发酵中药范文

发酵中药范文（精选6篇）

发酵中药 第1篇

1 传统的中药发酵技术

传统中药的发酵分为两类:一类是药料与面粉混合发酵,如神曲、六神曲、半夏曲等;二是药料直接进行发酵,如红曲、淡豆豉、百药煎等。传统中药发酵质量的好坏与许多因素有关,如发酵菌种、发酵温度、湿度、氧气等。由于发酵过程多凭经验进行,缺乏规范的工艺技术及适宜的监控指标,股发酵所得中药产品质量差异较大,难以制定统一的质量标准和检验方法,无法保证发酵中药产品的安全有效性和稳定可控性。

2 现代中药发酵方法和技术

20世纪80年代现代生物技术开始运用到发酵中去,从现代科学的角度探索发酵炮制的工艺及其机制,为典型的生物转化过程。目前中药发酵技术按照发酵形式可分为液体发酵和固体发酵两大类。

2.1 液体发酵技术

液体发酵主要是把菌丝加入培养基中,与药材混合后在一定温度条件下进行发酵。具有生产机械化、自动化程度高,物质传递效率高,有利于实现大规模工业化生产等优点。但多数中药不具备抗菌能力,易被杂菌污染而对工业条件要求较高。三株口服液就是利用液体发酵技术,以大豆芽为原料,在牛肉汤、大豆芽浸液、酵母膏、蔗糖、葡萄糖中加入双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和DL菌联合发酵制成。陈晋安等采用液体发酵法对蛹虫草发酵条件进行研究,结果表明,采用优选出的发酵培养基及发酵条件进行蛹虫草的液体发酵具有原料来源丰富、条件简单、发酵周期较短和菌体得率高等优点,为今后扩大规模试验及工业化生产打下了良好的基础。梅兴国等利用发酵技术筛选高产紫杉醇细胞株,进行摇瓶发酵紫杉醇最高含量达到100mg/L左右。王林等观察中药对灵芝菌液体发酵过程中生物量的影响以及其发酵液对慢性支气管炎的疗效,结果表明,麻黄,莱菔子,金银花,连翘四味中药对生物量有明显促进增加作用,动物实验表明,灵芝菌与中药混合发酵液在止咳作用等方面优于单纯灵芝发酵液。

2.2 固体发酵技术

固体发酵是以具有一定活性成分的中药材或药渣作为发酵营养基质,用一种或多种真菌作为发酵菌种。中药基质在提供真菌所需营养的同时,还受到真菌酶的影响而改变自身组织、成分,产生新的性味功能,具有双向性,体现了药用真菌与中药材之间的有机结合。不同性质的发酵组合,可能产生大量的新药,故具有广阔的开发前景。庄毅等应用固体发酵技术研究槐耳时发现,槐耳菌在添加中药的基质上发酵的提取物,在各项免疫指标上都明显超过槐耳浸膏,对慢性乙型肝炎患者,治疗后转阴率由33%提高到50%,疗效显著。

3 发酵对中药的作用和影响

中药通过发酵后可起到增效、解毒、产生新活性成分、节约药用资源等作用。

3.1 增效作用

中药发酵主要通过提高中药有效成分含量和增加有效成分的利用率来达到增效作用。吴志勇等将黄芪发酵,大大提高了黄芪多糖的含量。经福建中医学院测定,发酵的黄芪所含的黄芪多糖最多可达普通水提法的5倍。卫生部药品检验所实验表明,发酵中药只需要1/28的量,便可与普通水提物一份的量发挥等同药效。汤兴利等通过体外试验证明,对盾叶薯蓣采用预发酵方式,其有效成分薯蓣皂苷元的产量明显增加。蔡琨等以染料木素和大豆黄素为指标检测采用纯种发酵的淡豆豉主要有效成分,结果表明纯种发酵可以保证淡豆豉生产的稳定性和产量的提高。药代动力学研究证明,苷类成分在肠道内难以吸收,大多数需经肠道细菌酶分解为分子量更小的苷元而发挥疗效。徐萌萌等利用微生物发酵,实现了栀子、黄芩、牛蒡子、甘草这些苷类中药在体外成分的转化,提高了其苷元的含量,使其更利于人体吸收。3.2减毒作用微生物的分解作用可将药材中的有毒物质分解,或者对药材中有毒物质的毒性成分进行修饰使其毒性降低或者消失。潘扬等对马钱子发酵前后马钱子生物碱含量进行了对比,结果发酵后马钱子碱含量降低,马钱子碱氮氧化物含量增加。李雁群等报道苦参灵芝发酵液,具有抗HBV的作用,苦参经过灵芝发酵后毒性降低。熊晓辉等利用灵芝对大豆进行深层发酵可以较完全地去除引起食后胀气的低聚糖。

3.3 产生新活性成分

由于微生物也会形成丰富多样的次生代谢产物,它们有些本身就是功效良好的药物;或以中药中的有效成分为前体,经微生物的代谢可以形成新的化合物或微生物的次生代谢产物和中药中的成分发生反应形成新的化合物。冯志华等用地衣芽胞杆菌C2-13发酵红花,结果使红花酚羟基的数量大幅提高,其抗氧化功效及对小鼠肝脂质过氧化的抑制作用增强,同时其生物利用率也呈上升趋势。李国红用枯草芽胞杆菌对三七须根进行发酵,得到5个新化合物。

3.4 节约药用资源

中药提取后的药渣,也可以利用发酵技术对中药进行多次提取,能充分有效地吸收利用大部分营养物质、节省药源、提高企业的经济效益。秦俊哲等用中药渣代替传统原料进行灵芝固体发酵,发现其固体菌丝中多糖含量和氨基酸含量都大大提高,不仅提高了药效,而且节约了药用资源。

4 小结

酵素菌发酵中药渣试验研究 第2篇

一方面中药渣作为废物被抛弃, 另一方面中药渣通常含有丰富的蛋白质、糖、纤维素、矿物质等初生物质。由于目前的中药提取方法和工艺相对比较单一, 中药中的部分药用成分仍留存在药渣中, 这些残留的初生及次生物质使得药渣仍然具有很高的再利用价值。

中药渣的研究包括3个方面的问题:一是中药渣的污染问题;二是中药药渣的综合利用问题;三是中药渣的处理问题。3个方面相互关联, 研究中药渣的污染, 有助于探寻药渣的利用方向和处理方法;反过来, 研究中药药渣的应用和处理方法, 应注意既要充分利用药渣资源, 又要防止发生二次污染[3,4]。

近年来, 中药渣再利用涉及到以下几个方面:再提取其他有效成分用于栽培食用菌[5,6,7,8,9,10,11,12,13]、制作饲料或饲料添加剂[14,15,16,17,18,19,20]、制成有机肥料[21,22,23]、处理废水[24]、用作生物质能源[25]、用作造纸原料[26]、用于发酵生产食醋[27]等。本文对中药渣进行高温固态堆积发酵, 研究不同微生物发酵菌种的作用效果, 以期对中药渣再利用生产有机肥料提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 中药药渣。

