表达调控范文

表达调控范文（精选9篇）

表达调控 第1篇

一、企业知识基因的确定

企业知识是指在企业经营活动中, 能够参与价值创造的各类知识。这种知识包括企业经营管理中的各类显性知识、隐含知识以及有这些知识所产生出来的新知识。企业的知识主要有以下三种来源; (1) 由企业的信息系统所捕获的信息; (2) 本企业的已有知识所产生出的新知识; (3) 在企业最佳实践活动所产生的经验成果。

从知识的角度来看, 企业的知识是决定一个企业性状的最根本因素之一, 正如生物体的性状由基因决定一样, 企业的性状是由其知识决定的。由于企业知识分布广泛, 并非所有知识都对企业的生命活动发挥作用而影响其生物性状。因此, 企业基因定义为对企业生命活动及其性状起表达作用的专有知识。企业基因就是一个企业生命体中某些具有遗传功能的能够影响和制约企业发展的元素的片段, 每个片段都可以独立起作用, 也可以几个片段综合起作用, 进而影响制约甚至决定企业的生存与进化。

二、企业基因的表达调控

生物体内每个细胞都含有该物种的一整套基因, 基因通过复制把遗传信息传递给下一代, 从而使后代表现出与亲代相似的性状, 遗传学上把这一过程叫做基因的表达。生物体内的基因之所以能够有序的表达, 是因为生物体内存在着对基因表达的调控机制, 这种机制是生物体内所不可缺少的。

企业基因同样具有表达与调控机制, 企业基因复制是指专有知识在企业中被表达、传授和保持, 也就是专有知识被企业内员工共享、被企业记录下来, 有的知识甚至能够被企业精确地复制。有了企业基因组的复制, 构成企业核心竞争力内核的专有知识 (主要为默会知识) 则不会随经营环境变迁、员工流动等而改变, 企业核心竞争力将具有稳定性和复制性。

麦当劳的餐饮帝国, 背后隐藏着一套完整的企业基因复制表达与调控的机制。同时, 这种机制在麦当劳这样的连锁企业中得到了最典型的实现。目前, 麦当劳在118个国家设有31062家餐馆, 每天服务顾客4700多万人。企业基因通过连锁复制, 各个分店表现出与原店一样的企业特质。下面我们将深入探讨连锁经营企业的基因是如何进行复制的。

麦当劳培训是麦当劳企业基因表达机制传递路径, 其基因表达机制如图所示。麦当劳在世界上有5所大学, 教授来自世界各地, 教学设备先进, 芝加哥的汉堡包大学时对分店经理和重要员工培训的基地。企业基因有BOC、BMC、IOC、AOC、OMC等。BOC包括产品制作方法;生产及质量管理、营销课程、作业和资源管理、利润管理等;AOC包括QSCV (Quality, Service, Cleanness&Value) 研究、提高利润方法、房地产、法律、财务分析、人际关系等;专题管理技巧、现场监督、市场评估等。

麦当劳特许连锁经营是麦当劳基因表达调控机制。麦当劳有一套严格的基因复制和调控程序和标准, 严格的申请基因复制标准和复制要求。具体步骤:一是分店的建立, 每加一家分店, 麦当劳总部都要派人选择地址、组织安排店铺的建筑、设备安装和内外装饰, 确保复制店面风格一致;二是特许费。特约经销商一旦与公司签约, 须先付一笔2.25万的特许使用费其中一半现金支付, 另一半以后支付;以后每年按当年销售额上交公司一笔特许权使用费 (3%) , 房产租金 (8%) ;三是合同契约。公司为特许经营者承担下列责任:公司在汉堡包大学培训员工;开展管理咨询;协助经营, 负责广告宣传、公共关系和财务咨询;提供培训所需的阅读材料、教具设备;向特许店提供供货优惠;四是货物分销。公司不直接现代特许店提供餐具、食物原料, 而是与专业供销公司签约, 再由他们向分店送货。

三、从企业基因的视角看, 企业基因及其载体层面的成功复制是连锁行业成功的前提

企业拥有很好的体系能够把企业的基因完整无缺的进行精确的复制, 不断地累计优秀的企业基因, 并且反复执行而获得效益, 企业基因的复制机制起着基础性作用。正是由于企业基因在遗传复制中, 将企业与另外的企业相区分的性状保留下来, 企业的成长是通过企业基因复制完成的, 保障了企业在运营过程中稳定而有序的状态得以持续存在和发展。

摘要：采用类比法, 比照生物学中基因的有关概念和理论从新的视角探究了企业基因复制的问题。建立了基于知识的企业生物概念体系, 较为深入地研究了企业基因 (企业专有知识) 的表达调控机制, 并以麦当劳连锁经营为案例, 研究企业基因复制和调控路径。

关键词：企业基因,基因复制,企业知识,连锁经营

参考文献

[1]薛亮:野中郁次郎的知识转化理论综述[J].北京师范大学经管学刊2005 (6) :75～～76

[2]吴洁云赵阳阳:麦当劳:温情征服世界[M].北京:中性出版社, 2004

[3]雷海民:企业生命工程基础理论的研究[M].大连大学2005:80～81

维生素对人类基因表达调控的研究 第2篇

【关键词】 维生素基因表达与沉默调控

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.554 文章编号：1004-7484（2012）-08-2858-02

作为外部因子的各种营养成分与人类基因的表达与沉默，它们之间相互作用主要表现在两个方面：一方面营养成分的摄入量影响了人类基因的表达与沉默；另一方面基因表达结果又影响了营养成分的代谢途径和代谢效率，并决定了个体对营养物质的需要量。随着二十世纪后半叶分子生物学、分子遗传学、细胞营养学等理论的迅速发展，科学界对维生素调控基因表达的方式、途径和作用机制都得到了不断揭示，其重要性受到了人们越来越多的关注。

维生素调控和影响基因表达的主要方式是维生素作为酶的辅助因子参与基因表达，作为酶的辅助因子参与基因表达的维生素中最典型的维生素莫过于VH，又被称为辅酶R或者生物素，除了直接参与D-C6H12O6异生作用的代谢外，VH还可以参与合成脂肪酸或者氨基酸的代谢过程。在参与四种羧化酶催化作用时，VH主要起到辅基的作用，即乙酰辅酶AacetylCoA辅酶A、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶、丙酮羧化酶、羧化酶丙酰辅酶A。饮食是哺乳动物VH的唯一来源，肠粘膜内存在的辅酶R酶能够进行蛋白结合VH切分。Maeda等（1996）试验报道，大鼠辅酶辅酶R充足组中OTC的活力明显高于辅酶R缺乏组，辅酶R充足组肝脏内的氨基酸转氨甲酰酶OTC在基因表达过程中比辅酶R缺乏组高40%。这就说明在缺乏VH的条件下会导致OTC活力降低和OTCm核糖核酸数量减少。

维生素作为一些蛋白质转录因子的组成部分，调控多种基因的表达，对基因的表达产生重要影响，这里以维生素A在脱氢酶作用下氧化代谢产物视黄酸为例子。视黄酸受体是能够和视黄酸进行特异结合的细胞核内受体，是类固醇激素类细胞核受体中的一种，存在于细胞核内基因转录调节控制范围内，目前，已知受其调节控制的基因数量已经达到五十多种，视黄酸可以调控基因表达，减弱上皮细胞向鳞片状的分化，增加上皮细胞生长因子受体的数量，它与脱氧核糖核酸连接及调节基因表达的受体结合以维持上皮组织和各种其他组织的导向分化，其中相当重要的就是生长因子IGFs和生长激素，视黄酸受体和视黄酸结合后能够启动调节相关基因的转录，从而控制细胞的分化与细胞的生长。

VA氧化分解产生的视黄醛与细胞核的视黄酸受体结合可以调节特异基因的表达。视黄醛的受体主要有三种，并且其受体的基本结构相同，受体蛋白都存在着A、B、C、D、E、F等模式不同的结构区域，A区、B区是不依赖配体就可以进行特异性转录激活的自调节功能区，其中C区为脱氧核糖核酸结合域，重点参与脱氧核糖核酸的顺序的识别，E区是配体结合区。

