过程中, 铜绿假单胞菌制剂和化疗药物可以充分发挥各自优势, 相互补充, 起到协同增效作用。相信将来联合铜绿假单胞菌制剂的腹腔免疫化疗将在治疗胃癌腹水, 腹腔脱落癌细胞及腹腔微转移等方面发挥重要作用。

参考文献

[1]宋希双, 姜涛, 吴东军, 等.PA菌毛株菌苗膀胱灌注预防膀胱癌术后复发的研究[J].中华泌尿外科杂志, 2001, 22 (10) :597～600.

[2]张继锋, 笪美玲, 高国谦.绿慕安腔内注射治疗恶性胸水32例报告[J].河南肿瘤学杂志, 2000, 13 (6) :465～466.

[3]孙文平, 付红文, 刘妮, 等.PA-MSHA菌毛株疫苗对三种癌症患者免疫疗效的临床观察[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2000, 20 (4) :373～376.

肺部铜绿假单胞菌 第9篇

1 资料与方法

1.1 入选标准

观察对象为首都医科大学宣武医院与北京市垂杨柳医院肠道门诊2011年4月1日~2013年10月31日两个肠道季的门诊就诊患者, 所有患者均≥14岁, 并排除慢性腹泻及复诊患者。所有患者均行血常规和粪便检查。将随机抽样的1311例大便标本送至区疾病预防控制中心 (CDC) 进行进一步病原菌检测。

1.2 感染性腹泻和细菌性痢疾的临床诊断标准

参照《感染性腹泻诊断标准及处理原则》 (GB17012-1997) 和《细菌性痢疾、阿米巴痢疾诊断标准及处理原则》 (GB16002-1995) , 有 (或无) 流行病学史、有急性腹泻的临床症状, 并伴大便镜检≥1个白细胞和 (或) 红细胞, 即可临床诊断为除霍乱、细菌性痢疾和阿米巴痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻。有 (或无) 流行病学史、有急性腹泻的临床症状, 粪便常规检查白细胞或脓细胞≥15/HPF (400倍) , 并可见红细胞, 即可临床诊断为细菌性痢疾。上述两种疾病的诊断尚须排除其它非感染性因素所致的大便有形成分的改变, 如大肠癌、溃疡性结肠炎、放射性肠炎等。

1.3 检测方法

对所入选的1311例大便标本进行粪便培养, 并进行细菌学分型。每位患者留取1份粪便标本约5ml, 4℃冰箱保存, 48小时内送区CDC检测。主要检测的病原菌为霍乱弧菌、志贺菌属、沙门菌、大肠埃希菌、副溶血弧菌、单胞菌等。

1.4 铜绿假单胞菌的鉴定方法

常规方法进行细菌培养, 可疑菌落的鉴定方法采用VITEK2全自动微生物分析仪, GN鉴定卡片在有效期内。

1.5 统计学方法

应用SPSS17.0统计软件, 计量资料以 (±s) 表示, 计数资料以率表示。

2 结果

2.1 病原检测结果

1311例便标本的细菌培养阳性率为30.4% (399/1311) , 共培养出444种细菌, 其中42例标本有两种细菌感染, 占3.2%, 2例标本培养出三种细菌, 占0.1%。1311例便标本中阳性率最高的前三种细菌分别为副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌, 感染率分别为5.3% (70/1311) 、5.1% (67/1311) 和3.1% (40/1311) ;其次为铜绿假单胞菌和致病大肠埃希菌, 分别为2.7% (36/1311) 和1.5% (20/1311) 。铜绿假单胞菌占检出细菌数的8.1% (36/444) 。

