分型检测范文

分型检测范文（精选7篇）

分型检测 第1篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

本院2009年12月至2010年4月,妇科门诊就诊的泌尿生殖道炎患者共794例,均为女性,年龄17~60岁,平均年龄38岁。

1.2 标本采集

采集的脱落细胞放在盛有细胞保存液的小瓶里,4℃保存待检。

1.3 仪器及试剂HPV DNA抽提试剂盒(Qiagen公司):

人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒(凯普公司);KP-TC48扩曾仪(凯普公司);Hybri Ma XM医用核酸分子快速杂交仪(凯普公司)。

1.4 HPV分型检测步骤

(1)HPV DNA提取。(2)HPV PCR扩增。(3)核酸分子快速导流杂交。(4)显色HPV基因分型。操作和结果判读按试剂盒要求进行。

2 结果

2.1 HPV感染的总阳性率:

在794例患者中,有113例感染1种或1种以上HPV病毒,总阳性率为14.23%。

2.2 单一型别感染和多型别感染比例及构成

本文HPV阳性患者共113例,单一型别HPV感染84例,占总数的74.33%;在多型别感染的29例(25.67%)中,2种型别感染23例,占多型别感染的79.31%;随合并感染的型别数增加,比例逐渐下降,其中有1例同时感染6种型别的HPV病毒。在单一型和多型别HPV感染中,HPV52(30例)为最常见,其次为HPV16(21例),HPV58(21例),HPV18(15例),均为高危型HPV。低危型最常见类型为HPV53(18例)、HPV6(9例)和CP8304(6例),没有检测到HPV45和43型。在29例多重感染中,以2重感染为主,其中最常见HPV52.53共6例,3重感染有4例为HPV52.53.31、HPV16.52.59、HPV16.68.CP8304和HPV16.52.31。

3 讨论

3.1 宫颈病变筛查中HPV检测的重要性HPV感染可以表现为长期的隐性感染,大多数妇女在感染HPV病毒9~15个月后通过自身免疫将病毒清除掉。而持续感染HPV高危型病毒的妇女发生CIN的风险增加250倍,持续感染HPV高危型病毒是引起并维持CINIII的必要条件[3]。因此,早期筛查出持续感染是非常重要的。由于HPV检测可预测发病风险,且有较高的阴性预测值,因此,先行HPV检测可提高细胞学检测的有效性[4]。

3.2 HPV型别检测由于HPV病毒有多种亚型,约100种亚型与生殖道感染有关,大量流行病学研究资料已经明确了涉及宫颈癌发生的HPV型别,以其与癌瘤发生的危险性分为高危型与低危型,目前已经发现高危型HPV有14型别,包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68,低危型7种HPV6、11、42、43、44、53、CP8304,有2型或2型以上者为多型感染。HPV型别有着明显的地区分布差异,中国地域宽广,明确一个地区HPV流行的主要型别,可帮助设计该地区常见感染亚型的检测试剂盒,根据感染型别预测病变进展,评估预后,指导临床医生制订治疗方案。目前,已有对HPV感染进行分型分布的研究,认为在宫颈筛查及癌前病变病情随访监测中有着重要的意义[5]。有研究表明不同HPV亚型的感染其致病性和后果也有差异[6]。在我们的研究中HPV总阳性率为14.23%。在多型别感染中,主要是2种型别病毒感染,占多型别感染的79.31%,随合并感染的型别数增加,比例逐渐下降。在感染型别上,HPV52、16无论在单一型别,还是在多种型别中都是最常见的。本研究中宫颈病变患者最常见的HPV基因型为52、16、58、18、53,有文献报道中国宫颈癌患者HPV16、18最常见[7],58和52位居第3、4位,但本次研究中发现HPV52感染的阳性率最高,其次是HPV16、53与文献报道有所不同。高危型感染率较低危型相比,上升趋势更为明显,这和已知的大部分文献报道相一致。

3.3 本次研究采用的凯普导流杂交HPVDNA检测技术能同时对21种HPV基因型进行检测,特异性和灵敏度高,结果一致性较好,但还存在操作比较繁琐,杂交操作中产物间易污染且检测时间长等不足。

摘要：目的 探讨人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的感染在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及浸润性宫颈癌(ICC)中的表达,旨在提高宫颈上皮内瘤样病变及浸润性宫颈癌的诊断率。方法 对就诊的有宫颈疾患的妇女794例,采用导流杂交HPV基因分型技术进行DNA检测。结果 HPV检测阳性113例,阳性率14.23%,其中单一型别HPV感染84例,占总数的74.33%,多型别感染的29例,占总数的25.67%,最常见的HPV基因型为52、16、58、18、53高危型感染率较低危型相比,上升趋势更为明显。结论 在宫颈病变筛查中HPV检测可提高细胞学检测的有效性,是早期诊断CINⅢ及ICC的一个重要辅助方法。