Hox基因（同源异性盒基因）是发育基因，从时间以及空间上协调和调控生物体的生长与发育，视黄酸能够通过控制Hox基因来影响生物胚胎的发育。笔者对脊椎动物中同源异性盒基因（Homeoboxgenes）研究中发现，Hox同源异性盒基因编码的脱氧核糖核酸有与视黄酸受体结合点位，在胚胎发育过程中起着非常重要的作用。目前脊椎动物发育过程的分子机制已取得了长足进展，常借助随机或定标导入基因的方法，引起生物体“获得”或“失去”功能的突变，来研究同源异性盒基因的功能，这些研究有望揭开胚胎发育过程中分子调控的机制。一个受精卵如何发育分化成个体？CRABP（视黄酸结合蛋白），可以在细胞浆内和细胞核之间自由来往，并且把视黄酸运送到细胞核内染色体的受体位置上，然后再返回细胞浆内，视黄酸和其受体在进行结合后就具有了启动和调节基因转录的功能，从而控制细胞的生长和分化，并最终分化形成不同的组织和器官。这样，就按照遗传图谱的指令形成了完整的生物体。此时，具有一维结构的脱氧核糖核酸的遗传信息就成为了具有三维结构的胚胎，并最终发育成为具有思维结构的生命。在生物发育中，作为蛋白质转录因子的重要组成，视黄酸可以影响相当多的基因表达。作为细胞核内的受体，视黄酸可以和染色体脱氧核糖核酸结合从而进行调控基因表达，视黄酸受体通过结合视黄酸被激活，然后针对受到调控的遗传信息产生“扳机”效应。动物实验表明，维生素A可以对IGF系统产生影响，饲喂缺乏维生素A的饲粮一段时间，1日龄的日本公鹌鹑与对照组相比，血清中IGF-Im核糖核酸的水平下降了22%，同时，睾丸、肺、肝脏和心脏中的IGF-Im核糖核酸水平也下降了21%-52%。

VC可以影响阿朴蛋白A-Ⅰ基因的表达：Ikeda（1996）实验表明，VC缺乏组血清阿朴蛋白A-Ⅰ浓度降低，VC正常组肝脏内阿朴蛋白A-Ⅰm核糖核酸水平比VC缺乏组升高了40%。在实验中对VC缺乏组与VC充足组进行比较，肝脏内阿朴蛋白A-Ⅰ基因进行转录的速率没有明显的区别，这说明VC是在转录后影响阿朴蛋白A-Ⅰ基因的表达。由于肝脏阿朴蛋白A-Ⅰm核糖核酸与肝脏VC浓度之间存在着非常密切的关系，因此VC能够促进肝脏阿朴蛋白A-Ⅰm核糖核酸的稳定。目前，人类还没有弄清楚VC缺乏调节肝脏阿朴蛋白A-Ⅰ合成的原理。但是无论其原理怎样，人类已经通过实验证明了VC确实可以对肝脏阿朴蛋白A-Ⅰm核糖核酸的水平产生一定的影响，并且使针对转录之后的水平起到一定的作用。

VD是通过脱氧核糖核酸结合蛋白在基因水平上对蛋白质的基因进行调节的。在细胞核内和VDR（VD受体蛋白）相结合，VDR大于包含100个左右的氨基酸残基。目前VDR主要存在在34种结构和功能不相同的细胞内部，并且很可能参与构成了细胞核。这是由于每一个细胞都必须通过二价钙离子的转运对其新陈代谢进行调节，而合成钙结合蛋白就必须VD参与其中，VD还能调控其他诸如降血糖素、白细胞介素Ⅰ、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白等基因的转录。VD的活性形式是1，25（OH） 2D3。1，25（OH）2D3是一種固醇类激素，该激素的生物学活性通常受到细胞内特定的受体进行介导。VD对相关基因的调控表现在：①维生素D对骨代谢具有调控作用。1，25（OH）2D3可以对靶细胞核内具有高度特异性的VDR产生作用，从而实现对血钙以及骨正常钙化进行调节。VDR是目前已经知道的调节OC（骨钙素）的组成单位，通过1，25（OH）2D3进行介导的骨钙素转化与表达是通过VDR上的脱氧核糖核酸结合区以及靶基因启动子旁边的反应元件，也就是VDRE（VD反应元件）之间的相互作用，这样就可以改变部分位置的超螺旋状态控制基因的表达来完成的（Staal等，1996）。②水平比较高的1，25（OH）2D3能够抑制甲状旁腺素进行基因转录。在1，25（OH）2D3的作用下，原代培养鼠甲状旁腺主细胞中甲状旁腺素m核糖核酸水平以及甲状旁腺素的分泌水平明显降低。1，25（OH）2D3能够通过降低P2增强子活性降低PTHR（甲状旁腺素受体）基因表达为m核糖核酸的水平（Amizuka等，1999）。

VE又称生育酚，是人类必需的维生素之一，VE生物活性功能非常重要。α-生育酚是VE主要活性形式之一，在人的肝脏内α-TTP（α-生育酚转运蛋白，α-tocopherol transfer protein）在基因表达过程中不会受到日粮α-生育酚影响，但是，日粮中的蛋白质不充足常常会影响到这种基因的表达（Huang和Shaw，1998）。α-生育酚能够通过抑制自由基的生成，使核算内切酶难以活化，从而加快清除受损脱氧核糖核酸等一些复杂的途径，减轻自由基对于细胞膜中的多种物质造成损伤，如：不饱和脂肪酸、细胞骨架、膜内含有丰富巯基的蛋白质成分、核酸等细胞膜内物质（于芳，2002）。α-生育酚对部分基因的调控表现在：①在日粮中加入α-生育酚能够降低活性氧的水平，降低由于活性氧诱发引起的脱氧核糖核酸损伤。α-生育酚可以抑制CD36基因m核糖核酸以及蛋白质的表达，能够降低动脉平滑肌内脂蛋白的氧化，抑制泡状细胞的形成，因此可以有效抑制动脉硬化（Ricciarelli等，2000）。②α-生育酚能清除细胞内NO和OH，从而阻止它们对碱基的破坏。③α-生育酚可以通过降低金属离子对脱氧核糖核酸的加合作用抑制染色体变化，铬离子能够引起脱氧核糖核酸和核糖核酸单链断裂，α-生育酚可以抑制铬引发的脱氧核糖核酸和核糖核酸损伤。另外，α-生育酚能够诱发角质细胞内热蛋白基因HSP70的正确表达，这说明α-生育酚对由铬离子引发的基因毒性存在着保护作用，如果存在铁离子，VE可以减少双氧水诱发的脱氧核糖核酸的加合作用。④α-生育酚还可以抑制c-Myc基因表达，从而诱导导致白血病细胞的凋亡，从而抑制导致白血病细胞的增多繁殖等多项功能。

VK族化合物是2-甲基-1，4-萘醌系列衍生物，包括VK1、VK2、VK3。VK对部分基因的调控表现在：①VK在体内可以以辅酶的形式发挥作用，来完成对凝血因子的调控。VK辅酶活性的形式是KH2（氢醌），可以被分子氧氧化，生成KO（环氧化合物）提供能量，从而使底物蛋白谷氨酸残基的γ位和CO2结合，生成γ-羧化谷氨酸，KO类型的VK在二硫醇依赖性还原酶的作用下，会重新生成KH2的形式，这样就可以构成体内”VK2循环”。凝血抑制因子蛋白C，X，Z以及肝源性凝血因子Ⅱ，Ⅻ，Ⅳ，Ⅹ等物质肝脏内翻译合成后并没有活性，在VK与谷氨酸羧化酶的共同作用下，其分子结构内的谷氨酸残基被转化为γ-羧化谷氨酸残基，凝血因子等蛋白被激活γ-羧化谷氨酸残基与Ca2+化合后可以引发Ca2+，磷脂，蛋白质三者之间的相互作用，进而激发凝血反应。②VK和可以调控VK依赖性骨蛋白。VK依赖性骨蛋白中骨钙素的合成受VK与VD的共同调节，VK参与蛋白质的翻译后羧化修饰过程。

所有的维生素对基因表达都会产生一定的影响，而且有些是直接参与基因表达的调节，维生素对基因表达的调控作用汇总如下：VA作用于VA受体基因位点，促进蛋白转录与翻译；VB1作用于所有基因，作为TPP的组成部分，参与生物能量代谢；VB2作用于所有基因，作为FAD的组成部分，参与ATP合成；VB3烟酸作用于所有基因，作为NAD的组成部分，参与ATP合成；VB6作用于所有基因，促进转氨酶表达，促进嘌呤和嘧啶合成；VC作用于羟化酶受体基因转录，促进原胶原蛋白转录；VD作用于类固醇受体基因转录，促进钙结合蛋白转录；VE作用于所有基因，保护脱氧核糖核酸，防止被自由基破坏；VK凝血酶原，促进转录后谷氨酸残基羧化；叶酸促进脱氧核糖核酸，核糖核酸转录与翻译，促进嘌呤和嘧啶合成。

综上所述，多种维生素对人类基因组中的成千上万个基因的表达与沉默所产生的影响进行了初步的阐述，笔者认为将来对维生素影响基因表达相关的研究，主要从以下三个方面入手：①维生素影响基因表达，从而影响人类新陈代谢途径及生理机能，其中包括其缺乏症和中毒症的具体分子作用机制；②维生素影响基因表达进而影响人类健康水平的具体分子机制；③维生素与其他营养素（如蛋白质、必需氨基酸、必需脂肪酸、碳水化合物、微量營养元素等）的共同作用，影响基因表达过程中的相互作用关系的具体分子机制。

参考文献

[1] 李殷.植物维生素E生物合成途径及调控.复旦大学；发表时间：2009-05-18.