2.2 铜绿假单胞菌感染患者的临床特点

2.2.1 一般特点

36例患者中, 男12例, 女24例, 男女比例1∶2, 年龄14~85岁, 平均年龄 (40.2±16.4) 岁。职业:学生5例, 干部及职员6例, 退休10例, 其他无固定职业15例。31例均为本市常住人口, 5例为临时来京人员。在4~10月份腹泻季节里, 均培养出铜绿假单胞菌, 阳性数分别为6例、5例、7例、5例、4例、4例和5例。患者发病后2~72小时就诊, 平均 (39.2±22.5) 小时就诊。在36例患者中, 除2例有糖尿病、1例有冠心病外, 其他均无基础疾病。72.2% (26例) 患者无任何不洁饮食史, 6例患者曾食海鲜, 4例患者有进食剩饭菜史。所有患者就诊前均未使用抗生素及益生菌类药物。

2.2.2 临床特点

在36例铜绿假单胞菌腹泻患者中, 约1/3的患者除腹泻外, 没有任何其他临床症状。绝大多数 (86.1%, 31例) 患者无发热, 只有13.9% (5例) 的患者有低热 (最高腋下体温38.5℃) 。约一半的患者 (47.2%, 17例) 有腹痛。大多数患者 (86.1%, 31例) 大便次数>3次/天, 一半 (47.2%, 17例) 的患者为水样便, 不到一半 (41.7%, 15例) 的患者伴呕吐。多数患者 (61.7%, 24例) 白细胞正常, 不到1/3 (27.8%, 10例) 的患者白细胞增高, 个别 (5.6%, 2例) 患者白细胞降低。多数患者 (72.2%, 26例) 大便中无红白细胞。

便培养为铜绿假单胞菌感染的患者, 临床诊断细菌性痢疾6例, 感染性肠炎8例, 其他22例。治疗中使用抗生素15例, 9例输注抗生素, 6例为口服抗生素;其他21例未用抗生素。

3 讨论

假单胞菌广泛分布于土壤、淡水、海水及生物体中, 为革兰阴性杆菌, 其模式种为铜绿假单胞菌, 该属细菌为条件致病菌, 是医院获得性感染重要的致病菌[3]。随着抗菌药物在临床的广泛使用, 铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药性有日益增高的趋势, 给临床治疗带来巨大挑战[4~6]。血液系统、呼吸系统和尿道是最常见的感染部位, 但铜绿假单胞菌也可在消化道任何部位产生病变, 常见于婴幼儿以及肿瘤化疗致粒细胞低下的免疫缺损者, 可引起婴幼儿腹泻[7~9]及成人盲肠炎或直肠脓肿, 消化道铜绿假单胞菌感染亦是败血症的重要入侵门户之一[10]。

虽然早在1918年就有报道, 以发热、腹泻和休克为主要表现的“上海热”是与明确的铜绿假单胞菌感染脓毒血症有关的社区获得性肠炎[7]。但铜绿假单胞菌导致成人社区获得性肠炎的报道并不多见。

人体肠道虽可有铜绿假单胞菌的存在, 但在健康人或非肠道感染者中, 作大便细菌培养时, 偶可见到培养基上有个别该菌菌落生长, 而主要为大肠埃希菌菌落生长。当人机体抵抗力低下时, 肠道可感染该菌而发病, 此时肠道原有正常菌群被抑制, 生物屏障遭到破坏, 该菌即成为致泻的病原菌, 在肠道菌的培养基上可见该菌呈单一的纯培养或优势生长。但从本研究可以看出, 在社区获得性腹泻的成人标本中, 铜绿假单胞菌感染并不少见, 在所有细菌中占8.1% (36/444) , 这部分患者, 症状多不严重、无明显基础疾病, 1/3的患者除腹泻外, 可以没有任何其他临床症状。尽管如此, 铜绿假单胞菌的肠道感染, 也应引起广大医务人员的注意, 以免引起患者进一步的脓毒血症。