由吉林万通集团有限公司生产, 吉林万通集团盛泰生物工程股份有限公司提供。

1.1.2 酵素菌种。

由潍坊岛本微生物技术研究所提供, 含有细菌、酵母菌和丝状真菌三大类24种微生物组成[28]。酵素菌种以米糠为载体, 呈黄褐色, 粉状, 有浓烈酵母香味 (试验代号:BYM) 。

1.1.3 有机物料腐熟剂 (发酵菌种) 。

由北京、山东、河南三地微生物肥料生产企业生产, 均由细菌、酵母菌、真菌组成复合微生物群, 有效活菌总数5亿~20亿个/g, 菌剂产品均获得农业部微生物肥料登记证 (试验代号分别是BM、SM和HM) 。

1.2 试验方法

1.2.1 中药渣发酵试验。

试验在吉林万通集团盛泰生物工程股份有限公司生物有机肥厂进行。试验地点远离正常发酵区域, 相对隔离, 设专人负责, 全程记录试验数据。

中药渣发酵试验采用条垛式堆肥发酵方式进行。将原料混合物堆成长条形的堆或条垛, 在自然好氧条件下进行, 是一种最常见的有机肥发酵系统。垛纵切面呈三角形, 每个发酵堆底部宽2 m、高1 m、长3 m, 发酵料堆体积约3 m3。

发酵基础配方:中药渣60%, 发酵菌种2%, 其他38%;含水量65%, p H值为自然值。

试验设5个处理, 分别将中药渣接种酵素菌种和有机物料腐熟剂标记为BYM、BM、SM、HM, 以不接菌种, 而接种等基质物料作对照 (CK) 。不同处理间相互隔离, 3次重复。人工配料, 同时试验, 工具不混用。不同料堆之间间隔距离5m, 并用塑料薄膜覆盖隔离。观测料堆温度、水分、碳氮比、p H值, 并采用白菜种子发芽率试验测定发酵程度和质量。1.2.2白菜发芽试验。选取饱满、无病虫害、整齐一致的白菜种子, 用50℃热水冲烫5 min后, 转入清水中冲洗, 浸种4h, 播种。每盆装发酵堆肥1 kg, 均匀播种50粒白菜种子, 覆盖细沙, 保湿。观察统计发芽, 及幼苗生长情况。

每隔24 h, 调查各处理种子的发芽情况 (以出苗为度) , 从第1粒种子出苗开始, 连续观察, 直至不再出苗为止。按如下公式计算种子发芽率:

1.3 图像绘制

本试验数据采用Oringin8 Pro SR4进行处理和图像绘制。

2 结果与分析

2.1 不同处理堆肥温度变化情况

由表1和图1可知, 接种不同菌种处理中药渣堆肥温度变化趋势基本一致, 均呈现先上升后下降的趋势, 类似“抛物线”状。但是, 接种微生物菌种处理堆肥温度上升速度明显加快。在发酵第3天, 堆肥温度由高到低的顺序是BYM>HM>BM>SM>CK。发酵高温时段出现在堆肥9~18 d, 其中BYM处理的堆肥温度最高, 达71.5℃, 且保持65℃以上高温。BM、SM和HM处理的堆肥最高温度均超过60℃, 但维持时间不长。空白对照 (CK) 最高发酵温度未超过55℃, 但在50℃以上范围内维持较长时间。所有处理, 堆肥温度下降时间均出现在堆肥18 d左右, 但CK组有后延的现象。由此说明, 接种微生物菌种有利于堆肥发酵温度快速提升, 加快发酵进程, 而BYM处理的堆肥温度高, 有利于有机物质的分解, 也利于高温杀灭病原菌和杂草种子。

(℃)

2.2 不同处理堆肥水分含量变化情况

由表2和图2可知, 堆肥过程中水分含量均呈下降趋势, 以接种微生物菌种水分散失快, 而以BYM处理水分散失最快。到第18天, 接种微生物菌种的堆肥含水量从最初的65%将降至45.5%~52.5%, 下降了12.5~19.5个百分点, 而未接种的CK只下降了7个百分点。由于通风条件一致, 因此水分散失主要是由于温度上升导致水分蒸发引起的。说明添加外源微生物菌种处理温度上升较快, 从而引起水分蒸发较快。此外, BYM处理的物料含水量降低最快, 空气得以补充, 避免了发生厌氧发酵的可能性, 有利于提高堆肥质量。

2.3 不同处理堆肥p H值变化情况

由表3和图3可知, 堆肥初始p H值均在6.7~6.8之间, 处理间无明显差异。在堆肥后期, 各处理间表现出差异。接种微生物菌种的堆肥p H值呈上升趋势, 而以BYM处理, 堆肥p H值上升最大, p H值升高1.3, 呈微碱性。根据堆肥腐熟p H值[29]应在8.0~9.0之间的标准, 说明添加BYM处理的p H值达到堆肥腐熟标准所需时间最短, 发酵最快。同时, 在这种微碱性环境下, 更有利于环境中放线菌的生长繁殖, 对于酸化土壤生态改良十分有利。

(%)

2.4 不同处理堆肥碳氮比变化情况

由表4和图4可知, 随着发酵时间的推移, 堆肥中碳氮比均呈现下降的趋势。据统计, 不同处理的全碳和全氮含量均呈现下降趋势, 但全碳含量下降幅度较全氮要大, 这是由于微生物活动消耗了堆肥中有机碳并转化成CO2损失掉了。添加微生物菌种的堆肥在第20天, 碳氮比 (C/N) 为 (20.2~21.5) ∶1.0, 第24天, BYM处理的堆肥C/N降为19.5∶1.0, 根据杨毓峰等[30]的研究, 当固项C/N低于20:1时可以判定堆肥已经完全腐熟。本试验添加了风化煤, 含碳量高, 发酵过程中C/N偏高, 可以预测, 当C/N接近20∶1时即可判定堆腐已经腐熟。因此, 利用BYM处理的堆肥在第18天即可达到完全腐熟的程度, 堆肥时间提前。

2.5 不同堆肥对白菜种子发芽率的影响

由表5和图5可知, 随着堆肥时间的延长, 白菜种子的发芽率均呈上升趋势。接种微生物菌种的中药渣高温堆肥白菜种子的发芽率明显高于CK, 而以BYM处理的种子发芽率最高。第15天, 白菜的发芽率达到60%, 堆肥基本腐熟;第18天, 发芽率达到80%;第21天, 发芽率达90%, 此时堆肥已经腐熟;而第21天, 空白对照的堆肥白菜发芽率仅为28%, 说明堆肥对植物仍然有毒性, 还需要继续堆腐。由此可见, 添加微生物菌种能明显加速堆肥内部有害物质的分解, 而以BYM表现最佳。

(%)

3 结论与讨论

酵素菌是由细菌 (bacteria) 、酵母菌 (yeast) 和丝状真菌组成的有益微生物群, 是发酵有机质材料的好气性菌种[31]。利用酵素菌对中药渣进行好气性高温固态堆积发酵处理, 可显著提高发酵温度, 促进水分散失, 调节p H值, 降低碳氮比, 缩短发酵时间, 提高中药渣的腐殖化程度。因此, 酵素菌可作为一种发酵中药渣生产有机肥料的优良的腐熟剂。