[2] 朱晓海，何清濂，林子豪，赵耀忠，吴建明.常用维生素对人前脂肪细胞增殖和分化的作用.中华医学美学美容杂志，2003年第06期.

[3] 江岩，添加几种维生素饮食对人食管癌细胞增殖影响及其机制研究.四川大学；发表时间：2007-05-20.

表达调控 第3篇

1.1 表观遗传学基本概念

表观遗传学的概念是1957年由Waddington[1]提出的。随着现代生物科学的发展,表观遗传学的定义也在逐渐完善。目前,研究领域对其的定义为:基因功能的改变凡未牵涉到DNA的序列,又可通过细胞的有丝分裂而遗传者,称为“epigenetics”[2]。由此说明,在基因组中,除序列含有遗传信息外,也有一部分遗传信息记载在其修饰上。当前,学者对植物表观遗传学的研究集中在DNA甲基化、组蛋白密码、染色质重塑等方面内容。

1.2 DNA甲基化

DNA甲基化(DNA Methylation)普遍存在于动植物细胞以及细菌基因组中,是在DNA甲基转移酶的作用下,使S腺苷甲硫氨酸(Sadomet,SAM)的甲基基团转移到胞嘧啶或腺嘌呤残基上(主要是胞嘧啶,腺嘌呤偶有发现),从而完成DNA的修饰[3]。DNA甲基化能够影响DNA和蛋白质的相互作用,抑制基因的表达。因此,在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着非常重要的作用。

1.3 组蛋白密码

组蛋白在翻译后的共价修饰中会发生改变,如发生甲基化、乙酰化、泛素化等,从而提供一种识别的标志,为其他蛋白与DNA的结合产生协同或拮抗效应,它是一种动态转录调控成分,称为组蛋白密码(histone code)[4]。这些组蛋白密码可以被一些特定的蛋白质识别,继而将其翻译成一种特定的染色质状态,进而实现对特定基因的调节。因此,组蛋白密码能够显著地扩大DNA密码子对所携带遗传信息的存储量。

1.4 染色质重塑

染色质通常通过核小体改变结构。这类伴随着基因表达调节的染色质结构产生的变化被称作染色质重塑(chromatin remodeling),其包括2种类型:一种是依赖共价结合反应的化学修饰,也就是所谓的组蛋白密码[5];另一种是依赖ATP的物理修饰,靠ATP水解所释放的能量改变染色质。

2 植物开花过程的调控

植物能否开花的重要环节就是植物由营养生长向生殖生长转变的过程。随着分子生物学分子遗传学的发展,对植物开花途径的研究也逐渐明确[6]。

2.1 春化作用途径

温度是影响植物开花的重要环境因素之一。对于冬性和二年生植物,如果不经低温诱导处理,其开花过程可以推迟几周甚至几个月。低温对开花的促进作用称为春化作用[7]。目前,十字花科的拟南芥和禾本科的小麦、大麦等应用于春化相关的基因研究[8,9]。在拟南芥中,与春化作用有关的基因有FRI、FLC、VRN1、VRN2和VIN3等[10]。研究表明,单基因FRI控制冬性发育特性的拟南芥[11],如果其编码的盘绕蛋白发生突变,可导致拟南芥过早开花。FLC属于MADS盒基因[12],其编码的蛋白转录因子是一个强的开花抑制因子,高水平表达对开花具有抑制作用。FLC对开花的抑制作用由于显性等位基因FRI的存在而加强。促进植物开花的过程中,低温春化抑制FLC的表达是通过FRI转录及蛋白表达水平的负调控来实现的[13]。研究发现,拟南芥的春化作用进程中还有基因VRN1、VRN2和VRN3的参与[14]。

2.2 光周期途径

光是植物生长发育的一个重要条件,只有通过光周期的调控影响,植物才能顺利完成整个生长发育进程[15,16]。拟南芥是典型的长日照植物,其光周期途径是由光受体感受光信号开始的,在短日照条件下抑制开花,长日照条件下促进开花。目前,在拟南芥中共发现3种隐花色素(CRY1、CRY2、CRY3)和5类光敏色素(PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE)。隐花色素感受蓝光和紫外光,光敏色素感受红光和远红光。二者感受昼夜长短和光的强弱并产生昼夜节律[17]。其中,远红光、蓝光通过PHYA、CRY1和CRY2促进开花,红光通过PHYB、PHYD和PHYE抑制开花[18,19]。

2.3 自主开花途径

自主途径也是通过抑制FLC基因的表达而促进开花。在拟南芥中,相继克隆到FCA、FY、FLD、FPA、FVE、LD和FLK 7个基因。拟南芥开花时间调控中,FCA、FPA、FLK和FY基因都编码RNA结合蛋白,它们对FLC前体m RNA的调节和稳定性在开花控制中是非常关键的,属于转录后的调节[20]。

2.4 赤霉素途径

GA对拟南芥开花有促进作用,其能加速短日照条件下的野生型拟南芥和长日照下的fb、fac、fd、fe、co、fpa、f、tfve和fwa等晚花突变体开花[21]。在GA途径中,关键基因GAI、RGA和RGL1序列和功能都非常相似。研究表明,可能是由于GA合成途径的打断,以致GA生物合成途径突变体减少对GAI、RGA和RGL1的抑制作用,最终导致植物开花推迟。由此可见,通过GA合成途径影响开花,是通过与GAI、RGA和RGL1基因的作用实现的[8,9]。目前研究认为,GA启动开花的分子机理是激活花分生组织特异基因LFY的启动子,加强LFY的转录活性,从而启动开花[22]。

3 表观遗传对植物开花基因表达的调控

表观遗传在植物开花过程中起重要的调控作用。而在植物开花的多种调节途径中,表观遗传的调节主要是在春化作用途径中实现的。以拟南芥为例,简要阐述在拟南芥的春化作用途径中表观遗传对基因表达的调控。

3.1 春化途径相关基因组成的复合体

PAF1样复合体,通过自身编码的蛋白质修饰FLC染色体进而实现对其表达的调控。FRI复合体,SUF4与FRI、FES1和FRL1相互作用共同组成FRI复合体调节的表达。SWR1样复合体,由ESD1、SUF3、ARP6和PIE1组成SWR1复合体促进FLC的表达。PRC2样复合体,PRC2复合体具有组蛋白甲基转移酶的活性,可以使靶基因产生组蛋白的甲基化修饰作用[23]。

3.2 组蛋白的修饰

组蛋白翻译完成后,其氨基尾巴会发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化等共价修饰方式,从而共同构成组蛋白密码(histone code)假说,即在一个或多个组蛋白氨基尾端的多种修饰状态,可以互相联合或依次地被特定的蛋白(酶)或其他复合体等识别、结合而起作用,为发动或阻遏基因转录的染色质相关蛋白提供结合位点[24]。通常认为,FLC组蛋白甲基化有2个功能:一是可作为信号被开花抑制因子组成的PAF1、SWR1、FRI复合物识别;二是使FCL的组蛋白结构发生变化,为开花促进因子组成的PRC 2-Like复合物更容易靠近FLC[25]。在基因沉默相关的各种组蛋白修饰中,最典型的是组蛋白去乙酰化,自主途径抑制因子FLD和FVE也参与FU染色体的去乙酰化作用[26,27],且FLD的缺失能够促进拟南芥突变体fri的FLC染色体组蛋白H3的ly4三甲基化。最近有研究表明,FLC组蛋白H3的S10的磷酸化修饰在拟南芥春化作用过程中起重要作用,LHP1对维持FLC稳定的抑制状态起关键作用,有丝分裂过程中FLC组蛋白H3的S10的低水平磷酸化为LHP1与FLC组蛋白H3的ly9甲基化连接提供结合位点;而减数分裂过程中FLC组蛋白H3的S10的高水平磷酸化阻止LHP1与FLC组蛋白H3的ly9甲基化位点的连接,FLC的抑制状态被解除。

