大肠杆菌血清型

大肠杆菌血清型（精选8篇）

大肠杆菌血清型 第1篇

1 病料采集

鸡大肠杆菌病主要临诊表现有脐炎型、急性败血型、气囊炎型、全眼球炎型、卵黄性腹膜炎型。败血症型在临床上主要表现为纤维素性的心包炎、纤维素性的肝周炎、纤维素性的腹膜炎, 临诊类型比较典型, 且发病率较高, 为此本实验采集的病料多为败血型的鸡大肠杆菌病料。

2 分离菌株的形态染色特征和培养特性

2.1 形态及染色特征

大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢的直杆菌, 大小为2~3μm0.4~0.7μm, 两端钝圆, 散在或成对, 通常无可见荚膜, 碱性染料对本菌有良好着色性, 菌体两端偶尔略深染。

2.2 培养特性

本菌为需氧兼性厌氧菌。在普通培养基上生长良好, 最适生长温度37℃, 最适生长p H值为7.2~7.4。在肉汤培养基中培养18~24h, 呈均匀浑浊, 管底有少许黏液状沉淀, 液面与管壁可形成菌膜;在营养琼脂培养基上生长24h后, 形成直径2~3mm, 圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色、边缘整齐的菌落;在麦康凯琼脂上形成红色菌落;在伊红美蓝琼脂上产生紫黑色带金属闪光的菌落;在SS琼脂平板上多不生长或生长较差, 少数生长者因分解乳糖产酸, 使中性红指示剂变为红色, 出现粉红色菌落;一些致病性菌株在绵羊血平板上呈β溶血。在中国蓝平板上, 形成蓝绿色菌落, 中心为深蓝色;在远藤氏琼脂平板上, 形成有金属光泽的深红色菌落。

3 鸡致病性大肠杆菌的分离与鉴定结果

分离培养出17株大肠杆菌疑似菌株, 生化试验鉴定结果表明, 分离菌株试验结果如下:发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇, 对蔗糖的发酵因菌株而异, 吲哚试验、MR试验阳性, VP试验、柠檬酸盐试验阴性, 不产生硫化氢。综合分析, 这些分离株均为大肠杆菌。

4 鸡大肠杆菌的血清学鉴定结果

将17株分离菌分别进行血清鉴定。结果说明:17个分离株中测定出15个分离的血清型, 鉴定出5种血清型即O18、O15、O8、O78、O35, 其中O35血清型, 共6株, 占定型菌株的40%;O18血清型共5株, 占定型菌株的33.3%.因此可以认定O35型、O18型为主要流行血清型。

5 讨论

5.1 鸡大肠杆菌病概述

鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌的某些血清型菌株引起一类传染病的总称, 主要临诊表现有脐炎型、急性败血型、气囊炎型、全眼球炎型、卵黄性腹膜炎型。各品种和年龄鸡均可发生。

5.2 大肠杆菌病增多的原因

大肠杆菌广泛地存在于自然界以及饲料、饮水中, 细菌可通过消化道、呼吸道、接触等多种途径传播。除此以外, 随着养鸡业的发展, 一些新问题也成为疾病增多的原因。诸如, 生产的不配套、种鸡场的失控、病死鸡的环境污染、饲料;病毒病的感染;免疫接种方式;投药方式;饲养管理不善等都为大肠杆菌病的发生与流行创造了有利条件。

5.3 不同鸡场或区县大肠杆菌血清型有所差异

结果辨明, 同一鸡场或区县大肠杆菌血清型大多相同, 但也存在多个致病血清型;不同鸡场或区县大肠杆菌血清型有所差异。此试验为使这些血清型菌株制备疫苗, 为我区预防和控制本病提供了可能。

5.4 大肠杆菌病的致病因素及预防措施

目前大型集约化鸡厂普遍采用的笼养方式.因其饲养密度过大、采光不足、缺少运动、环境卫生及饲养管理不善等因素, 常可导致机体抵抗力下降、肠道正常菌群的微生态平衡被破坏、致使细菌大量繁殖而发病。

平时要加强饲养管理, 搞好鸡舍及周围环境卫生以减少应激因素。对鸡舍及污染场地进行清理消毒;适时免疫接种;发病时及时采取隔措施, 加强对鸡舍的消毒。

6 结论

6.1 本试验利用传统细菌分离、培养技术分离到17株鸡大肠杆菌。

6.2 通过血清型鉴定, 17株大肠杆菌中的15株分别属于O18、O15、O8、O78、O35, 其中O35血清型, 共6株, O18血清型共5株, 有两株未鉴定出血清型。

大肠杆菌血清型 第2篇

关键词：鸭疫里默氏杆菌；血清型；致病性

中图分类号： S858.322.61文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0166-02

收稿日期：2013-05-17

基金项目：河南省科技攻关项目（编号：122102110022）。

作者简介：焦凤超（1979—），男，河南西平人，硕士，讲师，从事病原微生物与免疫学研究。E-mail：fengchaojiao@163.com。鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）引起鸭、鹅、火鸡以及其他鸟类的一种接触传染病[1]，别称鸭传染性浆膜炎，主要侵害2～8周龄的雏鸭，呈急性或慢性败血症，其特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎，也可能发生无任何临床症状的呼吸道感染，发病率5%～90%，死亡率高达90%[2]。由于该菌血清型众多，各血清型间无交叉保护作用且存在地域差异，所以导致目前疫苗的免疫预防效果不是十分理想。本研究通过对河南省信阳市部分地区疑似鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定和血清型分析，以期为该地区鸭疫里默氏杆菌病的免疫预防提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料病料取自河南省信阳市送检的10份鸭疫里默氏杆菌病疑似病例的脑、心血、肝、脾等组织。

1.1.2菌株及阳性血清鸭疫里默氏杆菌1、2型菌株和标准血清由华中农业大学赠送。

1.1.3主要培养基麦康凯琼脂、TSA、TSB等培养基购自浙江杭州天和微生物试剂有限公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.4细菌微量生化管细菌微量生化管购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.5试验动物试验用健康樱桃谷肉雏鸭购自河南华英集团公司。