发酵技术在中药研究中的应用 第3篇

中药产业是中华民族特有的传统产业,又是当今快速发展富有成长性的产业。广西地处亚热带季风区,特殊的自然生态条件,孕育了丰富的动植物中草药资源,中草药资源种类排在全国第2位,使之成为我国“天然药库”和“中药材之乡”。进入21世纪以来,虽然广西的中医药产业发展迅速,但在提升医药产品含金量和附加值的加工业方面,由于缺乏科技创新,新药创制和优势品种的二次开发相当薄弱,在一定程度上制约了广西中医药又好又快的发展[1]。近些年来,随着生物技术的不断发展,发酵技术逐渐与中药发展相接轨,发酵后的中药材其有效成分能够更容易被提取和分离,并在改善药效、减少药物副作用、产生新的活性成分等方面都有良好的效果[2]。这种将发酵技术运用在中药制作过程的思想对广西现代中医药的发展有着极其重要的意义,有望成为中医药产业及技术发展的一条新的重要途径。

2 新型发酵技术在中药研制中的具体应用

2.1 微生物转化发酵

这种方法将微生物作为发生发酵反应的天然容器,不仅将微生物作为原材料,还将其作为化学反应的环境场所,在发酵的过程中通过改变药物的分子结构并对其分子排列方式进行修饰,从而达到提高药效的目的。该技术的核心是在反应过程中将药物的大分子结构加以合理破坏,使其变为更易于人体吸收的小分子结构,提高人体对于药物的吸收程度。还可以在处理小分子结构的药物时在分子之间加入某些营养元素,如铁、氮等,以提高药效。

薛会玲通过对微生物进行发酵从而转变了黄芩的分子结构,使其溶解性增强,提高了单位溶液中的有效药物成分,该实验药品药效明显优于以往传统的黄芩药剂[3];王辉用微生物发酵法水解掉了白藜芦醇苷细胞壁上的纤维素,打破了白藜芦醇苷不能转化的屏障,并且经过这种方法处理过的白藜芦醇苷转化效率极高,大大地提高了药效[4]。微生物发酵法不仅可以通过发酵改变单一药物的分子结构,还可以在两味以上的药材混合后同时改变两种药材的结构,臧建伟利用光合作用,将光合细菌与六味地黄汤进行混合,在发酵的过程中两种物质的分子结构都有了明显的变化,发酵过后的六味地黄汤效果明显好于反应前,这种经发酵的药材在延缓衰老、滋阴补肾方面效果良好[5]。通过多位专家的实验,笔者发现微生物转化发酵技术不仅适用于提高单味中药的药效,也能提高复方制剂的药效。目前在微生物转化发酵药材的研究领域中,最前沿的技术是将菌株与中药联合双向发酵的技术,这种技术能够更快、更准确地提取药材中的药用成分。

2.2 微生物酶发酵

酶对于中药的研制起到了举足轻重的作用,将适度、适量、种类合适的酶同药用成分一同反应,利用酶对某些化学反应的催化作用,可以大大提高中药制作的速度和生产药品的质量。生物学家们将发酵技术与酶提取技术相结合,研发出微生物酶发酵技术,该技术的原理是利用对微生物进行发酵,从微生物细胞中快速提取出细胞中的各种酶,但要求微生物绝对的纯净,在发酵过程中不能产生可溶解酶的杂质,同时要求微生物安全可靠、无毒性,并且微生物要易于培养和管理。

微生物酶发酵技术的生产方式包括传统固体发酵、液体深层发酵和固定化原生质体发酵,这些技术目前应用越来越广泛,其在中药研制中主要用来制作药曲。药曲的主要功效为和食消胃,对于驱除胃火有着很好的功效。以往制作药曲的方法主要是将杏仁泥、赤小豆、辣蓼草、青蒿、面粉、苍耳草等药末混合后经发酵而成,原始的方法制作过程虽然简单,但是发酵过程极慢。而今利用微生物酶发酵的方法将霉菌进行发酵操作,在发酵过程中的适当时刻将曲类中药投入反应容器与微生物及其产出的酶一同发酵,使药物发泡、生衣[6]。日常生活中常常用此法制作健胃消食、发散去火类的药材,是我们生活中必不可少的良药。

2.3 菌丝体发酵

菌丝体发酵顾名思义,旨在提取微生物中的菌丝体,由于药中真菌中含有能与菌丝体发生对制药过程来说有益的反应,最终能够产生药理活性物质,因此,这种方法在中药研制过程中被用于扩大药源,不仅用于寻找名贵中药的可替代物质,还被应用于改进传统药物真菌反应方法[7]。例如:李雪曾通过对大型真菌发酵,提取出了真菌中的菌丝体,并将其与中药中的药用真菌发生反应,最终产生了能够抗击肿瘤的活性物质[8]。近年来,研究人员发现裂褶菌含有多种活性物质,同时其在发酵过程中细胞壁能够自然脱落,这样有利于产生菌丝体,这种特性使其非常适合被应用于菌丝体发酵技术中,它含有的各种活性物质与分解出的菌丝体在发酵反应中能够产生各种抗病毒物质,能够抵抗各种疾病,但其来源较少是它发展受限制的一项重要因素。

2.4 微生物代谢产物的发酵

这种发酵技术在中药研发的过程中曾起到很重要的作用,是一项被应用时间很长的技术,但由于近期微生物发酵技术的快速发展,使该技术可能很快被淘汰。微生物代谢产物的发酵曾经被用于提取蛋白质、多糖、生物碱、抗生素等多种药用物质,由于产生了这些药用物质,因此利用微生物代谢产物的发酵方法制作的药材具有很强的保健作用,适合于制作一些保健品性质的中药材。微生物代谢产物的发酵是早期发酵技术的主要生产方式,分为初级代谢产物和次级代谢产物,典型的方式为好氧型发酵和厌氧型发酵。好氧型发酵的主要产物大多数为一些有机酸和抗生素,厌氧型发酵方式会获得一些很特殊的代谢产物。微生物代谢产物的发酵方法起步较早,发展过程很长,因此该技术很成熟,被熟练地应用于制作各种保健品中药材、伤病康复药材上,用这种方式得到的药材普遍稳定,虽然效率稍低于前几种发酵方式,但是稳定性较高。近年来,该项技术又有了一些新的突破,将已有的传统的培养方式与提取代谢的方法相结合并结合新的技术,能够分析鉴定微生物代谢的产物,提高发酵过程中微生物代谢的准确性,同时可以对发酵过程中的微生物代谢进行合理调控[9]。

3 结论与展望

笔者通过介绍中药研究领域中常用的4种发酵技术(菌丝体发酵、微生物酶发酵、微生物代谢产物的发酵以及微生物转化发酵)的不同应用领域、不同技术环节,揭示了发酵技术在中药研制过程中应用的广泛性与必要性。随着现代科学技术的发展,一个领域要想得到发展,就需要与其他学科领域相融合,随着中药学、微生物学、分析化学、药理学等多学科的融合,微生物发酵技术将更广泛地应用于中药制作领域。从以上4种发酵技术的应用可知:未来的中药研制过程离不开发酵技术,发酵技术会在中药研发过程中起到举足轻重的作用,努力地研究发酵技术、利用发酵技术是将来整个中药行业的行业趋势,发酵技术的发展必将决定我国中医药产业的发展前途,应用现代生物技术大规模工业化提取中药有效生物活性成分,发展具有中国特色的生物技术医药工业具有相当广阔的前景。

摘要：文章通过介绍4种常见的中药研发领域中应用的发酵技术,揭示了各种发酵技术的操作模式以及其对于中药研发的重要作用。发酵技术与中药研发技术相结合也更加有助于增加药物的药用成分,提高其药效的同时能够扩大生产,弥补了传统中药研发技术的不足之处,扩大了传统中医学的应用范围。

关键词：发酵技术,中药研究,应用

参考文献

[1]佚名.广西中医药现代化科技产业发展规划[EB/OL].http://www.doc88.com/p-27513203210.html,201 1-07-09.

