标记基因范文

标记基因范文（精选9篇）

标记基因 第1篇

关键词：果树农艺,性状基因,分子标记

我国有着丰富的果树资源,即使同一种类的果树结出来的果实在形状方面也存在着明显的差异,在我国大部分地区都将果树建设作为重要的经济来源,在果树种植、培育过程中需要耗费较大的人力物力财力,如果果树的性状不够优良,则农户种植完成的果树在市场上将没有优势存在,而通过果树性状基因的分子标记,可以对果树中的优良品种和性状基因进行筛选,从而促进我国果树的健康发展。

1 果树农艺性状基因常用标记方法

1.1 已知信息捕捉法(KIH)

在果树性状基因筛选过程中,常用的一种方法就是已知信息捕捉法,这种方法就是将一些其他植物的已知基因或者是做好标记的序列信息,通过特异性的PCR扩增或者是通过探针杂交的方法掌握果树上的分子信息,之后进行克隆测序、同源性分析完成特异性片段的标记,整个操作过程安全性较高,简便易用。有学者将扁桃桃S-RNase的2个氨基酸和甜樱桃的基因通过设计PCR最终获得了果梅的自交亲和基因标记;此外,通过甜樱桃的S2-RNase中的c DNA探针杂交获得了果梅自交亲和基因的分子标记。还有学者通过果树的抗白粉病基因获得了葡萄抗白粉病基因的分子标记。

1.2 集团混合分离分析法(BSA)

果树在生长过程中经历了较长时间的发展,通过集团混合分离分析法可为果树的基因性状分子标记提供新的方法,该方法主要根据确定的性状目标将果树群体分成两组,然后从每组中分别选出5~10株果树,提取出DNA,将提取出来的DNA进行等量混合,形成抗感池,根据确定的性状目标进行分池,此时同一个分离群体组成的抗感池在遗传背景方面有较大的共同点,只有确定的目标性状基因存在着一定的差异,可以记作NILs,这种标记方法也是果树农艺性状基因常用的标记方法,通过该方法可对大多数果树农艺性状基因进行标记,当然在具体的标记过程中需要确定出合适的分离群体。考虑到果树分离群体存在较大难度,可以通过借助其他材料进行BSA分析,继而完成果树的群体分离[1]。

1.3 平行芽变分析法(PSA)

许多果树新品种的培育是通过芽变得到的,这是因为部分果树没有性系保存和繁育,很容易发生无性系体细胞突变,进而产生芽变,发生芽变的个体和母体之间在基因方面极为相似,在一定程度上与NILs可以等同。有学者通过PAPD对荔枝焦核突变体进行鉴别,怀枝与焦核怀枝间谱带的相似系数可达到99.85%,而三月红与焦核三月红间谱带的相似系数可以达到99.87%,这些都进一步表明了芽变与母体之间的相似度较高,通过对芽变的基因性状标记可得到果树的性状基因标记。有学者采用这种基因标记方法,通过对金丝小枣的无核变异系得到了枣有核性状的相关PAPD标记,这种性状基因标记方法同样具有操作简单、快速的优点,但同时在收集相关的芽变系资源过程中难度较大,而且果树的芽变较多,只有点突变的才能用该方法进行分析。

2 果树农艺性状基因分子标记的应用分析

2.1 基因作图与图位克隆

基因作图属于一种遗传学作图,通过基因作图可进一步对基因进行研究,对染色体中特定的DNA片段进行定位,而图位克隆则是根据目的基因进行基因分离,这些都是基因研究中的主要工作,在果树育种和基因克隆方面都发挥着重要作用。有学者将6个RAPD标记的Vf基因与1个同位酶标记的PGM-1基因整合在覆盖28c M的遗传图谱中。还有学者将8个RAPD标记和15个AFLP标记的Vf基因整合在一个遗传图谱上。通过这些图谱可以为果树的种植、培育提供重要参考。标记完成的遗传距离在1 cm或者是1 000 kb以内的可进行基因的分离和克隆,将标记的染色体作为起点,然后使用染色体跳跃法得到基因的全长序列[2]。

2.2 种质资源鉴定

早期对于果树的种质资源鉴定和评价主要是通过对果树的观察和相关记录完成的,这种方法耗费时间较长,而且有一定的局限性。比如,对果树接种病进行抗病评价期间,外界的环境因素可能会对抗病效果产生影响,对于病原菌也没有明确的鉴别方法,但是分子标记方法可以有效地进行种质资源鉴定,而且不受上述因素的影响。例如,国外有学者研究后发现苹果和葡萄中的抗白粉病毒资源。

2.3 分子辅助选择

果树生长过程中可以通过分子辅助选择将确定的目标性状表现出来,这样可以在早期有效地控制果树的性状,使果树生长和结果均朝着人们确定的方向发展,促进了优良品种果树的繁殖。

3 结语

果树农艺性状基因的分子标记方法为基因标记提供了多种方法,实现了基因的有效控制,促进了果树的基因研究,同时在基因作图与图位克隆、种质资源鉴定与分子辅助选择方面都发挥了重要作用。

参考文献

[1]孙正文,黄兴奇,李维蛟,等.分子标记技术及其在水稻基因定位上的应用[J].基因组学与应用生物学,20111):78-86.

标记基因 第2篇

水稻抗褐飞虱基因SCAR标记的获得

采用282个随机引物对药用野生稻1665和栽培稻桂99远缘杂交的抗褐飞虱近等基因系B3F4分离群体的不抗池DNA和抗池DNA进行了特异性RAPD标记筛选,从中筛选到一个具有明显的特异性扩增带谱的RAPD标记S1159,序列分析表明,S1159序列长度为1 408 bp,与基因库中已报道的水稻第四号染色体的BAC克隆(编号OSJNBa0070O11)序列(67114-69100)有51.86%的同源性.为了提高所找到的RAPD标记S1159在应用上的稳定性,将RAPD标记转化为SCAR标记检测近等基因系群体,结果表明与RAPD标记结果一致,说明该研究得到的RAPD标记具有较好的.稳定性和重复性,为进一步的研究打下了良好的基础.

作 者：武波 韦东 欧倩 WU Bo WEI Dong OU Qian 作者单位：广西大学,生命科学与技术学院,广西,南宁,530005刊 名：广西植物 ISTIC PKU英文刊名：GUIHAIA年，卷(期)：26(6)分类号：Q943.2关键词：药用野生稻 抗褐飞虱基因 RAPD标记 SCAR标记

标记基因 第3篇

关键词：青海大黄油菜；黄籽基因；SSR；遗传图谱；物理图谱

中图分类号： S565.401文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0032-04

收稿日期：2013-05-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：31060196）；国家“863”计划（编号：2011AA10A104）；国家“973”计划（编号：2012CB723007）；国家油菜产业技术体系专项（编号：CARS-13）。

