Akt信号通路

Akt信号通路（精选7篇）

Akt信号通路 第1篇

PI3-K/AKT信号通路最早被发现在胰岛素刺激及其应答的调控中起重要作用。随着研究的深入和下游底物的不断发现, PI3-K/AKT信号通路作为一条非常重要的细胞内信号转导通路被人们所认识。激素、生长因子、细胞因子、细胞外基质成分和应激等多种因素刺激后, AKT信号通路被活化, 在细胞周期调控、细胞生长与存活, 细胞增殖与凋亡, 细胞的迁移、分化及糖类代谢等的调控中扮演重要角色。AKT执行的复杂功能, 主要是通过磷酸化一系列特异性下游底物完成的。近年来对AKT信号通路的研究发现, 干细胞的增殖影响AKT及其下游信号分子的磷酸化表达水平, 这提示AKT信号系统在调控干细胞的增殖中起着重要的作用。

1.1 AKT的结构

AKT属于AGC蛋白激酶家族[1], 已经被证实是PI3-K/AKT信号通路的中心介导蛋白。1987年, Staal等[2]在小鼠的反转录病毒AKT8中找到一个癌基因, 命名为v-AKT。1991年, 3个独立的研究小组[3,4,5]先后成功克隆出AKT基因, 发现它是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 并认为AKT可能在酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸磷酸化途径中形成功能联系。AKT作为一种相对分子质量约60×103 (60KD) 的胞内信号蛋白, 因其激酶结构域与蛋白激酶A (PKA) 和蛋白激酶C (PKC) 具有高度同源性, 故又被称为蛋白激酶B (PKB) 。目前, 在哺乳动物中已发现的AKT家族至少包括三种亚型:AKT1, AKT2和AKT3, 也被称为PKBα, PKBβ和PKBγ。AKT1在真核细胞中广泛表达, 主要调控细胞存活和增殖;AKT2在胰岛素敏感组织中高度表达 (如肌肉、脂肪组织) , 参与胰岛素调节的代谢过程;而AKT3则主要分布在脑和睾丸组织, 调节细胞的大小以及数目[6]。它们在结构上具有高度的同源性和保守性, 其分子由氨基末端PH结构域、羧基末端调节结构域 (包含疏水基) 和中间的激酶催化结构域组成, 含有thr308、thr450、Ser473和Ser124四个磷酸化调节位点, 其中thr308 (位于催化结构域) 和Ser473 (位于调节结构域的疏水基) 的磷酸化与AKT活化有关, 并且双位点磷酸化才能使AKT完全激活。

1.2 AKT信号通路的调节

AKT是PI3-K/AKT信号通路中的关键信号转导分子, 其活化依赖于PI3-K, 因此研究中多以磷酸化的AKT (p-AKT) 作为衡量PI3-K活性的指标。PI3-K (phosphoinositide 3-kinase, 磷脂酰肌3-激酶) , 是一种胞内磷脂酰肌醇激酶, 根据结构和底物的不同可以分为三型, 其中Ⅰ型P13-K参与生长因子和细胞因子激活的信号通路应答, 主要介导细胞的生存、增殖、分化等生物学功能[7]。Ⅰ型PI3-K是一种包含催化亚基和调节亚基的异源二聚体, 其中调节亚基由三个基因编码, 有五种亚型:p85α, p55α, p50α, p85β和p55γ;催化亚基有三种亚型, p110α, p110β和p110δ, 分别由不同基因编码。胰岛素或者生长因子等配体激活受体酪氨酸激酶 (RTKs) , 或者G-蛋白偶联受体受刺激后均能使P13-K磷酸化。在活化的PI3-K作用下, 细胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸 (PIP2) 被磷酸化而转换成磷脂酰肌醇三磷酸 (PIP3) , 细胞质内的AKT因而被募集到细胞膜并通过氨基末端的PH结构域和PIP3结合并发生构象改变, PDK1 (3-phosphatide-dependent kinase, 磷脂酰激酶依赖激酶1) 得以靠近、催化AKT的thr308磷酸化。但是AKT的完全活化还需要Ser473的磷酸化, 后者的磷酸化相对复杂, 研究者们曾经推测其磷酸化调节可能与一种假想的名为PDK2的激酶有关, 但实际上后来的研究证明依据刺激和环境的不同[8,9], 参与催化该位点的酶是mTORC2或者DNA-PK。AKT完全激活后进一步介导其下游信号的级联反应, 参与调控细胞的存活、增殖、迁移、分化以及其他细胞代谢活动。随着研究的深入, 越来越多的蛋白分子被鉴定为AKT信号通路的特异性下游底物, 包括目前研究较多的:促凋亡因子BAD、胱天冬蛋白酶9 (caspase-9) , 促凋亡转录因子Forkhead家族, 促生存信号NF-κB, 雷帕霉素 (mTOR) 以及与糖代谢有关的糖原合成激酶-3 (GSK-3) 等。

PTEN则是AKT信号通路中重要的负性调节分子, 通过将PIP3去磷酸化为PIP2来实现对PI3-K的负调节, 此外, PP2A和PHLPP1/2分别通过诱导thr308、Ser473的去磷酸化而使AKT钝化, 也起到负性调节作用[10]。人工合成的LY294002是PI3-K的特异性抑制剂, 通过阻断PI3-K而实现对PI3-K/AKT信号通路的抑制。

2 AKT信号通路在干细胞增殖中的作用

干细胞可以分为三类:全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞;依据其所处的发育阶段则分为胚胎干细胞和成体干细胞。近年来干细胞在再生医学研究方面显示出广阔的临床应用前景, 成为其中最前沿, 最具活力和影响力的研究领域之一[11]。

尽管自我更新和增殖是干细胞的固有性质, 但目前对调控其增殖的信号通路及分子机制并不完全清楚。近年来的研究发现AKT信号通路及其下游蛋白的磷酸化表达水平可能决定着干细胞的命运, 在维持干细胞未分化状态、调节干细胞自我更新和增殖中起关键作用。

2.1 胚胎干细胞

1998年James等首次成功建立了人胚胎干细胞系, 将人卵体外受精培育至早期胚泡, 提取内细胞群, 最终得到了5个人胚胎干细胞系[12]。然而, 胚胎干细胞体外培养扩增时极易分化为其他细胞, 限制了干细胞移植的临床应用。

早在1999年, Sun等[13]在研究小鼠胚胎干细胞时就发现, PTEN基因缺陷的细胞完成一个细胞分裂周期的时间较正常时减少5%~10%。这项研究第一次使人们认识到PI3-K/AKT信号通路可能在胚胎干细胞的增殖调控中发挥重要作用。随后的研究进一步证实了这个发现, 当用PI3-K特异性抑制剂LY294002处理后, 胚胎干细胞的增殖减慢, 细胞富集于G1期[14]。周睿卿等[15]以胎鼠成纤维细胞作为饲养层, 二维培养的方法培养人胚胎干细胞并观察其生长状态, 以饲养层细胞、肿瘤细胞K562细胞株作为对照, 结果发现, 人胚胎干细胞在未分化状态时Pten抑制的PI3-K/AKT/mTOR信号通路下游磷酸化关键蛋白活性较低。研究者推测, PI3-K/AKT/mTOR信号通路在胚胎干细胞的自我复制和分化中起到重要作用, 更由此猜想如果抑制负调节蛋白PTEN或直接激活该通路正调节关键蛋白, 可能会加快人胚胎干细胞增殖、减少凋亡。

2.2 成体干细胞

脑缺血等损伤可以激活成年大脑内源性神经干细胞, 促使其增殖、产生新的神经元并向损伤部位募集, 这种现象在侧脑室外侧壁的室管膜下区 (SVZ) 和海马齿状回颗粒下层 (SGZ) 尤其明显[16,17]。但是这种调控机制至今仍未完全阐明, 研究表明微环境的改变、神经营养因子以及信号转导通路等可能都参与其中。1999年, Kitagawa等首次报导在永久性大鼠大脑中动脉缺血模型中观察到PI3-K/AKT信号通路的激活, 这提示AKT信号通路可能在神经干细胞的增殖方面起作用[18]。随后的大量研究证实这种内源性的干细胞增殖调控涉及多条信号通路, 其中由生长因子激活的PI3-K/AKT信号通路可能在干细胞生长、存活以及增殖中扮演重要角色[19,20,21]。这在赵宇等[22]体外培养的大鼠神经干细胞实验中也得到证实, 应用不同浓度梯度的PI3-K特异性抑制剂LY294002孵育后进行细胞存活、增殖等检测, 结果发现LY294002阻断AKT信号通路呈剂量依赖性, 且随着浓度升高, p-AKT含量降低, 大鼠神经干细胞的增殖受到明显抑制。

此外, 有关AKT信号通路参与其他成体干细胞如心脏干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等增殖调控的相关报道也有许多。成熟的心脏组织中仍然存在少量干细胞, 有研究表明其数量只占正常心肌细胞的1%[23]。赵岚等[24]证实, 心肌梗死同样促进内源性心脏干细胞增殖, PI3-K/AKT信号通路参与了大鼠心肌梗死后心脏干细胞的动员调节。在大鼠冠脉阻塞模型中观察到, 急性缺血诱导局部心肌AKT表达水平和干细胞数量同步进行性升高, AKT抑制剂显著抑制上述各项指标的动态演变, 使心肌梗死面积进一步恶化。Gharibi等[25]利用血小板源生长因子受体β体外培养人间充质干细胞, 发现P13-K/AKT/mTOR以及下游相关蛋白p70S6K和4E-BP1与干细胞增殖调控有关, 另一条信号通路ERK则介导间充质干细胞的分化。Perry等[26]揭示Wnt (β) -catenin和PI3-K/AKT信号通路的共同作用下, 造血干细胞才能实现自我更新和扩增。

同样有研究报导称AKT信号通路与干细胞的分化密切相关。Isomoto等[27]应用mTOR特异性抑制剂rapamycin阻断PI3-K/AKT/mTOR信号通路后发现成骨分化受抑制, 这提示PI3-K/AKT/mTOR信号通路的活化与成骨前体细胞即间充质干细胞的分化有关。国海东等[28]研究表明在骨形态发生蛋白-2 (BMP-2) 诱导的骨髓源性心肌干细胞向心肌细胞分化中, PI3-K/AKT信号通路发挥了重要的调控作用。成体干细胞在发育过程中, 既要维持自我增殖, 又要进一步分化为各种类型细胞, 在其分化和增殖之间应该存在着一种平衡调节机制, 可能AKT信号通路正是这种平衡途径之一。