[2]葛馘发酵在中药研究中的应用[J].时针国医国药,2008(2).

[3]薛慧玲.微生物发酵转化黄芩的研究[D].成都:四川大学硕士学位论文,2006.

[4]王辉.微生物转化虎杖中白藜芦醇普及产品及其产物的分离醇化[D].大连:大连理工大学博士学位论文,2009.

[5]臧建伟.六味地黄丸生物制剂的药效学研究[D].广州:广东药学院硕士学位论文,2007.

[6]徐志刚.常用曲类中药及临床应用[J].浙江中西医结合杂志,2008(12).

[7]姜文侯,孙武岳.蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵的研究[J].微生物学通报,1996,26(3):186-194.

[8]李雪.裂褶茵液体发酵条件及发酵产物的药理活性研究[D].长春:吉林农业大学硕士学位论文,2008.

复方中药发酵制剂的安全性研究 第4篇

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 、产朊假丝酵母 (Candida utilis) 、嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus) , 购自中国普通微生物菌种保藏中心。

1.2 培养基

营养肉汤培养基、YPD培养基、MRS培养基、固态培养基, 自制。

1.3 复方中药发酵制剂的制备

复方中药由连翘、黄芪、板蓝根、茯苓、白术、枳实、山楂、甘草8味中药组成, 各味中药均购自郑州九九重阳大药房。分别于50~60℃条件下烘干2~3 h, 粉碎, 过80目筛, 发酵前调整物料含水量为50%, p H值为6.0左右, 使枯草芽孢杆∶产朊假丝酵母∶嗜酸乳杆菌的比例为1∶1∶1, 混匀后按照4%接种量接入物料中, 搅拌均匀后装入不透气的塑料袋中, 压实, 封口, 置31℃环境中培养72 h, 烘干, 备用。采用水提法提取制成浓度为0.5 g/m L的中药液。

1.4 试验动物

昆明系小鼠200只, 体重为18~22 g, 雌雄各半, 由河南省实验动物中心提供。动物饲养条件:室温为 (22±3) ℃, 相对湿度为55~60, 无对流风, 人工昼夜 (12 h白昼、12 h黑夜) , 试验分组给药前禁食12 h。

1.5 急性毒性试验

选取健康小鼠40只, 随机分为4组, 雌雄各半, 每组10只, 一次性灌胃给药, 试验组给药剂量分别为5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg, 阴性对照组给予相同体积的纯化水。给药后观察小鼠的毒性反应, 连续观察7 d。小鼠急性毒性试验如未测出半数致死量 (LD50) , 则需测出最大耐受量 (MTD) :取健康小鼠20只, 随机分成2组, 雌雄各半, 采用的药物浓度为0.5 g/m L (药物的最高浓度) , 按照0.04 m L/g灌胃给药, 3次/d, 累计折合日用药量为按体重60 g/kg。连续观察7 d, 于第7天脱颈椎处死全部小鼠, 剖检, 记录心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的病理变化。

1.6 致突变试验

1.6.1小鼠骨髓微核试验

选取健康小鼠50只, 雌雄各半, 随机分为5组, 即低、中、高剂量组和阳性对照组、阴性对照组, 每组10只。阴性对照组给予纯化水, 阳性对照组给予环磷酰胺 (0.04 g/kg) 。灌胃给药2次, 2次间隔时间为24 h, 于末次给药后6小时处死小鼠, 取股骨骨髓涂片, 姬姆萨染色, 油镜镜检, 每只小鼠计数1 000个嗜多染红细胞的微核细胞数。

1.6.2小鼠精子畸变试验

选取健康雄鼠50只, 随机分为5组, 即低、中、高剂量组和阳性对照组、阴性对照组, 每组10只。每天给药1次, 连续5 d, 于第1次给药后的第35天处死小鼠, 取副睾制片。每只小鼠计数1 000个精子, 检查精子形态, 计算精子畸形率。

1.7 统计学分析

应用Excel 2007和SPSS 12.0统计软件对试验数据进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验结果

在整个试验期间, 各组小鼠精神状态、饮食正常, 生长情况良好, 均无明显异常反应, 无死亡现象发生。处死后尸检观察小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均未发现任何异常改变。因此, 该复方中药发酵制剂的LD50>20 g/kg, 具体多少, 现有剂型无法测得, 需进行最大耐受量试验。最大耐受试验结果表明, 小鼠精神、食欲、活动与阴性对照组相比均未见异常变化, 内脏器官未见任何异常。根据急性毒性分级标准, 复方中药发酵制剂属于实际无毒。

2.2 小鼠骨髓微核试验 (结果见表1)

注:与阴性对照组比较, **表示差异极显著 (P<0.01) , 无肩标表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表1可知:复方中药发酵制剂的3个剂量组微核率与阴性对照组相比均差异不显著 (P>0.05) , 与阳性对照组相比差异极显著 (P<0.01) ;各剂量组之间差异不显著 (P>0.05) 。说明试验结果为阴性, 该复方中药发酵制剂对小鼠的体细胞无诱变作用。

2.3 小鼠精子畸变试验 (结果见表2)

注:与阴性对照组比较, **表示差异极显著 (P<0.01) , 无肩标表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表2可知:复方中药发酵制剂的3个剂量组精子畸形率与阴性对照组相比均差异不显著 (P>0.05) , 与阳性对照组相比差异极显著 (P<0.01) ;各剂量组之间差异不显著 (P>0.05) 。说明该复方中药发酵制剂对小鼠生殖细胞无致畸变作用。

3 讨论

急性经口毒性试验的目的是初步估计药物对靶细胞可能的毒性作用机制, 为其他毒性试验提供依据[4]。本试验结果提示, 按照最大剂量灌胃给予复方中药发酵制剂, 小鼠全部存活, 无法测出LD50, 在小鼠可接受的最大体积下进行最大耐受量试验, 结果表明, 小鼠对该复方中药发酵制剂的最大耐受量达到60 g/kg以上。一般认为, 按照体重计算, 1日龄小鼠最大给药量相当于成人临床日用量的100倍以上则较为安全[5]。而本试验采用的最大耐受量折合成人临床日用量为546倍。因此, 可以认定该制剂在短期内使用安全, 毒性级别应属于实际无毒。