作者简介：赵会彦（1989—），男，河南南阳人，硕士研究生，主要从事春油菜分子生物学研究。E-mail：13639767407@163.com。

通信作者：肖麓，博士。 E-mail：981919669@qq.com。油菜是世界范围内广泛种植的油料作物之一，也是我国食用植物油的重要来源。油菜种皮颜色有黄色、褐色、黑色等，研究结果表明，在相同遗传背景下，黄籽油菜与黑、褐籽等油菜相比，具有种皮薄，皮壳率低，蛋白质和含油量高，色素含量少等优点[1-2]。白菜型黄籽油菜为自然界存在的天然黄籽资源之一，对白菜型油菜黄籽基因进行定位，开发与黄籽基因紧密连锁的分子标记，构建黄籽基因的遗传连锁图谱和物理图谱，对黄籽油菜分子标记辅助选择育种体系的建立、黄籽基因的图位克隆以及转基因油菜品种的培育等都具有重要的意义[3-7]。Chen等利用印度黄籽沙逊构建白菜-芥蓝（B. campestris-B. alboglabra）C染色体组异附加系，并利用该异附加系筛选出一个与黄籽基因紧密连锁的RAPD标记B06-600[8]。Rahman等在白菜型黄籽沙逊油菜中发现1个与黄籽性状主效基因（Br1/br1）紧密连锁的SRAP标记SA7BG29-245，并将这个标记转化为共显性SNP（单核苷酸多态性）标记和SCAR（序列特异性扩增区域）标记[9]。Zhang等利用大白菜双单倍体群体进行黄籽基因的精细定位和图位克隆，用13个SRAP标记、6个SCAR标记和4个SNP标记构建了黄籽基因的遗传连锁图谱，克隆了控制种皮颜色的基因，该基因位于白菜型油菜A6连锁群[10]。Kebede等对白菜型黄籽沙逊油菜种皮颜色基因进行了QTL定位，共检测到4个QTL位点，其中一个主效QTL位点SCA9-2和一个微效QTL位点SCA9-1位于A9连锁群，其他两个微效QTL位点（SCA3-1和SCA5-1）分别位于A3和A5连锁群，共解释了67%的表型变异[11]。Xiao等对青海大黄油菜黄籽性状进行了遗传分析和基因定位研究，结果表明青海大黄油菜黄籽性状受一对隐性基因（Brsc1）控制，筛选到与Brsc1紧密连锁的10个AFLP标记（Y1至Y10）和3个SSR标记（CB10255、CB10022、CB10428），将其定位于白菜型油菜A9染色体上，同时构建了Brsc1基因所在区域的遗传连锁图谱[12]。

综上所述可见，前人对不同的白菜型黄籽油菜品种的黄籽基因进行了定位、克隆等研究，但是对于不同油菜品种的研究结果有所不同。本研究所用青海大黄油菜是起源于青藏高原的白菜型油菜地方品种，有能够稳定遗传的黄籽性状，是一种研究白菜型油菜黄籽性状的优异种质资源[13-14]。前人将大黄油菜黄籽基因Brsc1定位于A9染色体上特定区段，但标记数目有限，图谱饱和度不够。本研究在前人研究的基础之上，进一步扩大作图群体，结合分离体分组混合分析法（bulked segregant analysis，BSA法），在Brsc1所在染色体区段筛选新的与Brsc1连锁更为紧密的SSR标记，增加与Brsc1基因紧密连锁标记的数目，提高Brsc1遗传连锁图谱的标记密度，为大黄油菜黄籽基因的克隆創造条件。同时，检测所获SSR标记是否为共显性标记，用于大黄油菜分子标记辅助选择育种体系的建立。

1材料与方法

1.1试验材料和群体构建

本研究所用亲本材料为青海大黄油菜和一个白菜型油菜褐籽品系（编号09A-126），由青海省农林科学院春油菜研究所提供。两亲本均已连续自交或兄妹交8代以上，其种皮颜色性状均可稳定遗传。以大黄油菜为母本，09A-126为父本，F1代与大黄油菜回交，构建BC1群体，作为定位群体；F1同时自交，获得F2群体，F2中每一单株套袋自交获得F2：3家系，用于与目标基因连锁的共显性标记的筛选。

1.2DNA提取和性状调查分组

油菜苗期，采用CTAB法提取叶片总DNA[15]。测定每份DNA溶液的浓度，稀释至50 ng/μL，-20 ℃下保存备用。

油菜角果完全成熟后，分单株收获，晾干后考种。通过肉眼观察，考查每一单株的种皮颜色。根据考查结果，将BC1群体单株分为黄籽和褐籽两组。随机选取12个黄籽单株和12个褐籽单株，将单株DNA等量混合，分别构建两个黄籽基因池和两个褐籽基因池。根据F2群体中各单株的种皮颜色性状，将F2群体首先分为黄籽和褐籽两组，再根据F2 ∶3家系性状，将F2群体中的褐籽单株分为纯合褐籽（性状不分离）和杂合褐籽（性状分离）两组，最终将F2群体分为黄籽、杂合褐籽和纯合褐籽3组。

nlc202309041818

1.3SSR标记开发与检测

根据前人的研究结果，Brsc1被定位在白菜型油菜A9染色体上的一段2.8 Mb的区间内。从BRAD数据库（http：//brassicadb.org/brad/）下载Brsc1所在区间的序列信息，利用SSRHunter 1.3软件，进行微卫星筛选。然后利用Primer 3软件设计SSR引物（http：//frodo.wi.mit.edu/）。同时利用BRAD数据库中Brsc1所在区间内已有的SSR标记在我们的定位群体中进行多态性分析[16-19]。SSR引物由上海生工生物工程有限公司合成。SSR扩增反应参照梅德圣等的方法[20]。扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离检测。SSR引物首先在2对基因池中进行检测，表现为多态性的引物继续在BC1分离群体的单株中进一步进行分析，若仍然表现多态性，则确定为与Brsc1基因紧密连鎖的标记。获得的特异SSR引物同时用F2群体中的单株进行检测，以确定其是否为共显性标记。

1.4SSR标记遗传图谱和物理图谱的构建

特异性SSR标记在BC1分离群体中进行重组单株的筛选，计算重组率，利用Kosamabi函数转换为遗传距离[21]。利用MAPMAKER/EXP3.0软件，构建Brsc1的SSR标记遗传图谱，并利用MapDraw V2.1作图软件进行遗传图谱和物理图谱的绘制[22]。

2结果与分析

2.1SSR标记开发与筛选结果

前人将Brsc1定位于A9染色体上Y06（19.3 Mb）和Y10（22.1 Mb）之间2.8 Mb的区间内。从BRAD数据库下载该区间部分序列，用于SSR引物的设计，并下载该区间已公布的SSR标记。用黄籽/褐籽基因池和BC1分离群体单株进行检测，共获得5个与Brsc1紧密连锁的特异性SSR标记：A-11-65、A-11-145、B-6-32、BrID10607和KS10760，引物序列信息见表1。 各特异性引物扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，条带多态性明显，带型清晰稳定，图1和图2所示分别为引物BrID10607和KS10760扩增结果。同时，5个特异性SSR标记对F2群体中的单株进行扫描，结果显示，A-11-65为共显性标记，能够区分黄籽、杂合褐籽和纯合褐籽单株（图3）。表1与青海大黄油菜黄籽基因Brsc1紧密连锁的SSR标记

SSR标记1引物名称1引物序列（5 ′→3′）1遗传距离

2.2SSR标记遗传连锁图谱和物理图谱的构建

本研究所构建BC1作图分离群体包含1 740个单株，6个与Brsc1表现连锁的SSR标记在BC1群体中进行重组单株的筛选，计算重组率，确定各连锁标记与Brsc1之间的遗传距离（表1）。将6个SSR标记与前人对Brsc1的定位结果进行比较和整合，构建Brsc1的遗传连锁图谱（图4）。各连锁SSR标记的物理位置见表1，使用作图软件绘制其物理图谱（图4）。新开发的6个SSR连锁标记位于Brsc1同侧，与Brsc1间的平均遗传距离为0.012 2，连锁紧密。新开发的SSR标记覆盖染色体上0.9 Mb的长度，图谱标记密度进一步增加。

3讨论

与前人所获得的分子标记相比，本研究筛选得到的5个与目标基因Brsc1紧密连锁的SSR标记与Brsc1之间的遗传距离进一步缩短，最近的标记为KS10760（0.005 7 cM）。将新获得的SSR标记与前人研究所得Brsc1的遗传连锁图谱进行整合，图谱标记密度进一步增加。高密度的遗传图谱是实现Brsc1图位克隆的关键。新开发的SSR标记位于Brsc1同侧，要实现Brsc1的克隆，在Brsc1另一侧还须开发更多与 Brsc1 距离更近的分子标记，将Brsc1锁定于更小的范围内。本研究所用作图分离群体较前人有所扩大，作图群体的扩大使连锁标记与目标基因之间的遗传距离测算更为准确，图谱精度进一步提高，且为连锁更紧密的分子标记的开发创造了条件。