关键词：人乳头状瘤病毒,HPV分型:导流杂交HPVDNA检测技术

参考文献

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分型检测 第2篇

关键词：人乳头瘤病毒,基因分型,检测,质量评价

人乳头瘤病毒(Human Papiliomavirus,HPV)是一种非均质、双股环形DNA病毒。1995年HPV型的定义更新为只要Ll区的DNA序列有10%以上与已知型不同,则为一新型;如差异在2%以下称为变异体;在型与变异体之间,即序列差异在2%～10%之间称为亚型[1]。现在报道的HPV型别已经超过了120种。其致病范围从机体表皮、泌尿生殖系已扩展到头颈部癌组织。其中约有40种与肛门、生殖道感染有关,30余种可从受感染的生殖道中分离出来,约有20余种已证实与宫颈肿瘤有关[2]。不同HPV型别的感染其致病性和后果也有差异[3]。因而,不同地区和人群HPV型别感染的分布资料是宫颈上皮内瘤变(cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)和宫颈癌防治策略的基础。HPV疫苗设计有赖于HPV的地理分布信息,对各地区进行HPV的分型研究,能获得各地区HPV型别分布情况的信息,这就方便了HPV疫苗的设计。此外,HPV疫苗使用之后,仍旧需要进行HPV的分型检测,以获得使用疫苗后的HPV型别分布情况信息以便于评估疫苗的实际效果。所以,HPV病毒分型检测对子宫颈病变的早期发现、宫颈细胞学异常的评估和管理,病程的进展,CIN治疗后的随访,以及人群的流行病学状态和病毒疫苗的研制都有重要意义。

目前HPV在临床上有多种检测方法,常见的有人乳头状瘤病毒分型检测试剂盒(表面等离子谐振法)、人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒、人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)、人乳头瘤病毒分型检测试剂盒(基因芯片法)、高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(流式荧光杂交法)、人乳头瘤病毒(HPV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒、人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)、高危型人乳头瘤病毒DNA检测试剂盒(酶切信号放大法)、人乳头瘤病毒(HPV)DNA检测试剂盒(荧光-PCR法)、高危型人乳头瘤病毒DNA检测试剂盒(杂交捕获化学发光法)等。如何评价这些试剂盒,如何为临床提供科学合理的依据是我们面临的问题。

1.HPV检测方法

由于HPV在体外不能增殖,故不能用常规方法培养。传统方法主要是通过形态学方法与免疫学方法对其进行检测。但传统方法的特异性和灵敏度不够理想,且不能或不便对HPV进行分型,因而目前HPV分型检测的主要技术是应用分子生物学的方法进行HPV的检测。

1.1以靶序列扩增为基础的检测技术

以靶序列扩增为基础的检测技术包含有型特异性PCR、通用引物PCR法、mRNA扩增检测、PCR后核酸杂交结合免疫胶体金技术分型法、多重PCR(multiplex PCR)法等。而在通用引物PCR法中根据检测手段的不同可分为PCR表面等离子谐振法、基因芯片法、PCR产物飞行质谱分析法、反向杂交法、实时荧光PCR法等。

表面等离子谐振法是利用在金属膜/液面界面,由光的全反射引起的物理光学现象来分析分子间相互作用的技术。谐振角高度依赖于金属表面近表面的折射率。表面上的生物分子的结合会改变此处的折射率,从而引起谐振角的变化。生物传感芯片阅读仪是一种光学传感器,可以检测由于谐振角的变化而引起的SPR信号。SPR技术在检测、分析生物分子间的相互作用等方面得到广泛的应用[4]。北京金菩嘉公司利用表面等离子谐振技术检测24种人乳头瘤病毒(HPV)基因型,使PCR产物流过表面包被有24种HPV基因型特异性探针的SPR生物传感芯片,与芯片表面HPV基因型特异探针反应,通过检测芯片上的杂交信号从而同时对HPV的24种基因型进行检测。

反向杂交法是将一定长度的已知序列的特异性寡核苷酸探针以点状或平行线状的形式固定在合适的基质上,一般是羧基化的尼龙膜。杂交时,

荧光素或生物素标记的PCR产物与膜上固定好的寡核苷酸进行杂交。杂交后通过化学发光或显色反应进行测定。采用反向杂交技术的还有INNO-LiPA试剂,国产的潮州凯普公司生产的人乳头瘤病毒分型试剂盒等。

1.2以信号放大技术为基础的检测技术

以信号放大技术为基础的检测技术包含杂交捕获化学发光法、酶切信号放大法以及荧光原位杂交法。

杂交捕获2代(hybrid capture 2,HC2)是Digene公司的一种新型HPV DNA检测技术,该法所使用的是含HPV16,15,31,35,39,45,51,52,56,58,59和68等13种HPV型的全长RNA探针物。在检测前,样本需先进行热一碱变性。混合RNA探针先与样本中的DNA进行杂交形成RNA-DNA杂合体,这些RNA-DNA杂合体可被一种特异性的抗体所结合,再与偶联有碱性磷酸酶的第二抗体结合后加入显色底物,最后通过显色反应来判定是否有感染[5]。由于使用的是混合探针,该法不适合对病毒进行分型的检测。此外,研究报道指出,HC2的探针会与13种高危型HPV以外的HPV型有交叉反应[6]。

酶切信号放大法为美国FDA批准的一种新型的HPV分型检测方法,它的原理为使用一种Cleavase酶切割由两种特定序列的寡核苷酸与目标DNA结合形成重叠时,在目标DNA识别位点上形成的特定结构。该结构可被Cleavase酶识别为底物。Cleavase酶使荧光团与抑制分子之间的FRET寡核苷酸断开,并产生荧光信号,作为断开的片段反复断开、结合的标记。