1.2方法

1.2.1病原菌分离无菌采集病死鸭的脑、心血、肝脏等病料，划线接种到TSA（含5%小牛血清）培养基和麦康凯培养基上，置于烛缸内37 ℃培养24 h，观察细菌的生长情况。在TSA培养基上生长而不能在麦康凯培养基上生长的菌落为可疑鸭疫里默氏杆菌，挑取单菌落在TSA（含5%小牛血清）培养基上进行纯化培养，待进一步鉴定[3]。

1.2.2病原菌染色镜检挑取TSA平板上单个可疑菌落，进行革兰氏和瑞氏染色，镜检观察形态。

1.2.3生化试验按程安春等的方法[4]采用微量发酵管（添加10%小牛血清）进行常规生化试验。

1.2.4病原菌血清学鉴定参照程安春等的方法[5]，将分离的病原菌株纯培养物进行平板凝集试验：在干净载玻片中央滴加纯化水1滴，用接种环蘸取经过离心洗涤的分离菌少许，与纯化水混匀，滴加未稀释的阳性血清1滴。将载玻片反复振荡或用接种环涂开，注意观察结果。几秒钟后出现清晰的乳白色絮状凝集块者即判定为阳性反应。阳性反应者须重复3次上述操作以减少假阳性。

1.2.5人工感染试验将确定血清型的分离菌纯化后，分别接种于加有5%小牛血清的TSB液体培养基上，37 ℃振荡培养24 h后进行纯粹性检验、细菌比浊计数，活菌含量约为 10亿CFU/mL。取未免疫过鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的14日龄健康樱桃谷鸭作为试验对象（每组10羽）。试验组以分离菌纯培养物0.1 mL/羽接种，含菌数为1亿CFU，第7组为对照组，接种等量的生理盐水。接种后观察10 d，记录发病和死亡情况[6]。

2结果与分析

2.1细菌分離结果

试验表明，从10例鸭疫里默氏杆菌病疑似病例的脑、心血、肝、脾等组织中分离出6株疑似菌株，依次命名为XY1、XY2、XY3、XY4、XY5、XY6。6株鸭疫里默氏杆菌分离株均呈革兰阴性、不运动、无芽孢、单个或成双存在、偶见长丝状的短小杆菌，瑞氏染色呈两极浓染，符合鸭疫里默氏杆菌的形态特征。

2.2生化试验结果

分离菌均不发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇等碳水化合物，靛基质试验、甲基红试验、尿素酶试验、硝酸盐还原试验均为阴性，不产生硫化氢、液化明胶、过氧化氢酶阳性。基本符合鸭疫里默氏杆菌的生化特性。

2.3血清型鉴定结果

将分离到的6株细菌分别与标准阳性血清进行平板凝集试验，结果表明XY1、XY3均与抗鸭疫里默氏杆菌2型阳性血清发生凝集反应；XY2与抗鸭疫里默氏杆菌1型阳性血清发生凝集反应；XY4、XY5、XY6未定型。

2.4人工感染试验结果

试验组樱桃谷雏鸭接菌24 h后开始出现精神沉郁、行动迟缓、 排绿色稀粪、共济失调等症状，3～5 d全部发病死亡。剖检死鸭发现，其患有或轻或重的纤维素性心包炎、气囊炎、肝周炎；并对死鸭进行细菌分离，结果重新分离到接种菌，并能凝集相应血清型的鸭疫里默氏杆菌。对照雏鸭均健存。

3结论与讨论

目前鸭疫里默氏杆菌已呈全球性分布[7]。2002年前，学者普遍认为鸭疫里默氏杆菌有21个血清型。2003年程安春等提出4个新的血清型存在，命名为22～25型[4]。2006年张大丙等提出血清10型还存在4个亚型，并鉴定出1个变异株以及2个可能的新型菌株[8]。因此鸭疫里默氏杆菌实际存在的血清型可能更复杂，且各血清型间的交叉保护性不强[9-12]。本研究参照程安春等介绍的平板凝集方法[5]共分离鉴定出6株鸭疫里默氏杆菌，其中3株为血清1型或血清2型，另外3株未定型，说明信阳市鸭群存在包括血清1型和血清2型在内的多种血清型感染。由于采集病料和标准菌株、标准血清的局限，其他流行的血清型有待进一步分离和鉴定。

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由于该菌血清型众多，且各地区流行的鸭疫里默氏杆菌优势血清型存在差异，使疫苗免疫预防效果不尽如人意，因此许多养殖户纷纷放弃了疫苗转而依靠使用药物防治该病发生，从而导致了兽药滥用、养殖成本增加以及耐药菌株不断增多，给食品安全带来了很大的隐患。因此，选择适合当地血清型的鸭疫里默氏杆菌菌苗或进行自家疫苗的研制是防治该病的关键。发病鸭群采用药物治疗时也应根据本场分离菌株的药敏试验结果，选择高敏药物，避免超量或滥用抗生素，以减少耐药菌株的产生，降低食品药物残留的风险。

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大肠杆菌血清型 第3篇

1 材料

1.1 粪样

试验选择内蒙古呼和浩特地区28头患临床型乳房炎的中国荷斯坦泌乳奶牛, 直接从肛门采集新鲜粪便。

1.2 培养基

普通营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红-美蓝 (EMB) 琼脂、SS琼脂、营养肉汤、生化鉴定管等, 均购自广东环凯生物科技有限公司;大肠杆菌O抗原定型血清, 购自中国兽医药品监察所。

1.3 试验动物

体重为18～26 g的健康小白鼠, 内蒙古大学实验动物研究中心提供。

2 方法

2.1 粪样的采集

用一次性无菌橡胶手套直接从28头中国荷斯坦泌乳奶牛肛门采集直肠新鲜粪样100 g, 分别装入无菌处理的采样瓶中, 立即封闭瓶口, 送至实验室, 4 ℃保存, 待分离与鉴定。

2.2 细菌的分离与纯化培养

将粪样接种于伊红-美蓝琼脂培养基上, 置37 ℃培养24 h;再将可疑菌落分别接种伊红-美蓝琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、普通营养琼脂培养基, 37 ℃纯化培养24 h, 观察菌落形态特征。挑取典型菌落涂片、革兰染色、镜检。将所得纯培养物置营养琼脂斜面4 ℃保存, 备用。