Xiao等所得与Brsc1 紧密连锁的SSR标记，距离最近的为CB10022（0.8 cM），本研究新开发的SSR标记不但与Brsc1之间遗传距离大大缩短，而且得到一个共显性标记A-11-65（0.008 0 cM）。由于SSR标记具有操作简单，重复性好，成本较低等优点，因此被广泛应用于分子标记辅助选择育种。本研究所得到的SSR标记，不但与Brsc1连锁紧密，而且扩增条带清晰稳定，尤其是共显性标记的获得，能较准确地区分不同基因型的单株，因此很适用于建立白菜型黄籽油菜分子标记辅助选择育种体系。不足之处在于没有筛选到与Brsc1共分离的SSR标记，SSR连锁标记的数目也不够多，为提高分子标记辅助选择的准确率，还需要开发更多与Brsc1紧密连锁的分子标记。

本研究利用新开发的SSR标记进行遗传图谱构建，这些标记是根据目标基因所在特定区段的序列信息进行开发的。随着基因测序技术的发展，植物基因组序列信息数据库的不断完善，通过搜索数据库序列信息开发SSR引物越来越普遍。利用该方法进行目标基因的定位，目的性强，可快速筛选出与目标基因连锁的分子标记。但该方法需要以一定的定位结果为基础，并且需将目标基因锁定于较小的区段内，否则会增加SSR标记开发和筛选的难度。该方法还可用于开发SCAR、IP标记等，适用于目标基因的精细定位。

参考文献：

[1]刘后利. 油菜遗传育种学[M]. 北京：中国农业大学出版社，2000：215-225.

[2]高永同. 黄籽油菜的遗传和育种研究进展[J]. 中国油料，1984（3）：89-93，96.

[3]李爱民，张永泰，蒋金金，等. 芸苔属主要油料作物黄籽性状分子遗传研究进展[J]. 分子植物育种，2009，7（2）：407-412.

标记基因 第4篇

研究采用RT-PCR技术根据已登录的普通牛MyHC不同亚型序列设计引物克隆九龙牦牛MyHC序列, 进而确定九龙牦牛肌纤维类型的组成, 为研究九龙牦牛优良肉质形成的机理提供理论依据。

1 材料

1.1 试验牦牛

试验所用的健康九龙牦牛来自四川省甘孜州九龙县, 屠宰后迅速取其背最长肌, 置于液氮内带回实验室。

1.2 主要试剂

Trizol试剂, 购自Invitrogen公司;反转录试剂盒、pMD-18T载体和Taq DNA聚合酶, 购自TaKaRa公司;DNA回收试剂盒, 购自博大泰克公司;JM-109感受态细胞, 购自天泰公司。

2 方法

2.1 引物设计与合成

根据GenBank中普通牛MyHC基因的序列, 用Primer Premier 5.0软件分别设计PCR引物 (见表1) , 引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

2.2 RNA提取与反转录

按照Trizol试剂说明书提供的方法提取九龙牦牛背最长肌总RNA, 紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度 (OD260/OD280=1.8～2.0) 。

取总RNA 1 μg进行反转录, 按照RNA PCR Kit (AMV) Ver 3.0的方法, 以Oligo (dT) 为引物合成cDNA第一链。

2.3 PCR反应

PCR反应体系 (25 μL) :超纯水16.375 μL、2.5 mmol/ L dNTP Mix 2 μL、PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol/ L MgCl2 1.5 μL、cDNA 1.5 μL、25 μmol/ L 上、下游引物各0.5 μL、0.5 U/ μL Taq DNA 聚合酶0.125 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s, 50.0～54.4 ℃ 退火1 min, 72 ℃ 延伸1 min, 共38 个循环;72 ℃延伸10 min。

2.4 PCR产物回收及克隆测序

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离, 紫外灯下切割目的片段, 用DNA回收试剂盒回收目的条带。回收产物连接于pMD-18T载体, 转化后筛选阳性克隆, 用质粒提取试剂盒提取质粒, PCR鉴定后送上海英俊生物技术有限公司测序。

3 结果与分析

3.1 MyHC1、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b基因克隆

通过对退火温度和镁离子浓度的筛选, 优化PCR 扩增条件。结果在镁离子浓度为1.5 mmol/L和退火温度为50.0～54.4 ℃时获得特异扩增产物, 经回收和序列测定后得到与预期结果相符的398～529 bp的核苷酸序列, 见图1。

1.MyHC2b;2.MyHC2x;3.MyHC2a;4.MyHC1;M.DL-2 000 Marker。

3.2 MyHC1、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b序列分析

经测序后获得的MyHC1、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b核苷酸序列, 与引物设计源 (普通牛) 进行同源性比较, 发现普通牛MyHC1基因的743, 785位G碱基变为T, 804, 860位的T碱基变为C, 与引物设计源的同源性为99%;与GenBank上登录的猪和马的同源性依次为94%、94%。MyHC2a与引物设计源、猪和马的同源性依次为100%、94%、94%。MyHC2x基因1 464位的T碱基变为A, 与引物设计源的同源性为99%, 与猪的同源性为96%。MyHC2b基因37位G碱基变为A, 83位的C碱基变为T, 388位的A碱基变为G, 438位的T碱基变为C, 与引物设计源的同源性为99%, 与猪的同源性为93%。说明MyHC基因在进化上高度保守。

4 讨论

通过改变肌纤维的数目和肌纤维类型的转换来提高动物的产肉量和肉质, 是动物育种和肉类研究的焦点。大多数陆栖脊椎动物的肌纤维数目在出生前就已确定, 但肌纤维的类型并未固定, 存在类型的转换。研究表明, 肉鸡Ⅰ型肌纤维含量与肌肉嫩度呈正相关, Ⅱ型肌纤维比例与肉质呈显著负相关[6]。猪Ⅰ型肌纤维比例高, 肉色红润, 鲜嫩多汁, 风味良好;Ⅱ型肌纤维比例高, 肉色发白, 品质下降[7]。因此, 从肌纤维类型角度研究优质肉形成的分子机制具有重要意义。关于九龙牦牛肌纤维类型的转换及调控因素目前未见报道, 研究旨在确定九龙牦牛肌纤维类型的组成, 为进一步研究肌纤维类型的转换提供基本资料。

根据纤维收缩速度和代谢特征的不同, 将其分为慢收缩氧化型、快收缩氧化酵解型和快收缩酵解型;从形态学角度分别称为红肌纤维、白肌纤维和中间型纤维。其中建立在MyHC表达基础上的分子分型目前应用最为广泛。研究表明:在牛和猪中, MyHC共有MyHC1、MyHC2a、MyHC2x和MyHC2b 4种类型[8,9], 因此研究利用RT-PCR技术并根据GenBank上登录的普通牛MyHC1、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b序列设计引物, 克隆九龙牦牛MyHC同工型。结果成功地获得了九龙牦牛MyHC1、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b部分cDNA序列, 初步揭示了九龙牦牛肌纤维的分子分型包括这4种类型。

摘要：为了确定九龙牦牛肌纤维类型的组成, 试验根据普通牛肌球蛋白重链 (MyHC) 基因序列设计引物, 以成年九龙牦牛背最长肌总RNA为模板, 采用RT-PCR的方法扩增九龙牦牛MyHC1、My-HC2a、MyHC2x、MyHC2b的部分基因序列, 并与普通牛进行同源性比较。结果表明:成功获得九龙牦牛MyHC1、MyHC2a、MyHC2x、MyHC2b序列长度分别为451 bp、529 bp、398 bp和485 bp, 与普通牛相应序列的同源性分别为99%、100%、99%、99%。

关键词：九龙牦牛,肌纤维,肌球蛋白重链

参考文献

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[5]TONIOLO L, MACCATROZZO L, PATRUNO M, et al.Fiber typesin canine muscles:myosin isoform expression and functional charac-terization[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2007, 292 (5) :1915-1926.

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[8]DURIS MP, PICARD B, GEAY Y.Specificity of different anti-my-osin heavy chain antibodies in bovine muscle[J].Meat Sci, 2000, 55 (1) :67-78.