参考文献

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肺部铜绿假单胞菌 第10篇

1 Exo S蛋白功能区

Exo S是1978年首次从铜绿假单胞菌菌株388的培养上清液中纯化得到的48 ku蛋白,由453个氨基酸残基组成,有5个主要功能区,图1[4]。氨基端起始的15个氨基酸残基构成分泌域(secretion domain,S);15~51位氨基酸构成分子伴侣结合域(chaperone binding domain,CBD);52~77位氨基酸是膜定位区(membrane localization domain,MLD),指导Exo S与宿主细胞膜结合;96~232位氨基酸是Rho因子-GTP酶活化蛋白(GTPase-activating protein,GAP)活性区,其中精氨酸(Arg)146位氨基酸是发挥酶活性的关键序列;233~453位氨基酸是ADP核糖基转移酶(ADP-ribosyltransferase,ADPRT)活性区,谷氨酸(Glu)379和Glu381是发挥ADPRT活性的关键氨基酸;位于ADPRT活性区的418~429位氨基酸构成蛋白活化因子结合位点(factor activating exoenzyme S,FAS),现已知FAS是一种14-3-3蛋白,在真核生物中普遍存在的一类高度保守的调节蛋白,与多种细胞进程有关,如有丝分裂、细胞周期调控、凋亡,通过对Beclinl信号通路的调节,激活宿主细胞凋亡和自噬[5],是Exo S发挥生物学活性必需的真核细胞辅助因子。

2 Exo S蛋白的调控

Exo S蛋白分泌受exo S基因控制,宿主细胞及环境变化是诱导基因表达的关键因素。自然环境中分离的铜绿假单胞菌exo S基因携带率高于临床菌株,分泌的Exo S蛋白ADPRT活性亦显著高于临床菌株,推测Exo S可能是铜绿假单胞菌适应外界环境的结果,进入人体后环境条件改变致使基因缺失或表达抑制[6]。基于Exo S的主要功能是通过破坏肌动蛋白骨架重排发挥毒性作用,M.Cisz等[7]利用细胞松弛素D和放线菌酮预先处理细胞、破坏肌动蛋白骨架,结果表明,两者均不能影响exo S基因表达,而成孔毒素(如链球菌溶素O、α毒素)则能阻止T3SS启动,进而影响蛋白分泌,说明exo S基因的诱导表达与细胞内蛋白变化无关,而与宿主细胞膜的完整性密切相关。进一步采用钙离子载体(卡西霉素)试验证实,exo S基因表达水平亦不受宿主细胞液低钙环境影响,说明接触依赖性exo S基因启动的关键因素是宿主细胞膜的完整性。另外,Exo S蛋白能负反馈调节其自身分泌效应。铜绿假单胞菌黏附至细胞表面后,T3SS启动,向宿主细胞靶向输送Exo S蛋白,继续接触则Exo S蛋白通过GAP和ADPRT活性调节蛋白转位,以自我调节方式下调exo S基因表达,阻止蛋白质的进一步分泌,可能是细菌的一种防止过度损伤的自我保护机制。牟锐等[8]利用Real-time PCR技术检测铜绿假单胞菌pfm基因(利用Mu转座技术筛选出的与铜绿假单胞菌泳动能力相关基因)在转录水平上对exo S的影响,结果发现,pfm突变株exo S基因表达水平与野生型相比降低6.2倍,菌体内exo S量明显降低,补充pfm后表达恢复正常,推测可能是pfm突变导致代谢紊乱。梁海华等[9]研究发现,影响铜绿假单胞菌群体感应系统的pmpR和pqsR基因能够调控exo S基因表达,exo S基因在pmpR和pqsR突变体中与野生型菌株相比表达水平明显升高,但其机制尚未明确,推测可能是一种间接调控。Exo S蛋白与exo S基因的表达调控是一个极其复杂的过程,涉及众多的基因及信号通路,是未来研究中需重点关注的领域。

3 Exo S蛋白的分子伴侣

T3SS分子伴侣是一类酸性小分子,不同的分子伴侣具有类似的结构,已知分子伴侣的晶体结构都是同型二聚体,没有ATP结合和水解活性,与ATP依赖的分子伴侣没有相似性[10]。分子伴侣的功能仍不完全清楚,可能通过阻止相应底物自身或与其他胞内蛋白结合而发挥稳定底物的作用,防止底物降解,使底物处于恰当的分泌状态。Exo S和Exo T拥有共同的分子伴侣Spc S,是维持分泌前和分泌时稳定性所必需的。目前,已鉴定的Spc S是由Orf1基因编码的分子质量13.1 ku、等电点5.04的酸性小蛋白分子,有与Spc U相似的保守亮氨酸富集基序,与耶尔森菌属T3SS分子伴侣Syc E有44%的氨基酸相同,属于Ⅰ类伴侣分子。Orf1基因缺陷株Exo S分泌量显著减少,菌体内Exo S高浓度积聚,补充Orf1后分泌恢复,推测Orf1的主要作用是在Exo S的分泌过程中维持其稳定性,使胞内Exo S分子处于优先分泌的竞争状态[11]。