杨鸿等[6]研究发现, 一些单味中药及其成分在动物整体试验或在细胞离体试验中已显示出遗传毒性阳性或可疑阳性, 因而在中药及其复方的研究中重视其遗传毒性显得尤为必要。目前, 微核试验是最常用的哺乳动物体内遗传毒学短期试验。小鼠精子畸变试验是食品安全性毒理学评价程序中的主要指标之一。以上2个试验的结果表明, 复方中药发酵制剂对小鼠无遗传毒性。综合本试验结果, 可初步认为该复方中药发酵制剂是安全可靠的。但由于复方中药发酵制剂发酵后产生的新成分和新的药理作用尚未探明, 不能判定该发酵制剂长期应用是否会产生毒性, 对于该发酵制剂的长期毒性还有待进一步研究。

摘要：为了考察复方中药发酵制剂的安全性, 试验采用急性毒性试验、小鼠骨髓微核试验和小鼠精子畸变试验检测了该制剂的急性毒性和致突变性。结果表明:复方中药发酵制剂对小鼠急性毒性试验的半数致死量 (LD50) >20 g/kg, 最大耐受量 (MTD) >60 g/kg, 属实际无毒;小鼠骨髓微核试验和小鼠精子畸变试验均为阴性。说明该药物安全性良好。

关键词：复方中药,发酵制剂,安全性,毒理学,急性毒性,致突变性

参考文献

[1]汪洋, 汪德刚, 张世新, 等.中药微生态发酵技术研究进展与展望[J].中国动物保健, 2014, 16 (9) :22-26.

[2]戴, 程茂基, 韩信, 等.中草药混菌发酵生产新型生物中药的研究[J].饲料工业, 2013, 34 (11) :20-24.

[3]张文, 王文春, 王晓方, 等.芽孢杆菌发酵中药复方及抑菌活性的检测[J].广东饲料, 2013, 22 (11) :24-26.

[4]李良波, 陈声晶, 龚成, 等.清窦灵合剂及浸膏的急性毒理学研究[J].湖北民族学院学报:医学版, 2014, 31 (1) :1-3.

[5]谢秀琼.中药新制剂开发与应用[M].2版.北京:人民卫生出版社, 2000.

发酵中药 第5篇

冠突散囊菌是茯砖茶在“发花”过程中自然形成的一种具有益生性能的优势菌[3,4,5], 由于它的存在, 使得茯砖茶的色、香、味得以不同于其他茶类, 并且具有抗氧化[6]、促消化、降脂减肥[7]、抑菌[8]、抗癌[9]等保健功效。同时冠突散囊菌还可以在非黑茶茶类和几种常见的药用植物上“发花”, 如红茶、绿茶、银杏叶、枇杷叶、杭菊花[10,11]。

目前, 尚无将冠突散囊菌接种到桑叶上进行固体发酵的研究, 本研究创新性地以中药桑叶为例, 结合微生物发酵方式, 对该药固体发酵前后70%乙醇提取物的抗氧化活性进行比较, 同时对发酵前后桑叶中总黄酮、总酚酸含量进行测定, 以探讨固体发酵技术对中药成分提取及药理活性的影响。

1 仪器与试药

1.1 原料与试剂

桑叶产自安徽 (生产批号:20130701) , 经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶;冠突散囊菌由清华大学工程物理系粒子技术与辐射成像教育部重点实验室分离获得并鉴定[12];马铃薯葡萄糖琼脂购自北京奥博星生物技术有限公司;芦丁购自成都曼斯特生物科技公司 (纯度≥98%) ;没食子酸购自成中国食品药品检定研究院 (纯度≥98%) ;2, 2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二铵盐) (ABTS) 购自Amresco公司;1, 1-二苯基-2-三硝苯肼 (DPPH) 购自Alfa Aesar公司;菲洛嗪购自AALDRICH公司;水杨酸购自西陇化工股份有限公司;维生素C (Vc) 购自广州化学试剂厂;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

VARIOSKAN FLASH型全波长扫描多功能读数仪为美国Thermo Scientific公司的产品;KQ 5200 DE型超声仪为昆山市超声仪器有限公司的产品;EYEL4旋转蒸发仪为日本EYELA公司的产品;Venticell烘箱为德国MMM公司的产品;DZE-6050型真空干燥箱为北京神泰伟业仪器设备有限公司的产品;SVE-4A1型垂直流超净工作台为新加坡ESCO公司的产品;AL204-IC型电子天平为梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司的产品;SHZ-CB型循环水式真空泵为巩义市英峪予华仪器厂的产品;微量移液器为美国Thermo公司的产品;恒温培养箱为德国MMM公司的产品;NANOpure超纯水系统为美国Barnstead公司的产品;3-18K型超速离心机为美国Sigma公司的产品。

2 方法

2.1 样品液的制备

2.1.1 未发酵桑叶提取液的制备

称取8 g桑叶于500 m L锥形瓶, 加70%乙醇500 m L超声提取2次, 每次45 min。立即减压过滤, 残渣用少量70%乙醇洗3次, 合并滤液, 浓缩得干膏。精密称取各样品0.5 g (生药量) , 用2 m L 70%乙醇溶解, 超声提取2次, 最后用适量70%乙醇定容至5 m L容量瓶中, 制成质量浓度为100 mg/m L样品溶液。用70%乙醇依次稀释, 得到质量浓度为:20、12.5、5、4、2、0.8、0.16、0.032 mg/m L的供试品溶液。

2.1.2 固体发酵桑叶提取液的制备

2.1.2. 1 固体发酵桑叶

照本实验室前期研究茯砖茶中冠突散囊菌的分离纯化方法[12], 将得到纯化后的冠突散囊菌在PDA平板培养基上培养4 d。在无菌操作条件下, 吸入无菌水5 m L, 用接种环将黄色闭囊壳刮下, 悬浮于无菌水中, 再将悬浮液吸入盛有95 m L无菌水并带有玻璃珠的三角瓶内, 30℃, 150 r/min振摇20 min, 制成均匀的孢子悬液。测定孢子数量, 孢子浓度为5.0×108~6.0×108cfu/m L。称取8 g桑叶于500 m L锥形瓶中, 高压湿热灭菌后, 待瓶温恢复到室温。在超净工作台中进行接种操作。将制备好的50 m L菌悬液均匀喷洒到8 g桑叶上, 于30℃培养箱中培养7 d。

2.1.2. 2 固体发酵后桑叶提取液的制备

将发酵后的桑叶参照“2.1.1”项下方法进行提取, 依法得到相同质量浓度的供试品溶液。

2.2 体外抗氧化活性测定

2.2.1 对自由基清除能力的测定

2.2.1. 1 DPPH自由基清除试验

采用Tagashira and Ohtake (1998) 的方法, 略作修改。分别吸取各供试品溶液50μL于96孔板中, 加入150μL 0.2 mmol/L DPPH自由基测定液, 迅速混匀, 37℃恒温反应30 min, 在510 nm处测定吸光度。样品空白对照以无水乙醇代替DPPH自由基测定液, 其余步骤与样品相同;阴性对照以70%乙醇代替样品溶液, Vc作为阳性对照, 其余步骤与样品相同。所有的测量值均做3个复孔取其平均值。样品的抗氧化程度用对DPPH自由基的清除率表示, 清除率越大, 抗氧化活性越强, 反之则弱。计算公式为:清除率 (%) =[1- (A1-A2) /A0]×100%, 其中, A0为阴性对照组吸光度;A1为样品组吸光度;A2为样品空白对照组吸光度。