标记基因 第5篇

罗氏沼虾3个群体线粒体COⅠ基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)线粒体DNA的`COⅠ基因,测定该基因片段序列.分析了罗氏沼虾缅甸原种F1代、江苏养殖群体和广西选育F2代3个群体共17只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态.结果表明,缅甸原种F1代遗传多样性最为丰富,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传多样性相对贫乏.在长度为498 bp的基因片段中,共检测到10个多态性核苷酸位点(占2.01%),17只个体具有5种基因型,3群体各自的平均核苷酸位点差异分别为0.88%、0.07%和0.UPGMA分子系统聚类树显示,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传关系最近,其单倍型混杂聚成一支,而缅甸原种F1群体相对独立为另外一支.COⅠ基因可以作为区分两分支群体的遗传标记.

作 者：杨学明 郭亚芬 陈福艳 蒋钦杨 梁万文 蒋和生 YANG Xue-Ming GUO Ya-Fen CHEN Fu-Yan JIANG Qin-Yang LIANG Wan-Wen JIANG He-Sheng  作者单位：杨学明,陈福艳,梁万文,YANG Xue-Ming,CHEN Fu-Yan,LIANG Wan-Wen(广西水产研究所,南宁,530021)

郭亚芬,蒋钦杨,蒋和生,GUO Ya-Fen,JIANG Qin-Yang,JIANG He-Sheng(广西大学动物科技学院,南宁,530005)

刊 名：遗传  ISTIC PKU英文刊名：HEREDITAS(BEIJING) 年，卷(期)： 28(5) 分类号：Q95 关键词：罗氏沼虾   COⅠ基因   序列多态性   遗传标记  

标记基因 第6篇

然而迄今, 油茶微卫星分子标记的开发利用研究甚少, 国内只有少量利用茶树EST微卫星标记引物随机扩增油茶基因组的报道[2]。如何成功的开发油茶类物种的SSR标记, 已然成为油茶分子育种工作者的研究重点。目前SSR标记的开发依赖于拥有大量的DNA序列基础, 而在以往, 传统的微卫星开发途径主要通过构建基因组文库, 费时耗力并且效率不高, 局限了微卫星的运用。微卫星富集文库法开发SSR标记可在短时间内获得一定数量的微卫星, 近几年在遗传背景研究相对薄弱的物种中广为采用, 如在黄花柳[3]、铁皮石斛[4]、毛竹[5]等有成功的案例。本研究旨在尝试采用磁珠富集法快速制备油茶基因组微卫星标记, 并运用于油茶遗传学研究。

1 材料与方法

1.1 材料与DNA的提取

微卫星富集文库建立用油茶样品采自江西省林业科学院油茶种质基因库内赣无系列油茶高产无性系编号赣无1, 新鲜幼叶冷冻保存备用。DNA的提取与检测参照文献[6]的报道。

1.2 基因组DNA的酶切和与接头连接

采用限制性内切酶BSP143I (NEB) 对目的基因组DNA酶切, 选择回收大小在400~900 bp之间的DNA片段。在胶回收试剂盒 (天根) 纯化后的产物中加入接头引物:oligo A (5’-GGGTCGAATTCGAGCT-CAG-3’) 与去磷酸化后的oligo B (5’-P04-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3’) , 在T4连接酶 (上海生工) 作用下进行目的DNA片段与接头的连接反应。检测接头与基因组DNA酶切产物连接效果的方法是将连接产物稀释5倍后, 用oligo A接头引物对连接产物进行PCR扩增, 50μL反应体系:连接产物稀释液12μL, 10×PCR缓冲液5μL, Mg2+1.5 m M, d NTPs 200μM, 酶1 U, oligo A接头引物5 pmol:PCR反应程序:95℃预变性5 min;95℃30 s, 55℃50 s, 72℃1 min, 35 cycles;最后72℃延伸10 min, 8℃保存。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测, 经胶回收纯化, 作为后续与生物素探针杂交用模板。

1.3 微卫星DNA片段的捕捉、富集及回收

选择生物素标记探针 (AC) 15、 (AG) 15与目的DNA片段进行杂交来富集油茶微卫星, 探针与目的DNA片段杂交反应步骤:将50μL PCR产物在95℃变性5 min后, 马上放在冰上迅速冷却;加入3μL20×SSC, 10μL (AG) 15 (100 p M) 、10μL (AC) 15 (100p M) 探针, 加dd H2O补至100μL后, 温和地混合, 60℃下保温1 h进行杂交, 4℃保存。

将杂交反应物和处理好的平衡磁珠混匀 (Promega) , 并在室温下轻柔摇动后, 于37℃下温育30 min, 使生物素链和链霉亲和素结合, 期间每隔1~2 min轻轻摇动1次。温育结束后, 将离心管置于磁力架上, 去除溶液。在50℃下, 用300μL 0.1×SSC将磁珠清洗4次, 每次15 min。将洗净的磁珠用80μL dd H2O稀释后, 在水浴锅中90℃变性5 min, 然后迅速在磁场中收集上清液, 此即为富含有微卫星序列的DNA溶液。

将富集产物稀释5倍后, 用oligo A接头引物对富集产物进行PCR扩增检测。20μL反应体系:富集产物稀释液5μL, 10×PCR缓冲液2μL, Mg2+1.5m M, d NTPs 200μM, 酶1 U, oligo A接头引物5 pmol:PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃30 s, 50℃50 s, 72℃1 min, 35 cycles;最后72℃延伸10 min, ℃保存。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 质粒重组转化与克隆检测

利用限制性内切酶BSP143I切去接头并回收的微卫星DNA片段, 并经T载体 (Promega) 连接后转化大肠杆菌感受态细胞。阳性克隆采取抗生素筛选, 同时采用M13 (+) 、M13 (-) 、 (AG) 8、 (AC) 8引物对菌液进行PCR扩增检测, 能扩增出微卫星特征片段, 说明质粒重组成功。

1.5 微卫星序列的筛选与引物设计

测序结果用Vec Screen软件去除载体序列。质量控制后序列用SSR Hunter检索微卫星, 并分析各微卫星重复基元类型。引物设计采用Primer 5.0软件 (PRIMIER Biosoft International, CA, USA) , 设计引物的长度在20个碱基左右, 扩增片段长度在100~300bp, 上下游引物的退火温度相差不超过4℃。此外当一条DNA序列中含有两个微卫星位点, 且相距>50bp时, 每个位点分别设计引物;反之, 引物设计时就尽量使两个位点在一对引物的扩增范围内。

1.6 SSR标记体系建立

经优化筛选建立油茶SSR标记体系。PCR反应体系:10μL中含10×PCR缓冲液1μL, Mg2+2.5 m M, d NTPs 0.2 m M, 上下游引物各0.2μM, Taq聚合酶1U (5 U/μL) , DNA30 ng左右。PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃, 30 s, Ta, 40 s, 72℃, 30 s, 25个循环;最后72℃延伸1 min, 8℃保存, Ta为各引物对应的退火温度。采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物, 50 bp Marker (天根) 作为标准分子量, 电泳产物经银染后对各位点进行数据判读。

2 结果与分析

2.1 油茶微卫星富集文库的构建

本研究中有针对性的选取BSP143I及酶所对应的接头, 有选择性的截取片段大小合适的DNA模板进行微卫星探针杂交, 并通过PCR放大产物, 从而获得足够用于测序的富含微卫星位点的DNA片段, 方法简单快速。试验中通过对接头连接及磁珠富集前产物的浓度优化 (原液、稀释5倍、稀释10倍) , 来控制PCR放大扩增质量, 其中产物均以稀释5倍后效果最佳。其中用oligo A接头引物对富集产物进行PCR扩增检测, 电泳检测见图1, 最终切取约500 bp左右的片段用于质粒重组转化。为严格筛选阳性克隆, 本试验增加微卫星探针PCR检测步骤, 若克隆中含有微卫星序列, 则PCR产物应比阴性对照增加对应扩增产物。其中PCR法筛选油茶微卫星DNA片段的部分阳性克隆的电泳见图2。利用该方法提高了克隆测序的准确率。