4 Exo S蛋白的生物学作用与致病机制

4.1 诱导促炎因子和趋化因子转录

Exo S可以通过接触依赖性在细胞内发挥细胞毒作用,也可以以可溶性蛋白的形式(接触非依赖性)在胞外发挥毒性作用。胞外Exo S具有T淋巴细胞丝裂原作用,促进T淋巴细胞有丝分裂,诱导大量T淋巴细胞活化,这种作用与ADPRT活性无关,活化的T淋巴细胞易发生凋亡。用无ADPRT活性的Exo S/DG和有ADPRT活性的重组Exo S(r Exo S)刺激外周血单个核细胞,结果发现,二者均能强烈诱导促炎因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和趋化因子IP-10、I309、MIP-1β、MIP-1α的转录表达(mRNA水平),进而募集中性粒细胞、单核细胞和T淋巴细胞至感染部位,细胞浸润导致感染组织发生免疫炎症反应损伤[12]。研究显示,Exo S也能利用羧基端的TLR2和N端的TLR4通过My D88依赖途径活化巨噬细胞,诱导IL-1β分泌,加重局部炎症,介导组织损伤[13]。

4.2 结合FXYD3抑制Na-K ATP酶活性

FXYD3是小分子单跨膜蛋白FXYD家族成员之一,广泛分布于哺乳动物的多种组织细胞中,具有离子通道调节作用,与Na-K ATP酶活性密切相关。GST拉下试验(GST pulldown assay)证实,Exo S蛋白与FXYD3跨膜区相互作用,导致FXYD3灭活,进而抑制Na-K ATP酶活性,破坏肠黏膜上皮细胞屏障中紧密连接蛋白(tight junctions,TJs)结构,使肠黏膜通透性增强,肠道感染铜绿假单胞菌更易突破黏膜屏障扩散入血,表现为更强的毒性作用和更高的致死率[14]。体外试验显示,exo S基因缺陷株穿透单层细胞的能力明显低于野生株(P<0.05),进一步研究发现,exo S基因缺陷株不能减少紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达,因而不能破坏TJs结构,阻止了细菌的进一步扩散[14]。由此可见,Exo S可以不依赖ADPRT活性,通过破坏TJs促进细菌的侵袭和扩散。

4.3 ADPRT活性

ADPRT活性是Exo S发挥毒性作用的最主要因素。Exo S的ADPRT靶蛋白范围广泛,包括亲环蛋白A、Ig G3、载脂蛋白A、波形蛋白和Ras-like GTP酶超家族成员。介导多种宿主蛋白(如Ras超家族蛋白)的ADP核糖基化,抑制DNA合成和细胞内吞作用,引起宿主细胞的信号传导过程失偶联,导致细胞变圆及细胞调亡样死亡。Exo S阳性菌株能募集更多的炎症细胞至感染部位,但ADPRT抵抗吞噬细胞吞噬使细菌逃避免疫细胞杀伤得以存活,导致局部严重的炎症反应,引起宿主组织继发性损伤及局部的免疫抑制反应[15]。角膜上皮细胞内吞细菌后,ADPRT活性能抑制吞噬小泡内的酸性环境,细菌可以在宿主浆膜小泡(plasma membrane bleb-niches)中生长繁殖,增强细菌的侵袭能力[16,17]。V.Hritonenko等[18]研究发现,铜绿假单胞菌的胞内繁殖能力取决于ADPRT活性,与T3SS转座蛋白无关。ADPRT活性的发挥需要真核辅助因子FAS的参与,FAS蛋白只存在于真核生物中,属于多功能的14-3-3蛋白,真核细胞辅助因子限制性是细菌的一种自我保护机制。J.Okuda等[19]研究发现,缺失14-3-3蛋白结合位点变异株分泌的Exo S(只有1~388位氨基酸)能够通过与人类支气管上皮细胞驱动蛋白超家族成员7(kinesin superfamily 7,KIF7)结合诱导细胞毒作用,说明真核细胞14-3-3蛋白是Exo S发挥ADPRT活性的重要因素,但不是唯一因素,应对Exo S作用的分子机制进行深入研究,进一步阐明铜绿假单胞菌的致病机制。