3 AKT信号通路与肿瘤发生

近年来AKT信号通路与肿瘤发生的关系也日益受到人们的关注。AKT的过度表达或者PTEN等负调控机制的失活与恶性肿瘤的发生密切相关, 在多种恶性肿瘤中可以检测到该通路信号蛋白及其调节分子的异常表达[29,30]。蔓小红等[31]研究发现, 尖锐湿疣和宫颈鳞状细胞癌中PI3-K/AKT信号通路被异常激活, HPV有可能通过影响PI3K和P-AKT的表达上调进而引起感染上皮的异常增殖。研究已经证实PI3-K/AKT信号通路参与调节肿瘤细胞的增殖、存活和迁移, 目前以该通路及其关键分子为治疗靶点的肿瘤治疗新策略也成了研究热点。张辉等[32]的研究表明, AKT激酶在前列腺癌生长、发展以及激素依赖性向激素非依赖性的转变过程中起着重要作用。p-AKT蛋白磷酸化水平在AKT磷酸化激活过程中占主导地位, 是AKT激活的必要过程。米非司酮抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖, 诱导细胞凋亡, 其机制可能是通过抑制AKT信号转导通路, 从而激活Caspase。

4 中医中药

最近天津中医药大学的一个研究小组从传统中药丹参中提取出了45种活性成分[33], 一一检测其对于体外培养的神经干/祖细胞的增殖诱导能力, 筛选结果提示丹酚酸B对神经干/祖细胞具有促进增殖作用, 并且这种促进作用呈时间-剂量依赖关系, 其调控的分子机制可能与PI3-K/AKT信号通路有关;动物实验也证实丹酚酸B可以通过干预PI3-K/AKT信号通路介导短暂性脑缺血大鼠模型大脑神经干细胞的自我更新和增殖。丹参抗肝纤维化的作用已经被证实, 丹参的水溶性有效成分丹参素具有保护肝细胞, 显著抑制肝星状细胞增殖并促进其凋亡的作用[34]。王珏等[35]研究提示不同浓度的丹参素和渥曼青霉素作用于肝星状细胞24h后, 细胞中磷酸化AKT (p-Akt) 表达随药物浓度增加表达逐渐减弱, 这说明丹参素和渥曼青霉素对肝星状细胞增殖的抑制作用与其抑制PI3-K/Akt信号通路中AKT的活化有关。赖真等[36]研究发现, 黄芪可刺激PI3-K/AKT信号通路的表达, 减轻大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡。

5 展望

目前的研究揭示AKT信号通路参与了干细胞的自我更新和增殖调控, 未来研究的一个方向极有可能以此为调控靶点, 筛选药物, 提高干细胞的增殖率, 进而为干细胞治疗和再生医学提供更多的细胞来源, 使干细胞疗法在“不治之症”的治疗方面得到更广泛的应用。Jun等[37]研究发现, 原钒酸钠通过干预AKT和ERK信号通路促进中风大鼠大脑SVZ区的神经前体细胞增殖。由此推测, 原钒酸钠可能因此成为治疗脑中风的潜在药物。但是这种调控机制是非常复杂的, 可能不止涉及一条信号通路, 而是多条通路的相互作用、相互影响。有关干细胞增殖的精确调控机制以及胞内信号通路间的相互作用尚有待进一步的研究证实。

Akt信号通路 第2篇

关键词：PI3K/Akt信号通路,羊种布鲁氏杆菌16M,抑制剂LY294002,免疫印迹,巨噬细胞

布鲁氏杆菌病是一种严重危害人和家畜健康的人兽共患传染病［1 － 2］。布鲁氏杆菌为革兰阴性的兼性胞内寄生菌,其急性期的临床特点主要为恶寒、发热、关节和肌肉痛等; 人感染布鲁氏杆菌后造成骨关节、神经系统、生殖系统和免疫系统等损害,慢性期主要症状为骨关节病及包括神经系统在内的多系统、多器官的损害,患者一般会表现出神经- 精神症状,病程较长,容易复发并再感染,从而导致劳动力的丧失。动物布鲁氏杆菌病的特点是生殖器官、胎膜及其他多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成,引起流产、睾丸炎及关节炎等症状。布鲁氏杆菌病给人类健康和畜牧业和谐发展带来严重危害［3］。因此,研究布鲁氏杆菌及对宿主细胞的致病机制,为布鲁氏杆菌疫苗研发和防控提供理论基础,对于国民经济的发展和人畜的安全具有重大的意义。

PI3K / Akt信号转导通路是重要的细胞生存通路之一,Akt作为PI3K/Akt信号转导通路的关键分子,在促进细胞生存、生长、增殖,促进细胞运动、侵袭和转移,抑制细胞凋亡方面起核心作用［4］。PI3K/Akt信号通路与肿瘤的发生发展密切相关,在多种肿瘤组织有Akt的过度表达和活化。PI3K/Akt信号通路还与一些病毒的生存繁殖密切相关,然而PI3K/Akt信号通路与布鲁氏杆菌的生存关系如何,目前还尚无相关报道。笔者推测PI3K/Akt信号通路在布鲁氏杆菌致病过程中发挥重要作用,为此,本试验研究PI3K/Akt信号通路在布鲁氏杆菌致病过程中的作用,目的是揭示布鲁氏杆菌的致病机制,为抗布鲁氏杆菌药物的研制提供理论基础。

1 材料

1. 1 菌株、细胞与质粒

羊种布鲁氏杆菌16M,由石河子大学人畜共患病实验室提供; 大肠杆菌DH5α,由铜仁学院生物与农林工程技术实验室保存。

1. 2 主要试剂

无内毒素质粒大提试剂盒、增强型HRP - DAB试剂盒,购自天根生化( 北京) 科技有限公司; 胎牛血清,购自GIBCO公司; 细胞转染试剂LipofectamineTM2000,购自Invitrogen公司; 酵母提取物( Yeast Ex-tract) 、蛋白胨( Tryptone) 、Na Cl,购自Oxoid公司; 琼脂糖,购自上海生物工程技术有限公司; MTT、DMSO,购自索莱宝公司; LY294002( PI3K抑制剂,以DMSO作为溶剂) ,购自碧云天公司; 兔抗鼠磷酸化Akt( Ser473) 和Akt ( Thr308 ) 以及Akt单克隆抗体、HRP - 羊抗兔二抗,购自Cell Signaling Technology公司; β - actin,购自Bioworld公司; ECL荧光检测试剂盒,购自Thermo公司; BCA蛋白定量试剂盒,购自上海生物工程技术有限公司。

2 方法

2. 1 小鼠巨噬细胞RAW264. 7 的布鲁氏杆菌侵染

将16M用PBS洗脱菌体,利用细菌比浊法计算数量,按比例通过10 倍稀释菌悬液,然后将悬液涂于固体培养基上,置于37 ℃、10% CO2培养箱中培养3 d,每个稀释浓度重复3 次,进行计数取平均值确定布鲁氏杆菌数目。以50∶1( 细菌数∶细胞数) 的比例,用16M侵染RAW264. 7 细胞,并将侵染后的RAW264. 7 细胞置于37 ℃ 、5% CO2培养箱中继续培养。

2. 2 细胞蛋白质的提取

细胞计数并收集1 × 106个细胞,1 500 r/min离心5 min; 弃上清液,收集细胞,加入1 × PBS洗涤3 次; 弃上清液,在细胞沉淀中加入100 μL RIPA裂解液和10 μL/m L PMSF ( 100 mmol/L) 、5 μL/m LNa3VO4( 200 mmol/L) 、2 μL/m L Na F ( 0. 5 mol/L) 、150 μL / m L phos STOP phosphatase inhibitor ( Roche公司产品) ,细胞悬浮混匀,在冰上静置20 min; 4 ℃、15 000 r / min离心15 min; 移出上清液至一支新离心管,即为含总蛋白的溶液。

2. 3 蛋白浓度的BCA法测定

吸取50 μL或样品到标记好的试管中,加入1 m L BCA工作液,轻柔涡旋混匀。标准检测条件:37 ℃ 孵育30 min或室温放置2 ~ 16 h。加强型检测条件: 在60 ℃孵育15 min。将试管冷却至室温,在一个干净的吸光杯中加入1 m L水,在波长562 nm条件下调零。将待测液加入干净的吸光杯,10 min内测定并记录所有反应液的吸光值( OD562值) 。校正的吸光值是将各标样和试样的读数减去空白样吸光度值。结合已知的BSA标样的量和校正过的吸光度值画出标准曲线。参照标准曲线,根据各蛋白试样的校正吸光度值,在标准曲线的线性范围内读出各样品的蛋白浓度。根据样品体积和稀释度计算原来样品中的蛋白量。

2. 4 Western - blot检测

当SDS - PAGE结束时,将含有目的蛋白的凝胶切下,尽量避免用手碰触。同时裁剪6 ~ 7 张大小和凝胶相同的滤纸和1 张硝酸纤维素膜( NC膜) ,切除凝胶、NC膜与滤纸一角作为标记。将凝胶与NC膜在膜转移缓冲液中静置平衡10 min,NC膜与滤纸分开浸泡。转膜: 将3 层滤纸放于半干式电转仪中,然后放胶,将NC膜放于其上,再铺3 层滤纸,200 m A和20 V电泳1 ~ 2 h。封闭: 小心取出NC膜,倒放在一个干净平皿中,用TBST洗膜3 次,每次5 min; 将NC膜放入杂交瓶中,加入10 m L膜封闭液,在37 ℃条件下于杂交仪上封闭1 h。与一抗的结合: 倒去封闭液,将NC膜放入盛有TBST的平皿中冲膜3 次,每次5 min; 将NC膜放入杂交瓶中,加入用TBST稀释的一抗( 1∶1 000) ,在37 ℃ 条件下于杂交仪上杂交1 ~ 2 h。 与二抗的结合: 用TBST冲膜3 次,每次5 min; 加入用TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔HRP - Ig G二抗5 m L( 1∶3 000) ,37 ℃ 于杂交仪上杂交1 h; 用TBST冲膜3 次,每次10 min; 加ECL底物显色液,避光显色1 min,然后照像。