2.2 克隆测序及引物开发

本试验最终获得具有微卫星序列的克隆测序结果52份, 去除质粒序列及接头引物序列后, 碱基长度在181~453 bp, 其中各微卫星位点都符合探针AG与AC所对应的重复基元, 基本以AG/CT与AC/GT重复为主, 重复次数在9~36不等, 其中未观测到其他类型的微卫星重复基元。成功利用其中的40条DNA序列开发SSR引物编号YC_g SSR01~YC_g SSR40, 序列开发引物成功率在90%以上, 对扩增结果进行比较分析后, 共得到14对具有清晰扩增条带的SSR引物, 占总引物的35%。各引物信息特征见表1。

2.3 遗传多样性分析应用

标记多态性检测用材料为18个高产无性系来自于江西油茶国家良种, 编号为赣无系列, 全部为6倍体物种, 18个无性系的主要表型及经济性状见文献[7]。经筛选, 表1中2、3、6、9、13、15号引物具有较好的扩增多态性, 数据按1/0统计后经POPGEN 32软件计算, 5个标记共获得30个位点, 其中多态位点22个, 占93.3%;18个无性系总的基因多样 (H) 为0.3432, 总的Shannon多样性指数 (I) 为0.510 4, 显示各无性系多样性较为丰富, 各无性系的UPGMA遗传距离聚类同样显示各无性系遗传关系复杂多样 (图3) 。

3 讨论

SSR作为一种有效的分子标记已被广泛应用于遗传多样性分析、遗传图谱构建、物种分类和系统发育以及比较基因组学等许多研究领域。然而, 传统SSR标记的开发依赖于构建基因组文库并进行批量测序, 从而获得大量的DNA序列作为引物开发的基础, 费时费力且效率不高。诚然, 随着植物基因组学的发展, 大规模植物基因测序技术日新月异, 二代测序技术如Roche公司的454技术、illumina公司的Hiseq技术等推动了高通量转录组测序时代的来临, 通过测序得到大量DNA序列来开发SSR标记已经成为非常有效的SSR分子标记开发途径。但近10 a来, 利用选择杂交进行SSR富集分离的方法, 针对希望短时间、低成本的快速获得微卫星引物的研究者来说, 仍是较为普遍的方法。

在本研究中, 利用生物素标记的SSR探针与油茶合适片段大小的基因组文库杂交, 杂交反应产物利用磁珠的固定作用分离出富含SSR的DNA序列, 随后再次利用SSR探针进行富含SSR序列的筛选与富集。其中, SSR探针的选择是杂交富集SSR成败的关键。Tóth等[8]对几个物种的微卫星分布特点进行比较分析, 其分析结果显示基因组中二核苷酸重复基元中以 (AC) n、 (AT) n和 (AG) n为主。但 (AT) n易形成二级结构不宜用作探针筛选微卫星, 因此本研究使用 (AC) 与 (AG) 类型的生物素探针。本研究采用该方法成功的开发了14对油茶SSR标记, 其中6对标记在18个油茶无性系中表现出较好的多态性, 可见该方法简单快速而有效, 可为山茶属其他重要经济树种的相关研究提供很好的借鉴。

参考文献

[1]Zhang D L, Stack L, Zhang R Q, et al.Teaoil camelliaeastern"olive"for the world[J].Acta Hort., 2008, 769:43-48.

[2]刘冰, 金龙, 曹翠萍, 等.油茶SSR-PCR反应体系建立与优化[J].安徽农业大学学报, 2011, 38 (6) :858-862.

[3]邓玉营, 徐立安, 张博, 等.黄花柳基因组微卫星分离及多态性位点检测[J].分子植物育种, 2008, 6 (1) :89-94.

[4]谢明璐, 候北伟, 韩丽, 等.铁皮石斛SSR标记的开发及种质纯度鉴定[J].药学学报, 2010, 45 (5) :667-672.

[5]彭镇华, 刘贯水, 李璐滨, 等.磁珠富集法开发毛竹SSR标记引物[J].林业科学研究, 2011, 24 (6) :743-748.

[6]温强, 叶金山, 雷小林, 等.油茶ISSR反应体系建立及优化[J].中南林学院学报, 2006, 26 (6) :22-26, 43.

[7]温强, 雷小林, 叶金山, 等.油茶高产无性系的ISSR分子鉴别[J].中南林业科技大学学报, 2008, 28 (1) :39-43.

标记基因 第7篇

早在20世纪60年代,Rodbell等人已经成功从脂肪组织分离获得细胞,之后这一方法经过多次修饰后被用于从脂肪组织中分离干细胞[4,5]。当前从脂肪组织中分离干细胞的最常用方法是通过胶原酶消化脂肪组织,但酶解效率并不高,每克脂肪分离的细胞量仅在105数量级[1,3,6,7,8]。尽管有研究通过采用不同酶组合消化的方法有效提高了ASC的产率,但是其细胞产率同样很少能达到106个/g脂肪,无法满足组织工程与再生医学对种子细胞的大量需求[9,10,11]。

本研究通过优化胰蛋白酶和胶原酶对脂肪组织的消化条件,获取ASC高效分离方法,同时利用荧光基因标记方法对分离的ASC进行标记和功能检测,为后期ASC的组织工程与再生医学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

SPF级别SD大鼠,80~120 g,日龄25~35 d,共12只,购自维通利华实验动物中心。

1.1.2 试剂

抗坏血酸(99%)、IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤,≥99%)、地塞米松(≥98%)、吲哚美锌(99%)、Ⅰ型胶原酶(≥31.25~125 units/mg solid)购自Sigma公司;胰酶(250 N.F.U/mg)购自Gibco公司;荧光标记的CD29(100μL)、CD45(100μL)、CD34(100μL)、CD90(100μL)均购自BD公司;α-MEM(500 m L)购自Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum)购自MD genics公司。GFP-Fluc的慢病毒载体(1011PFU/m L)购自赛业生物(广州,赛业生物科技)。

1.2 方法

1.2.1 消化酶组分与脂肪来源干细胞的分离

脂肪组织分离自SD大鼠腹股沟,经无菌解剖液冲洗数次去除血污。随后,将脂肪组织充分剪碎,实验分3组,分别添加0.1%Ⅰ型胶原酶、0.1%胰酶或0.1%Ⅰ型胶原酶+0.1%胰酶,37℃条件下消化,不断轻轻搅拌。

为确定最佳消化时间,分别消化处理30 min、45min、60 min,然后加入血清终止消化。200μm孔径的筛网过滤,600 g离心5 min收集细胞,加入红细胞裂解液去除血细胞后,血细胞计数器计算每克脂肪组织活得的细胞,同时台盘兰染色计算死细胞数。37℃、5%CO2孵箱孵育24 h活细胞完全贴壁,收集未贴壁的细胞并计数,用于评估不同的消化时间对分离细胞活力的影响。

1.2.2 流式细胞术

将配到P3代细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集,用0.1%BSA溶液将细胞重悬至1×106m L-1,选择兔抗大鼠的PE anti-rat CD29、FTTC anti-rat CD90、FITC anti-rat CD45和PE anti-rat CD34抗体室温孵育20 min,PBS为对照组。离心,弃上清后重悬,用流式细胞仪(FCM)检测CD29、CD90、CD34和CD45的表达,通过利用Cellquest软件采集和分析。

1.2.3 ASC的转染标记

将生长良好的ASC提前1d以1×105细胞/孔接种于6孔培养板。次日,去除培养液,加入1 m L新鲜培养液,同时以MOI=10的剂量加入慢病毒浓缩液,37℃孵箱孵育24 h,去除培养液,PBS多次洗涤后,加入新鲜培养液进行培养。2 d后,用荧光显光显微镜观察GFP表达,细胞扩增后通过流式细胞数检测GFP阳性细胞率评价病毒转染效率。同时,加入能够有效杀死对照组ASC的最低浓度嘌呤霉素进行筛选成功转染标记的细胞。