4.4 GAP活性

Exo S蛋白的GAP活性同Exo T蛋白的活性在生理、生化特性上完全相同,作用于真核细胞的小分子GTP酶Rho、Rac及Cdc42,导致宿主细胞肌动蛋白骨架被破坏,使宿主细胞变圆、脱落,并抑制细胞迁移、干扰吞噬作用。啤酒酵母生长抑制试验显示,AD-PRT缺陷株感染酵母细胞生长不受影响,GAP缺陷株感染酵母细胞生长受到明显抑制,说明与ADPRT相比GAP毒性较弱,在致病中起次要作用[20]。

Exo S阳性菌株具有较强侵袭力除以上原因外,尚有证据显示[21]与铜绿假单胞菌的Ⅳ型鞭毛(TFP)有关,缺少TFP的菌株不能穿透上皮细胞,致病力减弱。

5 针对Exo S的治疗策略

Exo S作为铜绿假单胞菌与宿主相互作用过程中的关键致病因子,对铜绿假单胞菌的成功感染和致病具有重要作用,这一重要性使得毒性蛋白成为颇具前景的新药靶点。在鼠肺炎模型试验中,抑制ADPRT活性或增强中性粒细胞和巨噬细胞吞噬活性是治疗铜绿假单胞菌肺炎的有效策略。S.Bouillot等[22]研究发现,在人类内皮细胞中提高c AMP浓度的物质[如福司考林(forskolin,FSK)、前列腺素E2(PGE2)、沙美特罗(salmeterol)等]通过激活EPAC/Rap1信号通路,能有效减少由Exo S导致的细胞皱缩及细胞屏障破坏、通透性增强,避免细菌穿过血管内皮细胞,发生血行性播散。张成芳等[23]在化合物MBX1641基础上设计了20种α苯氧基酰胺新衍生物,结果表明,有5种新衍生物对铜绿假单胞菌的exo S基因表达具有明显抑制作用,其中N-(2-吡啶基甲基)-2-(2,4-二氯苯氧)-丁酰胺(5r)的活性强于已知的抑制剂MBX1641,并具有很好的水溶性,为耐药性铜绿假单胞菌的治疗提供了有益信息。

6 结语

铜绿假单胞菌是一种世界范围的重要条件致病菌,在免疫功能低下患者常引起致死性感染,加之耐药问题日趋严重,寻找新的、有效的作用靶位成为治疗感染的新方向。Exo S作为铜绿假单胞菌的重要致病因子,通过对其作用机制的探讨,有望为抗感染治疗药物的筛选提供参考依据。目前,对Exo S的研究虽然取得一定进展,但有关Exo S分泌及基因表达调控的详细机制尚未完全阐明,除14-3-3蛋白外是否还存在其他真核细胞辅助因子,是否可以通过控制分子伴侣抑制Exo S分泌等问题尚待进一步研究。

摘要：ExoS是铜绿假单胞菌通过Ⅲ型分泌系统靶向输入真核细胞的毒性蛋白之一,该蛋白有助于细菌进入宿主细胞,逃避机体免疫系统的攻击,并抑制细胞分裂、导致细胞凋亡,在铜绿假单胞菌的致病机制中发挥重要作用。文章对近年来有关ExoS蛋白的研究做一简要综述,为难治性铜绿假单胞菌感染治疗提供理论依据。