2. 5 LY294002 抑制试验

将细胞在10% FBS培养基中培养,取对数生长期细胞2 m L,以1 × 106/ m L的密度接种于六孔培养板中,继续培养6 h后,加入LY294002,浓度分别选取10,20,40,80 μmol/L,1 h后观察p Akt( S473) 和p Akt( T308) 的抑制状态。方法: 将细胞混悬液立即置入液氮以终止作用,继以冰冻PBS洗涤细胞3 次。收集细胞,采用1 × 106个/50 μL RIPA提取总蛋白质,BCA法测定总蛋白浓度。

2. 6 MTT试验

将不同浓度的LY294002( 10,20,40 μmol/L) 与巨噬细胞共同孵育,以0. 1% DMSO处理的细胞作对照,置37 ℃、5% CO2培养箱使细胞贴壁培养6 ~24 h; 加入适当浓度的受试化合物,继续培养适当时间; 小心吸取上清液,加入90 μL新鲜培养液,再加入10 μL MTT溶液继续培养4 h; 弃去上清液,每孔加入110 μL Formazan溶解液,置摇床上低速振荡10 min,使结晶充分溶解; 在酶联免疫检测仪490 nm处测定各孔的吸光值,同时设置调零孔( 培养基、MTT、Formazan溶解液) 和对照孔( 细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、Formazan溶解液) ,每组设定3 复孔。

2. 7 布鲁氏杆菌的培养、计数

将保存的布鲁氏杆菌冻干菌接种于10% 小牛血清肝琼脂培养基,置37 ℃、10% CO2培养箱培养4 d;挑取单菌落,接种于斜面培养基再培养4 d; 加入2 m L生理盐水,用接种环将斜面培养基上的细菌轻轻刮下,以1 × 10－ 1~ 1 × 10－ 15均匀稀释细菌,并取1 × 10－ 13、1 × 10－ 14、1 × 10－ 15稀释菌液200 μL涂布于120 mm含有10% 小牛血清肝琼脂培养基的平板中,每个稀释度涂2 个平板,置于10% 、37 ℃ 的CO2培养箱中培养4 d,对细菌进行平板计数。

2. 8 数据的统计学分析

使用SPSS17. 0 数据统计软件对试验数据进行统计学分析。

3 结果与分析

3. 1 羊种布鲁氏杆菌16M对PI3K / Akt信号通路的激活

通过Western - blot检测结果( 见图1) 可以看出: 羊种布鲁氏杆菌16M侵染巨噬细胞,p - Akt( S473) 和p - Akt( T308) 在0. 5 ~ 4 h内有表达,在0. 5,1,2,4 小时时,p - Akt( S473) 与 β - actin的灰度值比值分别为0. 890 ± 0. 009、1. 070 ± 0. 072、0. 620 ± 0. 053 和0. 420 ± 0. 025,同时p - Akt( T308)与 β - actin的灰度值比值分别为0. 840 ± 0. 031、1. 450 ± 0. 128、0. 900 ± 0. 017 和0. 380 ± 0. 021( 见图1B) 。经统计学分析,p - Akt ( S473 ) 和p - Akt( T308) 在第1 小时的灰度值比值显著高于对照组和其他组( P < 0. 05) ,表明其表达量最高。p - Akt( S473) 和p - Akt( T308) 表达水平在第8,12,24 小时恢复正常,与对照组相比其表达量无显著差异( 见图1A和B ) ( P > 0. 05 ) 。结果表明,羊种布鲁氏杆菌16M在0. 5 ~ 4 h激活了PI3K / Akt信号通路。

注:与对照组(侵染0 h)相比,*表示差异显著(P<0.05)。

3. 2抑制剂LY294002 对16M介导的PI3K / Akt信号通路的阻断

抑制剂LY294002 和DMSO分别与巨噬细胞作用1 h,然后再用16M侵染巨噬细胞1 h,Western -blot检测p - Akt( S473) 和p - Akt( T308 ) 的表达量。对照组细胞的p - Akt( S473) 和p - Akt( T308) 与β - actin的灰度值比值分别为0. 160 ± 0. 045 和0. 180 ± 0. 051( 见图2A和B) 。仅16M感染细胞的p - Akt( S473) 和p - Akt( T308) 与 β - actin的灰度值比值分别为1. 070 ± 0. 071 和1. 250 ± 0. 032。当抑制剂LY浓度增大至10 μmol/L时,p - Akt( S473) 和p - Akt( T308) 的灰度值比值显著低于仅16M感染组细胞( P < 0. 05) ( 见图2B) 。当抑制剂LY294002 浓度增大至20 μmol/L时,16M + LY294002 组细胞p -Akt( S473) 和p - Akt( T308) 与 β - actin的灰度值比值分别为0. 190 ± 0. 018 和0. 170 ± 0. 027,与对照组细胞p - Akt( S473) 和p - Akt( T308) 的灰度值比值无显著差异( P > 0. 05) ( 见图2B) 。结果表明: 当LY294002 浓度为10 μmol / L时,可明显抑制p - Akt( S473) 和p - Akt( T308) 的表达; 当LY294002 浓度增大至20 μmol/L时,完全抑制了p - Akt( S473) 和p - Akt( T308) 的表达( 见图2A和B) 。说明抑制剂LY294002 对16M介导的PI3K / Akt信号通路的阻断具有浓度依赖性,随着浓度的增加其阻断效果越明显。

3. 3 抑制剂LY294002 对巨噬细胞活性的影响

将抑制剂LY和DMSO分别与巨噬细胞作用48 h,检测结果表明: 当抑制剂LY294002 的浓度为10 μmol / L和20 μmol / L不影响细胞的活性,在浓度为40 μmol/L时细胞的成活率降至70% ,当浓度增大至80 μmol/L时细胞的成活率降至为45% 。加DMSO后的细胞形态为小圆球形,与正常细胞形态相同,对照组加DMSO不影响细胞的活性( 见图3A) 。加入LY294002 的浓度为10 μmol/L和20 μmol/L时,细胞形态也为小圆球形,与正常细胞形态相同; 当LY294002 的浓度为40 μmol / L时,细胞变大,形态开始呈不规则形; 当LY294002 的浓度再增大至80 μmol/L时,细胞呈梭形( 见图3A) ,说明在40,80 μmol / L时细胞活性显著低于正常细胞组( P <0. 05,见图3B) 。结果说明采用抑制剂LY294002 的浓度为20 μmol/L时不影响巨噬细胞的活性,可以进行后续试验。

4 讨论

PI3K / Akt信号通路与很多疾病有关,在细胞内参与调控物质代谢、细胞增殖与存活等生物学行为。PI3K下游靶蛋白Akt具有丝氨酸/ 苏氨酸残基,可直接被PI3K激活。在PI3K途径中,当上游信号作用于细胞膜表面时,穿膜受体酪氨酸激酶自磷酸化或磷酸化其他底物后,能在细胞膜内表面产生PI3K结合点,PI3K结合后可产生一些磷脂,然后激活Akt,被激活的Akt可介导细胞生长和分化,同时还可提高抗凋亡基因的表达而抑制细胞凋亡,或活化其他信号转导通路来调控细胞的适应性生存。PI3K/Akt异常激活与体内许多癌症发生密切相关［5］。p - Akt是Akt的功能活化状态,Akt只有被激活后才具有生物学功能。p - Akt在大多数肿瘤组织中过度表达。Akt的活化同时需要催化结构域的Th308 位点和C端的调节结构域的Ser473 位点的磷酸化,只有2 个位点的磷酸化才能使Akt充分活化从而达到最大活化状态。本研究表明,光滑型菌株( S2308) 及可激活p - Akt的Thr308 和Ser473 两个位点,充分活化的Akt调控细胞的一系列生理活动; 对p - Akt的激活程度可能与光滑型菌株的毒力强和粗糙型菌株的毒力弱有关。本研究利用16M作为侵染模型,发现16M对PI3K/Akt的激活依赖于侵染时间、侵染比例。当布鲁氏杆菌侵染1 h,细菌数与细胞数的比例为50∶1 时激活PI3K / Akt的程度最强。因磷酸化蛋白易降解,要添加磷酸酶抑制剂,如加入5 μL/m L Na3VO4( 200 mmol/L) 、2 μL /m L Na F ( 0. 5 mol/L ) 、150 μL / m L phos STOP phosphatase inhibitor,否则磷酸化蛋白易降解,无法检测磷酸化蛋白表达。另外,用BCA测定法对蛋白含量进行定量后,确保上样量达到50 μg,否则很难检测磷酸化蛋白的表达。

注:与未经任何处理的对照组相比,*表示差异显著(P<0.05)。

注:与对照组(DMSO处理组)相比,*表示差异显著(P<0.05)。

LPS是布鲁氏杆菌的经典毒力因子,包括类脂A、核心低聚糖和O抗原或O链三个部分。布鲁氏杆菌LPS的生物学活性与传统的内毒素不同,主要与其特殊的化学结构有关。当布鲁氏杆菌LPS的O -多聚糖缺失时,布鲁氏杆菌从光滑型转变为粗糙型,导致细菌的毒力减弱,易于被巨噬细胞杀死［6 － 7］。已有研究表明,脂多糖O型多糖抑制细胞的吞噬作用,抑制溶酶体溶解和宿主细胞凋亡［8］。布鲁氏杆菌及其宿主细胞最开始接触的是始于布鲁氏杆菌表面和宿主细胞胞质膜的接触,脂多糖缺失的突变株毒力较亲本株减弱,这说明布鲁氏杆菌LPS在细菌毒力上具有很重要的作用［9］。笔者推测: 对PI3K/Akt激活的强弱与布鲁氏杆菌致病性呈正相关,光滑型布鲁氏杆菌致病性强的原因可能与其LPS能激活PI3K / Akt通路程度较强有关,粗糙型布鲁氏杆菌致病性弱的原因可能与其LPS能激活PI3K/Akt通路程度较弱有关。

