病毒载体范文

病毒载体范文（精选10篇）

病毒载体 第1篇

1 慢病毒载体

1.1 发展背景

大多逆转录病毒只能感染分裂期的细胞, 容纳外源基因的DNA片段长度不超过8 kb;腺病毒载体在感染细胞时病毒DNA只在细胞核内游离, 不整合到染色体上, 在体内也不能长期稳定表达, 且反复使用容易引起免疫反应。这些非慢病毒的逆转录病毒载体对不分裂的静止细胞不感染, 或出现表达沉默等缺陷, 难以克服, 所以应用范围较局限。慢病毒载体可以感染非分裂期细胞, 克服了上述缺陷。而且慢病毒载体可以容纳较大片段的目的基因, 在体内可以长期表达, 免疫反应小, 安全性好。随着对慢病毒载体的深入研究, 慢病毒载体不仅在基因治疗方面显示出优越特性, 而且在转基因动物制备方面也显示出了优势。

1.2 发展过程

早期慢病毒载体主要来源于HIV-1, 之后出现了非灵长类慢病毒载体系统, 随后又出现了各种有蹄类动物的慢病毒, 但是非灵长类慢病毒载体是否能用于人类的基因治疗, 其安全性如何, 亲代病毒是否能在人体完成复制或引起人类疾病等问题还需进一步研究和证实。目前对来源于HIV-1的慢病毒载体研究最深入, 对其生物学特性最了解。它的发展过程主要经历了4个发展阶段:第一代为复制缺陷型载体, 只能获得较低的滴度, 存在产生野生HIV的严重危险;第二代载体系统采用Trono课题组构建的3种质粒表达系统, 他将慢病毒载体分为包装质粒、包膜质粒和载体质粒, 使其共同重叠序列最小化, 降低了产生有复制能力的病毒, 获得了较高滴度的慢病毒载体, 提高了安全性;第三代载体系统是以自身失活的慢病毒载体为代表, 删除了HIV-1基因组的增强子以及转录因子结合部位, 使病毒RNA不能转录, 因此该系统更加安全;第四代载体又称可调控性慢病毒载体, 此代载体系统把可诱导性基因插入慢病毒载体中, 人为的控制基因表达, 保留了自身失活的特性。

1.3 慢病毒载体的构建

由于野生型的慢病毒对人类及其他动物有毒害作用, 所以慢病毒载体的构建首先要考虑的是病毒载体的安全性。构建慢病毒载体要尽可能的去除反式功能基因序列, 以外源基因代替, 保留病毒本身的末端重复序列以及病毒的包装信号。以HIV-1慢病毒载体系统为例, 构建HIV-1慢病毒载体就要将HIV-1基因组中的顺式作用元件包括包装信号、长末端重复序列与编码反式作用蛋白的序列分离。载体系统包括包装部分和载体部分, 载体部分已经缺少形成完整病毒所需的蛋白基因, 不能依靠自身基因形成完整的病毒颗粒;而包装部分是去除了包装, 由逆转录和整合所需的顺式作用序列HIV-1基因组构建, 能反式提供产生病毒颗粒的蛋白, 载体部分和包装部分互补, 只含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列, 同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及此位点插入的目的基因[2]。这样形成的HIV-1慢病毒载体系统重组的病毒颗粒, 只能去感染并整合宿主细胞, 但不能在宿主细胞中产生子代病毒, 增强了安全性。

2 慢病毒载体的应用

2.1 基因治疗

2.1.1 治疗HIV感染

随着艾滋病患者在全球范围内的激增, 尽快研究出治疗艾滋病的方法成了摆在面前最重要的问题。HIV感染需要持续性的治疗来抑制病毒的复制。研究证明, 目前使用的抗逆转录病毒药物能够有效延长从病毒感染到艾滋病症状出现的时间[3]。但其固有的缺陷是艾滋病患者易对其产生抗药性。这迫使许多研究者把目光从对艾滋病化学药物的研究转移到HIV的基因治疗上。将抗Rev的siRNA基因转入CD34+造血干细胞中, 在SCID-hu小鼠体内分化为巨噬细胞;然后用HIV-1去感染这些巨噬细胞和T细胞, 这些细胞都表现出了明显的抗HIV-1的特性[4]。