2.3 分离菌的生化鉴定试验

将所得纯化细菌的24 h肉汤培养物按生化鉴定管使用说明书进行鉴定。

2.4 分离菌的血清型鉴定

采用玻板凝集试验方法进行血清型鉴定。

2.5 动物试验

取纯化细菌的37 ℃、24 h肉汤培养物经腹腔给小白鼠注射, 0.5 mL/只, 每种细菌做2个重复及生理盐水对照, 观察24 h内的发病、死亡情况, 对死亡或发病明显者立即进行剖检, 取发病小白鼠的心脏、肝脏组织涂片、镜检, 若与注入细菌相同, 则判定此菌为病原菌。未见发病的小白鼠继续观察1周。

3 结果与分析

3.1 培养及染色特性

从28头试验牛粪样中共分离出28株细菌, 经革兰染色、镜检可见两端钝圆、散在或成对存在的革兰阴性直杆菌, 无芽孢, 无荚膜;在伊红-美蓝琼脂上长出黑色、带金属光泽的菌落;在麦康凯琼脂上形成红色菌落;在普通营养琼脂上生长良好;在SS琼脂上不生长;使营养肉汤出现混浊现象, 管底有沉淀。

3.2 生化鉴定 (结果见表1)

3.3 血清型试验

从28头试验牛的粪样中共分离到28株分离菌, 其中2株有自凝现象, 7株未定型, 其余19株的分型结果见表2。

3.4 动物试验

接种分离菌12 h后, 小白鼠昏睡, 厌食, 被毛蓬松, 少数拉黄色稀便, 嘴、鼻流出黄色液体。半数以上的小白鼠于24～72 h死亡, 剖检死亡小白鼠可见腹腔内含有大量血斑及臭味的黏性、黄绿色或橙黄色渗出物, 肾脏、脾脏肿大。而未死亡的小白鼠均表现出不同程度的发病。对照组小白鼠均正常。从以上发病或死亡小白鼠的脾脏、肝脏和心脏等部位均能分离到原接种细菌。

4 讨论

在引起奶牛乳房炎的所有细菌中, 由金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌引起的病例占所有病例的90%左右[4]。而在集约化奶牛场, 由大肠杆菌引起的病例也逐渐增多。试验从28头患临床型乳房炎奶牛粪样中均分离出了病原性大肠杆菌, 其检出率为100%。动物试验结果表明, 所分离到的大肠杆菌均有较强的致病力。

奶牛乳房炎大肠杆菌血清型较复杂, 试验中已定型的有19株, 包含46种血清型, 其中血清型O51、O55、O127、O7、O91、O101、O112、O92、O142等较多, 为该地区致病性大肠杆菌的优势血清型。在国内外报道的致病性大肠杆菌血清型中, O78、O1、O35、O2 等4种血清型为优势血清型[4], 而本试验中鉴定出的O35血清型占定型菌株的21.05%, 其余均未检出。因此, 不同地区奶牛大肠杆菌血清型分布差异较大, 故弄清该地区致病性大肠杆菌的血清型对有效防治大肠杆菌引起的疾病有着重要作用。在血清型鉴定过程中, 发现有的菌株与多种单因子血清有凝集反应, 表现出多种血清型, 这可能是由大肠杆菌菌株表面存在多种抗原而引起的。

奶牛乳房炎是大肠杆菌引起的奶牛疾病之一, 除此之外, 在集约化奶牛场, 大肠杆菌还会引起犊牛大肠杆菌病、奶牛子宫内膜炎、奶牛胎盘炎症、肢蹄病以及大肠杆菌病与牛附红细胞体病混合感染等等。大肠杆菌的致病性与其O抗原有关, 还与K抗原和所产的毒素有关, 它们均能通过质粒转移, 使致病血清型随着病原菌的流行不断变化, 从而使致病性血清型越来越多[5,6]。因此, 兽医工作者需要建立长期监测机制, 及时发现新致病型, 采取措施防止疾病的发生。

除此之外, 管理因素也极为重要。在本试验中, 大肠杆菌的检出率非常高, 提示了该地区奶牛场的饲养管理、挤奶卫生及消毒等均存在一定问题。大肠杆菌可通过环境传播来污染乳头, 导致乳房炎的发生。若环境卫生不良以及饲养管理不当, 大肠杆菌引起的不仅仅是奶牛乳房炎。

参考文献

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大肠杆菌血清型 第4篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例

对江苏省中部地区疑似大肠杆菌感染的病死猪有明显病变的肝脏、心脏、脾脏、肺脏等进行无菌采集413份病料, 同时收集死猪的相关资料, 进行相关信息统计。

1.1.2 培养基与制剂

普通肉汤自制, 麦糠凯琼脂、伊红美蓝琼脂等均购自杭州天和微生物试剂公司;吲哚试验、MR试验、VP试验等生化试验用试剂按常规方法配制;大肠杆菌O1~O163抗原标准血清;购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养

先将病料进行革兰染色并镜检。然后将病料接种于普通肉汤中, 37℃培养24 h。取出肉汤培养物分别接种于伊红美蓝培养基、麦康凯培养基和斜面培养基上进行培养, 观察细菌生长特点及菌落特征。

1.2.2 生化试验

将分离的菌株接种于葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖等微量糖发酵管中, 37℃培养24 h, 然后观察结果并详细记录。

1.2.3 血清型鉴定

按照中国兽医药品监察所提供的产品说明书进行操作, 所分离菌株首先经玻板凝集试验初步筛选出可能的O血清型, 然后通过玻板凝集试验确定其O血清型。即高压抗原和血清各取10μL在玻板上混匀, 0.5 min内出现明显0.5%石炭酸生理盐水凝集者为“阳性”反应。同时以高压抗原与0.5%石炭酸生理盐水混合作对照, 观察有无凝集现象。

1.2.4 动物试验

将分离鉴定的菌株接种到普通肉汤培养基上, 37℃培养18~24 h, 将菌液用生理盐水稀释5倍后颈部皮下接种20只3日龄海兰褐鸡, 每只0.2 m L (含菌量约2108cuf) 。设10只为对照组, 每只颈部皮下注射灭菌肉汤0.2 m L。隔离饲养, 观察1周。