LY294002 是一个高度特异性的抑制剂,它可以特异地抑制PI3K的活性,但是不抑制其他的脂质和蛋白激酶活性。研究表明,LY294002 可以抑制PI3K - 依赖的Akt磷酸化和激酶活性,它通过和ATP竞争PI3K催化结构域的结合位点发挥作用［10］,从而有效抑制其下游蛋白Akt的磷酸化,已被广泛应用于信号传导通路的作用及靶向治疗的研究中。本研究使用PI3K的特异性抑制剂LY294002 阻断PI3K/Ak通路,依赖于抑制剂LY294002 的剂量,其最佳剂量为20 μmol/L,这为后续试验提供了侵染模型和材料,为其他信号通路与布鲁氏杆菌的研究提供依据。

Akt信号通路 第3篇

1 材料与方法

1.1 一般材料

C57BL/6小鼠购自重庆医科大学实验动物中心。DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均购自美国Gibico公司,RNA提取试剂Trizol和荧光试剂SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均购自日本Ta Ka Ra公司,蛋白提取试剂RIPA、PMSF、Na F、Na3VO4和BCA蛋白测定试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司,NF-κB抗体购自美国Abcam公司,蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)及p-Akt抗体均购自美国CST公司,β-actin抗体、HRP标记二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。IL-1α、IL-6和TNF-α酶联免疫试剂盒购自晶美生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠成骨细胞的培养及鉴定

取20只出生24 h内的小鼠,引颈处死,75%酒精浸泡10 min。无菌的条件下取出颅盖骨浸泡在D-Hanks液中。分别剪成0.1 mm×0.1 mm×0.1 mm的组织块,加入10 ml0.25%的胰蛋白溶液,37℃孵育30 min。1 000 r/min离心5 min,弃上清液。加入0.2%胶原酶10 ml,37℃孵育2 h,每5 min震荡1次。1 000 r/min离心5 min,弃上清。用DMEM培养基冲洗3次。200目滤网过滤去除骨碎片。收获细胞以完全培养基(含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液)重悬,吹打均匀,接种至多个25 cm2培养瓶。放入37℃,5%二氧化碳CO2培养箱培养。每48 h换液1次,细胞融合成单层至80%以上时,0.25%胰酶消化制成细胞悬液,采用差速贴壁法进行成骨细胞纯化。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,碱性磷酸酶活性检测鉴定成骨细胞。

1.2.2 细胞处理分组

实验中细胞主要按照以下分组进行处理,收集第4代细胞进行实验,将原代成骨细胞按1×105接种于6孔板上。将胆固醇溶于乙醇溶液,待细胞生长至80%融合状态时加入不同浓度的胆固醇溶液,胆固醇终浓度为0μg/ml,12.5μg/ml,25μg/ml,50μg/ml,乙醇浓度为0.25%,对照组为只含有10%FBS的DMEM培养基。

1.2.3 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)

细胞按上述分组进行处理,用不同浓度胆固醇溶液培养基培养24 h,离心管收集培养上清液备用,用预冷的PBS洗涤细胞两次,用Trizol法提取原代成骨细细胞总RNA,逆转录合成c DNA。采用RT-PCR检测目的基因,用2-ΔΔCt值计算目的基因的相对表达量。其中人白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)基因引物正向序列:5'-GAAATC GTGGAAATGAG-3';反向:5'-TAGGTTTGCCGAGTA GA-3'。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)基因正向引物:5'-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT-3';反向:5'-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3'。人白细胞介素1α(interleukin 1α,IL-1α)基因引物正向序列:5'-CTCTAGAGCACCATGCTACAG-3';反向:5'-TTGGAATCCAGGGGAAACACT-3'。内参β-actin基因引物正向序列:5'-GCTGTCCCTGTATG CCTCT-3';反向:5'-GATGTCACGCACGATTTCC-3'。

1.2.4酶联免疫分析(Elisa)

采用酶联免疫试剂盒,按试剂说明进行检测,酶标仪测定450 nm波长处光密度(optical density,OD)值,以标准品浓度和OD值作标准曲线,样品浓度根据标准曲线得出。

1.2.5蛋白质免疫印迹分析(Western blot)

提取原代成骨细胞蛋白并用BCA法测定蛋白浓度。取60μg蛋白上样,SDS-PAGE电泳分离蛋白后转膜到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,一抗4℃孵育过夜,TBST洗3次,HRP标记的二抗室温孵育1 h,TBST洗3次后加ECL试剂反应,显像、成像。用目的条带与β-actin的灰度值比较表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间比较用单因素ANOVA分析,用LSD-t检验或SNK-q检验进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆固醇对成骨细胞IL-1α、IL-6和TNF-αm RNA表达的影响

按上述方法分离小鼠原代成骨细胞进行碱性磷酸酶活性检测鉴定,可见大量染色阳性细胞,细胞膜及细胞浆内颗粒染色呈蓝黑色颗粒,鉴定结果见图1。成功分离的成骨细胞接种6孔板,并用不同浓度的胆固醇刺激成骨细胞24 h,实时荧光定量PCR测定IL-1α、IL-6和TNF-αm RNA表达。0μg/ml组与对照组比较各炎症因子的表达基本无变化,说明酒精溶酶基本不影响本实验中炎症因子的表达。不同浓度胆固醇显著诱导IL-1α、IL-6及TNF-α的m RNA水平,且呈现一定的剂量依赖性,见图2A~C。本结果提示在成骨细胞中胆固醇与炎症因子IL-1α、IL-6和TNF-α的m RNA水平呈正相关。

1)P<0.05;2)P<0.01。1:对照组;2:0μg/ml组;3:12.5μg/ml组;4:25μg/ml组;5:50μg/ml组

2.2 胆固醇对成骨细胞IL-1α、IL-6和TNF-α分泌水平的影响

如附表所示,不同浓度的胆固醇刺激成骨细胞24 h后,酶联免疫吸附法测定细胞培养液上清中分泌IL-1α、IL-6和TNF-α的水平变化。0μg/ml组与对照组比较,IL-1α、IL-6及TNF-α均无明显变化;12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml组均能显著诱导IL-1α、IL-6及TNF-α的水平。说明胆固醇可以促进IL-1α、IL-6和TNF-α的分泌,且IL-6的分泌与胆固醇浓度呈正相关。

2.3 胆固醇对成骨细胞Akt和NF-κB信号通路的影响

如图3A与3B所示,胆固醇刺激成骨细胞后Western blot测定不同处理组蛋白变化,与对照组比较,12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml 3组中NF-κB水平均显著增加(P<0.01),而p-Akt水平显著降低(P<0.01)。提示:成骨细胞中胆固醇浓度与NF-κB蛋白表达一定范围内呈正相关(P<0.01),胆固醇浓度与成骨细胞Akt磷酸化水平一定范围内呈负相关(P<0.01),统计结果见图3C与3D。

注:+与对照组比较,P<0.01

+P<0.01。1:对照组;2:0μg/ml组;3:12.5μg/ml组;4:25μg/ml组;5:50μg/ml组

3 讨论

Akt信号通路及靶基因对骨分化、骨形成和骨重建都有着关键调控作用。血浆网膜素-1(omentin-1)和胰岛素可以通过增加Akt的磷酸化水平,促进成骨细胞的增殖。敲除Akt1/Akt2的小鼠骨化延迟,敲除Akt2对BMP2没有影响,但可通过对骨特异性转录因子(Runx2)基因的调控阻断骨髓基质细胞或间充质干细胞向成骨细胞的分化[13]。Akt磷酸化可以抑制糖皮激素诱导的成骨细胞凋亡。NF-κB广泛表达于多种组织细胞中,其激活后参与许多基因的转录调控,在免疫、炎症、氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡等生理病理过程中发挥重要调控作用。NF-κB与骨代谢密切相关,γ射线可导致NF-κB活化,促进成骨细胞凋亡。NF-κB p50激活后也可刺激成骨细胞和破骨细胞分泌集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1,CSF-1),其在骨的重建中有着重要作用。TNF-α可以刺激成骨细胞NF-κB蛋白与其内源性抑制因子核因子抑制蛋白-κB(nuclean factor-kappa B,IκBα)的解离,短时间可见核周NF-κB蛋白浓度增加,并迅速入核调控目的基因,导致成骨细胞凋亡[14]。NF-κB的抑制剂PMMA可以有效阻断间质细胞向成熟破骨细胞的分化[15],骨保护素(osteoclastogenesis inhibitory factor,OPG)与NF-κB配体核因子KB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)结合使基质金属蛋白酶9(matix metalloproteinase 9,MMP9)表达增高,阻断破骨细胞的生成、抑制骨的再吸收。本研究结果显示,胆固醇浓度与Akt的磷酸化水平负相关,与NF-κB的表达正相关,提示胆固醇可能通过NF-κB与Akt信号通路介导成骨细胞分化过程。

PI3K/Akt是调节NF-κB及下游基因表达的重要信号通路。过表达的胰岛素受体底物1(insulin receptor 1,IRS1)可通过PI3K/Akt信号通路抑制NF-κB和其下游BAX基因(Bcl2-associated X protein,BAX)的表达促进成骨细胞增殖,且上述作用可以被PI3K的抑制剂LY294002所逆转[16]。PI3K/Akt磷酸化后,激活NF-κB及其调控下游细胞因子和炎症介质TNF-α、IL-1α及IL-6的释放[17]。TNF-α、IL-1α、IL-6等炎症介质的分泌可以促进炎症反应,不仅对破骨细胞性骨吸收有明显促进作用,而且还能影响成骨细胞性骨形成。TNF-α能够抑制胶原合成、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性和骨钙素合成,同时可以通过NF-κB途径增加IL-6、IL-1α和ICAM 1基因的表达从而增加骨质流失。IL-6在骨更新中有着重要作用,成骨细胞分泌的IL-6与多种细胞因子共同作用促进骨吸收和骨重建[18,19]。本研究观察结果显示,高胆固醇促进TNF-α、IL-1α与IL-6表达,而且表达水平与胆固醇浓度正相关,提示高胆固醇可能通过Akt/NF-κB信号通路促进炎症反应,从而影响成骨细胞分化过程。