3.3 春化记忆

多个基因协同控制着拟南芥的春化记忆,基因间相互调节是通过染色质修饰改变的方式来实现对FLC转录活性的抑制,进而实现对下游开花控制基因的调节,最终促使开花的快速转变。完成春化作用,拟南芥FLC的抑制状态可以稳定地保持在有丝分裂过程中,FLC此种表观遗传特征表明产生细胞记忆的分子机制与其他真核生物不同,拟南芥春化的细胞记忆由长时间的低温诱导产生,应用分子遗传学的方法已经鉴定VRN1、VRN2、VIN3和LHPI是目前鉴定参与拟南芥春化记忆的4个关键基因[28]。在春化过程中,最初FLC的表达抑制是通过VIN3对FLC组蛋白去乙酰化作用来实现,随后FLC的乙酰化一方面使FRI、PAF1-LIKE、SWR1-LIKE复合体对FLC转录的促进作用受到限制,另一方面为组蛋白H3ly27和ly9的甲基化作用提供基础,从而进一步增强对FLC的抑制作用,最后组蛋白去乙酰化和H3ly27、ly9甲基化为LHP1与FLC染色体的连接提供结合位点,LHP1与FLC染色体的连接对FLC的抑制在温度回暖后维持在稳定的状态[28]。

4 展望

表达调控 第4篇

目的 研究激活素受体相互作用蛋白2(ARIP2)在小鼠肝细胞中的表达及调控.方法 采用半定量PCR技术检测ARIP2 mRNA在Hepal-6细胞中转录水平的动力学变化规律及其调控因素.结果 Activin A刺激Hepal-6细胞ARIP2 mRNA的`转录水平呈时间依赖性升高,刺激早期(4 h)无明显变化,12 h后显著升高.信号传导激动剂PMA和LPS刺激Hepal-6细胞24 h,均可上调ARIP2 mRNA的转录水平,而A23187则抑制其转录.ARIP2过表达明显抑制Hepal-6细胞ActRⅡA mRNA的转录水平,对ActRⅡB则无影响.结论 ARIP2作为激活素信号传导抑制蛋白,其表达受多种因素影响.ARIP2可能通过影响ActRⅡA表达,参与激活素作用后期的信号传导负反馈调节过程.

作 者：张红军 马迪 陈芳芳 柳忠辉 台桂香 作者单位：张红军(吉林大学基础医学院免疫学教研室,吉林省神经免疫重点实验室,长春,130021;牡丹江医学院病原生物学教研室,牡丹江,157011)

马迪,陈芳芳,柳忠辉,台桂香(吉林大学基础医学院免疫学教研室,吉林省神经免疫重点实验室,长春,130021)

表达调控 第5篇

关键词：Syncytin1,GCM1,GATA-3,转录调控

Syncytin 1由位于染色体7q21上的ERVWE1env基因编码,其表达的细胞组织特异性受基因启动子活性和上游的调节区域共同调控[1]。在ERVWE1位点上游的调节区域有转录因子GCM1、SP1、GA-TA-2、GATA-3和AP2等结合位点。Syncytin 1在胎盘组织的表达是合胞体滋养层形成的关键机制,转录因子GCM1在调控胎盘组织Syncytin 1的表达中起重要作用[2,3],而其他转录因子的细胞组织特异性未见报道。研究显示流感病毒感染使得非胎盘源性细胞Syncytin 1的表达显著增高[4],然而ERVWE1env基因对非胎盘源性细胞的转录调控机制目前不清楚。笔者应用实时RT-PCR检测Syncytin 1及其转录因子在胎盘源性细胞和非胎盘源性细胞中的表达,探讨各转录因子对Syncytin 1细胞特异性表达的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人星形胶质细胞瘤细胞CCF-STTG1和绒癌细胞系JEG-3细胞均购自ATCC公司;培养液RP-MI1640、D-MEM/F-12和MEM均为Invitrogen公司产品;胎牛血清(FBS)、LipofectamineTM2000转染试剂盒、DNaseI、Oligo(dT)12-18、Superscript II试剂盒、Platinum SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒、pcDNA3.1/V5-HIS-TOPO载体、One Shot TOP10感受态均购自Invitrogen公司;引物由Invitrogen公司合成;测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成;HP GenomeWide GCM1 si RNA和GATA3si RNA由Qiagen公司设计合成;荧光素标记的si R-NA(fluo-siRNA)、Endo-free plasmid maxi试剂盒、RNeasy Mini试剂盒均购自Qiagen公司;Advantage2 Polymerase Mix试剂盒、TITANIUM Taq PCR试剂盒购自Clontech公司;人胎盘c DNA购自Ambion公司;ABI 9700 PCR仪和Prism 7000实时PCR仪为Applied Biosystems产品;流感病毒A/WSN/33由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

CCF-STTG1细胞用RPMI 1640培养液培养,JEG-3细胞用D-MEM/F-12培养液培养。以上培养液均加入10%FBS和100 u/mL penicillin/streptomycin。

1.2.2 细胞病毒感染

用12孔板培养细胞,分对照组和实验组,达到75%左右覆盖率进行病毒感染。用培养液MEM清洗细胞3次后每孔加入用600μL MEM稀释的流感病毒A/WSN/33(2105pfu),对照组则加入不含病毒的等量MEM,轻轻转动培养皿,置于37℃、5%二氧化碳饱和湿度孵育箱孵育1h后吸除培养液,用MEM清洗细胞4次,加入1 m L相应的正常培养液,培养24 h后收集细胞。

1.2.3 GCM1和GATA-3的克隆和转化

人胎盘c DNA为模板,GCM1(NM_003643)完全开放读码框(open reading frame,ORF)用正义引物5'-GGCCGA TCCAGCTATATCAA-3'和反义引物5'-CTGGGGTG CACATAGTGAAA-3'扩增,GATA-3(NM_001002295)ORF用正义引物5'-ATGGAGGTGACGGCGGACCA-3'和反义引物5'-CTAACCCATGGCGGTGACCA-3'扩增。1μL胎盘c DNA,引物各400 nmol/L,加Advantage 2 Polymerase Mix,25μL反应体系,反应条件:94℃,2 min;94℃30s,68℃2 min;20个循环;68℃,7 min。纯化PCR产物并与pcDNA3.1/V5-HIS-TOPO质粒连接,转化入One Shot TOP10感受态,经PCR鉴定有正义或反义插入的质粒用Endo-free plasmid maxi试剂盒纯化并测序;用LipofectamineTM2000转染试剂盒转染。

1.2.4 GCM1

siRNA和GATA-3 siRNA的转染选择GCM1 m RNA序列和GATA-3 m RNA序列为目标,分别设计并合成5个si RNA分子,预实验选择抑制效应最佳的si RNA并优化实验条件。选择fluo-siRNA作为对照,以便监控转染效率和消除非特异性抑制作用。

CCF-STTG1细胞分fluo-siRNA+病毒感染组和GCM1 si RNA或GATA-3 si RNA+病毒感染组。12孔板培养细胞,达到75%左右覆盖率用培养液MEM清洗细胞3次,加入含相应si RNA和LipofectamineTM2000转染试剂复合物的培养液,培养48 h后吸除培养液,继续按方法2进行病毒感染。JEG-3细胞分fluo-siRNA组和GCM1 si RNA或GATA-3si RNA组,分别用含相应si RNA和LipofectamineTM2000转染试剂复合物的培养液培养48 h后收集细胞。

1.2.5 实时RT-PCR

用RNeasy Mini试剂盒提取细胞RNA,500 ng RNA经DNaseI 37℃处理30min,然后用β-actin PCR检测并确定样本中DNA被有效清除后用SuperscriptⅡ试剂盒加Oligo(dT)12-18为引物合成c DNA,保存在-20℃。设计引物,Syncytin 1上游引物5'-GTTAACTTTGTCTCTTCCAG AATCGA-3',下游引物5'-CATCAGATCGTGGGCTA GCA-3';GCM1上游引物5'-CCAGGAGTGGCCAGA TTCC-3',下游引物5'-TGCCGCTGCGCATTC-3';GA TA-2;上游引物5'-CAAGTCCAAGAAGAGCAAGAA AGG-3',下游引物5'-GGATGACTTCTCCTGCATGC A-3';GATA-3上游引物5'-GGACGAGAAAGATTG CCTCAA-3',下游引物5'-TGGGACGACTCCAGCTT CA-3';AP-2上游引物5'-CCCGTGTCCCTGTCCAA GT-3',下游引物5'-CGAAGAGGTTGTCCTTGTTAAT AGG-3';内参β-actin上游引物5'-CGCGAGAAGA TGACCCAGAT-3',下游引物5'-CAGAGGCGTACAG GGATAGCA-3'。加入Platinum SYBR Green qPCR Super Mix在Prism 7000实时PCR仪完成反应。PCR反应参数:50℃2 min;95℃2 min;95℃15 s;60℃30 s;50个循环。从PCR指数相产生的Ct(Threshold Cycle)值输出到Microsoft Excel工作表进一步分析。每个样本目的基因的相对表达水平表示为2-ΔΔCt(倍),ΔΔCt=ΔCt样本-平均ΔCt对照组,△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin。