1.2.4 ASC的生长特征和分化潜能鉴定

1.2.4. 1 MTT法分析ADSCs的生长动力学

ASCs分别以1×104细胞/孔的密度接种于96孔培养板来测定细胞增殖曲线。每天通过MTT法测定细胞的吸光值。测定前,每一培养孔中加入20μl MTT液(25 mg/m L),37℃、5%CO2孵箱孵育4 h,弃去上清液,加入150μl DMSO,充分混匀,使用酶标仪,490 nm波长下测定每一培养孔的吸光值,每组至少测定5孔,取平均值。对照组为经过同样操作的无细胞培养孔。

1.2.4. 2 ADSCs的多向分化潜能鉴定

成脂肪、成骨诱导分化与分析按照Zuk PA的方法[5,12],方案见表1。成脂分化的表型获得通过油红O染色来检测确定。为了评估成骨分化的表型,诱导分化3 w后通过茜素红染色检测基质的矿化水平。

1.2.4. 3 RT-PCR

成脂分化2 w和成骨诱导分化3 w后,用试剂盒提取细胞总mRNA(OMEGA Total RNA,OMEGA,USA),反转录获取c DNA(Quant Script RT Kit,Tiangen),然后RT-PCR检测成脂和成骨分化相关基因的表达水平。采用两步法PCR扩增,扩增条件为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,之后72℃延伸30 s,共40个循环。RT-PCR中所用引物见表2。最后2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.5 生物发光成像

对于体外培养细胞,将不同数量梯度的细胞利150μg/m L D-荧光素底物孵育,1 min后采集0.5~1 min内的发光信号,检测细胞数量与生物发光信号之间的线性关系。对于体细胞,将1×106细胞注射到小鼠腹股沟部位。检测前,利用含2%异氟烷的气体麻醉小鼠,腹腔给药D-luciferin(0.150 mg/g体重),并将小鼠放置于成像仓,成仰卧体位,采集峰值信号。

1.2.6 统计学分析

剂量结果利用x±means表示,不同组样本平均数之间利用单因素方差分析,P<0.05时有统计学差异。统计软件为SPSS 13.0。

2 结果与分析

2.1 ASC分离条件的优化

由图1可见,0.1%Ⅰ型胶原酶+0.1%胰酶组能够显著提高ASC分离效率,细胞产量较单一胰酶或胶原酶消化提高4~5倍;随着消化时间延长细胞产量增加,但当消化时间达到45 min后,继续延长消化时间对细胞产量没有显著影响,45min与60min细胞产量相似,60 min消化后较45 min消化死细胞数显著增加。因此,最佳消化时间为45 min(图1)。

2.2 培养细胞的表型特征

ASC分离培养3代后,通过流式细胞术对相关表面标志的表达情况进行检测,如图2所示,大多数细胞表达CD29、CD90等标志物,而几乎不表达CD45、CD34等造血谱系的标志物,这一表型特征与文献报道相似。

2.3 GFP-Fluc双报告基因的标记

经慢病毒孵育转染后,流式细胞检测显示GFP阳性率可到40~50%,经过嘌呤霉素筛选后,GFP阳性率能高达99%,表明获得了纯度较高的GFP-Fluc双报告基因标记细胞(见图3)。

2.4 慢病毒转染后的ASC生物学性能评价

MTT检测结果证实经过慢病毒转染后的ASC与正常ASC有着相似的增殖能力(图4)。如图5所示,ASC与慢病毒转染后ASC的形态相似,都呈纤维状,且与正常培养的ASC(图5A)相比,经慢病毒转染后的细胞表达绿色荧光蛋白(图5D)。茜素红和油性红染色结果(图5B,C,E,F),以及成脂肪和成骨分化特异性基因RT-PCR检测结果(图6)显示二者具有相似的成脂肪和成骨分化潜能。以上结果表明慢病毒转染未对ASC的生物学性能产生明显影响。

2.5 体外与体内生物发光成像示踪

如图7A所示,体外细胞数量与生物发光信号成线性关系,表明生物发光信号可以用于ASC的定量追踪。而体内生物活体成像结果进一步证实(图7B),慢病毒标记的ASC可以用于活体干细胞移植后的追踪。

3 讨论

组织工程和再生医学是一门多学科交叉的科学,近年来随着现代生物技术进步而迅速发展[13,14]。尽管如此,如何选取合适的干细胞用于再生医学的修复研究及应用,仍然是一项具有挑战性的困难工作[15,16]。一般地,用于再生医学的干细胞应该满足下列条件:(1)能够大量获得;(2)收集方法具有较低的侵入性;(3)具有多向分化潜能;(4)能够安全、有效地移植到自体或同种异体宿主;(5)便于产业化实际应用。

脂肪组织在自体细胞移植替代治疗方面是一类来源丰富、实用且诱人的供体组织来源。目前研究表明,脂肪来源的间充质干细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的性质,并且在组织修复与再生中具有广阔的应用前景[17,18,19]。尽管如此,现有的从脂肪组织分离细胞的方法还具有一定局限性,导致细胞治疗所要求的细胞数量只能通过大量的抽取脂肪组织或者长期的传代培养来满足,很不适合实际应用需要。因此,在脂肪来源干细胞的治疗前景被充分应用之前,有必要开发一种以最少脂肪组织、在较短时间内获得充足细胞的高效分离方法。

本研究中,通过对胶原酶、胰蛋白酶和二者复合酶三种消化方法进行优化比较,发现0.1%Ⅰ型胶原酶+0.1%胰蛋白酶的复合酶消化能够显著提高ASC分离效率,最佳消化时间45 min,细胞产量较单一酶消化提高4~5倍。流式细胞术鉴定结果表明,经体外扩增培养的ASC以表达CD29和CD90等标志物为主,而几乎不表达CD45、CD34等造血谱系的标志物。

近年来,基于报告基因的非侵袭性成像方法为干细胞移植后的检测分析提供了有效手段。非侵袭性成像法不仅可以用于体内细胞移植后的追踪,同时还具有实时检测细胞存活数量和位置等信息[20]。由于标记的报告基因具有稳定遗传的特性,由此为细胞增殖的实时追踪提供了有效手段[21]。在本研究中,通过利用载有GFP-Fluc双报告基因的慢病毒转染ASC,其GFP阳性率能高达99%。不仅如此,ASC与慢病毒转染后ASC的形态相似,都呈纤维状,并且具有相似的成脂肪、成骨分化潜能和增殖能力。而体外细胞生物发光和体内活体发光成像示踪结果表明,ASC可以用于活体干细胞移植后的定量追踪。

综上,通过利用胶原酶、胰蛋白酶复合酶法可以有效提高脂肪干细胞的原代分离效率。慢病毒标记后的ASC,具有正常ASC相似的多项分化潜能和增殖能力,且具有良好的活体发光成像示踪性。

摘要：[目的]探索ASC高效分离方法,采用荧光基因标记法对分离的ASC进行标记、功能检测和示踪研究。[方法]通过优化脂肪组织的酶解消化条件,分别采用胶原酶、胰蛋白酶及组合对脂肪组织消化,检测细胞产量,并用流式细胞术进行鉴定。之后利用GFP-Fluc双报告基因对体外分离培养的ASC进行标记,鉴定其多项分化潜能。[结果]胶原酶、胰蛋白酶复合酶消化能够显著提高ASC分离效率,细胞产量较单一酶消化提高4~5倍。体外扩增培养ASC以表达CD29、CD90等为主。GFP-Fluc基因标记后的ASCs具有成脂肪、成骨分化潜能,可用于活体干细胞移植后的定量追踪。[结论]胶原酶、胰蛋白酶复合酶解法可以显著提高脂肪干细胞的原代分离效率4~5倍。