Akt信号通路 第4篇

目前的研究表明运动训练促进骨骼肌肥大的信号通路主要是PI3K/Akt/m TOR通路。本研究采用大鼠体重负重进行间歇游泳运动的模式, 旨在研究促进骨骼肌肥大的适宜的运动负荷, 观察体重负重游泳训练引起的肌肉生长过程中PI3K、Akt和m TOR的表达以及磷酸化等内在机制变化。

2实验方法

2.1实验对象

采用健康雄性SD大鼠40只, 体重240-260g。大鼠常规分笼饲养, 4只/笼, 均以标准啮齿动物饲料喂养, 自由饮水。室温保持在20–25℃, 相对湿度50-55%, 光照及黑暗的环境各12小时。

2.2实验对象分组及训练安排

适应性喂养一周后, 随机分为5组, 每组8只, 一组为对照组 (C组) , 其余四组分别以无负重 (T0伹) 、5% (T5伹) 、10% (T10伹) 和15% (T15伹) 体重负重隔日进行间歇游泳训练。对照组不训练, 实验组在尾部悬挂重物, 在水池中游泳, 每次运动时间为30min (56min, 间隙时间为6min) , 持续8周。训练过程中如果大鼠出现力竭现象, 及时捞起, 休息2min后, 继续游泳, 完成规定时间。

2.3实验取材

最后一次游泳训练12小时后进行取材。将大鼠称重后以10%水合氯醛 (35-40 mg/100g体重) 腹腔麻醉, 呈仰卧位固定, 取大鼠左右两侧腓肠肌称重, 液氮速冻后转至&80℃保存等待检测。

2.4肌肉蛋白含量测定

2.4.1肌肉蛋白的提取

(1) 取出冻存腓肠肌, 取200 mg肌肉组织用预冷的PBS清洗。

(2) 将肌肉组织上的PBS吸干置于试管中, 加入1 ml组织裂解液, 其中每1ml裂解液含5ul的磷酸酶抑制剂、5ul的蛋白酶抑制剂和5ul的PMSF。

(3) 用眼科剪将肌肉组织剪碎, 于4°C中静置30min。

(4) 使用匀浆机将肌肉组织充分匀浆, 移至1.5ml离心管中。

(5) 用4℃低温高速离心机以12000 RPM离心10min中, 取上清。-20℃保存待用。

2.4.2用考马斯亮蓝法测定肌肉总蛋白的含量。

2.4.3蛋白免疫印迹法测定特殊蛋白

(1) 蛋白处理:取蛋白提取上清, 按1:4的体积比加入4x protein loading buffer, 沸水煮10min。-20℃保存, 待用。

(2) SDS-PAGE电泳:上样量为20ul, 浓缩胶电压为60V, 待蛋白样品中的溴酚蓝至浓缩胶与分离胶的交界处, 电压调节至120V。转膜电压100V, 转膜时间为4小时, 然后用5%脱脂奶粉封闭1h。一抗孵育摇床过夜, 抗体用1%BSA稀释液。二抗选用辣根过氧化酶标记的兔抗羊IGG孵育。

(3) 化学发光, 显影、定影。

(4) 图像分析

将X光片扫描成图像并保存为电脑文件, 用Image J分析软件读取图片上目的条带灰度值。

2.5实验数据处理

数据采用SPSS 13.0统计软件处理。数据用均数和标准差形式表示 (mean±SD) , 采用单因素方差分析对不同组别的数据进行比较, p﹤0.05和p﹤0.01分别表示差别具有显著和非常显著的统计学意义。

3实验结果及分析

3.1各组大鼠的体重及肌肉指数

注:*表示与对照组相比P<0.05, **表示与对照组相比P<0.01

#表示与15%体重负重组相比P<0.05, ##表示与15%体重负重组相比P<0.01

8周间歇负重游泳训练后, 与C组相比, T10组和T15组大鼠体重显著下降 (P<0.01) ;T5组大鼠的体重亦有显著性下降 (P<0.05) , 运动组间比较T15组大鼠体重分别与T0组、T5组、T10组相比均有显著性下降 (P<0.05) 。 (见表1)

8周间歇负重游泳训练后, 与C组相比, T15组大鼠的腓肠肌质量指数有显著提高 (P<0.05) ;训练组间比较, T15组与T0组, T5组大鼠的腓肠肌质量指数相比有显著性提高 (P<0.05) 。

3.2各组大鼠腓肠肌的蛋白浓度

8周间歇负重游泳训练后, 与C组相比, T5、T10和T15大鼠腓肠肌蛋白浓度OD值有显著性提高 (P<0.05) 。T10、T15组与T0组相比大鼠腓肠肌蛋白浓度OD值有显著性提高 (P<0.05) 。 (见表2)

3.3各组大鼠腓肠肌肌中PI3K/Akt/m TOR信号通路蛋白的变化

8周间歇训练后, 与C组相比, T10, T15组大鼠腓肠肌中磷酸化的PI3K的平均光密度值具有非常显著提高 (P<0.01) 。各组大鼠腓肠肌中磷酸化的PI3K的平均光密度值与大鼠体重负重成正相关。各组大鼠腓肠肌中PI3K的平均光密度值差异性不大 (见图3和图4) 。

3.4各组大鼠腓肠肌肌中Akt以及磷酸化的Akt的平均光密度值

8周间歇负重游泳训练后, 与C组相比, 运动组大鼠腓肠肌中Akt的平均光密度值都有提高, 但不具有统计学意义。与C组相比, T15组大鼠骨骼肌中磷酸化Akt的平均光密度值有显著提高 (P<0.05) 。 (见图2和图3)

3.5大鼠腓肠肌中m TOR及磷酸化的m TOR的平均光密度值

8周间歇负重游泳训练后, 运动组大鼠腓肠肌中m TOR的平均光密度值高于对照, 但不具有统计学意义。与C组相比, T10, T15大鼠的骨骼肌中磷酸化的m TOR的平均光密度值具有非常显著提高 (P<0.01) 。与T0组, T5组相比, T10, T15组大鼠的骨骼肌中磷酸化的m TOR的平均光密度值具有非常显著提高 (P<0.01) 。 (见图5和图6)

4分析讨论

4.1负重游泳训练引起骨骼肌肥大的原因

负重训练能够提高肌肉质量, 并使骨骼肌肥大 (肌纤维面积增大) 。如大鼠举重的运动模型诱导肌肉肥大, SD大鼠通过体重负重爬梯训练建立肌肉肥大模型。但是举重, 体重负重爬梯等动物模型都不能克服动物的“感情因素”, 况且实验对设备的要求较高。训练大鼠跑步, 则要采用电击刺激或恐吓等驱赶手段, 仅刺激大鼠尾部的皮肤, 就会引起大鼠生理上的改变, 如引起去甲肾上腺素和肾上腺素的升高。然而大鼠天生就会游泳, 在进行游泳训练时, 不会产生强烈的抵触情绪, 避免承受体力外的不良刺激少, 是一种卷入“情感因素”最少的训练方式之一。

本研究采用大鼠体重负重游泳训练模式, 进行为期8周的间歇游泳训练。结果显示, 大鼠的体重有明显的差异, 与对照组相比, 运动组大鼠的体重都有显著性降低, 运动负荷与体重成负相关关系。同时实验过程中观察大鼠的状态, 无过度疲劳状态体现。说明游泳训练能够有效的控制大鼠的体重, 降低大鼠的脂肪含量, 提高瘦体重。

实验后大鼠两侧腓肠肌总质量差异性不大, 为了更好的比较各组大鼠的骨骼肌增长程度, 选用肌肉的质量指数, 即大鼠肌肉质量与体重的比值, 统计结果显示, 运动组大鼠的腓肠肌质量指数与对照组大鼠相比有明显的提高, 分析实验中肌肉生长的原因, 实验中大鼠的负重最高采用自身体重的15%, 目前的文献报道大鼠游泳的负重量最高采用自身体重的15%, 因此可以将本实验中负重游泳运动作为一种力量训练。力量训练, 特别是大负荷力量训练, 不仅可以刺激低阀值的神经肌肉单元 (如慢肌纤维) , 而且还能刺激高阀值神经肌肉单元 (如快肌纤维) 以满足体重负重的要求。腓肠肌是一块以快肌纤维为主的肌肉, 大强度的运动以快肌为主, 所以大强度的运动训练导致腓肠肌的肥大, 本实验中大鼠体重负重强度越大腓肠肌的质量指数越高符合这一论断。骨骼肌生长取决于蛋白的合成和降解之间的平衡, 抗阻力量训练后, 蛋白的合成增加。因此, 在本实验中保证运动后营养充足的情况下体重负重游泳训练模式能够促进腓肠肌蛋白的浓度升高, 负荷量越大, 蛋白的浓度越高。

4.2负重游泳训练对PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响

迄今为止, 已经有不少研究涉及运动对于PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响, 但是, 由于采用的手段和方法千差万别, 因此, 要得出一个肯定的结论并不太容易。目前, 一个比较普遍的看法认为, 类似耐力运动的刺激选择性激活AMPK通路, 从而抑制m TOR信号通路, 抗阻力量训练则激活Akt/m TOR的通路。

本实验中八周体重负重游泳后, 大鼠腓肠肌中PI3K、Akt、m TOR的磷酸化水平与对照组相比有显著性提高, 其中T15组大鼠的PI3K、Akt, m TOR的磷酸化水平都有显著性提高, 分析原因是负重游泳这种运动形式作用于肌细胞膜促进肌细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路, 促进骨骼肌细胞蛋白质的合成。其中T10组大鼠腓肠肌中Akt磷酸化水平较对照组有提高但不是特别明显, 同组大鼠腓肠肌中PI3K磷酸化的水平有明显的调高, 提示Aktm RNA下调的途径可以独立于PI3K之外, 且10%负重体重游泳训练可以诱导这种特异Akt失活途径的启动;在激活Akt的方式上除了通过PI3K以外, 尚有其他的激活事件发生, 也可能是10%体重负重游泳没有达到激活Akt磷酸化的阈值, 虽然有蛋白质合成的增加的肥大现象, 可能是其它信号通路被激活的原因。同时一些研究发现运动后虽然m TOR被激活, 但并没有出现Akt磷酸化提高, 提示运动导致的m TOR激活可能具有不依赖于Akt的信号途径, 即存在运动诱导的肌肉肥大的非Akt/m TOR信号途径, Atherton等人指出, 特定的细胞信号转导作用可能与不同的运动模式密切相关 (如运动方式、运动强度、动物模型等) , 甚至与肌纤维类型、信号靶点和磷酸化位点等相关。实验中T0组, T5组大鼠腓肠肌PI3K、Akt、m TOR磷酸化水平与对照组相比没有大的变化, 原因可能是负荷量太小, 达不到力量训练的强度, 相当于有氧运动耐力运动对骨骼肌刺激作用。