慢病毒载体在对HIV-1感染治疗中有许多优势。第一, 一些来自HIV-1和HIV-2的慢病毒载体可与病毒RNA竞争包装和竞争使用用于病毒复制的病毒蛋白, 抑制其复制, 从而控制了HIV的感染。第二, 慢病毒载体可以稳定转染分裂细胞及非分裂细胞, 特别是那些与HIV-1复制和免疫恢复有关的细胞 (树突状细胞, T细胞) 。第三, 慢病毒载体可以设计成表达具有治疗性抗HIV-1的基因, 特异的对病毒复制的各个阶段进行控制。此外, RNAi技术与慢病毒载体结合成为抗病毒感染基因治疗的研究热点, 并且已用于对HIV感染治疗之中。利用RNAi技术不仅可以在HIV-1感染早期减少病毒颗粒的大量复制及装配, 还可以抑制与HIV-1病毒结合的DC特异性IGN受体 (DC-SIGN) 的表达, 并降低了DC-SIGN与病毒的结合能力, 起到抗感染的作用。

2.1.2 治疗肿瘤

长期以来对肿瘤的治疗一直是以手术、放疗、药物为主, 肿瘤基因治疗是继这些传统治疗方式之后出现的一种全新的治疗方式。慢病毒载体可以将治疗肿瘤基因安全有效的植入人体内, 使其长期有效表达。Simming等[6]在鼻咽癌的研究中, 用慢病毒载体携带在人类多种恶性肿瘤中高表达的ABCC2 (一种ATP结合盒多药耐药转录蛋白) 的shRNA, 转染化学依赖性抗顺铂的鼻咽癌细胞系CNE2细胞, 使得CNE2细胞对顺铂的敏感性提高。在Kock等[7]对神经胶质瘤的研究中, 证明了慢病毒载体的应用加速了神经胶质瘤细胞的凋亡。因此, 慢病毒载体的应用提高了肿瘤细胞对传统化疗药物的敏感性。

RNAi技术也在肿瘤基因治疗中得到应用, 癌症的发生主要是由于原癌基因的突变和异常激活, 慢病毒能在各类细胞中实现针对原癌基因的RNAi特异性降低其表达, 从而抑制癌变细胞增生;能够高效的传递肿瘤相关基因的shRNA, 在转录后沉默, 使目的基因的表达受到抑制, 减少其在肿瘤发展和肿瘤侵袭中的促进作用, 从而起到治疗的作用。

2.1.3 治疗血液系统疾病

慢病毒载体不仅能感染造血干细胞 (HSCs) , 使携带的目的基因整合至HSCs基因组中, 且能利用病毒携带的调控元件, 使目的基因随着HSCs细胞特异性表达。有人研究用小鼠模拟人α-地中海贫血的模型, 用于慢病毒载体介导治疗基因[7]。用于试验的载体来源于TNS9 vector, 这一载体已表现出了良好的转移治疗用的人类β-globin进入小鼠造血干细胞的能力[8], 但是转移进去的基因在表达过程中出现了衰减现象[9], 原因有待研究。但在对β-地中海贫血的治疗中, 慢病毒载体介导的β-globin基因进入小鼠的造血干细胞却取得了不错的效果[10]。

2.1.4 治疗移植排斥反应

近几年来器官移植已经广泛的用于治疗严重的脏器衰竭中, 但是怎样减轻器官移植后出现的移植排斥反应和移植物抗宿主病 (graft-versus-host disease, GVHD) 成为最急需解决的问题。T淋巴细胞的激活、分化和增殖在移植免疫应答中起着关键作用。对T淋巴细胞进行基因改造以减轻排斥及GVHD是移植领域的重要方向之一[11]。李振宇等[2]通过构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒三质粒系统, 观察其在小鼠淋巴细胞中的表达情况, 结果发现慢病毒载体对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率, 能够快速稳定地将外源基因转移至T细胞。