标记基因 第8篇

黑龙江省作为我国重要的春小麦产区,也是国内新近区划出的大兴安岭沿麓强筋麦产业带的主栽地。随着育种目标的过度集中,所培育的小麦新品种遗传基础愈加狭窄。因此为防止此趋势恶化,急需引进新的基因源来丰富黑龙江地区的育种亲本谱,扩展本地区春小麦遗传基础。俄罗斯春小麦产区纬度与黑龙江接近,其春小麦农艺性状如春化和光周期等特性与黑龙江的较为相似,更重要的是俄罗斯小麦品质类型以面包麦为主。因此,俄引春小麦优异资源作为杂交亲本改良黑龙江小麦品种时,可在更容易保证其强筋品质性状下丰富本地区春小麦的遗传基础。黑龙江省农业科学院对俄农业技术中心通过多年对俄合作,引进大量的小麦种质资源。但是,有关LOX活性基因在这些品种上分布情况还未见报道。为此,该研究选用部分俄引春小麦品种为试材,利用新开发的与LOX相关的分子标记对这些品种进行分析,为黑龙江省地区小麦品种改良和种质创新提供分子遗传学信息。

1 材料与方法

1.1 材料

俄罗斯引进的春小麦品种247份,主要来源于俄罗斯的东南部和远东小麦产区。所有供试品种由黑龙江省农业科学院对俄农业技术合作中心收集和保存。PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。GeneAmpPCR System 9700PCR仪,BIO-RAD Sub-cellModel192商通量电泳槽,BIO-RAD凝胶成像系统。

1.2 方法

于2013年黑龙江省农业科学院园艺分院田间双行种植,3 m行长,行距15cm,株距5cm。小麦三叶期选有代表性的3 株混合采样,按CTAB法提取基因组DNA[11]。

根据Hongwei Geng等的研究结果[7,8],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成SSR标记Xwmc312和STS标记LOX16/LOX18的引物序列,用以分别检测QLpx.caas.1AL和QLpx.caas-4B位点上脂肪酸氧化酶活性基因等位变异。

标记的反应体系为25μL:PCR反应体系25μL,含模板50ng,Taq酶1.25 U,上下游引物(10μmolL-1)各1.0μL,dNTPs(2.5mmolL-1)2.0μL,10PCR缓冲液[100 mmolL-1Tris-HCl(pH8.3),50 mmolL-1KCl,15 mmolL-1MgCl2]2.5μL,用ddH2O定容至25μL。Xwmc312的扩增程序为95℃预变性5min;95℃变性1min,67℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环;72℃ 延伸8min。引物LOX16 的扩增程序为95℃预变性5min;94℃变性45s,63℃退火45s,72℃ 延伸1min,35 个循环;72℃ 延伸10min。LOX18的扩增程序为95℃预变性5min;94℃变性45s,63℃退火45s,72℃延伸1 min,35 个循环;72℃延伸10min。

PCR扩增产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳45min后,通过凝胶成像系统扫描分析。

2 结果与分析

2.1 QLpx.caas-1AL位点Xwmc312标记的多态性分析

与QLpx.caas-1AL位点上紧密连锁的Xwmc312有3 种等位变异,分别是Xwmc312-247,Xwmc312-235和Xwmc312-227。其中Xwmc312-235为LOX高活性等位变异,另外2种为低活性等位变异。从图1看出,247份供试材料QLpx.caas-1AL位点的PCR检测结果表明,ZXM1,ZXM3和ZXM12等共142份品种扩增出247bp特异条带,占57.49%;ZXM9,ZXM33和ZXM63等共85份品种扩增出235bp特异条带,占34.41%;ZXM32,ZXM85和ZXM357等20份品种扩增出227bp特异条带,占8.10%。

M:DL2000;1~24:ZXM60,ZXM59,ZXM58,ZXM57,ZXM56,ZXM55,ZXM54,ZXM53,ZXM50,ZXM45,ZXM43,ZXM60,ZXM52,ZXM51,ZXM49,ZXM48,ZXM42,ZXM41,ZXM40,ZXM85,ZXM35,ZXM33,ZXM32,ZXM31

2.2 4BS上TaLOX-B1位点标记LOX16/LOX18的多态性分析

4BS上TaLOX-B1 存在两种等位变异,TaLOX-B1a(高LOX活性)和TaLOX-B1b(低LOX活性)。显性等功能互补PCR标记LOX16和LOX18能有效区别该为点高低LOX活性等位变异类型。TaLOX-B1 位点的PCR检测显示(见图2),247份供试材料TaLOX-B1 位点的PCR检测结果表明,共有247 份材料扩增出LOX16 或LOX18 特异条带。 其中,ZXM356、ZXM383和ZXM386等16份品种扩增出LOX16特异条带,属于高LOX活性的等位基因型TaLox-B1a,占6.48%;ZXM1、ZXM3 和ZXM367等230份品种扩增出LOX18特异条带,为低LOX活性的等位基因型TaLOX-B1b,占93.12%;有1 份材料(ZXM334)同时扩增出LOX18和LOX16特异条带,表明该品种在此基因位点处于杂合状态,占0.41%。

因此,在俄罗斯引进小麦品种中,主要以TaLOX-B1 位点上与低LOX活性相关的TaLOX-B1b基因型为主,TaLOX-B1a基因型较少。

M:DL2000;1-18:ZXM1,ZXM3,ZXM356,ZXM4,ZXM5,ZXM386,ZXM7,ZXM10,ZXM383,ZXM357,ZXM12,ZXM14,ZXM15,ZXM16,ZXM214,ZXM17,ZXM18,ZXM372

2.3 QLpx.caas.1AL与TaLOX-B1 位点上等位变异组合类型的分布

由表1可知,出现6种基因组合,按分布频率大小依次为:Xwmc312-247/TaLOX-B1b(分布频率53.85%),主要包括ZXM1、ZXM2和ZXM380等133 个品种;Xwmc312-235/TaLOX-B1b(分布频率31.58%),包括ZXM11、ZXM35和ZXM362等78个品种;Xwmc312-227/TaLOX-B1b(分布频率7.69%)包括ZXM32、ZXM33 和ZXM382 等19个品种;Xwmc312-247/TaLOX-B1a(分布频率3.64%),包括ZXM166、ZXM356和ZXM370等9个品种;Xwmc312-235/TaLOX-B1a(分布频率2.43%),主要有ZXM167、ZXM200 和ZXM372等6个品种;Xwmc312-227/TaLOX-B1a(分布频率0.41%),仅有ZXM357这1个品种。其中,第一种组合为主要类型,占供试品种的一半以上,后3种组合所占比例较低,合计不超过7%,另外一个品种ZXM334 的等位变异组合类型为Xwmc312-247/TaLOX-B1a/b。

注:A:Xwmc312-247;B:Xwmc312-235;C:Xwmc312-227;a:TaLOX-B1a;b:TaLOX-B1b.Note:A:Xwmc312-247;B:Xwmc312-235;C:Xwmc312-227;a:TaLOX-B1a;b:TaLOX-B1b.