5结论

5.1游泳训练能够有效地降低大鼠的体重, 适宜的运动负荷能促进大鼠骨骼肌的生长, 可以为后续的研究提供动物模型。

5.2适宜负荷游泳训练能诱导PI3K/Akt/m TOR信号蛋白磷酸化表达, 促进骨骼肌蛋白合成及肌肉的生长。

摘要：观察在不同游泳训练强度对大鼠骨骼肌生长的影响, 并检测PI3K/Akt/mTOR信号蛋白的活性表达, 以进一步探讨运动促进肌肉生长提供相关的细胞分子机制。研究结果表明适宜的游泳训练负荷能促进大鼠骨骼肌的生长。适宜负荷游泳训练能诱导PI3K/Akt/mTOR信号蛋白磷酸化表达, 促进骨骼肌蛋白合成。

关键词：肌肉生长,游泳运动,大鼠,信号通路

参考文献

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[4]王水泓.抗阻训练导致骨骼肌肥大的细胞和分子机理[J].中国运动医学杂志, 2006, 26 (4) :503-506.

[5]张媛, 漆正堂, 丁树哲.Akt对骨骼肌质量的作用及运动训练对其影响的分子机制[J].体育科学, 2008, 28 (3) :73-77.

Akt信号通路 第5篇

关键词：套细胞淋巴瘤,淋巴结反应性增生,p-Akt,p-m TOR,p-RPS6

套细胞淋巴瘤 (mantle cell lymphoma, MCL) 是侵袭性非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin lymphoma, NHL) , 在西方国家占NHL3%~6%[1], 大多数患者初诊时即为中晚期, 本病开始对化疗反应尚可, 但最终难免复发[2]。虽然利妥昔单抗、硼替佐米等新的治疗药物及方法不同程度的提高了缓解率, 但在所有淋巴瘤亚型中远期生存率仍最低, 故有必要寻找新的治疗方法。本文对PI3K/Akt/m TOR信号传导通路在MCL活性进行检测, 探索其发病机制, 为MCL靶向治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择福建医科大学附属泉州第一医院病理科2005~2015年保存的MCL 15例 (MCL组) 、淋巴结反应性增生 (lymphoid reactive hyperplasia, LRH) 20例 (LRH组) 病理切片, 其中MCL组男14例, 女1例, 年龄52~78岁, 中位年龄67岁, LRH组男11例, 女9例, 年龄15~56岁, 中位年龄36岁。所有病理诊断均由资深病理科医师确诊。

1.2 试剂

即用型免疫组化超敏S-P试剂盒、DAB显色试剂盒、抗体稀释液购于福州迈新公司。免抗人p-Akt (Thr308) 、免抗人p-m TOR、免抗人p-RPS6购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 实验方法

按S-P试剂盒说明书, 将石蜡切片60℃干烤1h, 利用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡, 用不同浓度酒精浸泡及蒸馏水冲洗进行水化, 用柠檬酸盐缓冲剂 (0.01M, p H6.0) 煮沸修复, 每张切片加1滴过氧化酶阻断溶液 (试剂A) , 室温下孵育10min, 磷酸缓冲盐溶液 (PBS缓冲液) 冲洗后, 每张切片加1滴正常非免疫山羊血清 (试剂B) , 室温下孵育20min。之后除去血清, 每张切片加1滴第一抗体, 4℃过夜。PBS冲洗后, 每张切片加1滴生物素标记的第二抗体 (试剂C) , 室温下孵育20min。PBS冲洗后, 每张切片加1滴链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液 (试剂D) , 室温下孵育20min。PBS冲洗后, 每张切片加2滴新鲜配制的D、A、B溶液, 然后自来水冲洗, 苏木素复染。最后用1%盐酸酒精分化, 中性树胶封片, 用DAB显色。

1.4 结果判定

先按细胞性部位染色强度计分:0分为细胞无染色, 细胞阳性表达部位染成浅黄色或浅棕色为1分, 细胞阳性表达部位染成棕黄色为2分, 细胞阳性表达部位染成棕褐色为3分;再在高倍镜下取4个不同视野, 各计数200个细胞, 按阳性细胞所占的百分比计分:无阳性表达为0分, 1分:阳性细胞表达细胞≤25%, 2分:25%<阳性表达细胞≤50%, 3分:50%<阳性表达细胞≤75%, 4分:75%<阳性表达细胞≤100%, 染色强度得分与阳性细胞百分比得分的乘积结果对应表达:阴性 (-, 0分) , 弱阳性 (+, 1~3分) , 中等阳性 (++, 4~7分) , 强阳性 (+++, 8~12分) 。

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

MCL组患者p-Akt、p-m TOR和p-RPS6在细胞质及细胞核均有阳性表达, 但以细胞质为主, 大部分肿瘤细胞呈中~高强度表达。LRH组p-Akt、p-m TOR和p-RPS6的表达大多数为弱~中强度阳性。所有组织中p-Akt和p-m TOR的表达情况基本一致, 仅MCL组3例标本中p-m TOR表达强阳性而p-Akt不表达。MCL组p-Akt、p-m TOR、p-RPS6的阳性表达率均高于LRH组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

注:与LRH组比较, *P<0.05

3 讨论

PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K) /Akt (protein kinase B, PKB) /m TOR (mammalian target of rapamycin, m TOR) 信号转导通路是细胞生命活动极为重要的信号传导通路之一, 它调节细胞增殖、分化、凋亡、存活等活动, 异常表达可导致细胞恶性转化[3,4]。目前已发现在人类多种常见肿瘤中存在该通路异常激活[5,6], 李刚[7]在262位弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中, 利用免疫组化的方法检测p-Akt的表达, 发现大部分患者均有表达p-Akt, 其中高表达56例, 同时p-Akt的表达与患者的临床进展、无进展生存期及总生存期存在一定的相关性。同时有学者除在弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤等血液病肿瘤中发现PI3K/Akt/m TOR通路异常表达外, 发现抑制该通路可有效抑制淋巴瘤细胞的增殖[8,9,10]。故PI3K/Akt/m TOR通路有可能成为淋巴瘤靶向治疗目标, 该通路利用信号分子磷酸化进行信号传递, 因测定信号分子的磷酸化情况可反应该通路活化程度。

Rudelius等[11]在16种MCL株组织中发现p-Akt高表达, 且该通路的抑制剂能阻断或减少Akt及其下游因子m TOR在内 (p27、FRKHL-1、MDM2和Bad) 的磷酸化活性。Dalcol等[12]通过研究发现13例MCL患者中度到强度的p-Akt染色率为40%~80%。而Psyrri等[13]在33例MCL中检测到p-Akt高水平表达率为36%。上述研究提示MCL PI3K/Akt/m TOR通路中信号分子Akt在高水平磷酸化状态, 该通路可能存在异常激活状态。故本研究通过检测该通路各信号分子Akt、m TOR、PRS6的磷酸化情况, 来判断该通路活化情况。

本文通过检测15例MCL和20例LRH病理切片中p-Akt、p-m TOR、p-RPS6蛋白的表达情况, 并进一步统计两者之间的差异。本实验结果提示Akt/m TOR信号通路可能在MCL的发生、发展中发挥着重要的作用, 这与之前国外的研究结论[12,13]一致。但在LRH中阳性率稍高于文献报道, 可能与本研究中检测抗体为多克隆抗体敏感度高或样本量过少因素有关。这有待今后通过扩大标本量或采用蛋白免疫印迹进一步明确。

Akt信号通路 第6篇

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

RPMI 1640培养基、胰蛋白酶﹑HEPES、L-谷氨酰胺 (美国, Gibco公司) ;人脐静脉内皮细胞株 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) (美国, ATCC公司) ;AngⅡ、兔抗人Akt、p-Akt单克隆抗体非免疫血清、兔抗人NF-κB、IκBα单克隆抗体非免疫血清 (美国, Santa Cruz公司) ;β-半乳糖苷酶染色试剂盒 (美国, Sigma公司) ;流式细胞仪FAC Scan (美国, BD公司) ;Biophotometer分光光度仪 (德国, Eppendort公司) 。

1.2 方法

1.2.1 四甲基偶氮唑蓝比色法测定HUVECs活性

取对数生长期HUVECs制成5108个/L的细胞悬液, 每孔加100μL培养液置培养箱过夜, 弃去培养液后, 对照组 (6孔) 每孔加入100μL培养液, 实验组 (每组6孔) 加入含不同浓度 (10-8、10-7、10-6、10-5和10-4mol/L) AngⅡ100μL培养液置培养箱培养48h, 结束前4 h每孔吸去上清液, 加0.5 g/L四甲基偶氮唑蓝100μL继续培养4 h, 吸去全部上清液, 然后每孔加入200μL二甲基亚枫, 振荡摇匀, 使结晶充分溶解, 酶联免疫检测仪在570 nm处测每孔吸收度, 以上实验重复3次, 以实验组与对照组光吸收值的百分比代表存活细胞的百分数。

1.2.2 HUVECs培养及实验分组

将HUVECs贴壁生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中, 置于5%二氧化碳 (CO2) 、37℃培养箱中培养, 2~3 d换液以维持良好的生长状态。用0.25%胰蛋白酶进行消化、传代, 待细胞长至亚融合时无血清培养12h, 使细胞达到同步化。加入AngⅡ (终浓度为10-6mol/L) , 持续刺激48、12和24 h各补充AngⅡ一次即为AngⅡ诱导的HUVECs衰老模型。对照组为不含AngⅡ的上述培养液培养48 h;AngⅡ组为AngⅡ诱导的HUVECs衰老模型组。