2. HPV检测存在的困惑

将HPV检测应用到我国妇女的宫颈癌早期筛查,目前还需要基础数据的积累,包括我国人群中HPV型别分布状况;我国宫颈癌以及癌前病变HPV型别分布规律;国际上已经认定的高危型HPV是否在我国具有类似的致癌性;不同的高危型HPV在我国人群中病毒载量的阈值等。因此在HPV的检测应用中存在一定的困惑。

2.1 对高危型别认识的不完全一致

依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低,分为低危型HPV与高危型HPV。但是高危型和低危型的区分并不明确。在研究人员的争议中存在不同的高危型别区分。如部分研究人员认为高危型别包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别,而部分研究人员认为还可以包括82、66、73、53等型别。宫颈癌及其癌前病变的发展是多因素作用的结果,除了与病毒有关以外,宿主(自身的免疫状态、个体基因的HPV易感性)和环境(是否同时合并其他病毒感染、吸烟、饮酒、多性伴等)的协同因素也是非常必要的。因此确定高危型别HPV,特别是新的型别是否为高危型别存在困难,造成了研究人员对不同型别HPV的危险性判断不一致。

2.2 病毒载量和宫颈病变相关性

病毒载量的高低是否与宫颈病变的程度相关,能否作为临床筛查宫颈病变的指导依据,目前研究结论尚不统一。有研究发现不同级别的宫颈病变与病毒载量之间呈相关性,载量越高宫颈病变程度加重的危险性越大。但也有研究不支持这一观点,因为发现有些宫颈癌变期,HPV的载量反而不高。因此有关病毒载量的研究必须在分型检测的基础上,同时兼顾整合态检测,才有可能提供HPV感染自然史有效信息,并解释HPV载量与疾病的相关性。

2.3 不同型别检测的交叉

HPV核酸分型检测试剂盒的研发设计关键在于引物探针的设计筛选,文献报道选择不同的引物对扩增效率和检测限均产生影响,同时,由于各型别HPV均有一定的变异度,而且,国内尚未见不同型别HPV分离株以及同一型别不同分离株序列分析的系统资料,因此,在应用中发现部分试剂盒针对部分型别的检测存在有交叉反应。

3.HPV参考品的建立

通过不同型别人乳头瘤病毒样本收集、样本型别检测后,根据GenBank中参考序列设计各型别L1基因扩增引物,通过PCR扩增、连接、转化、构建包含不同型别L1基因重组质粒,建立了人乳头瘤病毒L1基因分型国家参考品,并在此基础上建立了人乳头瘤病毒全基因组基因分型国家参考品。中国食品药品检定研究院构建的人乳头瘤病毒L1基因分型国家参考品和人乳头瘤病毒全基因组基因分型国家参考品,几乎涵盖了临床所能常见的HPV的型别,能评价绝大多数HPV基因分型试剂盒,为检测试剂盒评价和临床实验室质量评价提供了质控物质,具有十分重要的应用价值。

4. 行业标准的建立

根据人乳头瘤病毒核酸(分型)检测试剂(盒)的现状,中国食品药品检定研究院负责起草了《人乳头瘤病毒核酸(分型)检测试剂(盒)》的行业标准,该标准适用于采用实时PCR荧光法、PCR-反向杂交法、表面等离子谐振法、杂交捕获-化学发光法、酶切信号放大法、基因芯片法等技术方法的检测试剂盒。在技术指标的设定上需要进行检测限、特异性、准确性等指标的考核。在该标准中规定了如下主要技术要求:

a)准确性(阳性符合率)

检测试剂盒检测范围人乳头瘤病毒不同型别国家分型参考品或经标化的企业参考品,结果应均为阳性。

b)特异性(阴性符合率)

检测人乳头瘤病毒阴性的参考品,检测结果应均为阴性。检测人乳头瘤病毒不同型别国家分型参考品或经标化的企业参考品,检测结果应符合要求。

c)重复性(精密度)

检测试剂盒检测范围人乳头瘤病毒多个型别国家分型参考品或经标化的企业参考品,反应结果应一致、且均为阳性。

d)检测限

检测限应不高于104copies/反应。

通过参考品的建立和应用,以及行业标准的制定,可以较好地规范产品,提升产品质量,保障临床检测质量,更好地为临床服务,为患者服务,满足我们对试剂质量检测和考核的目标。

参考文献

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分型检测 第3篇

子宫颈筛查的目的在于尽量发现高级癌前病变,从而减少浸润癌。近年来,国内外妇科学专家均建议对30岁及以上妇女进行人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)检测及细胞学联合的子宫颈筛查[1]。2006年6月,我院引进了第二代杂交捕获技术(HCⅡ),对宫颈病变患者进行HPV DNA检测,收到良好的效果[2]。2008年11月,我院又引进了凯普HPV导流杂交分型检测技术,进一步探讨高危型HPV亚型的分布特点,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2006年6月~2008年6月接受HCⅡHPV DNA检测患者共2 153例,所有对象均有性生活史,年龄19~76岁,中位数36岁;以病理学诊断为标准,其中宫颈癌66例(宫颈鳞癌65例,宫颈腺癌1例)、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)238例(CINⅠ87例、CINⅡ65例、CINⅢ86例)、宫颈炎1 276例(轻度276例、中度634例、重度366例),另外以体检为目的无临床症状者332例,有妇科临床症状(宫颈湿疣95例、性交后出血或异常阴道出血62例等)241例。