2.2.1. 2 ABTS+自由基清除试验

参考文献[13]及[14]的方法, 略作修改。吸取各供试品溶液50μL于96孔板中, 加入150μL ABTS+自由基测定液[7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合, 在734 nm处调节吸光度为 (0.700±0.020) ], 混匀, 室温下反应30 min, 在734 nm处测定吸光度。样品空白对照以50%乙醇代替ABTS+自由基测定液, 其余步骤与样品相同;阴性对照以70%乙醇代替样品溶液, Vc作为阳性对照。其余步骤与样品相同。所有的测量值均做3个复孔取其平均值。样品的抗氧化程度用对ABTS+自由基的清除率表示, 清除率越大, 抗氧化活性越强, 反之则弱。样品对ABTS+自由基的清除率计算公式为:清除率=[1- (A1-A2) /A0], 其中A0为阴性对照组吸光度;A1为样品组吸光度;A2为样品空白对照组吸光度。

2.2.1. 3·OH自由基清除试验

参考文献[15]的方法, 略作修改。向5 m L比色管中依次移取1.5 m L硫酸亚铁溶液 (2 mmol/L) 和1 m L双氧水溶液 (6 mmol/L) , 混合均匀后用6 mmol/L水杨酸溶液定容至刻度, 36~37℃恒温水浴反应15 min后测定A值, 即A0值。在该体系中加入1 m L各浓度的样品溶液, 36~37℃恒温水浴反应15 min后测定A值, 即为Ax值。样品空白对照以70%乙醇代替所有反应试剂。所有测定值均做3个复孔取平均值。样品的抗氧化程度用对·OH自由基的清除率表示, 清除率越大, 抗氧化活性越强, 反之则弱。样品对·OH自由基的清除率计算公式为:清除效率 (%) = (A0-Ax) /A0×100%。

2.2.2 对Fe3+还原能力、Fe2+螯合能力的测定

2.2.2. 1 铁离子的还原/抗氧化能力

参照文献[16]的方法, 略作改进。取各供试品溶液0.2 m L, 分别加入0.2 m L0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液 (p H=6.6) 和0.2 m L 1%K3Fe (CN) 6溶液。将上述混合物于50℃恒温反应20 min, 冷却后加入0.2 m L 10%的三氯乙酸水溶液终止反应, 3000 r/min离心10 min。取上清液0.4 m L, 加0.4 m L蒸馏水, 加0.08 m L 0.1%Fe Cl3溶液, 混匀。吸取200μL于700 nm处测定其吸光度A0样品空白对照以水代替K3Fe (CN) 6, 其余步骤与样品相同;阴性对照以70%乙醇代替样品溶液, Vc作为阳性对照, 其余步骤与样品相同。所有的测量值均做3个复孔取其平均值。

2.2.2. 2 Fe2+螯合能力测定

取各供试品溶液100μL, 加入25μL 2 mmol/L Fe SO4·7H2O, 震荡混匀后加入25μL 5 mmol/L Ferrozine试剂。反应10 min后于562 nm处测定其吸光度值。吸光度越低表示与Fe2+螯合能力越强。样品空白对照以水代替Ferrozine试剂, 其余步骤与样品相同;阴性对照以70%乙醇代替样品溶液, 其余步骤与样品相同。二乙胺四乙酸 (EDTA) 作为阳性。所有的测量值均做3个复孔取其平均值。计算公式为:螯合能力 (%) :[1- (A1-A2) /A0]×100%, 其中A0为阴性对照组吸光度;A1为样品组吸光度;A2为样品空白对照组吸光度。

2.3 桑叶中总黄酮、总酚酸含量测定

2.3.1 供试品溶液的制备

2.3.1. 1 未发酵桑叶供试品溶液的制备

精密称取参照“2.1.1”项下干膏0.2 g (生药量) , 用3 m L、70%乙醇超声提取20 min, 重复操作2次, 最后用70%乙醇定容到10 m L。制得0.02 g/m L (生药浓度) 的未发酵桑叶供试品溶液。

2.3.1. 2 固体发酵7 d桑叶供试品溶液的制备

精密称定将“2.1.2.2”项下的干膏0.2 g (生药量) , 参照“2.3.1.1”项下方法, 得0.02 g/m L固体发酵7 d桑叶供试品溶液。

2.3.2 发酵前后桑叶中总黄酮含量测定

2.3.2. 1 标准曲线绘制

分别吸取质量浓度为0.4、0.2、0.1、0.04、0.02、0.01、0.005 mg/m L的芦丁对照品溶液1 m L, 加2 m L 0.1 mol/L Al Cl3和1 m L 0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液 (p H=5.2) , 摇匀, 40℃水浴10 min, 吸取200μL反应液于96孔板中, 在405 nm处测定吸光度值。绘制标准曲线:Y=3.9748X-0.0032, r=0.9998。

2.3.2.2样品总黄酮含量测定

将发酵前后样品溶液参照“2.3.2.1”项下方法显色, 测定吸光度。代入标准曲线方程, 计算样品中总黄酮含量, 结果表示为芦丁当量 (mg/g) 。

2.3.3 总多酚含量测定

2.3.3. 1 标准曲线绘制

吸取20μL质量浓度为0.01~0.1 mg/m L没食子酸标准溶液于96孔板中, 加入100μL10%福林酚水溶液, 混匀, 反应5 min, 加入80μL 7.5%碳酸钠溶液, 混匀, 室温下反应60 min, 在765 nm处测定吸光度值, 绘制标准曲线:Y=5.8477X+0.0152, r=0.9994。

2.3.3. 2 样品总多酚含量测定

将发酵前后样品溶液参照“2.3.3.1”项下方法显色, 测定吸光度。代入标准曲线方程, 计算样品中总多酚含量, 结果表示为没食子酸当量 (mg/g) 。

2.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 固体发酵前后桑叶中总黄酮、总酚酸含量变化

固体发酵前后桑叶中总黄酮、总酚酸含量结果见图1。固体发酵7 d后的桑叶中总黄酮含量从未发酵时的4.39 mg/g增加到5.37 mg/g, 上升了22%;而桑叶中总多酚含量从未发酵时的3.95 mg/g减少到1.55 mg/g, 下降了近61%。表明采用冠突散囊菌对桑叶进行固体发酵, 可以明显改变桑叶中总黄酮、总酚酸的含量。

3.2 清除DPPH自由基能力

清除DPPH自由基能力见表1。可见发酵前后桑叶70%乙醇提取物对DPPH自由基均有一定的清除作用, 并在实验浓度范围内呈现明显的量效关系。且各浓度梯度下, 固体发酵7 d的桑叶70%乙醇提取物清除DPPH自由基能力较发酵前均有所下降, 其中阳性对照Vc、未发酵桑叶70%乙醇提取物清除DPPH自由基IC50值分别为:0.028、4.69 mg/m L, 而发酵后桑叶70%乙醇提取物的IC50值为17.63 mg/m L。统计学结果显示, 发酵前后桑叶70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力IC50差异有高度统计学意义 (P=0.005) 。