1.2.3 衰老细胞鉴定

β-半乳糖苷酶 (β-gal) 是一种可鉴定衰老细胞的生物学标志物, 按照β-gal染色试剂盒说明书进行操作。每组标本随机选取视野, 观察1 000个细胞, 细胞质蓝染为衰老细胞, 计数衰老细胞占细胞总数的百分比。

1.2.4 细胞周期变化

每组细胞以0.25%胰蛋白酶消化, 收集细胞, 用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次, 调整细胞数至1106个/m L, 逐滴加入预冷的70%乙醇固定, 1 000 r/min离心, 磷酸盐缓冲液洗2次后悬浮于0.5 m L PBS中, 缓慢加入5 m L冷乙醇, 4℃固定过夜。次日, 1 000 r/min离心, 磷酸盐缓冲液洗涤, 加入0.5 m L的碘化丙啶 (propidium iodide, PI, 终浓度50μg/m L) , 4℃避光反应30 min。流式细胞仪分析检测, 数据用BD公司提供的Moldifit 2.0分析。

1.2.5 Western blotting检测Akt、p-Akt蛋白水平

收集细胞, 按BCA试剂盒说明书进行蛋白定量, 每个样品上样量为20μL, 蛋白经过SDS-PAGE凝胶电泳分离后至PVDF膜, 5%脱脂奶粉的TBST室温下缓慢摇动封闭60 min, 加入一抗 (兔抗人Akt、p-Akt, 1︰100) 在4℃摇床孵育过夜, TBST洗涤后, 与二抗 (1︰1 000) 室温摇床孵育0.5 h, 常规洗膜化学发光试剂显色, Alpha Imager图像处理系统扫描测定感光区带平均积分吸光度。

1.2.6 Western-blotting检测NF-κB蛋白水平

收集细胞, 考马斯亮兰法测定蛋白样品浓度, 每个样品上样量为20μL, 按文献报道的Western blotting方法, 完成常规蛋白电泳分离胶浓度为12% (p H 8.8) , 浓缩胶浓度为4% (p H 6.8) , 抽提纯化的蛋白行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜, 5%脱脂奶粉的TBST 4℃封闭过夜, 加入一抗 (兔抗人NF-κB抗体, 1︰100) 室温摇床孵育3 h, TBST洗涤后, 与二抗室温摇床孵育0.5 h, 常规洗膜化学发光试剂显色。Alpha Imager图像处理系统进行定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析, 计量结果均以均数±标准差 (±s) 表示, 数据资料比较采用单因素方差分析 (ANOVA) , P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞存活率

MTT法检测可见, 10-6mol/L AngⅡ培养HUVECs48 h后, 存活的细胞数为对照组的 (81.9±0.04) %, (P<0.01, n=6) , 10-7mol/L和10-8mol/L组细胞存活与对照组相比无差异, 增加AngⅡ浓度至10-5mol/L和10-4mol/L, 则存活细胞数降至 (46.9±0.06) % (P<0.01, n=6) 。故本实验选用10-6mol/L AngⅡ复制了HUVECs的衰老模型。

2.2 细胞的形态学改变

用相差显微镜动态观察细胞形态变化:对照组HUVECs生长良好, 呈长梭形或不规则形;AngⅡ诱导组HUVECs排列不规则, 体积较大, 形态扁平, 胞浆区域增大, 细胞浆/细胞核的比例增加, 胞浆中可见较多颗粒或空泡 (见图1) 。

2.3 衰老相关的β-半乳糖苷酶 (β-gal) 染色

β-gal是一种鉴别细胞衰老的生物学标志, 在p H 6.0条件下, 随细胞老化, 胞内产生的蓝色沉淀物也越多即染色阳性, 产物也增多, β-gal染色结果显示, 对照组细胞几乎不表达β-gal;随着AngⅡ诱导HUVECs时间的延长, β-gal阳性细胞数明显增加, AngⅡ诱导组β-gal阳性细胞数明显增加, 80%以上细胞染色阳性, 有统计学意义 (P<0.05) , 表明AngⅡ诱导可导致HUVECs的衰老 (见附表及图2、3) 。

(n=6, %, ±s)

注:1) 与对照组相比, P<0.05;2) 与对照组相比, P<0.01

2.4 细胞周期分析

细胞增殖能力下降是衰老的另一个生物学标志, 而细胞周期变化可反映细胞的增殖能力。流式细胞仪分析显示对照组HUVECs的各期比例正常;随着AngⅡ诱导HUVECs时间的延长, HUVECs停滞于G0/G1期比例增加, G2/M期比例下降;AngⅡ诱导组大部分HUVECs停滞于G0/G1期, S期及G2/M期趋于消失 (见附表及图4) 。

2.5 不同时点AngⅡ作用对Akt、p-Akt蛋白质表达的影响

Western blotting显示, 随着AngⅡ作用HUVECs时间的延长, 其磷酸化水平逐渐升高, 16 h时为对照组的1.54倍 (P<0.05) , 32 h时, p-Akt蛋白质表达到高峰, 其磷酸化水平为对照组的4.16倍 (P<0.01) ;之后逐渐下降, 48 h为对照组的3.20倍 (P<0.01) , 而Akt蛋白水平与对照组相比无明显变化 (见图5) 。

2.6 不同时点AngⅡ作用对NF-κB蛋白表达的影响

Western blotting显示, 随着AngⅡ作用HUVECs时间的延长, NF-κB水平逐渐升高, 16 h时为对照组的1.42倍 (P<0.05) , 32 h时, NF-κB蛋白质表达到高峰, 为对照组的3.50倍 (P<0.01) ;之后逐渐下降, 48 h为对照组的2.36倍 (P<0.01) (见图6) 。

A:Western-blotting分析AngⅡ诱导HUVECs p-Akt蛋白表达的时间效应关系;B:分析各条带灰度, 标准化后线性图

A:Western-blotting分析AngⅡ诱导HUVECs NF-κB蛋白表达的时间效应关系;B:分析各条带灰度, 标准化后线性图

3 讨论

衰老是多细胞生物复杂系统中最为复杂的生物过程之一, 是长期发展、逐渐累积而形成。流行病学研究显示, 衰老是动脉粥样硬化性心血管疾病重要的危险因素[1], 在动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 过程中起着重要的作用, 是AS形成过程中的启始步骤, 但具体的分子机制仍不清楚。许多机制研究认为, 衰老的过程是借由信号转导途径实现的, 而不只是一种途径[2,3]。故本研究利用既往已复制的血管内皮细胞衰老模型[4], 首次探讨Akt/NF-κB信号转导通路调控血管内皮细胞衰老的机制, 从深层次揭示血管内皮细胞衰老的分子作用机制, 为延缓内皮细胞衰老以及防治动脉粥样硬化开辟新途径。

细胞周期是细胞生命活动中的基本过程, 细胞衰老是细胞周期调控下多基因参与的复杂生理病理过程, 具有一定的可控性。当培养细胞到它的寿命末期时, 由于端粒长度不可避免地缩短, 复制性衰老自然而然地发生。细胞衰老最显著的特征是细胞在很长一段时间内仍维持代谢活性, 但因阻滞于G1期, 失去了对有丝分裂原的反应和合成DNA的能力, 不能进入S期, 在衰老内皮细胞中, 其细胞周期蛋白、CDK等发生量与活性的变化[4,5], 本研究观察AngⅡ可促进血管内皮细胞衰老的改变, 抑制细胞进入增殖周期发生增殖, 与对照组比较, 给予AngⅡ处理后内皮细胞β-gal染色阳性率升高, G0/G1期细胞的比例明显上升, 而处于S期的细胞比例下降, 细胞存活率降低, 抑制内皮细胞增殖, 促进内皮细胞衰老;相差显微镜及流式细胞术亦显示衰老细胞较对照组细胞明显增多, 这与以往的研究是一致的[4]。

近年来报道, Akt (Ser/threonine protein kinase, 丝/苏氨酸蛋白激酶) 信号转导通路可能是调控衰老的一条重要信号途径[6,7]。Akt是Ser/Thr蛋白激酶, 在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶 (Phosphoinositide dependent protein kinase, PDK) 的协同下, PIP2和PIP3可与Akt结合, 导致Akt从胞浆转位到质膜, 并促进Akt的Ser 473和Thr 308位点磷酸化, 其Ser 473或/和Thr 308位点磷酸化是Akt激活的必要条件[7,8], 而Akt激活是其发挥促细胞生存功能的重要前提[9]。NF-κB是一种转录激活子, 在正常状态下, NF-κB在胞质中与它的抑制因子I-κB结合在一起, 失去转录活性。Akt能通过磷酸化激活IKK (I-κB的激酶) , 导致I-κB磷酸化、降解, 并与NF-κB分离, 被释放后的NF-κB转位到细胞核内并诱导目的基因的表达[9,10]。AngⅡ等多种信号可诱导核转录因子NF-κB的激活, 刺激NF-κB激活需要I-κB家族成员的顺序磷酸化、泛素化、蛋白酶体依赖的I-κB降解和NF-κB核定位信号的暴露, 进而与靶基因κB部位结合, 调控特定基因转录, 参与多种生物学过程, 在细胞生长、分化、凋亡、衰老等过程中发挥了极其重要的作用[10,11]。本研究发现, 随着AngⅡ作用时间的延长, AngⅡ能显著增强HUVECs Akt磷酸化表达, 提示AngⅡ可以激活HUVECs Akt通路, 但Akt信号途径通过哪些蛋白发挥衰老作用知之甚少。本研究发现NF-κB与p-Akt增多平行, 并且NF-κB蛋白与p-Akt表达呈正相关, 考虑Akt与NF-κB之间可能存在相互调节关系, 为此推测AngⅡ诱导HUVECs早、中期 (16 h和32 h) , 显著激活Akt信号转导通路, p-Akt表达逐步递增至高峰 (32h) ;随着时间进一步延长, p-Akt水平逐渐降低, 表明持续的AngⅡ对已发生表型改变HUVECs中Akt信号通路的激活作用已开始减弱, 当AngⅡ作用48h时, Akt表达已降至最低水平, 提示Akt信号途径参与全过程。另外, 本研究显示p-Akt表达呈持续增强时, NF-κB呈显著上升趋势, NF-κB蛋白质的表达呈动态变化, 表明Akt信号途径可能通过调控NF-κB途径参与HUVECs衰老, 这为动脉粥样硬化可能提供新的干预靶点。