2.2 应用于转基因动物

慢病毒载体从1996年发展起来后一直用于细胞转染和基因治疗的研究, 直到2002年Lois等把这一技术用于转基因大鼠和小鼠的制备。Hamra等用LV-EGFP转染体外培养的精原细胞, 然后把整合有LV-EGFP的精原细胞移植到用化学物杀死精原细胞的野生型大鼠的睾丸中, 移植后60 d, 与其年龄相当的雌性大鼠交配, 获得44只子代大鼠, 其中26只来自移植精子干克隆, 13只携带慢病毒转基因, 大约30 %转基因阳性。说明LV可以整合到精原细胞DNA上, 经自然交配制备转基因动物。利用慢病毒载体转染卵细胞或早期晶胚建立疾病动物模型或表达目的基因生产人类蛋白, 已成为当前生命科学领域的一个研究热点[12]。慢病毒载体基因转移的另一个重要发展方向是与RNAi技术相结合, 建立动物模型[13]。自1985年第一个转基因家畜的报道出现后, 目前转基因动物的生产已经涉及到多种物种, 如鸡[14]、猪[15]、小鼠[16]和牛等, 并都有成功报道。

3 问题及展望

病毒载体 第2篇

RNA干扰技术已广泛应用于沉默基因表达的研究.本文分析烟草花叶病毒(TMV)基因序列,选择设计编码小分子发卡结构RNA(hpRNA)的.cDNA;并根据农杆菌双元载体质粒p2355多克隆位点区限制性酶切位点,两端分别加入XbaI和BamHI酶切位点;分别合成单链DNA复性后插入到p2355上,经PCR、测序验证,表明已成功构建了具有潜在表达烟草花叶病毒siRNA的植物表达载体.图3表1参26

作 者：马欣荣 谈心 刘华玲 张义正 MA Xinrong TAN Xin LIU Hualing ZHANG Yizheng 作者单位：马欣荣,MA Xinrong(四川大学生命科学学院,成都,610064;中国科学院成都生物研究所,成都,610041)

谈心,刘华玲,TAN Xin,LIU Hualing(中国科学院成都生物研究所,成都,610041)

张义正,ZHANG Yizheng(四川大学生命科学学院,成都,610064)

病毒载体 第3篇

摘要： 运用pADxsi系统制备可表达人PDX1与PAX4双基因的重组5型腺病毒。从pEGFP-N1-PDX1质粒上酶切下目的基因PDX1并酶连到腺病毒穿梭质粒pShuttle-EGFP-CMV上，替换EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1；再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上酶切下连到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位点而得到穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4；双酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4将CMV-PDX1/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架质粒上，得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒质粒，然后在293细胞中进行包装并扩增重组腺病毒，并进行病毒滴度测定；体外感染人间充质干细胞。依据酶切、测序和PCR的结果均证明重组人PDX1与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确；而RT-PCR与WB结果也显示目的基因在细胞中稳定表达。应用重组技术成功构建人PDX1与PAX4双基因表达5型腺病毒载体，转录因子PDX1与PAX4在间充质干细胞内稳定表达且定位于细胞核内。

关键词： 5型腺病毒；间充质干细胞（MSCs）；胰腺十二指肠同源框蛋白1（PDX1）；成对盒基因4（PAX4）；转录因子

中图分类号：Q78文献标志码：A

文章编号：1672-1098（2016）02-0080-07

Abstract：With the use of pADxsi system， the recombinant adenovirus of expressing PDX1 and PAX4 is in place.GFP in the pShuttle-GFP-CMV vector is replaced with the target gene of PDX1 obtained from the pEGFP-N1-PDX1 plasmid， resulting in the pShuttleCMV-PDX1 plasmid. With the pEGFP-N1-PAX4 plasmid cut off， PAX4 is inserted into pShuttle-CMV-PDX1 to acquire the pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4 plasmid. Afterwards， the CMV-PDX1/CMV-PAX4 fragment is transferred to the ADxsi skeleton vector to get the pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 virus vector. Finally， the recombinant adenovirus is packaged， amplificated， and titrated in HEK293 cells for the infection of human umbilical cord mesenchymal stem cells. The structure of pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 adenovirus expression vector is confirmed by means of a restriction analysis and PCR. RT-PCR and Western blot results have established that the target genes are persistently expressed in the infected cells.The recombinant human PDX1 and PAX4 expressing adenovirus is successfully constructed， packaged， and amplificated.The target genes can be continuously presented in mesenchymal stem cells.