1.3 统计学分析

所有数据采用PRISM 3.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,各组间数据的比较采用t检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 JEG-3细胞和CCF-STTG1细胞Syncytin 1及其转录因子的表达

以人星形胶质细胞瘤细胞CCF-STTG1作为对照组,绒癌细胞JEG-3的Syncytin 1及其转录因子GCM1、GATA-2和GATA-3的m RNA相对表达水平与对照组比较,均差异有统计学意义,而转录因子AP-2 m RNA水平在细胞间差异没有统计学意义(见表1)。

2.2 流感病毒A感染对CCF-STTG1细胞的Syn-cytin 1、GCM1、GATA-2和GATA-3转录的影响

与对照组比较,病毒感染组Syncytin 1、GCM1、GATA-3转录水平显著提高,而GATA-2的表达没有明显改变(见表2)。

2.3 转录因子GCM1和GATA-3过表达对CCF-STTG1细胞Syncytin 1表达的影响

注:1)P<0.01;2)P<0.001

注:覮两组比较,P<0.001

与对照组比较,GCM1、GATA-3表达质粒的单独转染或者GCM1和GATA-3表达质粒的共同转染均未使得CCF-STTG1细胞Syncytin 1的表达显著改变(均P>0.05),见表3。

注:1)P<0.05;2)P<0.01;3)P<0.001

2.4 GCM1 si RNA和GATA-3 siRNA对细胞Syncytin 1转录的影响

如表4所示,GCM1 si RNA或GATA-3 si RNA使JEG-3细胞GCM1或GATA-3 m RNA水平比fluo-siRNA对照组明显降低时,Syncytin 1的表达也均比对照组显著降低。然而当GCM1 si RNA或GA TA-3 si RNA使流感病毒A感染的CCF-STTG1细胞GCM1或GATA-3 m RNA水平比对照组显著降低时,Syncytin 1 m RNA水平却没有显著变化。

3 讨论

Syncytin 1是人内源性逆转录病毒W编码的包膜糖蛋白。正常情况下它仅仅表达在胎盘滋养层,促进滋养层细胞的融合形成合胞体滋养层[5,6]。Syncytin 1在胎盘滋养层的异常表达与先兆子痫的发生密切相关[2,7]。在某些其他病理情况下,Syncytin 1在胎盘以外组织也有表达。OLUWOLE等[8]报道了ERVWE1 env基因在运动神经元病患者骨骼肌组织中异常转录。病毒感染可诱导多种非胎盘源性细胞ERVWE1 env基因的异常转录[4]。ERVWE1 env基因及其编码的蛋白Syncytin 1在多发性硬化患者脑组织星形胶质细胞中表达明显增高[9]。

Syncytin 1表达的细胞组织特异性受基因启动子活性和上游的调节区域共同调控。在ERVWE1位点上游的调节区域有转录因子GCM1、SP1、GATA-2、GATA-3和AP2等的结合位点。研究显示转录因子GCM1在调控Syncytin 1在胎盘组织的特异性表达上起重要作用,然而Syncytin 1在非胎盘源性细胞的转录和表达的机制不清。

笔者研究比较了胎盘源性细胞和非胎盘源性细胞的Syncytin 1及其转录因子的表达,结果显示Syncytin 1及转录因子GCM1、GATA-2和GATA-3具有胎盘源性细胞特异性表达,这提示GCM1、GA-TA-2和GATA-3可能在维持Syncytin 1在胎盘源性细胞的特异表达中起重要作用。进一步研究发现外环境因素流感病毒A感染诱使非胎盘源性细胞CCF-STTG1的Syncytin 1、GCM1和GATA-3的转录水平明显增高。这个结果引出了一个问题,转录因子GCM1和GATA-3是否参与流感病毒A感染等外环境因素下非胎盘源性细胞Syncytin 1的转录调控?采用表达质粒的转染和RNA干扰技术,笔者研究证实了在外环境因素病毒感染的情况下,转录因子GCM1和GATA-3的单一作用或联合作用不足以调控非胎盘源性细胞人星形胶质细胞瘤细胞CCF-STTG1的Syncytin 1异常转录。

Syncytin 1的细胞特异性转录机制比较复杂,除以上细胞组织特异性转录因子外,MATOUSKOVA等[10]研究发现Syncytin 1启动子的CpG甲基化机制也起重要作用。Syncytin 1 5'-长末端重复序列的CpG甲基化和Syncytin 1的表达呈负相关。在Syncytin 1高表达的胎盘和绒毛膜癌细胞系BeWo细胞检测到Syncytin 1 5'-长末端重复序列的低甲基化,而在其他不表达Syncytin 1的原代细胞和细胞系有高甲基化。流感病毒A感染等外环境因素下非胎盘源性细胞Syncytin 1的高表达是否有启动子的去甲基化?而且病毒感染后转录因子的异常转录是否参与Syncytin 1的转录激活及其机制?这有待进一步研究。

参考文献

[1]MI S,LEE X,LI X,et al.Syncytin is a captive retroviral enve-lope protein involved in human placental morphogenesis[J].Na-ture,2000,403(6771):785-789.

[2]NOORALI S,ROTAR IC,LEWIS C,et al.Role of HERV-W syncytin-1in placentation and maintenance of human pregnancy[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2009,17(4):319-328.

[3]CHENG YH,HANDWERGER S.A placenta-specific enhancer of the human syncytin gene[J].Biol Reprod,2005,73(3):500-509.

[4]NELLAKER C,YAO Y,JONES-BRANDO L,et al.Transactiva-tion of elements in the human endogenous retrovirus W family by viral infection[J].Retrovirology,2006,3(44).

[5]STOYE JP.Proviral protein provides placental function[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(29):11827-11828.

[6]RAWN SM,CROSS JC.The evolution,regulation,and function of placenta-specific genes[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2008,24:159-181.

[7]CHIANG MH,LIANG FY,CHEN CP,et al.Mechanism of hy-poxia-induced GCM1degradation:implications for the pathogene-sis of preeclampsia[J].J Biol Chem,2009,284(26):17411-17419.

[8]OLUWOLE SO,YAO Y,CONRADI S,et al.Elevated levels of transcripts encoding a human retroviral envelope protein(syn-cytin)in muscles from patients with motor neuron disease[J].Amyotroph Lateral Scler,2007,8(2):67-72.

[9]ANTONY JM,VAN MARLE G,OPII W,et al.Human endoge-nous retrovirus glycoprotein-mediated induction of redox reactants causes oligodendrocyte death and demyelination[J].Nat Neurosci,2004,7(10):1088-1095.

表达调控 第6篇

1 材料与方法

1.1 试剂

琼脂糖、dNTP、TaqDNA聚合酶、一步法RT-PCR试剂盒为TaKaRa公司生产, RNA提取试剂TRIZOL为美国Invitrogen公司生产, DEPC为Sigma公司生产。

1.2 实验药品

黄芪注射液由上海禾丰制药有限公司生产, 产品批号为070912;苦参注射液由山西振东制药有限公司生产, 产品批号为070915;红芪注射液由上海禾丰制药有限公司生产, 产品批号为070912;黄芩口服液由哈尔滨中药四厂生产, 产品批号为070205;双黄连口服液由哈药六厂生产, 产品批号为070205。

1.3 引物设计

根据GenBank大鼠β-防御素-2 (rBD-2) cDNA序列 (登录号为AF068861) 设计特异, P1、P2 (rBD-2) 。

1.4 给药

将健康的Wistar大鼠随机分成6组:空白组, 每日用0.3ml自来水灌胃;黄芪组, 每日用黄芪注射液0.3ml灌胃;双黄连组, 每日用双黄连口服液0.3ml灌胃;红芪组, 每日用红芪注射液0.3ml灌胃;苦参组, 每日用苦参注射液0.3ml灌胃;黄芩组, 每日用黄芩口服液0.3ml灌胃。灌胃剂量按“每kg体重占有体重表面积相对比值”计算得出。

2 结果

连续给实验动物灌胃6天后, 于第7天将实验动物处死并取子宫组织50mg, 按照RNA提取试剂盒操作说明进行总RNA的提取;然后用TaKaRa公司一步法RT-PCR反应试剂盒进行扩增。RT-PCR的反应条件如下:50℃30分钟, 使mRNA逆转录为cDNA;94℃预变性2分钟, 使RNase失活, 进行35个PCR循环:94℃30秒, 56℃30秒, 72℃45秒, 最后72℃延伸10分钟。然后取上述RT-PCR扩增产物6μl在1.5%琼脂糖进行凝胶电泳, 置于凝胶成像系统下观察结果, 并照相, 见图1。