1.2.5 毒力基因调查

按F.W.Sehofield[1]报道的方法对分离株的estⅠ (STa) 、estⅡ (STb) 、LT、Stx-2e毒素和毒力岛Intimin基因运用PCR方法进行鉴定。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果

在心脏、肝脏、脾脏及肠内容物中均能检测到红色、两端钝圆、大小中等、多数为单个散在, 有的为成对连接的革兰阴性菌。肉汤培养变浑浊, 底部有沉淀物;麦康凯培养基上出现红色圆形、光滑湿润的凸起菌落;伊红美蓝培养基上出现黑色带金属闪光的菌落;在斜面培养基上出现圆形菌落。

2.2 生化试验

分离的208株大肠杆菌生化试验结果均符合大肠杆菌科细菌生化鉴定特征, 能发酵葡萄糖、乳糖和蔗糖, 不能发酵肌糖、木糖, 能使麦芽糖、甘露醇产酸产气。吲哚试验和MR试验为阳性, VP试验和柠檬酸盐利用试验为阴性。

2.3 血清型鉴定

对分离鉴定的208株大肠杆菌进行血清型鉴定, 共鉴定出145株的血清型, 63株未能定型。定型菌株分别属于19种不同的血清型 (见表1) 。O9、O45、O107和O139为主要的血清型。

2.4 动物试验

大部分雏鸡在接种12 h后开始出现死亡, 48 h后全部死亡。剖解病死鸡, 其病理变化主要表现为胸腔内有大量的纤维素性渗出物, 心包炎, 肝脏呈土黄色、脾脏肿大、肠炎等大肠杆菌病的示病病变。无菌采集病死鸡脏器进行细菌学检测, 结果分离到与送检病例一致的大肠杆菌。

2.5 毒力基因的检测 (见表2)

从表2可以看出, 江苏中部地区猪大肠杆菌所含的毒力基因:含estⅠ的占39.2%, 含estⅡ的占64.8%, 含LT的占30.3%, 含Stx-2e的占20.6%, 含Intimin占15.9%。estⅠ和estⅡ较为流行, 含肠毒素estⅠ和/或estⅡ的细菌主要引发猪腹泻, 为临床治疗猪腹泻病时提供了参考价值。

3 讨论

大肠杆菌血清型众多, 国外报道的大肠杆菌血清型主要有O8、O9、O20、O64、O101、O138、O139、O141、O147、O149、O162等[2]。在本次调查的血清型中, O9、O45、O107和O139为江苏中部地区的优势血清型, 这和理论上猪大肠杆菌的血清型基本一致。另外尚有63株未能定型, 是否属于19种主要血清型之外或是新流行的血清型尚待研究。湖北省以O107、O101、O93、O9、O139、O141和O157为优势血清型[3];四川省以O141、O8、O2、O157、O9、O149血清型为主[4]。不同地区的血清型存在差异, 且同一地区的在不同流行时期血清型也不尽相同。因此, 在大肠杆菌的免疫预防中, 应充分考虑其血清型的多样性、易变性, 必须定期对养殖场的大肠杆菌进行分离鉴定, 选出血清型针对性较强的菌苗, 才能更有效地控制大肠杆菌病的发生。

对本次检测的血清型中毒力基因的种类、各毒力基因的致病作用及与血清型的关系进行了分析。江苏中部地区猪大肠杆菌的优势血清型为O9和O107。毒力基因调查结果显示, 88.9%的O9血清型含有estⅡ基因, 27.8%的菌株含有Stx-2e, 22.2%的菌株含有estⅠ, 11.1%的菌株含有Intimin, 52.2%的O107血清型含有estⅡ基因, 43.5%的菌株含有LT, 39.1%的菌株含有estⅠ, 34.8%的菌株含有Stx-2e。estⅠ和estⅡ基因与猪腹泻有关, Stx-2e基因与猪水肿病有关, 笔者分离的菌株中, 大部分携带上述毒力基因, 可以推测这些毒力基因对江苏中部地区猪大肠杆菌病的发生起着非常重要的作用。

大肠杆菌不同血清型的致病特点不一样, 本次检测通过对江苏中部地区猪大肠杆菌血清型与毒力基因的检测, 发现了与血清型有关的相关毒力基因之间的相关性及不同的血清型携带的毒力基因之间的关系。因此, 通过定期地对局部范围内的致病性大肠杆菌进行检测, 可以为该地区猪大肠杆菌病的防控提供理论指导。

参考文献

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锦州地区副猪嗜血杆菌血清型鉴定 第5篇

1 试验材料

1.1检验材料自2013年7月到2014年5月,从太和区、凌海、北镇、黑山、义县等地无菌操作采集疑似副猪嗜血杆菌病病死猪的血液、心包液、胸腹腔积水、淋巴结、肺脏等病料,共采集病料13份。

1.2参考菌株副猪嗜血杆菌参考菌株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供;金黄色葡萄球菌菌株和副猪嗜血杆菌标准血清型阳性血清由辽宁医学院微生物实验室制备保存。

1.3主要试剂加有20μg/m L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(北京希凯创新科技有限公司)和5%灭活新生牛血清的胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)(上海宝曼生物科技有限公司);葡萄糖、山梨醇、硫化氢、乳糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、尿素酶等细菌微量生化反应管以及靛基质、甲基红、V-P试剂盒均购自杭州天和微生物试剂有限公司;PCR Master Mix缓冲液购自北京全式金生物技术有限公司;引物由上海生工生物工程技术有限公司合成[1]。

2 试验方法

2.1分离培养将疑似副猪嗜血杆菌病猪的血液、心包液、胸腹腔积水、淋巴结、肺脏等病料进行细菌的分离培养,将病料经无菌操作划线接种于含NAD的TSA培养基上,在37℃条件下,并且有5%的CO2 培养箱中培养24 h。挑取培养后的副猪嗜血杆菌疑似菌落进行纯培养。

2.2生化试验用接种环挑取疑似副猪嗜血杆菌的纯培养单个菌落,接种于无菌的含NAD的葡萄糖、山梨醇、硫化氢、乳糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、尿素酶等生化培养基中,在37℃二氧化碳培养箱中培养18~24 h,观察生化试验反应结果。