2008年11月~2009年12月接受凯普HPV分型检测的宫颈上皮内瘤变患者342例,年龄19~66岁,中位数35岁;其中CINⅠ140例、CINⅡ127例、CINⅢ75例。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

HCⅡ基因杂交信号扩大仪(DML2000)及配套HPV DNA检测试剂盒、宫颈细胞采样器购自美国DIGENE公司;凯普导流杂交仪及配套试剂由凯普生物科技有限公司提供;ABI7000荧光定量PCR由中山达安基因有限公司提供。

1.2.2 标本采集

采用配套宫颈采样器插入患者阴道,于宫颈口顺时针旋转3~5圈,避免宫颈分泌物及血液污染,立即浸入含保护剂的专用试管,封盖后送至实验室4℃冰箱保存,2周内检测。

1.2.3 HPV DNA检测

采用第二代杂交捕获技术(HCⅡ)对患者宫颈脱落细胞HPV DNA载量进行检测,共检测16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68等13种高危型HPV。由实验技术人员严格按试剂盒说明书,经裂解-杂交-捕获-信号放大-分析实验步骤进行操作,在DML2000荧光检测仪上读取相对光学单位(RLU)。当RLU/阳性对照RLU>1.0时表示HPV DNA阳性。

1.2.4 HPV分型检测

按试剂说明书进行实验操作与结果判断。实验步骤如下:宫颈细胞HPV-DNA提取、PCR扩增、分子导流杂交、显色。可检测13种高危型HPV:16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68亚型;5种低危型HPV:6、11、42、43和44亚型。

1.3 统计学处理

所有数据应用SPSS10.0进行统计分析。计数资料用率表示,采用χ2检验或趋势χ2检验分析各组间差异,差异有显著性者再计算比值比(OR)。病毒载量采用百分位数计算方法,其结果用中位数(M)及四分位间距表示,检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 高危型HPV DNA阳性率

2 153例受检者中701例HPV DNA检测阳性,阳性率达32.6%。其中宫颈癌、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈炎患者阳性率分别达93.9%、30.2%、52.9%、80.2%和31.3%;其他妇科良性疾患:宫颈湿疣患者阳性率达51.6%,性交后出血或异常阴道出血患者达21.0%,体检无临床症状者阳性率达10.2%。见表1。

2.2 高危型HPV感染率年龄分布

2 153例接受宫颈筛查患者的各年龄阶段高危型HPV感染率见附图。75.0%的高危型HPV感染发生在30岁以上,且40~59岁是高危型HPV最高发的年龄阶段。

2.3 高危型HPV DNA病毒载量与宫颈癌、CIN病变程度的相关性

宫颈癌及CIN患者高危型HPV DNA病毒载量比较见表2。随着宫颈病变的严重程度增高,高危型HPV DNA病毒载量有上升趋势。

2.4 HPV亚型分布

342例宫颈上皮内瘤变经凯普导流杂交检测,共159例检测阳性,阳性率达46.5%,其中高危型HPV感染率为43.3%(148/342)主要的感染类型为16、52和58亚型,低危型HPV感染率为3.2%(11/342),主要的感染类型为11、6和42亚型;CINⅠ阳性率为30.0%(42/140),主要亚型为16、52和33亚型;CINⅡ阳性率为43.3%(55/127),主要亚型为16、58和18亚型;CINⅢ阳性率为68.0%(51/75),主要亚型为16、52和58亚型。

2.5 HPV多重感染

148例高危型HPV感染者多重感染率为23.0%(34/148);其中双重感染28例,占18.9%,三重及以上感染6例,占4.1%;CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ多重感染发生率分别为21.4%(9/42)、32.7%(18/55)和13.7%(7/51)。

3 讨论

子宫颈癌仍是威胁妇女生命健康的恶性肿瘤,占妇科生殖道恶性肿瘤第2位。研究显示,HPV感染是引发子宫颈癌的重要原因之一,高危型HPV持续感染可导致宫颈癌及CIN。因此,美国癌症联合会及美国妇产科联盟均建议对30岁及以上妇女进行HPV检测及细胞学联合的子宫颈筛查[1]。国内HPV检测方法多采用斑点印迹法、荧光原位杂交法、Southern杂交法、多聚酶链反应(PCR)法和近年来的杂交捕获法(HCⅡ)[3]、导流杂交基因分型技术[4]。

经一些前瞻性研究发现,HCⅡ技术是一种简便可靠的检测HPV DNA的方法,在子宫颈癌高危人群筛查中很有价值。本研究采用该技术对2 153例我院宫颈中心就诊的患者进行高危型HPV DNA检测,结果发现,宫颈癌及CIN患者高危型HPV感染率明显高于其他妇科良性疾患,并且宫颈癌患者的感染率高达93.9%,明显高于CIN患者。本研究66例宫颈癌患者中有4例高危型HPV DNA检测阴性,可能是由于目前已发现的高危型HPV有15种类别[5],而HCⅡ仅能检测其中的13种。目前认为HPV感染的高危因素有性行为、年龄和吸烟等。HPV感染好发于18~30岁女性,但大多为一过性的感染。若高危型HPV感染持续存在,则发生宫颈癌与CIN的风险将大大提高。本研究发现,随着年龄的增长,高危型HPV感染率有上升趋势,40~59岁是高危型HPV最高发的年龄阶段,这与MIN[6]在广东省的调查研究结果一致。因此,对40岁以上妇女进行宫颈病变筛查更有意义。