图1显示, 黄芪组、红芪组、双黄连组大鼠子宫组织β-防御素-2基因表达增强, 而苦参组及双黄连组没有发生明显改变。

3 讨论

防御素是宿主执行免疫防御能力的细胞所分泌的, 具有杀灭微生物活性和细胞毒性的小分子多肽, 目前广泛用于抗菌、抗病毒、抑制杀伤肿瘤细胞等作用的研究。β-防御素具有广谱的抗菌活性。其对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、螺旋体、分枝杆菌及有包膜病毒均具有杀灭作用[7]。细菌对传统抗生素的耐药性是当今临床医学中的难题, 发展新的抗感染战略势在必行[8,9]。

据文献报道, 黄芪、红芪、黄芩、双黄连、苦参具有对抗免疫抑制剂、激活免疫器官、增强体液免疫和细胞免疫的功能, 这些研究都表明这几种中药能调节机体免疫功能, 但未见其直接杀菌作用的报道, 或者有杀菌作用但药物浓度较高, 通过口服中药很难达到。在临床上这些中药却能起抗菌消炎作用, 特别是对治疗呼吸道感染有较好效果。其药理作用机理单纯用调节免疫功能是不能全面解释的, 有可能存在其他作用机理, 如诱导防御素的表达。有学者已发现中药大黄能诱导小肠黏膜产生防御素, 是中药大黄能在肠道发挥抗感染作用的一个重要因素。

实验显示, 黄芪、红芪、双黄连等中药可诱导并增强大鼠子宫β-防御素-2基因表达, 提示可利用黄芪等中药作为诱导剂增强β-防御素基因在机体抗感染关键部位 (如子宫) 的高效表达, 来抵抗病原微生物, 起到抗感染的作用。

摘要：目的通过黄芪等中药对大鼠子宫β-防御素-2基因表达的影响, 探讨中药在局部组织提高机体免疫力的作用。方法将30只健康的Wistar大鼠随机分成空白组、黄芪组、苦参组、红芪组、黄芩组、双黄连组, 分别灌胃, 于第7日将大鼠处死并提取子宫组织RNA, 用RT-PCR法检测大鼠β-防御素-2基因的表达变化。结果黄芪组、红芪组、双黄连组大鼠子宫组织β-防御素-2基因表达增强, 而苦参组及黄芩组没有发生明显改变。结论黄芪、红芪、双黄连等中药可以增强大鼠子宫β-防御素-2基因表达, 提示可以利用这些中药来增强局部组织的免疫力, 以达到杀灭病原微生物的作用。

关键词：大鼠,子宫,β-防御素-2,基因表达,黄芪,红芪

参考文献

[1]王伯瑶, 吴琦.内源性抗生素肽一天然免疫的重要介质[J].生命科学, 1991, 11 (增刊) :64～66.

[2]李萍, 陈新年, 景涛.结核杆菌感染对人肺组织β-防御素的作用[J].中国公共卫生, 2003, 19 (12) :1464～1466.

[3]Ganz T, Lehrer R I.Defensin[J].Pharmacol Ther, 1995, 66 (2) :191～205.

[4]Lemaitre B, Reichhart J M, Hoffmann J A.Drosophila host defense Dif-ferential induction of antimicrobial peptide genes after infection by variousclasses of microorgan-isms[J].Proc Natl Acad USA, 1997, 94:14614～14619.

[5]Lichtenstern A, Ganz T, Eselsted M, et al.In vitro tumor cellcytolysis mediated by peptide defensins of human and rabbitgranulocytes[J].Blood, 1986, 68 (6) :1047～1415.

[6]Sheu M J, Balwin W W, Brunson K W.Cyto toxicity of rabbit-macrophage peptides MCP21 and MCP22 for mouse tumorcells[J].Antimi-cr Agents Chemother, 1985, 26 (8) :626～629.

[7]Garcia C, Krause A, SandraS, et al.Human 4:anovel inducible peptide with a specific salt-sensitive spect rum of antimicrobial activity[J].JFASEB, 2001, 15:1819～1823.

[8]Davies J.Bacterial on the rampage[J].Nature, 1996, 383:219～220.

表达调控 第7篇

甲胎蛋白作为肝癌临床诊断最重要的生化指标, 其表达调控的机制及其与肝细胞增殖之间的联系是长期以来备受瞩目的重要科学问题。到目前为止, 有关肝细胞甲胎蛋白基因出生后快速转录抑制及其癌变时重新激活的机理仍是未解之谜。

章卫平教授与第二军医大学免疫学研究所曹雪涛院士合作, 于1998年首先从人树突状细胞中自主克隆了新型锌指蛋白ZBTB20, 并于2001年在国际上率先报道了初步研究结果。此后, 章卫平课题组在国家自然基金委、科技部863、973计划等项目资助下, 与国外大学合作, 利用条件基因打靶技术, 建立了肝细胞特异性ZBTB20基因缺陷的小鼠模型, 发现其成年肝细胞虽然处于静息状态, 但其甲胎蛋白的表达几乎接近胎肝水平, 揭示了ZBTB20的体内生物学作用及其靶基因, 明确了ZBTB20作为新型转录抑制因子可以直接抑制甲胎蛋白基因的表达, 由此提出了哺乳动物出生后肝脏甲胎蛋白基因下调主要由于ZBTB20的表达上调及其发挥的转录抑制作用所致的学术观点。

表达调控 第8篇

关键词：胃癌,microRNA-218,BMI1,BGC823细胞

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率居各类肿瘤之首[1]。胃癌的治疗方法是以手术为主,结合放化疗的综合治疗,但部分中晚期患者的预后不良,治疗效果欠佳,因此深入探究胃癌发生、发展的分子机制,寻找效果更佳、特异性更好的治疗靶点和方法是胃癌相关研究的重点。Micro RNA(mi R)是一类在多种生物中广泛存在的小分子非编码RNA,能够与靶基因的3’非翻译区(3’-UTR)特异性地互补结合,通过抑制靶基因m RNA的翻译或者将m RNA剪切降解,发挥沉默靶基因表达的作用[2]。mi R通过抑制靶基因的表达和功能,参与调节增殖分化、凋亡和侵袭转移等多种细胞生物学行为,并在多种复杂疾病及肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[3,4]。本研究通过分子生物学方法探究mi R-218在胃癌细胞中调控BMI1基因表达的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2010年9月-2013年4月在本溪钢铁公司总医院普外科及中国医科大学附属第一医院肿瘤外科诊断为胃癌的住院患者38例,男性26例,女性12例;年龄46~61岁,中位年龄56.2岁。取患者组织标本,包括肿瘤组织及距肿瘤边缘>5 cm的癌旁组织。人胃癌BGC823细胞系由中国医科大学附属第一医院肿瘤外科提供。

1.2 试剂

mi R的提取及检测相关试剂、mi R-218前体(mi R-218 precursor)及mi R对照购自Ambion公司,BMI1基因3’-UTR的野生型荧光素酶载体p GL3-Wt.UTR(Wt)和突变型荧光素酶载体p GL3-Mut.UTR(Mut,于3’-UTR第1470~1477碱基序列引入突变)由上海吉玛公司构建,荧光素酶活性检测试剂盒购自Invitrogen公司,Western blot检测相关试剂购自上海碧云天公司,转染试剂Transmessenger购自Qiagen公司,BMI1小鼠抗人单克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实时定量聚合酶链反应

提取待测组织标本中的小非编码RNA,对其进行3’端加Poly A处理,然后进行逆转录。以管家基因U6为内参基因,按照实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测试剂盒说明书进行操作,扩增mi R-218。所得实验数据应用比较Ct值法,即2-ΔΔCt法进行结果分析。

1.3.2 细胞转染

转染前24 h,在6孔板中每孔接种5×104个BGC823细胞,继续培养。取试剂盒中的Enhanser R试剂,将30 pmol待转染的mi R与其混合,加入Trans Messenger试剂4μl混匀,再加入无血清培养基至1 000μl混匀。弃去BGC823细胞的培养基,将上述混合液加入培养孔内,孵育2 h,然后转为正常培养基培养。

1.3.3 Western blot检测

收获待测细胞,提取蛋白,定量。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,再经封闭液封闭、抗体杂交孵育和发光成像等操作后得到包含BMI1蛋白条带,应用凝胶成像分析系统对条带进行定量分析。