2.3卫星现象试验[2]用接种环挑取疑似副猪嗜血杆菌的纯培养单个菌落,接种于无NAD的鲜血琼脂培养基上,再挑取金黄色葡萄球菌垂直划线接种在该培养基上,在37℃条件下,培养24 h,观察是否具有“卫星生长现象”,同时观察检测菌株是否有溶血特性。另取分离菌培养物划线于无NAD的鲜血琼脂培养基上,在37℃条件下,培养24 h,作为对照。

2.4 PCR鉴定[33]挑取TSA培养基上的单菌落进行PCR鉴定。试验所用的引物参照Gen Bank等(2001)发表的HPS-16Sr RNA基因进行引物的合成,上游引物为:Hp1 5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’,下游引物为:Hp2 5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT–3’,目的扩增片段长度为822 bp。PCR反应体系见表1。

将上述液体试剂混匀后放置于PCR仪上进行PCR反应,反应条件详见表2。

注:PCR Master Mix 缓冲液体系 (Mg Cl2浓度为 3 mmol/L、500 pmol/ L d NTP 2.0 L、25 mmol/L p H 8.3 Tris-HCl Taq 酶 0.2 L)。

2.5血清型鉴定用副猪嗜血杆菌1~15型标准阳性血清作对照。对6株分离菌株用KGR试验进行副猪嗜血杆菌血清型鉴定[4]。

3 试验结果

3.1形态特性分离菌株在TSA培养基上呈现灰白色圆形半透明的菌落;在鲜血琼脂培养基上生长缓慢,24 h仅生长出直径1~2 mm的灰白色圆形半透明菌落,无溶血特性;对所分离的菌株进行革兰氏染色后,菌体为革兰氏阴性短小杆菌,个别呈两极浓染的球杆状,无芽孢。

3.2生化试验鉴定结果试验结果表明,所分离的副猪嗜血杆菌菌株对葡萄糖、山梨醇、硫化氢、乳糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、尿素酶的生化试验结果一致,对麦芽糖、甘露醇和乳糖的生化反应不稳定。所分离的菌株生化试验鉴定结果均符合副猪嗜血杆菌标准菌株的生化试验特征。

3.3卫星现象试验结果在鲜血琼脂培养基上,呈现出明显的“卫星现象”。将分离菌培养物划线于无NAD的鲜血琼脂培养基上,无菌落生长。试验结果表明所分离菌株均为NAD生长依赖菌,符合副猪嗜血杆菌培养特征。

3.4 PCCRR鉴定结果根据副猪嗜血杆菌16S r RNA序列设计特异性引物,经PCR扩增后,DNA片段大小在822 bp。对采自锦州地区发病猪场的病料样本在TSA培养基上分离的单个菌落进行PCR检测,以DL2000 DNA Marker为标准,可见待检样本1为阴性,待检样本2、3、4、5、6、7与预期大小相符合为阳性, 结果见图1。

3.5血清型鉴定结果用副猪嗜血杆菌1~15型标准阳性血清作对照。对分离的6个副猪嗜血杆菌菌株进行血清型鉴定,结果显示血清4型1株、血清5型2株、血清12型1株、血清13型2株。初步确定了锦州地区副猪嗜血杆菌流行菌株的血清型,为猪场制定副猪嗜血杆菌病的防控措施提供理论依据。

4 讨论

由于副猪嗜血杆菌生长繁殖营养要求较高,所以不易培养,分离比较困难,致使分离率较低。本研究的分离率仅为46.15%,所以临床上经实验室检验中未分离到细菌并不代表副猪嗜血杆菌不存在, 用于副猪嗜血杆菌细菌分离的样品最好选用未经药物治疗的病猪。

本研究血清型试验鉴定结果表明,锦州地区副猪嗜血杆菌流行菌株的血清型为4型、5型、12型、13型,不能进行血清分型的有7株,占被检总数的46.15%。本试验结果符合国内外相关报道,Olvera A等[5]报道30%以上的加拿大分离菌株和美国分离菌株不能通过琼脂扩散试验分型。蔡旭旺等[6]曾报道副猪嗜血杆菌国内的血清型为血清4型、5型、12型和13型。可见,各个国家和地区副猪嗜血杆菌流行的血清型具有一定的差异性。

大肠杆菌血清型 第6篇

鸭疫里默氏杆菌 (Riemerella anatipestifer, 简称RA) 病原称为鸭疫巴氏杆菌 (Pasteurellaanatipestifer, 简称PR) 病、传染性浆膜炎 (Infectious serositis) 、新鸭病 (New duck syndrome) 、鸭败血症 (Duck septicemia) 、鸭疫综合征 (Anatipestifer syndrome) , Segers于1993年通过对其分子生物学分析而改称为RA[1]。RA为革兰氏阴性小杆菌, 有荚膜, 无芽孢[2]。已报道的鸭疫里默氏杆菌的血清型有21种, 各血清型之间缺乏有效的交叉免疫[3,4]。为了进一步控制鸭疫里默氏杆菌病的流行, 我们课题组进行了吉林省鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定及免疫防制的研究, 现把试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物及阳性血清

7日龄健康雏鸭购自双辽某种鸭场;非免疫鸭胚购自某健康鸭群。鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清由本课题组分离制备。

1.2 病料的采集

采集吉林省部分地区76个鸭场及养殖户疑似RA的病死鸭。

1.3 细菌的分离培养

无菌操作从病鸭的脑、心、肝脏、脾、肾等病料中分别接种于鲜血琼脂培养基、麦康凯培养基、普通营养琼脂培养基, 分别置于37℃厌氧培养及普通有氧培养24 h。挑选在鲜血琼脂培养基上生长, 而在麦康凯培养基、普通营养琼脂培养基上不生长的光滑、湿润、不溶血、露珠状的菌落作纯培养。

1.4 细菌的形态检查

将分离到的纯培养物分别进行革兰氏染色、吕氏美蓝荚膜染色、美蓝染色、瑞氏染色、葛雷氏鞭毛染色, 然后油镜观察。

1.5 生理生化特性

常规生化试验采用微量发酵管 (微量发酵管添加10%小牛血清, 置37℃, 观察10 d。) 。过氧化氢酶试验参照程安春等[5]介绍的方法, 采用3%H2O2;运动性测定用半固体穿刺法;明胶液化试验参照程安春等[5]介绍的方法进行, 观察7 d以上。