近年来,国内外一些文献发现高危型HPV DNA病毒载量与宫颈癌、CIN病变程度密切相关,但高危型HPV DNA病毒载量是否可作为预测宫颈疾病程度的指标,尚无定论。本次研究发现,随着宫颈病变的严重程度增高,高危型HPV DNA病毒载量有上升趋势,但与文献比较[7],其病毒载量差异较大,其原因可能是:(1)HCⅡ是通过样本RLU与阳性对照RLU比较得出高危型HPV DNA的相对含量,并非真正意义上的定量检测,其结果仅能作为参考;(2)HCⅡ检测结果受到样本中宫颈脱落细胞数量的影响,宫颈采样如何实现标准化是尚待解决的问题;(3)组织细胞缺氧造成的坏死有可能引起高危型HPV DNA的丢失。

本研究发现,在常州地区CIN患者感染高危型HPV的主要类型为16、52和58亚型,低危型主要为11、6和42亚型,这与国内的研究结果基本相符[6,7,8,9]。江敬红[9]的研究报告提示,HPV52和58虽然在中国地区CIN患者的检出率很高,但在发展为宫颈癌的过程中自然清除的速度也较快,在宫颈癌患者的感染率有所下降。因此,HPV16仍然是最应关注的高危亚型。同时,本研究发现,在CINⅠ~CINⅢ的发展过程中,阳性率逐步增高,HPV感染亚型有一些变化,特别是HPV58感染率有上升趋势。关于CIN演变过程中HPV不同感染亚型的变化以及这些变化的临床意义值得进一步的大样本验证。在CIN的人群中,大约有23.0%的患者存在多重感染,以双重感染最为常见,但在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ中并未发现多重感染发生率有明显的增高趋势,这与江敬红[9]的结果有些出入。笔者认为宫颈病变HPV多重感染需要更多的实验数据分析,高危型多重感染是否意味着更高的癌变风险也值得进一步的研究。

摘要：目的 探讨宫颈癌前病变患者进行人乳头状瘤病毒(HPV)DNA检测及基因分型的意义。方法 采集2153例宫颈中心就诊患者的宫颈脱落细胞,采用杂交捕获技术对HPV DNA进行检测。采用凯普导流杂交HPV分型技术检测342例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的HPV亚型。结果 ①2153例受检者中701例HPVDNA检测阳性,阳性率达32.6%;其中以宫颈癌患者感染率最高,达93.9%,其次为宫颈上皮内瘤变,达54.6%。②高危型HPV感染好发于30岁以上,40～59岁是高危型HPV最高发的年龄阶段。③随着宫颈病变的严重程度,高危型HPV DNA病毒载量有上升趋势。④宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV主要的感染类型为16、52和58亚型,低危型主要为11、6和42亚型。⑤CINⅠ主要感染亚型为16、52和33亚型,CINⅡ主要亚型为16、58和18亚型,CINⅢ主要亚型为16、52和58亚型。⑥高危型HPV感染者多重感染率为23.0%,其中双重感染18.9%,三重及以上感染4.1%。CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ多重感染发生率未发现明显增高趋势。结论 高危型HPV DNA检测用于宫颈癌前病变筛查极有价值。HPV16仍然是最应关注的高危亚型。

关键词：人乳头状瘤病毒,DNA病毒,第二代杂交捕获实验,基因分型,宫颈肿瘤,宫颈上皮内瘤变

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分型检测 第4篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年12月~2013年12月潮州地区的2200例妇女作为研究对象, 年龄25~67岁, 平均年龄 (35.6±5.3) 岁。其中已婚1988例, 未婚212例。健康及伴有慢性炎性疾病者1849例, CINⅠ级251例, CINⅡ级50例, CINⅢ级37例, 宫颈癌13例。所有被调查者均排除宫颈病变、宫颈切除、怀孕以及有宫颈病史等。所有被调查者均自愿签署知情同意书。

1.2 方法

TCT检测方法:先以特制的宫颈癌细胞采样器采集宫颈细胞, 之后将采样器置于装有细胞保存液的小瓶中漂洗, 再采用乙醇固定和巴氏染色的方法进行处理, 同时以Thin Prep 2000 System全自动液基薄层细胞学检测仪进行滤过和样本分散等处理。最后由资深医师阅片。HPV基因分型检测方法:先以特制宫颈刷刷取宫颈标本, 将其置于生理盐水中进行洗脱处理, 之后进行离心处理, 并且将得到的标本采取PCR扩增法检测, 最终对结果进行判读。