1.3.4 荧光素酶实验

分别将mi R-218 precursor或mi R对照与野生型或突变型重组载体共转染至胃癌BGC823细胞中。其中A组BGC823细胞共转染mi R-218 precursor和野生型重组载体,B组BGC823细胞共转染mi R对照和野生型重组载体,C组BGC823细胞共转染mi R-218 precursor和突变型重组载体,D组BGC823细胞共转染mi R对照和突变型重组载体。转染后的BGC823细胞,按照双荧光素酶试剂盒说明书检测荧光素酶相对活性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,检验数据的正态性以确定其分布情况,多组比较用单因素方差分析,两组比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中mi R-218的表达

应用比较Ct值法对RT-PCR的结果进行相对定量分析,结果显示,mi R-218在胃癌组织中的△Ct值为(4.72±0.13),而在癌旁组织中的△Ct值为(3.54±0.15),△△Ct值为1.18。胃癌组织中mi R-218的表达量是癌旁组织的44.29%,胃癌组织中mi R-218表达降低(P<0.01)。

2.2 胃癌组织中BMI1的表达及其与mi R-218表达的相关性

相对定量分析结果显示,BMI1在胃癌组织中的△Ct值为(2.96±0.15),而在癌旁组织中的△Ct值为(3.8±0.16),△△Ct值为-0.91。胃癌组织中BMI1的表达量为癌旁组织的188.03%,胃癌组织中BMI1的表达增强(P<0.01)。Pearson相关性分析显示,BMI1和mi R-218在胃癌及其癌旁组织中的表达均表现出明显的负相关,相关系数为-0.793。

2.3 mi R-218 precursor转染BGC823细胞后对BMI1蛋白表达的影响

各组Western blot结果见图1。未转染的BGC823细胞和转染mi R对照的BGC823细胞间,BMI1蛋白的相对表达量差异无统计学意义;而两组BGC823细胞比较,转染mi R-218 precursor的BGC823细胞中的BMI1蛋白下调(P<0.01)。

2.4 荧光素酶实验

在荧光素酶实验中,mi R-218 precursor或mi R对照与野生型或突变型重组载体被按照不同的组合形式共转染至胃癌BGC823细胞中。检测被转染细胞的相对荧光值,结果显示,与转染mi R对照组BGC823细胞比较,共转染mi R-218 precursor和野生型重组载体的BGC823细胞的相对荧光值下降,提示mi R-218能够与BMI1基因3’-UTR结合,并抑制荧光素酶的表达。而共转染mi R-218 precursor和突变型重组载体的BGC823细胞的相对荧光值无明显改变,说明结合位点序列的改变使其失去与mi R-218结合的能力。见图2。

A组:BGC823细胞共转染mi R-218 precursor和野生型重组载体;B组:BGC823细胞共转染mi R对照和野生型重组载体;C组:BGC823细胞共转染mi R-218 precursor和突变型重组载体;D组:BGC823细胞共转染mi R对照组和突变型重组载体†与B、C、D组比较,P<0.01

3 讨论

多梳基因家族(polycomb group genes,Pc G)是一组与细胞周期和增殖相关的重要基因,包括一系列转录抑制子,与多种恶性肿瘤的发生、发展相关[5,6]。1991年发现的细胞特异莫洛尼白血病病毒插入位点1(BMI1)基因亦归属于Pc G基因家族[7],其在结直肠癌和胃癌中的表达显著下调,而且其表达异常与肿瘤的发生、发展、侵袭转移以及预后等多项临床病理指标相关[8,9,10]。本研究首先对38例胃癌组织进行BMI1基因表达检测,结果显示,与癌旁组织相比,胃癌组织中BMI1基因的m RNA表达增强。本实验结果与上述报道相符,BMI1基因在胃癌组织中确实存在明显的表达异常,BMI1基因可能作为癌基因在胃癌的发生中发挥重要作用。但是胃癌中BMI1基因表达下调的原因及机制尚不清楚。

为分析胃癌中BMI1基因表达下调的原因,明确mi RNAs是否在其中发挥作用,本研究采用多种生物信息学软件进行分析预测,分析结果显示,BMI1基因m RNA的3’-UTR上存在mi R-218的结合位点,位于3’-UTR第1470~1477碱基序列。为验证上述预测结果,明确mi R-218能够作为上游调控基因参与调节BMII1的表达和功能,本研究将mi R-218precursor转染胃癌BGC823细胞以提高mi R-218的表达水平。后续的Western blot检测发现,转染mi R-218 precursor的BGC823细胞中,BMI1蛋白的表达下调,这提示mi R-218能够参与调节BMI1基因的表达,BMI1基因可能是mi R-218的靶基因。本研究发现,mi R-218在胃癌组织的表达下调,而且在胃癌组织及对应的癌旁组织中BMI1 m RNA与mi R-218的表达水平均表现出显著的负相关。上述实验结果进一步明确笔者对于mi R-218能够作为上游调控基因参与调节BMI1表达的推测,但调控机制如何,mi R-218是否通过与BMI1基因m RNA的3’-UTR结合抑制其翻译,从而下调BMI1基因的表达尚不清楚。荧光素酶实验分析结果显示,mi R-218能够与BMI1基因3’-UTR的野生型载体结合,抑制荧光素酶的表达,而突变型载体则不能引起荧光素酶的表达下降,说明结合序列的改变使其失去与mi R-218结合的能力,也证实mi R-218确实是与BMI1基因3’-UTR第1470~1477碱基序列特异性结合的。

综上所述,BMI1基因是mi R-218的靶基因之一,mi R-218能够沉默BMI1基因的表达。mi R-218在胃癌中表达下调,失去沉默BMI1基因表达的作用,使BMI1基因在胃癌中表达上调,BMI1基因作为胃癌的一个癌基因存在。

参考文献

[1]赵久达,李豪,曹成珠,等.1962例胃癌流行病学分析[J].现代预防医学,2008,35(3):439-440.

[2]CIPOLLINI M,LANDI S,GEMIGNANI F.Micro RNA binding site polymorphisms as biomarkers in cancer management and research[J].Pharmgenomics Pers Med,2014,23(7):173-191.

[3]OOM A L,HUMPHRIES B A,YANG C.Micro RNAs:novel players in cancer diagnosis and therapies[J].Biomed Res Int,2014(2014):959461.doi:10.1155/2014/959461.

[4]HAYES J,PERUZZI P P,LAWLER S.Micro RNAs in cancer:biomarkers,functions and therapy[J].Trends Mol Med,2014,20(8):460-469.

[5]ALOIA L,STEFANO B D,CROCE L D.Polycomb complexes in stem cells and embryonic development[J].Development,2013,140(12):2525-2534.

[6]CREA F,PAOLICCHI E,MARQUEZ V E,et al.Polycomb genes and cancer:time for clinical application[J].Crit Rev Oncol Hematol,2012,83(2):184-193.

[7]LOHUIZEN M V,VERBEEK S,SCHEIJEN B,et al.Identification of cooperating oncogenes in E mu-myc transgenic mice by provirus tagging[J].Cell,1991,65(5):737-752.

[8]LU H,SUN H Z,LI H,et al.The clinicopathological significance of Bmi-1 expression in pathogenesis and progression of gastric carcinomas[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(7):3437-3441.

[9]PUN J C S,CHAN J Y J,CHUN B K M,et al.Plasma Bmi1m RNA as a potential prognostic biomarker for distant metastasis in colorectal cancer patients[J].Mol Clin Oncol,2014,2(5):817-820.

表达调控 第9篇

关键词：肝内胆汁淤积,妊娠,心肌细胞,细胞凋亡

大量临床研究显示,妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)孕妇血液中胆汁酸水平愈高,胎儿窘迫发生率亦愈高,但是其发生机制尚不清楚[1]。药理学和毒理学基础研究表明,胆汁酸对动物组织和细胞具有明显的毒性作用,可以引起细胞凋亡和(或)死亡。本研究应用雌孕激素建立ICP孕鼠模型,探讨ICP时胎鼠心肌细胞凋亡及凋亡调控基因bcl-2和bax的表达。

1 材料与方法

1.1 实验动物

所有动物由第三军医大学实验动物中心提供。选择清洁级SD雌性大鼠45只,体重200～250 g,鼠龄150～180天,在室温18℃～25℃、相对湿度60%～70%的屏障系统内饲养,不控制饲料和饮水。在发情期与雄性大鼠按4:1同笼饲养。每天观察阴栓脱落情况,阴栓脱落日定为妊娠第1天,一直饲养到妊娠第15天待用。妊娠后的大鼠每隔3天称体重1次。