1.6 血清型鉴定

在洁净的载玻片上滴蒸馏水1滴, 用接种环沾取纯培养物少许, 于蒸馏水中混匀, 滴加未稀释的阳性血清1滴。将载玻片轻轻反复摇动, 或用接种环涂开, 同时观察结果。几秒钟后, 出现清晰的乳白色絮状凝集块者, 即为阳性反应[3]。

1.7 病毒的分离

无菌取病死鸭的脑、心血、肝脏、脾、肾等病料, 加入灭菌生理盐水1∶5稀释, 用无菌组织匀浆器捣碎, 低速离心, 取上清加入青霉素、链霉素 (1000 U/mL) , 4℃放置12 h。取处理过的上清接种10日龄鸭胚 (0.2 mL/胚) 。观察鸭胚能否产生病变或死亡, 若鸭胚不死亡, 收集尿囊液及绒毛尿囊膜, 匀浆, 无菌处理, 盲传3代。

1.8 细菌的致病性试验

雏鸭接种试验:用灭菌生理盐水洗下24 h的固体培养基上的菌落, 采用比浊计数法, 调整菌数至3109CFU/mL, 然后每只7日龄雏鸭颈部皮下注射该菌液0.4 mL;同时设对照 (3109CFU/mL) , 每只7日龄雏鸭颈部皮下注射已煮沸5 min的菌液0.4 mL作对照。若有病死鸭, 作细菌分离试验[6]。小鼠接种试验:每组3只小鼠腹腔接种, 剂量每只为0.5 mL, 另外设对照组进行对照, 均隔离饲养。

1.9 疫苗田间试验

在吉林省某发病肉鸭场及周围肉鸭场使用该疫苗进行鸭疫里默氏杆菌病的预防注射, 对7日龄健康雏鸭, 各颈部皮下注射疫苗0.5 m L, 观察是否有免疫反应以及免疫效果。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离培养

无菌采集病死鸭的脑、心血、肝脏接种于鲜血琼脂培养基、麦康凯培养基、普通营养琼脂培养基上, 37℃厌氧培养24 h后, 在鲜血琼脂培养基上生长出透明、光滑、露珠样、不溶血的小菌落, 随培养时间的延长, 菌落稍大。在低倍镜下, 45°折光观察, 菌落有淡蓝色荧光。而在麦康凯培养基或普通营养琼脂培养基上, 不见生长的有45株, 保存备用。其中在麦康凯培养基长出的透明湿润, 边缘整齐, 光滑凸起的红色菌落, 经病原学鉴定为大肠杆菌。这说明临床上存在着RA和大肠杆菌混合感染, 这在该病防制上要考虑到大肠杆菌致病的因素。

2.2 细菌的形态检查

将纯培养物进行吕氏美蓝荚膜染色、革兰氏染色、瑞氏染色、葛雷氏鞭毛染色法染色;经吕氏美蓝荚膜染色后, 菌体呈蓝色, 荚膜呈红色;经美蓝染色, 菌体多为杆状, 偶见个别菌体呈长丝状排列。经瑞氏染色后, 可见部分菌体呈两端浓染。经葛雷氏鞭毛染色法染色, 可见没有染成红色的鞭毛。与已报道的其他血清型鸭疫里默氏杆菌的形态一致, 表现出同种菌的共同特性。

2.3 生化特性测定

在半固体培养基上沿穿刺线生长;过氧化氢酶阳性;不发酵葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、甘露糖、甘露醇;90.1% (41/45) 的菌株尿素酶试验为阴性;不产生硫化氢;48.8% (22/45) 菌株能缓慢液化明胶;鸟氨酸脱羧酶试验阴性;西蒙氏枸橼酸盐试验阴性。

2.4 血清型鉴定

从吉林部分地区76个鸭场分离到45株鸭疫里默氏杆菌, 经平板凝集试验鉴定, 发现其血清型有1型18株、2型14株、3型4株、7型3株、未定型6株。在分离到的45株RA中, 血清1型、2型占的比例较大, 分别约占40%和31.1%, 为主要血清型;血清3型、7型、及未定型占的比例较少, 分别约占8.8%、6.6%、13.3%, 为次要血清型。说明在吉林省内至少存在RA的上述4种血清型, 为吉林省的血清型分型奠定了基础。

2.5 病毒的分离

鸭胚购自没有进行过任何疫苗免疫的某鸭群, 病料接种10日龄鸭胚绒毛尿囊腔 (0.2 mL/胚) 后。37℃培养96 h, 如未见鸭胚死亡或病变。收集尿囊液及绒毛尿囊膜继续盲传3代。

2.6 细菌的致病性试验

把从吉林省部分地区分离到的45株RA分为5组, 1型为1组, 2型为2组, 3型为3组, 7型为4组, 每组20只14日龄雏鸭分别颈部皮下注射进行观察, 结果接种后3 d, 有少部分鸭开始出现症状, 各组发病率分别为100%, 100%, 91%, 82%;死亡率分别为100%, 100%, 86%, 81%。发病鸭主要表现精神沉郁, 食欲下降, 行动迟缓或卧地不起, 眼鼻流出分泌物, 共济失调和腹泻等症状。鸭在接种后6~10 d死亡的, 表现出典型的心包炎、肝周炎、气囊炎, 脾肿大等病变。病程短于5 d的, 病变不明显, 仅有部分病鸭的脑部呈树枝状充血和肝脏肿大。耐过鸭生长发育严重受阻, 表明分离到的RA制病性都很强, 为疫苗的制备提供了必要的条件。

2.7 疫苗的检验

制备的疫苗无菌检验合格;安全检验合格;效力检验, 对照组雏鸭全部死亡, 免疫组雏鸭全部存活, 功毒保护率达到100%。

2.8 田间疫苗试验

对吉林省某发病肉鸭场的两栏雏鸭, 分别为3 000只和4 000只, 用新分离的RA菌株制备的菌苗进行鸭疫里默氏杆菌病的免疫预防, 试验结果表明, 该疫苗具有较好的安全性及预防效果, 保护率达91%以上。