1.3 观察指标

观察TCT和HPV基因分型检测的特异性、敏感性、阴阳性预测值的情况, 并且分析HPV检测中10种分型与宫颈癌的相关性。

1.4 统计学方法

使用SPSS17.0统计软件分析所得数据。计数资料行χ2检验;将HPV各个分型与宫颈癌的相关性进行Logistic回归性分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法的特异性、敏感性、阴阳性预测值情况的比较

HPV法检测的特异性、敏感性、阴阳性预测值均明显高于TCT法检测, 两者之间的差异具有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。

2.2 各种基因型与宫颈癌的相关性分析

在Logistic回归性分析后, HPV16、18、31、33、52、53以及58分型与宫颈癌有密切相关性 (P<0.05) 。详见表2。

注:两种检测方法比较, P<0.05

注:HPV16、18、31、33、52、53、58分型与宫颈癌具有紧密的相关性

3 讨论

随着我国宫颈癌的发病率不断增高, 宫颈癌的筛查工作也在不断深入, 妇女对于宫颈癌的重视程度也逐渐加强。近年来在临床工作中对于宫颈癌的筛查不断提高了重视程度, 早期防治宫颈癌的前提是有效筛查宫颈癌[3]。对于宫颈癌的筛查, 检测方法多种多样, 选择合适的检测方法成为宫颈癌筛查工作者的热点讨论问题。过往采取TCT以及巴氏涂片的方法比较普遍, 但是其筛查效果并不是很理想, 近年来随着医学研究技术的不断提高, 筛查效果也得到很大的改进[4]。在本次研究中分别采用TCT和HPV进行检测, 结果发现HPV检查法的特异性、敏感性、阴阳性预测值均明显高于TCT法检测, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。可见HPV检查法是筛查早期宫颈癌的有效方法。结果显示HPV16、18、31、33、52、53以及58分型与宫颈癌有密切相关性, 这也肯定了HPV检测方法的应用价值。

综上所述, 在宫颈癌的筛查方法中采取HPV基因分型检测法具有比较好的运用效果, 能够有效显示与宫颈癌具有紧密相关性的基因分型, 值得推广运用。

参考文献

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分型检测 第5篇

1 材料与方法

1.1 材料

收集中南大学湘雅医院妇科活检宫颈组织CIN1~CIN 3级石蜡标本100例。Eppendorf PCR仪, 凯普医用核酸分子快速杂交仪, eppendorf离心机, 上海-恒科电热恒温水槽。DNA提取试剂盒购自上海源奇公司, HPV DNA分型检测试剂盒购自潮州凯普公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

(1) 石蜡标本脱蜡; (2) 组织DNA抽提。

1.2.2 DNA扩增

在洁净离心管中按比例混合PCRmix、Tap酶, 混匀, 短暂离心, 按24μL/管分装到PCR管, 将临床样本DNA (1μL) 按相应顺序加入到各PCR管, 标记各管, 混匀, 短暂离心。各管放入PCR仪, 按程序扩增。PCR程序:95℃9 min, (95℃20 s, 55℃30 s, 72℃30 s) ×40个循环, 72℃5 min, 4~16℃Incubation。

1.2.3 变性

将PCR产物入PCR仪95℃变性5min, 迅速放入冰水中冰浴2 min。

1.2.4 杂交

按试剂盒步骤进行操作。

2 结果判断

检测结果显示75例有不同型别的HPV感染, 25例未检测出HPV感染。根据临床表现和HE切片判断其中20例可能是假阴性。针对20例未检出HPV感染的病例, 通过分析原因, 采取了以下一些措施:石蜡标本彻底脱蜡, 选取正确的组织, 增加组织量, 彻底清洗, 重新检测, 有17例检出HPV感染。见图1和2。

3 讨论

石蜡标本HPV基因分型检测技术是将石蜡标本经过脱蜡, DNA裂解、提取、扩增后采用导流杂交技术的原理, 在已固定好的核酸探针的低密度基因芯片膜上一次性快速检测21种HPV亚型的基因分型。由于此项技术经过了从脱蜡、DNA提取、扩增、变性杂交五个环节, 这五个环节中任意一个环节操作不谨慎都容易导致检测结果呈假阴性, 根据分析, 造成假阴性结果的原因有以下几方面: (1) DNA可能被污染, 抑制了被检测标本的显示。DNA污染的原因有:取材时的污染, 切片脱蜡时的污染, EP管、加样枪吸头的污染, 实验室未按常规设计和消毒导致DNA的空气污染等; (2) DNA提取的量可能不够。首先要检查蜡块组织的大小是否达到检测标准, 特别是CIN的标本, 应对照HE切片, 检查病变组织是否达到了检测的标准, 切片时蜡片的数量和厚度也要达到要求, 尽量削去非肿瘤组织特别是坏死组织; (3) 仪器设备使用不当。如:加样枪加样剂量不准确, 离心机转速未达标, PCR仪、杂交仪不会使用, 温度计、水浴锅设温不准确等。应定期校正这些仪器; (4) 在操作过程中, 温度、时间掌握不当。如DNA裂解、变性、杂交、封阻、酶标和显色的时间和温度, 特别是PCR产物变性后要放在0℃的冰水中 (即冰和水的混合物) 冷却的时间和温度; (5) 清洗不彻底。每次清洗时应待液体排尽后再进行下一次清洗; (6) 试剂过期, 或试剂在运输和贮存过程中保存不当, 或试剂本身有问题。试剂不能反复冻溶, 购买后应及时分装。尽量使用通过国家SFDA相关认证的试剂; (7) 固定未及时或大标本未切开, 固定剂渗透不到组织内部, 未使用10%中性福尔马林固定。若使用10%普通福尔马林固定标本, 由于此液呈酸性, 导致DNA被破坏, 所以标本离体后应采用10%中性福尔马林及时固定, 大标本应每隔1~2 cm切开, 固定时间6~48 h。再则, 不要使用微波和超声波处理的组织, 因为这两种波都可能对DNA有破坏作用; (8) 组织脱蜡不彻底, 脱蜡后未按要求烘干组织, 影响了裂解液、蛋白酶K的裂解效果。