3 结论与讨论

为了明确俄引春小麦的各种生物学特性,便于其用于黑龙江春小麦的品种改良,该研究首先利用Geng等[7,8]开发出针对LOX活性的2个主效基因位点(QLpx.caas-1AL和4BS上的TaLOX-B1)的分子标记对俄引的245份春小麦品种分析,结果表明,在QLpx.caas-1AL位点上,Xwmc312-247基因型比例为57.49%,Xwmc312-235基因型比例为34.41%,Xwmc312-227基因型比例为8.10%。第一种基因型最多,最后一种最少,这种分布趋势与在黑龙江品种上的结果相似: Xwmc312-247、 Xwmc312-235和Xwmc312-227分别是59.06%,22.05% 和18.11%。Xwmc312-247基因型最多,Xwmc312-227最少,与国内其他学者也有相似结果[9,10]。关于TaLOX-B1位点,研究结果表明,俄引品种高活性等位基因型TaLOX-B1a分布比例是6.48%,低活性的等位基因型TaLOX-B1b分布比例是93.12%;其中有一个品种在此位点表现杂合。而在黑龙江品种上虽然TaLOX-B1b分布比例表现高、TaLOX-B1a分布比例低,但是俄引春小麦品种低活性等位基因型TaLOX-B1b分布比例高出黑龙江品种4 个百分点,相应的其TaLOX-B1a分布比例低于黑龙江品种4个百分点。通过比较表明,俄引春小麦与黑龙江的LOX活性有差异。

标记基因 第9篇

肉羊的多胎性状是由其基因型决定的,它是可遗传的,遗传力为0.1~0.3[3,4,5]。生产实践中,德肉美母羊能产双羔,因此可以通过表型选择和基因型选择来提高产羔率的遗传进展[6,7,8,9],提高经济效益。德肉美羊多胎(Fec B)基因的遗传效应可以增加排卵数和产羔数。为了加快培育适合黑龙江省生态环境并且生产性能稳定的肉用绵羊高繁新品种(系),利用RFLP标记技术对德国美羊多脂基因型进行检测,找出与多胎性能相关的基因型提高肉羊产羔率,从而促进黑龙江养羊业的快速发展。

1 材料

1.1 试验动物

86只德肉美肉羊,均由齐齐哈尔市德美萨肉羊繁育有限公司提供。

1.2 试验试剂

PCR扩增所用的Taq DNA聚合酶、d NTP、Buffer、r Taq聚合酶、AvaⅡ限制性内切酶、DL-2 000 Marker,均由哈尔滨市香坊区海基试验耗材经销部提供;引物,由北京华大基因研究中心合成。

2 方法

2.1 样品的采集

根据羊的产羔记录,有针对性地选取一些产双羔的肉羊样本。用专制带有挡板的采样剪刀采集羊耳组织,用准备好的75%乙醇棉球擦拭耳部,剪刀也要用75%乙醇棉球擦拭,将采集的耳组织放入含75%乙醇0.5 m L的EP管中。

2.2 基因组DNA的提取

用酚、氯仿、异戊醇方法抽提基因组DNA。

2.3 基因组DNA的浓度测定和质量检测

使用分光光度计(由安法玛西亚公司提供)测定DNA浓度。根据记录的OD260/OD280比值估测DNA质量,一般OD260/OD280在1.6~1.8之间可以满足试验要求。根据记录的OD260数值及稀释倍数换算出待测DNA的浓度,并进行相应的稀释,以30 ng/μL分装作为工作液,4℃保存使用,DNA原液于-20℃保存。

2.4 引物的设计与合成

根据绵羊BMPR-IB基因(Gen Bank登录号为AF357007、AF298885)序列设计1对强制产生限制性酶切位点AvaⅡ(G/GTCC)的上、下游引物,预期扩增片段长度为140 bp,用于RFLP检测。RFLP引物序列:上游引物5'-GTCGCTATGGGGAAGTTTG-GATG-3',下游引物5'-CAAGATGTTTTCATGCCT-CATCAACACGGTC-3'。

2.5 体尺体重测定

羔羊出生2小时时和3月龄断奶时称重并测量体尺(体重、体高、体长、胸围)。

2.6 记录产羔数

记录德肉美羊产羔数,严格对应耳号。

3 结果与分析

3.1 RFLP检测结果

3.1.1 PCR反应体系

PCR反应体系(10μL):灭菌去离子水6.5μL,30 ng/μL的DNA模板0.5μL,10×Buffer 1.0μL,2.5 mmol/L的d NTP 1.0μL,10 pmol/μL的上、下游引物各0.25μL,0.5 U/μL的r Taq聚合酶0.5μL。

3.1.2 PCR反应循环参数

94.0℃预变性5 min;94.0℃变性30 s,58.0℃退火30 s,72.0℃延伸30 s,共36个循环;72.0℃再延伸5 min。

3.1.3 RFLP酶切体系

引物1的PCR扩增产物用AvaⅡ限制性内切酶进行酶切,酶切反应总体积为15μL,其中PCR产物5μL,10×Buffer 1.5μL,10 U/μL AvaⅡ限制性内切酶1.0μL,去离子水7.5μL,振荡,短暂离心(转速达12 000 r/min即可),酶切反应条件为37℃水浴4 h。

3.1.4 PCR产物扩增

以基因组DNA为模板进行PCR扩增,PCR产物用1%琼脂糖胶检测,结果表明,特异性扩增良好,片段长度与所设计的片段大小一致(140 bp),而且没有非特异条带,因此可以用来进行RFLP分析,结果见图1。

1.对照;2~11.PCR产物;M.DL-2 000 Marker。

3.1.5 RFLP酶切检测结果

所测的86个个体的电泳RFLP分析结果表明,产生3种基因型(见图2)。BMPR-IB746位点为G时会产生限制性内切酶AvaⅡ的酶切位点(G/GTCC),AvaⅡ酶切PCR产物后会产生2个片段(110 bp、30 bp);该位点为A时(AGTCC)则不存在AvaⅡ酶切位点,酶切PCR产物后只有1个片段(140 bp);该位点为A/G杂合时酶切PCR产物后会产生3个片段(140 bp、110 bp、30 bp)。将只有110 bp片段的命名为BB基因型,只有140 bp片段的命名为++基因型,有140 bp、110 bp 2个片段的命名为B+基因型。

3.2 各基因型母羊数量

结果见表1。

由表1可知,6只母羊携带Fec B纯合型(BB)基因,29只母羊携带Fec B杂合型(B+)基因,51只母羊携带Fec B野生型(++)基因。

1,2,4,7.B+基因型;3,5,6,8.BB基因型;9,10.++基因型;M.DL-2 000 Marker。

3.3 产羔率

结果见表2。

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异极显著(P<0.01),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

由表2可知,BB和B+基因型母羊的每胎产羔数均为2.000 0只,而++基因型母羊的每胎产羔数仅为1.000 0只。预测BB和B+基因型的母羊每胎产2只羔羊,++基因型的母羊每胎产1只羔羊。

3.4 产羔率与羔羊各项生产性能相关性的研究

3.4.1 初生重与体尺

结果见表3。

注:同列数据肩标大写字母不同表示差异极显著(P<0.01),小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写或大写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

由表3可知:徳肉美母羊BB基因型所产羔羊初生重为4.34 kg(n=6),B+基因型母羊所产羔羊初生重为4.42 kg(n=29),而++基因型母羊所产羔羊初生重为5.38 kg(n=51),经计算++基因型母羊所产羔羊初生重比BB基因型、B+基因型母羊所产羔羊初生重分别高1.04 kg、0.96 kg,且差异极显著(P<0.01)。++基因型母羊后代的体高、体长、胸围显著高于B+基因型、BB基因型母羊所产后代(P<0.05)。表明初生羔羊体重、体尺指标与母羊的产羔率成反比,即母羊的产羔率越高,所产羔羊的体重和体尺指标越小。

3.4.2 断奶重与体尺

结果见表4。

注:无肩标表示差异不显著(P>0.05)。

由表4可知,徳肉美BB基因型、B+基因型、++基因型母羊所产羔羊断奶重分别为26.52 kg、26.73 kg、27.34 kg,不同基因型断奶重与体尺之间差异不显著(P>0.05)。

4 讨论

试验中,BB基因型和B+基因型母羊的每胎产羔数均为2.000 0只,++基因型母羊的每胎产羔数为1.000 0只,表明Fec B基因是控制德肉美羊多羔性状的主效基因。BB基因型和B+基因型母羊可以留作种用,而且可优先选配带多胎基因的公羊[8],这加快了育成黑龙江地区肉羊多胎品系的速度。研究3月龄断奶重和体尺与单胎羔羊的体尺与体重差异不显著(P>0.05),说明早期生长发育快能稳定遗传。研究结果将直接推动和加速黑龙江省肉羊多胎品系的育种工作,具有重大的理论意义和实践价值。

参考文献

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