3 讨论

在吉林省76个鸭场及养殖户分离到45株RA, 说明RA感染在我省广泛存在, 说明鸭疫里默氏杆菌病对我省养鸭业造成很大危害。

从试验结果来看, 吉林省存在鸭疫里默氏杆菌的多种血清型, 而各血清型之间缺乏交叉保护。根据查新及有关报道, RA的耐药谱很广, 不同地方的RA株耐药谱有差异。这增加了控制鸭疫里默氏杆菌病的难度, 要想从根本上对本病进行控制, 必需采用本地毒株作苗保护。

我省鸭苗品种广泛, 来源引种较为混乱, 大部分引自南方, 并且这些引入的鸭苗有的未按全进全出的原则进行饲养管理, 对病死鸭及其污染物未做消毒处理, 可能造成吉林RA的多种血清型分布的状态, 使鸭疫里默氏杆菌病的控制更为复杂。

从试验结果来看, 本病和大肠杆菌混合感染, 症状基本相同, 在作苗免疫方面要考虑大肠杆菌的影响因素。从流行病学调查结果来看, 发病鸭的日龄范围较大, 但主要集中在2~6周龄。因此, 可在7日龄左右进行首免, 在首免后2~3周进行二次免疫。亦可对种鸭加强免疫, 提高雏鸭的母源抗体水平, 以减少发病。另外, 蜂胶是一种良好的佐剂, 能有效地增强机体的特异性和非特异性免疫力, 能使机体中抗体上升快, 抗体维持时间长, 鸭苗免疫后无不良反应。

参考文献

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[2]郑藤.鸭传染性浆膜炎的诊断和防制现状及进展[J].中国家禽, 2002, 24 (21) :40~42.

[3]张大丙.我国鸭疫巴氏杆菌血清型鉴定[J].畜牧兽医学报, 1999, 30 (6) :536~542.

[4]冯宜水.微山蛋鸭鸭疫里默氏杆菌病的综合防制[J].畜牧与兽医, 2001, 33 (1) :30.

[5]程安春, 汪铭书, 汪开毓, 等.现代禽病诊断和防治全书[M].成都:四川大学出版社, 1997.

大肠杆菌血清型 第7篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取2013年10月—2015年10月在该院神经科住院治疗的ACI患者150例。ACI诊断均符合第4届全国脑血管病会议修订的诊断标准 (1995年) [4], 并经CT、MRI检查确诊, 均排除合并心脑血管及肾功能不全或有其他神经系统器质损害患者。患者均在发病后2天内入院治疗。150例患者中, 男82例, 女68例;年龄43~82岁, 平均年龄 (61.0±8.3) 岁。另外收集同期在该院进行体检的健康人员100例作为对照组, 均无心、肝、肺、肾、脑等疾病, 其中男59例, 女41例;年龄42~84岁, 平均年龄 (61.8±8.7) 岁。上述研究对象均在近期1个月内未服用影响叶酸代谢和维生素B6、B12吸收的药物。两组性别、年龄等基本资料经统计学检验差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。该研究经医院伦理委员批准, 患者均签署知情同意书。

1.2 方法

采集待测者空腹外周静脉血5 m L, 室温下静置30min分钟后离心, 获得上层血清置于-20℃冰箱内保存。Hp Ig G抗体采用酶联免疫吸附 (ELISA) 法检测, 试剂盒选用上海行健生物科技有限公司产品, Hp阳性判断:抗体滴度≥20 k U/L。血清Hcy采用循环酶法检测, 试剂盒采用上海晶莹生物技术有限公司产品, Hcy异常参考值为>15.0μmol/L。血脂指标[总胆固醇 (TC) 、甘油三酯 (TG) 、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) ]采用全自动生化分析仪测定。血清C反应蛋白 (CRP) 采用超敏乳胶增强免疫比浊法测定。

1.3 统计方法

选用SPSS 21.0统计学软件分析数据, 计量资料用 (±s) 描述, 组间比较采用t检验, 计数资料用 (n, %) 描述, 采用Kb2检验, 血清Hcy水平与Hp感染的关系采用pearson相关性分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Hp阳性检出情况

病例组150例ACI患者中, Hp阳性检出115例, 阳性率为76.7% (115/150) 。对照组100例健康体检者Hp阳性检出44例, 阳性检出率为44.0% (44/100) 。病例组的Hp阳性检出率明显高于对照组, 差异有统计学意义 (χ2=27.675, P=0.00) 。

2.2 病例组中Hp感染者与非感染者间血清Hcy、CRP和血脂指标比较情况

Hp感染患者血清Hcy、CRP、TC、TG、LDL-C水平明显高于Hp非感染患者, HDL-C水平明显低于Hp非感染患者 (P<0.05) , 见表2。

2.3 病例组患者血清Hcy与Hp感染的关系

病例组150例患者中, Hcy水平>15μmol/L者99例, 高Hcy血症发生率为66.0% (99/150) 。将高Hcy血症发生率与Hp感染率进行pearson相关性分析, 显示两者有明显正相关性 (r=0.562, P=0.00) 。

3 讨论

目前, Hp感染是人类感染率最高的的一种细菌, 全世界Hp感染发生率约为50%[5]。Hp感染可引起慢性胃炎、胃十二指肠溃疡等胃肠道疾病, 同时还可诱发胃肠道以外的疾病, 如有研究报道, Hp感染在急性冠脉综合征发生中起着一定的作用[6]。该研究结果显示, 病例组ACI患者的Hp感染率为76.7%, 明显高于健康对照组的44.0%, 提示ACI患者易发生Hp感染或Hp感染会增加ACI的发生风险。AS的形成与血管内皮细胞损伤、血脂代谢异常、炎症反应等因素刺激有关。而Hcy是血管损伤所产生的氨基酸, 其水平显著增高会导致血管内皮损伤、血液高凝和血栓形成, 进而促进AS的形成, 因此是心脑血管疾病及外周血管阻塞性疾病发生的独立危险因素, 可作为患者预后的评估指标。CRP是一种敏感的炎症反应指标, 其与脑血管病变密切相关, 它可通过活化补体系统而促进炎症反应和组织损伤, 破坏脑血管内膜, 促进AS的形成[7,8]。