参考文献

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分型检测 第6篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

女性外阴尖锐湿疣患者60例, 年龄在18~56岁, 平均 (32.45±5.24) 岁。检测结果为阳性的30例作为感染组, 其余30例呈阴性的作为对照组, 两组差异具有统计学意义, 有可比性。

1.2 治疗方法

(1) 标本:用于送检的标本是用消毒后的无菌棉擦拭子宫劲糜烂处, 或者直接插入宫颈口以下1~3 cm处多次摩擦然后取出待用。 (2) 检测方法:运用反向斑点杂交法, 在一定的温度下, 将膜条上不同的位置, 与不同的靶序列精确对比的特种寡核苷酸探针与PCR产物杂交, 然后洗摸、显色, 检测基因。

1.3 统计学方法

收集所有的临床数据, 采用SPSS统计软件对患者数据进行综合分析, 计量的资料用 (±s) 表示。统计时对技术资料进行χ2检验。

2 结果

2.1 各型HPV检测结果

在60例患者中, 阳性宫颈HPV30例, HPV 6型的有14例, HPV 11型为8例, 各型的比例见表1。

2.2 各分型的比例

在各种分型中, 单一低危型的患者最多, 30例中有18例是阳性的, 单一的高危型最少, 有5例为阳性, 结果见表2。

注:χ2检验结果, P<0.05, 差异具有统计学意义

3 讨论

尖锐湿疣患者感染HPV时主要位置是黏膜及皮肤的表面, 这种感染会导致鳞状的上皮增殖, 导致损伤。临床上的处理多数是采用局部用药、手术切除为主要手段[5]。从检测结果可看出, 60例外阴尖锐湿疣患者感染宫颈HPV的有30例, 多数为亚临床感染, 疣体并未生长, 用肉眼几乎观察不到, 这就会使感染被忽略, 直接导致了病情的恶化, 因此, 对外阴尖锐湿疣患者的宫颈HPV检测具有重要意义。

当前HPV有200多种临床亚型, 分为低危型和高危型, 低危型有HPV6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, CP6108, 高危型有HPV16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82, CP6108。40岁以上的年两较大的女性较多发高危型HPV感染, 自然缓解会比较难, 这种感染与中、重度的宫颈癌及上皮的内瘤变有很大关联;而低危型的感染多发于性行为混乱的年轻女性群体, 较易自然缓解, 是导致慢性宫颈炎或轻度的宫颈上皮的内瘤变的主要原因。根据近年来的研究, 高危型患者出现年轻化趋势[6], 应该注重对这些患者的跟踪随访, 做好预防措施, 减少复发。宫颈HPV多数都是HPV6型, 此类发生癌变的可能性较低, 但仍需要定期的检查, 一排除其他病菌的感染, 如淋球菌、人型支原体、衣原体、解脲支原体等。尖锐湿疣感染其他的性病时, 容易导致疣体增殖, 形成大型的尖锐湿疣, 使治疗难度加大, 增加了癌变的几率。早期的诊断指标近年来主要有FQ-PCR, 其灵敏、迅速、简易, 是一种有效的HPV检测方法[7]。

宫颈尖锐湿疣流行很广, 是仅次于淋病的性传播疾病, 严重危害人类的健康。目前还没有有效应用于临床的HPV疫苗, 所以应保护好自身, 控制混乱的性行为, 有异常时及时治疗, 伴侣的HPV感染也要同时进行筛选, 以减少继发的感染。

摘要：目的 探究外阴尖锐湿疣患者的宫颈HPV的DNA分型的分布情况及结果分析。方法对60例患者运用反向斑点杂交法进行其宫颈HPV的DNA分型的检测。结果 60例患者中, 阳性的宫颈HPV 30例, HPV6型发病率最高, 14例, 占总病患数的23.33%, 占阳性的46.67%。宫颈HPV最多的为单一低危型, 30例中有19例, 而单一的高危型例数最少, 30例中有5例。结论 宫颈尖锐湿疣与外阴尖锐湿疣 (VCA) 患者宫颈HPV的DNA分型密切相关, 并且紧密影响其发展、癌变, 所以定期的筛选, 检查尖锐湿疣患者的宫颈HPV的DNA分型至关重要。

关键词：宫颈HPV,尖锐湿疣,DNA分型

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分型检测 第7篇

1 资料与方法

1.1 临床资料:

选择我院妇科门诊与2014年1月至2015年7月期间在宫颈癌筛查中自愿接受HPV检测且结果阳性的210妇女为观察病例, 其中年龄最小为26岁, 最大59岁, 平均年龄 (42.58±3.49) 岁。病例纳入和排除标准: (1) 高危型HPV感染阳性; (2) 自愿接受病理活检检查; (3) 纳囊白斑、血 (+) 等宫颈疾病症状显著; (4) 排除妊娠期、合并精神疾患等者; (5) 对知情实验内容, 自愿参与。本研究内容经由我院伦理委员会审核通过, 伦理委员会监督实验全程。

1.2 检查方法

1.2.1 高危型HPV检测:

患者取膀胱截石位, 阴道窥器完全暴露孔径后应用宫颈脱落细胞专业取样器 (上海之江生物公司) , 将宫颈刷放置在宫颈口5 s左右, 缓慢的顺时针旋转6圈以获取宫颈脱落细胞样本, 取出、放入到取样器中, 放置在4℃冰箱中, 24 h内检测。实验中为了保证检测的安全性和灵敏度、避免污染, 采取闭管检测, 检测步骤严格依据试剂盒说明书操作, 本实验中应用的HPV特异性引物包括13种亚型, 检测步骤主要为提取DNA、制作PCR反应模板、PCR片段扩增、应用Slan96型PCR荧光检测仪进行实时荧光定量检测以及判断计算检测结果。

1.2.2 病理活检:

阴道镜下获取活检组织, 经过固定、切片以及染色等处理后, 由两位专业病理医师采用双盲法阅片。

1.3 观察指标:

由于HPV负荷量取决于单位体积样本中的DNA总量和DNA浓度 (即单位体积样本数) , 因此, 临床研究中普遍应用ct值反映HPV负荷程度。参照文献[2]依据ct水平进行高危性HPV载量的定性评价, 具体标准如下: (1) “+”:ct≥30; (2) “++”:24≤ct<30; (3) “+++”:ct值<24。

1.4 统计学处理:

采用统计学软件SPSS16.0处理实验相关数据, 计数数据分析应用χ2检验, Spearman分析HPV与宫颈疾病的相关性, P<0.05, 差异具有显著性。

2 结果

本实验中, 经过病理检查证实210例患者中宫颈炎135例, CINⅠ和CINⅡ共49例, CINⅢ和宫颈癌16例。高危型HPV分析检测显示, 宫颈疾病中感染率最高的HPV亚型为52亚型, 共感染51例, 感染率为24.29%, 其次为58亚型, 共感染32例, 感染率为15.24%。宫颈炎中多重感染19例, 感染率为14.07%, CINⅠ~Ⅱ多重感染14例, 感染率为28.57%, CINⅢ~癌多重感染7例, 感染率为43.75%, 三种疾病多重感染率比较, P<0.05, 差异具有显著性。应用Spearman分析法对于高危型HPV病毒载量和宫颈病变严重程度、多重感染之间进行分析, 结果显示相关系数为0.225, χ2值为29.754, P<0.01, 具有显著性关联。

3 讨论

HPV感染作为宫颈癌最为直接、明确的病因, 防治HPV感染一直是预防宫颈癌的关键性举措。高危型HPV感染被认为是宫颈癌发生的必备条件之一, 因此早期检测高危型HPV、尽早给予有效干预具有十分重要的意义[3,4,5]。HPV作为双股DNA病毒之一, 能够降低机体免疫功能以提高感染HPV的风险。在人体中HPV具有诸多亚型, 目前常见的主要有13种高危亚型, 由于不同亚型基因具有较大差异, 因此不同HPV亚型间几乎不存在交叉性保护抗体, 因此, 高危型HPV极易出现多重感染, 导致治疗难度增高。不同的宫颈疾病均有可能存在高危型HPV感染, 关于HPV感染亚型以及多重感染对于宫颈疾病的影响一直是临床关注的焦点, 有研究认为[2]高危型HPV多重感染是导致宫颈疾病恶化、癌变的重要原因。本实验结果显示宫颈疾病高危型HPV感染以52亚型感染最常见, 且多为单一亚型感染, 但是随着疾病恶化, 多重感染率显著升高, 相关性分析证实高危型HPV感染与病变程度、多重感染呈正相关, 说明疾病越重, 高危型HPV病毒载量越高, 因此, 我们认为高危型HPV分型检测对于宫颈疾病诊断、评估疾病发展趋势具有重要意义, 建议临床加以重视。

摘要：目的 探讨高危型人类乳头状瘤病毒 (Human papilloma virus, HPV) 分型检测在宫颈疾病诊治中的应用价值。方法 选择我院妇科门诊进行宫颈癌筛查的患者中, 高危型HPV分型检测阳性得210例患者为观察对象, 以活检组织病理检查结果作金标准, 分析高危型HPV分析与宫颈疾病治疗的关联。结果 宫颈疾病主要为HPV52亚型感染, 宫颈疾病主要为HPV单一感染, 但是疾病越重, 多重感染出现概率越高 (P<0.05) ;Spearman分析证实高危型HPV病毒载量与宫颈病变程度、多重感染具有显著正相关性 (P<0.01) 。结论 检测高危型HPV感染对于发现宫颈癌前病变、筛查宫颈癌具有意义, 值得临床重视。

关键词：HPV分型,高危型,宫颈疾病

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