3.3 清除ABTS自由基能力

清除ABTS自由基能力见表2。可见发酵前后桑叶70%乙醇提取物对ABTS自由基均有一定的清除作用, 并在实验浓度范围内呈现明显的量效关系。且各浓度梯度下, 固体发酵7 d的桑叶70%乙醇提取物清除ABTS自由基能力较发酵前均有所上升, 其中阳性对照Vc以及发酵前后桑叶70%乙醇提取物清除ABTS自由基IC50值分别为:0.03、2.03、1.87 mg/m L, 统计学结果显示, 发酵前后桑叶70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力IC50差异无统计学意义 (P=0.169) 。

注:DPPH:1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼;IC150:抑制率为一半时抑制剂的浓度;与未发酵比较, **P<0.01

注:ABTS:2, 2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二铵盐;IC150:抑制率为一半时抑制剂的浓度

3.4·OH自由基清除能力

清除·OH自由基能力的测定结果显示, 发酵前后桑叶70%乙醇提取物对·OH自由基的清除能力均比较低, 在实验浓度为20 mg/m L时, 清除能力才达到23.78%、25.74%。故发酵前后桑叶70%乙醇提取物对·OH自由基具有很低的清除能力。

3.5 铁离子的还原/抗氧化能力

样品与Fe3+还原能力见表3。随着样品浓度的升高, 其吸光度也逐渐增大。比较发酵前后70%乙醇提取物对Fe3+还原能力发现, 发酵前吸光度较发酵后吸光度要高。统计学结果显示, 当发酵前后样品浓度高于0.08 mg/m L时, 各样品相同浓度间吸光度差异有高度统计学意义 (P=0.000) 。说明发酵降低了桑叶70%乙醇提取物对Fe3+的还原能力。

3.6 螯合能力

样品与Fe2+螯合能力见表4。由结果可知样品的螯合能力与浓度呈明显的剂量关系。其中发酵前后桑叶70%乙醇提取部位的半数螯合率分别为:20.89、9.20 mg/m L, 而EDTA半数螯合率为0.14 mg/m L。统计结果显示, 发酵前后桑叶70%乙醇提取部位与Fe2+螯合能力差异有高度统计学意义 (P=0.000) 。由半数螯合率可知, 固体发酵7 d桑叶70%乙醇提取部位螯合能力大于发酵前桑叶70%乙醇螯合能力, 但二者均小于阳性对照EDTA与Fe2+螯合能力。

注:与未发酵比较, **P<0.01;IC250:与Fe2+螯合率为50%时螯合剂的浓度

4 讨论

近年来, 活性氧和自由基学说已经成为现代生命科学研究的热点, 因此评价与筛选具有抗氧化活性的天然产物成为了科学研究的新趋势。目前尚无关于将冠突散囊菌采用固体发酵方式接种到桑叶上的报道。本研究通过在桑叶上固体接种冠突散囊菌, 并对其发酵一周后产物的抗氧化活性成分含量进行测定。结果发现, 利用冠突散囊菌的发酵, 可增加桑叶中总黄酮含量的同时, 降低了桑叶总总酚酸的含量。

利用冠突散囊菌固体发酵一周, 可增加桑叶中总黄酮含量。这一结果跟传统理论“固体发酵茯砖茶导致其总黄酮含量下降”相反。但微生物及其代谢过程中产生丰富的酶类, 能降解大量中药植物纤维素, 降低淀粉等高分子对中药成分的包裹作用, 有利于有效成分的溶出[17,18,19]是导致发酵后桑叶中总黄酮含量有所上升的原因之一。同时有报道称发酵桑叶茶时, 桑叶中总黄酮含量呈现出先增加后降低的趋势[20], 因此以天数为变量, 活性物质含量为指标的实验, 有待进一步完善。

发酵中药 第6篇

1 材料

1.1 供试药品

中药提取液由潍坊诺达药业有限公司提供;中药发酵液由潍坊诺达药业有限公司提供;甘草次酸对照品、黄芩素对照品、柴胡皂苷对照品由中国药品生物制品检验所提供;乙腈、色谱纯由天津市大茂化学试剂厂提供;甲醇、优级纯由天津市福晨化学试剂厂提供;硅胶G板由青岛海洋化工厂分厂生产, 批号080411。

1.2 仪器

Agilent12000型高效液相色谱仪 (四元泵、柱温箱、在线脱气机、自动进样器、紫外检测器由美国安捷伦公司生产) ;Agilent ZORBOX SB-C18色谱柱 (5μm, 4.6mm×150mm由美国安捷伦公司提供) ;XS105十万分之一电子分析天平由瑞士梅特勒公司提供;WFH-204B便携式紫外灯。

2 方法与结果

2.1 发酵前后柴胡皂苷薄层分析变化

取中药发酵液10ml、中药提取液10ml, 分别离心6000r/min, 离心10min, 取上清液, 分别加乙醚15ml萃取3次, 混合萃取液, 在水浴中挥干乙醚, 残渣加95%醇2ml使溶解, 供点样用。柴胡皂苷a, 柴胡皂苷b, 分别用95%的乙醇溶解, 供点样用。分别将提取液10l, 发酵液10ul和标准品溶液10ul点样于同一薄层板上, 展开剂分别为氯仿:甲醇:水 (70:25:5) 展开5cm, 挥干溶剂, 喷洒10%的硫酸加热显色。分别在可见光和365nm的在外观下观察, 结果如图1。

1, 2为中药提取液s为柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的混合物3, 4为中药发酵液S2为柴胡皂苷d S1为柴胡皂苷a

从薄层层析图可以看出, 中药提取液和中药提取发酵液中都存在柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的薄层点, 提取液和发酵液中均存在2种成分, 在中药发酵液的薄层点中还存在2个明显的点, 跑在了柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的前面, 说明该物质的极性比柴胡皂苷a和d的极性差, 根据文献报道, 上述几个物质为柴胡皂苷的苷元。

2.2 发酵前后甘草次酸含量变化

2.2.1 色谱条件

色谱柱Chromsphere C18柱 (150mm×4.6mm, 5μm) 、流相乙腈-水-甲醇 (7:2:1) 、流速0.8ml/min、检测波长268nm、柱温室温、进样量20μl。

2.2.2 标准品溶液的配置

精密称取甘草次酸对照品约成甘草次酸对照品溶液。再精密吸取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml, 置量瓶中, 配成各个浓度的甘草次酸标准品溶液。

2.2.3 标准曲线的绘制

分别取各个浓度的甘草次酸对照品溶液20μL, 依次进样, 测定峰面积, 记录色谱图及色谱峰面积, 以进样量 (μg) 对峰面积进行线性回归, 得标准曲线方程为Y=1341206.1X+87543.5 (相关系数r=0.9996) , 线性范围为0.0768~1.2288μg。