AS的形成与血脂代谢异常有关。该研究结果显示, ACI患者中, Hp感染者血清Hcy、CRP、TC、TG、LDL-C水平分别为 (27.4±5.9) μmol/L、 (7.9±2.2) mg/L、 (6.3±0.8) mmol/L、 (3.1±0.7) mmol/L、 (3.6±0.8) mmol/L, 明显高于Hp非感染患者的 (18.5±5.3) μmol/L、 (3.5±1.1) mg/L、 (5.2±0.7) mmol/L、 (2.3±0.8) mmol/L、 (2.8±0.7) mmol/L, HDL-C水平为 (1.1±0.2) mmol/L, 明显低于Hp非感染患者的 (1.9±0.3) mmol/L (P<0.05) , 说明Hp感染会加重患者体内血脂代谢紊乱, 炎症反应增加, 同时使血清Hcy水平升高。耿学川等[9]研究也报道, Hp感染伴有ACI患者的TC、TG、LDL-C水平分别为 (6.5±0.9) 、 (3.3±0.9) 、 (3.5±0.7) mmol/L, 而对照组为 (5.1±0.6) 、 (2.4±0.6) 、 (2.7±0.5) mmol/L;两组CRP分别为 (7.8±2.1) 、 (3.5±1.1) mg/L, 血清Hcy水平分别为 (27.9±5.2) 、 (18.5±5.3) μmol/L, 差异有统计学意义, 该研究结果与之吻合。这些因素均会增加AS的发生, 因此Hp感染会增加AS形成, 其具体机制可能为[10]:机体血脂代谢障碍使得TC、TG、LDL-C浓度增加, HDL-C浓度降低, 从而增加脂质沉积于血管壁, 促进AS的形成;Hp感染所致的胃肠道疾病会影响维生素B6、B12及叶酸的吸收, 导致Hcy代谢障碍, 使血清Hcy升高, 增加AS的发生几率;Hp感染可致血管内皮功能紊乱而产生炎症反应, 产生过量的纤维蛋白原, 促进AS的发生和进展。

该研究对ACI患者Hp感染及Hcy异常进行相关性分析, 发现两者呈正的相关性, 说明ACI患者Hp感染率升高会促进AS的形成, 因此提示我们对于ACI患者的治疗, 除了积极进行ACI疾病本身的治疗外, 还应进行Hp感染的防治, 以纠正血脂代谢紊乱, 减轻炎症反应, 降低血清Hcy浓度, 进而延缓AS的病理进展。

总而言之, ACI患者易发生Hp感染和血清Hcy含量增高, 血清Hcy含量与Hp感染密切相关, Hp感染会加重血脂代谢紊乱和炎症反应, 增加Hcy含量, 从而促进AS的形成, 加重ACI的进展, 故联合检测Hp感染及Hcy含量利于ACI病情及预后的评估, 指导临床治疗方案的制定。

参考文献

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[9]耿学川, 赵晓红, 韩立荣.脑梗死患者幽门螺杆菌感染状况及其与血脂代谢的关系[J].神经损伤与功能重建2010, 5 (1) :8.

奶牛布鲁氏杆菌病的血清学检查 第8篇

1 血清学检查的主要方法

血清学检查通常使用平板凝集试验和试管凝集试验两种方法, 平板凝集试验用于牛群粗筛, 筛出的阳性牛血清样品再用试管凝集试验做最后确诊。

2 平板凝集试验

2.1 材料准备

琥红抗原、标准阳性血清、阴性血清 (黑龙江省生物一厂购买) 、干净玻璃板1块、移液器、移液头、受检血清、牙签。

2.2 操作

在玻璃板上滴加0.03ml琥红抗原, 抗原旁边滴一滴等量待检血清, 并设阴阳性血清对照, 充分混合血清和抗原, 在室温20℃条件下观察结果。如果环境温度低, 可用酒精灯加热。

2.3 结果判定

在阴阳性血清对照成立条件下, 在4分钟内受检血清与抗原出现肉眼可见的凝集现象判为阳性, 否则判为阴性。

3 试管凝集试验

3.1 材料准备

抗原由黑龙江省生物制一厂购买, 使用前应摇匀, 使用前按1:20倍稀释即1ml抗原加19ml稀释液, 过期或出现结块的抗原不能使用。阳性血清、阴性血清由黑龙江省生物一厂购买。稀释液为0.5%石碳酸生理盐水, 配制方法即0.5g石碳酸加生理盐水至100ml, 调pH值7.2~7.4, 121℃高压灭菌20分钟。受检血清可快速离心制取, 2000转/分, 离心10分钟即可收集血清, 也可将装全血试管倾斜45°角放置环境温度在20℃左右2~3小时即可出血清。此外需玻璃试管、移液枪、移液头、试管架等。

3.2 操作方法

每份受检血清准备4个玻璃试管, 分别按1:50、1:100、1:200、1:400四个稀释度稀释。即第1管加1.2ml稀释液, 第2~4管各加入0.5ml稀释液, 然后用移液器吸取0.05ml血清加入到第1个试管中, 反复吹打3次吸出0.25ml弃之, 再吸0.5ml混合液加入到第2个试管中, 反复吹打3次, 吸取第2试管混合液0.5ml放入第3试管中, 直至倍比稀释第4试管, 反复吹打3次后从第4试管弃去混合液0.5ml, 这样1~4试管血清的稀释度分别为1:25、1:50、1:100、1:200。1~4试管每管分别加入1:20倍稀释的抗原0.5ml, 振动摇匀, 这样受检血清最终稀释度为1:50、1:100、1:200、1:400。将混合液连同阴阳性对照, 浊管对照和抗原对照置37℃温箱中培养48h, 见表1。

每次试验都应设阴性血清对照, 阳性血清对照和抗原对照。阴性血清对照方法步骤与受检血清试验方法相同。阳性血清对照应稀释到原有的滴度, 加抗原方法与受检血清相同。抗原对照, 1:20倍稀释的抗原加0.5m碳酸生理盐水, 看是否有自凝现象。

3.3 比浊管配制

每次试验都应配制比浊管作为判定凝集反应程度的依据, 按表2配制。

3.4 结果判定