尽管本实验发现Akt可作为NF-κB上游信号参与调节NF-κB作用, 但是p-Akt是如何调节NF-κB仍不清楚, 其具体作用环节有待于更深入的研究。至于AngⅡ是否通过PI3K、m TOR等其他信号通路促进HVVECs的衰老, 以及是否能通过干扰AngⅡ代谢来降低机体内AngⅡ浓度或给予Akt抑制剂来防治动脉粥样硬化, 尚需进一步研究探讨。

摘要：目的 研究血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 对人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 衰老的影响及其相关蛋白激酶B (PKB/Akt) 、核转录因子-κB (NF-κB) 表达的变化, 阐明血管内皮细胞衰老对诊治动脉粥样硬化的重要意义。方法 制备血管紧张素ⅡRPMI 1640培养液 (10-6mol/L) 培养HUVECs, 通过β-半乳糖苷酶 (β-gal) 染色、流式细胞仪检测细胞衰老, Western blotting测定Akt、磷酸化Akt、NF-κB蛋白水平。结果 AngⅡ诱导组β-gal阳性细胞数与对照组相比为 (80.10±6.81) %;流式细胞仪检测细胞周期停滞于G0~G1证实细胞衰老;与对照组相比, 16、32和48 h Akt磷酸化蛋白表达水平明显增高 (P<0.05) , Akt磷酸化水平于32 h达到最高峰 (P<0.01) ;磷酸化Akt表达呈持续增加时, NF-κB呈显著上升趋势。结论 血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞的衰老可能与Akt/NF-κB信号转导通路有关。

关键词：血管紧张素Ⅱ,内皮细胞,血管衰老,蛋白激酶B,核转录因子-κB

参考文献

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Akt信号通路 第7篇

PI3K/Akt和MEK/ERK通路是调节细胞增殖、分化、凋亡和衰老的关键途径[5]。目前已有证据证明PI3K/Akt和MEK/ERK通路有利于保护细胞免遭内质网应激诱导凋亡[6],本研究发现PI3K/Akt和MEK/ERK通路在肝癌细胞内质网应激条件下存在特异的信号交流(cross-talk)。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毒胡萝卜素(thapsigargin,TG),衣霉素(tunicamycin,TU)购自Sigma公司;PI3K抑制剂LY294002和MEK性抑制剂U0126购自Merck公司;抗GAPDH一抗购自Santa Cruz公司;抗HA-tag,p-Akt(Ser473),Akt,p-ERK1/2(Thr202/Tyr204),ERK1/2Ⅰ抗购自Cell Signaling Technology公司;Ⅱ抗购自Santa Cruz公司。Akt突变激活载体HA-myr-Akt由美国癌症研究中心Jin Q.Cheng教授惠赠。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养及处理

肝癌细胞株SMMC-7721用DMEM完全培养基(含10%FBS、20 m M碳酸氢钠20 m M HEPES、100 U/m L青霉素和100μg/m L链霉素)在5%二氧化碳,37℃孵箱内培养,根据具体情况更换培养基。用TU(5μg/m L)和TG(1μM)诱导肝癌细胞内质网应激,PI3K抑制剂LY294002(30μmol/L)、MEK抑制剂U0126(10μmol/L)在加TU或TG前孵育1 h分别阻断Akt和ERK活化,并按对应时间点收集细胞。突变激活的Akt表达载体HA-myr-Akt瞬时转染肝癌细胞株SMMC-7721 24h,并在相应时间点用TU(5μg/m L)和TG(1μM)诱导肝癌细胞内质网应激。

1.2.2 Western blot分析

SDS-PAGE电泳分离蛋白质后,采用半干式电转移将蛋白分子转移到PVDF膜,电转移结束后PVDF膜用洗膜缓冲液TBST洗涤3次(5 min/次),封阻缓冲液(5%BSA)在室温下密闭轻摇动封阻1 h。洗膜缓冲液洗涤3次(5min/次)后,PVDF膜与Ⅰ抗稀释液室温下轻摇动孵育2 h,洗膜缓冲液洗涤3次(5 min/次)。PVDF膜与II抗稀释液于室温下轻摇动孵育1 h,洗膜缓冲液洗涤3次(5 min/次)。加入ECL化学发光试剂A、B液各0.5 m L,混匀,润透PVDF膜后室温作用1 min。暗室中将PVDF膜迅速封入保鲜膜中,Kodak X-ray film压片,放射自显影5 min。X-ray film置于显影液中15~30 s,定影液中1.5 min,清水冲洗晾干。

2 结果

2.1 TU/TG诱导肝癌细胞内质网应激

GRP78(葡萄糖调节蛋白78)是内质网应激信号系统上游的开关分子,TU/TG刺激后显著诱导肝癌细胞SMMC-7721 GRP78蛋白的表达(见图1A,1B),表明TU/TG有效诱导肝癌细胞发生未折叠蛋白反应。

2.2 肝癌细胞中内质网应激介导P I3K/Akt和MEK/ERK活化的动力学特征

鉴于PI3K/Akt和MEK/ERK通路对内质网应激有重要调控作用,实验分析了肝癌细胞在内质网应激条件下Akt和ERK的活化情况。结果表明内质网应激明显上调肝癌细胞SMMC-7721中Akt和ERK磷酸化水平(见图2)。值得注意的是,Akt和ERK磷酸化改变有明显不同的特征。表现在Akt磷酸化呈现3 h以内明显上调,6 h之后则出现明显下降。ERK磷酸化呈逐渐上调趋势,且其明显上调发生在刺激作用6 h之后。

2.3 内质网应激介导P I3K/Akt和MEK/ERK间的信号交流

肝癌细胞SMMC-7721中,PI3K抑制剂LY294002不仅有效阻断了Akt的活化,而且显著增强了TU和TG介导的ERK磷酸化(见图3A)。MEK抑制剂U0126有效阻断了TU和TG介导的ERK的活化,但是其对Akt的磷酸化没无明显影响(见图3B)。为了进一步证实内质网应激条件下PI3K/Akt通路对MEK/ERK活化的影响,实验采用突变激活的Akt表达载体HA-myr-Akt瞬时转染肝癌细胞SMMC-7721,进而观察Akt过度激活对内质网应激介导的ERK磷酸化的影响。结果表明HA-myr-Ak显著抑制了TU和TG介导的SMMC-7721细胞ERK的磷酸化(见图3C)。

3 讨论

内质网腔内环境具有高Ca2+浓度和氧化性两大特征,该环境是保证蛋白在内质网内正确折叠、加工和转运的必要前提。许多因素将会破坏内质网环境,进而引起未折叠蛋白在内质网聚集,最终导致内质网应激。肿瘤细胞具有旺盛的蛋白合成和分泌功能,因而其内质网稳态的维持显得尤为重要。肿瘤生长过程中缺氧、过酸和营养不足能激活未折叠蛋白反应,进而使肿瘤细胞适应不利环境,未折叠蛋白反应的激活不仅对肿瘤的发展起着重要作用,而且能够降低肿瘤细胞对某些化学药物的敏感性[3]。

PI3K/Akt、MEK/ERK通路在细胞增殖、生存等方面起着重要作用。已有研究指出PI3K的活化对Raf/MEK/ERK的激活很有必要[7]。其他的研究也认为PI3K/Akt通路能增加Raf/MEK/ERK途径的的信号强度[8,9]。本研究发现在肝癌细胞中,内质网应激介导的Akt和ERK活化具有显著不同的动力学过程,表现在Akt磷酸化呈现3 h以内明显上调,6 h之后则出现明显下降。ERK磷酸化呈逐渐上调趋势,且其明显上调发生在刺激作用6 h之后。这提示Akt和ERK的活化可能存在某种联系。进一步的实验结果表明内质网应激时,肝癌细胞中PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路间存在特异的信号交流。

实验研究了PI3K/Akt对MEK/ERK活化的影响。肝癌细胞SMMC-7721中,PI3K抑制剂LY294002不仅有效阻断了Akt的活化,而且显著增强了TU和TG介导的ERK磷酸化,而Akt过度激活(突变激活的Akt表达载体HA-myr-Akt)显著抑制了TU和TG介导的ERK的磷酸化。实验也检测了肝癌细胞中MEK/ERK通路对内质网应激介导的Akt活化的影响。结果表明MEK抑制剂U0126有效阻断了TU和TG介导的ERK的活化,但是其对Akt的磷酸化无明显影响。以上结果充分表明,肝癌细胞SMMC-7721中PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路间存在特异的信号交流,且Akt活化对MEK/ERK通路起负调控作用,而MEK/ERK对PI3K/Akt通路活化无调控作用。目前已有研究报道在乳腺癌细胞中PI3K介导内质网应激ERK的活化[6]。但是PI3K/Akt介导不同细胞内质网应激诱导ERK的活化具有不同的效应,这个原因目前仍然还不清楚。

总之,该实验发现在内质网应激时,肝癌细胞中PI3K/Akt和MEK/ERK信号途径间存在特异的信号交流。

摘要：目的 研究内质网应激介导的肝癌细胞PI3K/AKt和M EK/ER K途径间的信号交流。方法 采用PI3K抑制剂LY 294002/Akt激活型突变载体m yr-Akt和M EK抑制剂U 0126分别阻断/激活内质网应激介导的Akt和ER K活化,并利用W estern blot分析内质网应激条件下PI3K/Akt和M EK/ER K途径间的信号交流。结果 阻断PI3K/Akt明显促进内质网应激介导的M EK/ER K活化,而过度激活PI3K/Akt则抑制内质网应激介导的M EK/ER K活化。阻断M EK/ER K对内质网应激介导的PI3K/Akt活化无影响。结论 PI3K/Akt和M EK/ER K信号途径间在内质网应激肝癌细胞中存在信号交流。

关键词：内质网应激,Akt,ERK,cross-talk,肝癌细胞

参考文献

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