2.2.4 样品处理方法

中药提取液、发酵液的处理方法:分别取中药提取液和发酵液10ml, 加入5%的盐酸20ml, 摇匀10min, 分别离心10min, 6000r/min。取上清液10ml, 用氯仿萃取3次, 20ml/次。合并萃取液, 蒸干, 用甲醇溶解, 定容到50ml容量瓶中。

2.2.5 精密度试验

取标准品溶液, 分别连续进样5次, 每次进样20μl, 记录吸收峰面积, 测定结果RSD为0.22%。

2.2.6 稳定性试验

取供试样品溶液, 室温放置, 每2h上样1次, 记录锋面积, 测定结果RSD为1.87%。说明样品在12h内稳定。

2.2.7 重现性试验

根据样品处理方法, 分别制备供试样品, 每个样品制备6分。分别测定含量, 测定结果药渣的RSD为1.74%, 发酵产物的RSD为1.58%。

2.2.8 加样回收试验

取已知含量的提取液和发酵产物样品, 精密称定5份, 置于锥形瓶中, 分别加入甘草次酸对照品溶液, 分别处理样品。测定样品中甘草次酸含量, 结果如表1、2。

2.2.9 含量测定

按照设定的色谱条件和标准曲线计算, 提取液和发酵产物中各3批产品中甘草次酸的含量, 结果如表3。

2.3 发酵前后黄芩苷、黄芩素的变化

2.3.1 色谱条件

色谱柱Chromsphere C18柱 (150mm×4.6mm, 5μm) 、流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液 (51:49) 、检测波长277nm、流速1.0ml·min-1、柱温25℃, 理论塔板数按黄芩苷峰, 黄芩素峰计算应不低于2500。

2.3.2 对照品溶液的制备

黄芩苷对照品溶液制备:取黄芩苷对照品适量, 精密称定, 加70%乙醇制成每1ml含25μg黄芩苷的对照品溶液, 摇匀, 既得。黄芩素对照品溶液制备:取黄芩素对照品适量, 精密称定, 加70%乙醇制成每1ml含100μg黄芩素的对照品溶液, 摇匀, 既得。

2.3.3供试样品的制备中药提取液、发酵液的处理方法:分别取中药提取液和发酵液, 分别离心10min, 6000r/min。取上清液5ml, 转移置于25ml容量瓶中, 加无水乙醇5ml超声溶解, 加入无水乙醇定容。从容量瓶中移取5ml至50ml容量瓶中, 用70%的乙醇定容。

2.3.4 检测波长的确定

黄芩苷与黄芩素对照品经DAD检测器进行紫外吸收光谱扫描, 二者均在277nm处有最大吸收, 故检测波长确定为277nm。

2.3.5 专属性试验按处方比例配制缺黄芩的阴性样品,

制备样品溶液, 根据色谱条件测定, 结果黄芩苷和黄芩素对照峰处均未出现色谱峰, 说明发酵液和提取液中其他成分对黄芩中黄芩苷和黄芩素的测定均无干扰。

2.3.6 线性关系考察

(1) 黄芩苷的标准曲线:精密称取黄芩苷对照品4.08mg, 置100ml量瓶中, 加70%乙醇溶解并稀释至刻度, 配制成浓度为40.8μg/ml的溶液。分别稀释成浓度为10.2、15.3、20.4、25.5、30.6、35.7μg/ml。精密吸取上述6个浓度对照品溶液10μl, 注入液相色谱仪, 按色谱条件测定峰面积。以进样量 (μg) 为横坐标 (X) , 峰面积为纵坐标 (Y) , 绘制标准曲线。结果表明:黄芩苷在0.102~0.357μg范围内与峰面积呈良好的线性关系, 其回归方程Y=33309.29X+2233.611 (r=0.9999) 。结果见图3。 (2) 黄芩素的标准曲线:精密称取黄芩素对照品13.43mg, 置25ml量瓶中, 加70%乙醇溶解并稀释至刻度, 配制成浓度为0.537mg/ml的溶液。分别稀释成浓度为53.7、107.4、214.8、322.2、429.6、537.0μg/ml。精密吸取上述6个浓度对照品溶液10μl, 注入液相色谱仪, 按色谱条件测定峰面积。以进样量 (μg) 为横坐标 (X) , 峰面积为纵坐标 (Y) , 绘制标准曲线。结果表明:黄芩素在0.537~5.370μg范围内与峰面积呈良好的线性关系, 回归方程为Y=51392.68X-666.28 (r=0.9998) 。结果见图4。

2.3.7 稳定性试验

制备供试品溶液, 室温下放置, 分别于0、1、2、4、6、8、10、12、24h后依次注入液相色谱仪, 测定黄芩苷与黄芩素的峰面积并计算RSD值。黄芩苷与黄芩素的RSD分别为0.22%和0.52%, 结果表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.3.8 精密度试验

取样品, 制备供试品溶液, 连续进样6次, 测定峰面积值并计算RSD值。黄芩苷和黄芩素的RSD分别为0.26%和0.53%, 结果表明仪器的精密度良好。

2.3.9 重复性试验

取同一批号样品, 制备供试品溶液6份, 测定其含量及RSD值。黄芩苷和黄芩素的含量分别为1.31mg/g (RSD=1.09%) , 8.43mg/g (RSD=0.48%) 。结果表明该方法重现性良好。

2.3.1 0 回收率试验

(1) 黄芩苷回收率试验:称取已知含量的同一批供发酵液和提取液各1ml (5份) , 精密称定, 分别精密加入黄芩苷对照品, 测定黄芩苷含量, 计算回收率, 结果见表4、5。 (2) 黄芩素回收率试验:称取已知含量的同一批发酵液1ml (5份) , 精密称定, 分别精密加入黄芩素对照品, 测定黄芩素含量, 计算回收率。结果见表6、7。

(mg、%)

(mg、%)

(mg、%)

2.3.1 1 黄芩苷、黄芩素在发酵液和提取液中的含量

分别取3批中药发酵液和提取液各2ml, 处理样品, 进入高效液相, 测定含量。

(mg/ml)

3 结论

从试验结果来看, 发酵液和提取液中均有柴胡皂苷a, 柴胡皂苷d的薄层特征, 并且发酵液中的薄层点要比提取液多两个, 并且特有的斑点移动距离大于柴胡皂苷a和d, 这说明这两种物质的极性、分子量小于柴胡皂苷, 根据相关文献报道, 这两种物质疑似柴胡皂苷a和d的苷元。从液相测定的甘草次酸、黄芩素、甘草酸、黄芩苷的含量来看, 通过发酵后甘草次酸、黄芩素含量升高, 而甘草酸和黄芩苷含量降低, 通过研究发现甘草次酸和甘草酸的区别就是, 甘草次酸比甘草酸少了一个葡萄糖, 而黄芩苷和黄芩素的区别也是如此, 黄芩素、甘草次酸、柴胡皂苷苷元, 在肠道内可以不经过肠道微生物的分解, 直接吸收进入血液, 药效要比黄芩苷、甘草酸、柴胡皂苷快, 因此, 通过生物发酵提高了中药的药效, 加快了中药的作用速度。

参考文献

[1]王丽宏, 吉红, 张宝彤等.中草药保肝作用的研究进展[J].饲料博览, 2012, 11:41-45.

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