1.2 实验方法

1.2.1 建立动物模型

20只SD孕鼠随机分为2组,每组10只。对照组:自孕15天起,每天后肢内侧皮下注射精制植物油2.5 ml/kg。肝内胆汁淤积症组(以下简称胆淤组):自孕15天起,每天后肢内侧皮下注射孕酮(溶解于精制植物油中)75 mg/kg和17-α-乙炔雌二醇(溶解于0.9%氯化钠溶液中)1.25 mg/kg。两组孕鼠均于妊娠第15天、妊娠第21天眶静脉采血1 ml,测定血生化指标。两组孕鼠均于妊娠第21天,断头处死母鼠,取母鼠肝脏、胎盘及胎鼠心脏进行病理组织学检查,HE染色。肝脏组织学检查见小叶间胆管内有胆汁淤积,部分肝细胞有空泡样变性,但无肝细胞坏死,血清总胆酸、转氨酶升高为模型成功。

1.2.2 胎鼠心肌组织原位凋亡及凋亡调控基因的检测

1.2.2.1 标本采集

断头处死母鼠后,迅速摘出胎鼠心脏,用10%中性甲醛固定,石蜡包埋,连续5 μm切片。

1.2.2.2 实验方法

①原位细胞凋亡检测:试剂盒购买自美国Santa Cruz Biotechnology公司。原位末端标记法(TUNEL)实验方法参照说明书进行。细胞凋亡以每100个细胞中的阳性细胞数表示(%),分别计算两组胎鼠心肌细胞凋亡指数。②凋亡调控基因的检测:采用SP免疫组织化学法检测胎鼠心肌细胞中bax和bcl-2的表达。免疫组织化学检测试剂盒和bax、bcl-2抗体购买自北京中山生物技术公司。检测时设置相应的阳性和阴性对照。细胞内出现棕黄色颗粒为阳性信号,bax和bcl-2位于胞膜和胞浆。采用北京航空航天大学CM-2000B型生物医学图像分析系统,在4010的高倍视野下,选择切片空白区定标及具有代表性的5个视野,测定其光密度值进行计算,获得所选高倍视野的平均光密度值(OD值)。

1.3 统计学处理

所得数据输入SPSS for Windows 10.0统计软件包进行统计。

2 结 果

2.1 两组胎鼠心脏组织学检查

光镜下可见胆淤组胎鼠心肌细胞空泡变性、水肿,对照组胎鼠心肌细胞形态正常。见图1(见插页4-1)。

2.2 两组胎鼠心肌细胞凋亡指数比较

胆淤组胎鼠心肌细胞凋亡指数39.79%±2.3421%,对照组为19.29%±2.4624%,两组比较,差异有非常显著性,P<0.01。见表1、图2(见插页4-1)。

2.3 两组胎鼠心肌细胞凋亡调控基因bax、bcl-2表达的比较

胆淤组胎鼠心肌细胞bcl-2基因表达OD值低于正常对照组,两组比较差异有非常显著性,P<0.01。胆淤组胎鼠心肌细胞bax基因表达OD值与正常对照组比较,差异无显著性,P>0.05。见表2、图3、图4(见插页4-1)。

3 讨 论

3.1 细胞凋亡调控基因对妊娠期肝内胆汁淤积症胎鼠心肌细胞凋亡的调控作用 ICP时出现高胆汁酸血症是其重要特征。Ye等[2]应用高压液相色谱法联合质谱法检测ICP孕妇血清胆汁酸的组分,以胆酸水平增高为主,尤其牛磺胆酸(TCA)和甘氨胆酸(GCA)明显增高。细胞凋亡抑制基因bcl-2和细胞凋亡促进基因bax是重要的细胞凋亡调控基因,参与调节许多因素引起的细胞凋亡。王冬梅等[3]研究妊娠期肝内胆汁淤积症患者31例,发现胎盘组织中细胞凋亡明显增加,胆淤组胎盘组织中细胞滋养细胞、合体滋养细胞、蜕膜细胞及间质细胞中细胞凋亡指数明显增高,bax基因表达增强及bcl-2基因表达下调。细胞凋亡在胎儿器官发生的过程中起着重要作用。研究发现[4,5],母体缺氧或服食药物均可能诱导胎儿心肌细胞凋亡增加,bcl-2基因表达显著下调。母体胆汁淤积时,胎儿血循环中的胆汁酸水平也明显增高,而且脐带血中胆汁酸浓度显著高于母体。细胞、动物毒理学实验及临床研究结果显示,胆汁酸对动物心脏或心肌细胞有毒性作用。肖建平等[6]检测ICP孕妇脐血心肌肌酸激酶增高,提示可能存在胎儿心肌损害。本研究结果显示,胆淤组胎鼠心肌细胞空泡变性、心肌组织肿胀,胎鼠心肌细胞凋亡指数显著高于对照组,bcl-2基因表达显著下调。本研究结果表明,妊娠期肝内胆汁淤积症时,胎鼠心肌细胞bax/bcl-2比例发生明显变化,胎鼠心肌细胞凋亡明显增加。

3.2 妊娠期肝内胆汁淤积症胎鼠心肌细胞凋亡的意义 ICP时往往容易发生胎儿窘迫,甚至死胎、死产等,但是,目前许多研究显示慢性胎盘功能不良学说难以解释临床现象。Germain等[7]总结了大量的对于人和动物的研究资料,认为迄今ICP仍然是一种谜一般的疾病,仍然是全世界产科医生和孕产妇所面临的共同难题。ICP时胎儿窘迫的发生非常突然。Alonso等[8]报道4例死产中有3例分别于胎死前2、5、6天行无应激试验(NST)均为有反应,而且在入院前的几小时内母体感胎动仍正常。Londero等[9]报道胎死前7小时NST正常。这些研究均提示ICP时胎儿窘迫为急性过程。Reid等[10]对5例死胎进行尸检,发现心包、胸膜及肺有瘀点及瘀斑等严重宫内急性缺氧的特征改变,而且ICP存活儿及死产儿的体重均正常,不符合胎儿生长受限(FGR)或胎盘灌流量不足引起的慢性营养不良征象。目前,大量有关ICP孕妇胎盘的研究尚不足以解释胎儿猝死的原因。

根据大量心脏病学研究资料分析,在全部猝死的患者中,最常见的是心脏性猝死,占72%,其中1小时内死亡者占78% 。在维持胎儿生命的血液循环途径中,胎盘、脐带和心脏控制着胎儿的血氧供应。本文研究结果显示,ICP时胎鼠心肌细胞空泡变性、水肿,胎鼠心肌细胞凋亡,凋亡抑制基因bcl-2在胎鼠心肌组织中的表达显著下调可能参与调控胎鼠心肌细胞凋亡。这可能与ICP时胎儿窘迫和死亡有一定关系,但尚需进一步的研究。本文作者的后续研究将进行更深入的探讨。

参考文献

[1]Rudolph CM,Trauner M,Kerl H,et al·Pruritic skin conditions during pregnancy:serumbile acidlevels are a highly reliable parameter to diag-nose intrahepatic cholestasis of pregnancy(ICP)[J]·Journal of Investiga-tive Dermatology,2004,123(2):A63·

[2]Ye L,Liu S,Wang M,et al·High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryfor the analysis of bile acid profiles in serumof women with intrahepatic cholestasis of pregnancy[J]·Journal of Chro-matograp-hy B,2007,860(1):10-17·

[3]王冬梅,朱启英,丁丽,等·妊娠期肝内胆汁淤积症患者胎盘细胞凋亡及调控基因的研究[J]·中华妇产科杂志,2003,38(1):5-7·

[4]Bae S,Xiao Y,Li G,et al·Effect of maternal chronic hypoxic exposure during gestationonapoptosisinfetal rat heart[J]·AmJ Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(1):H983-H990·

[5]Li G,Xiao Y,Zhang L·Cocaine induces apoptosisinfetal rat myocardial cellsthroughthe p38mitogen-activated protein kinase and mitochondrial/cytochrome c pathways[J]·J Pharmacol Exp Ther,2005,312(1):112-119·

[6]肖建平·126例妊娠期肝内胆汁淤积症胎儿脐血心肌酶检测的临床分析[J]·中国妇产科临床杂志,2006,7(5):368-369·

[7]Germain AM,Carvajal JA,Glasinovic JC,et al·Intrahepatic cholestasis of pregnancy:anintriguing pregnancy-specific disorder[J]·J Soc Gynecol Investig,2002,9(1):10-14·

[8]Alonso J,Rioseco,Milenko B,et al·Intrahepatic cholestasis of pregnan-cy:Aretrospective case-control study of perinatal outcome[J]·AmJ Ob-stet Gynecol,1994,170(3):890-895·

[9]Londero F,San Marco L·Intrahepatic cholestasis of pregnancy:Are we really able to predict fetal outcome[J]·AmJ Obstet Gynecol,1997,176(2):1274-1275·