Key words：adenovims vector；pancreatic and duodenal homeobox factor 1；paired box gene 4；mesenchymal stem cells

糖尿病是由于胰岛β细胞功能绝对或相对缺陷，以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病[1-2]。长期血糖增高，可导致大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，每年因糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10%是肾病变所致；因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍[3-4]。因此，预防糖尿病的并发症并最终控制血糖是重要的社会问题。

至目前为止，控制患者血糖仍主要是依赖每天胰岛素的补充，给患者生活带来极大的不便与沉重的经济负担。寻找具有合成与分泌胰岛素的细胞进行细胞替代治疗一直是研究的热点。近年来研究证实间充质干细胞具有多向分化的潜能且无免疫原性，是一类极具应用潜能的干细胞[4-5]。胰十二指肠同源框基因1 （pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX 1）在胚胎发育过程中具有促进胚胎干细胞向胰腺的早期发育和晚期胰岛素分泌细胞分化的功能[6]；此外，还具有维持胰岛β细胞合成与分泌胰岛素的功能[7-8]；然而，单独的PDX1转录因子并不能有效诱导干细胞定向向胰岛β细胞分化，在胰腺前体分化与发育过程中，成对盒基因4（paired box gene 4，PAX4）表达将有利于胰腺前体细胞定向向β细胞分化，并参与调控β细胞功能的成熟[8-10]。因此，PDX1与PAX4联合作用对诱导MSCs定向向具有合成与分泌胰岛素功能的β样细胞可能具有促进作用，基于这一假设，在本研究中，选用对MSCs具有较高感染效率的Ⅴ型腺病毒载体，构建携带目的基因PDX1与PAX4的重组腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4，感染MSCs细胞，以观测所携带的目的基因表达情况，为进一步研究PDX1与PAX4在诱导MSCs向具有合成与分泌胰岛素功能的β样细胞分化的可能及其分子机制奠定实验基础。

1材料和方法

1.1材料与试剂

Bgl II等多种限制性内切酶、Klenow及T4 DNAligase均购自美国Sigma 公司；CIP（Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal）酶、质粒提取纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒购自北京天恩泽公司；腺病毒pADxsi载体系统由上海汉恒生物有限公司提供；293细胞及DH5a菌株由深圳清华研究院郑义博士惠赠，pEGFP-N1-PAX4与pEGFP-N1-PDX1质粒为前期本实验室所构建。Anti-PAX4 antibody （ab42450）/IgG、Anti-PDX1 antibody （ab47383）/IgG购自美国Abcam公司，HRP标羊抗鼠IgG、HRP标羊抗兔IgG、FITC标羊抗兔IgG、CY5标羊抗鼠IgG购自eBioscience公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；RT-PCR试剂盒为北京天恩泽公司； DMEM/F12培养基购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone公司。原代人脐带间充质干细胞购自北京医科利昊生物科技有限公司。

1.2方法

1） pADxsi-CMV- PDX1/CMV- PAX4腺病毒载体的构建。 首先构建pShuttle-GFP-CMV- PDX1穿梭质粒：已知PDX1序列上游有Nhe I和Bgl II酶切位点，下游有Sal I和EcoR I酶切位点，首先用Sal I酶切pEGFP-N1- PDX1，再用Klenow平端处理，最后用Nhe I酶切，回收0.66 kb片段；其次用Nhe I和Pme I双酶切pShuttle-GFP-CMV载体，替换GFP， CIP去磷酸化处理，回收载体片段5.2 kb；最后，酶连切好的载体片段和插入片段，获得pShuttle-CMV-PDX1。再构建pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭质粒载体：从pEGFP-N1-PAX4上用BamH I和Sal I双酶切切下PAX4（PAX4序列上游存在BamH I和Bgl II酶切位点，下游存在Xba I和Sal I酶切位点）；同时对pShuttle-CMV- PDX1载体用BamH I和 Sal I双酶切，CIP去磷酸化处理，胶分别回收与纯化载体与酶切PAX4目的基因片段并用T4 DNA 连接酶酶连得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭质粒。最后用T4 DNA 连接酶酶连目的片段pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4和pADxsi骨架质粒；转化产物并转染DHSa，扩增pADxsi -CMV-PDX1/CMV- PAX4质粒，对质粒产物进行提取并进行电泳签定，产物由上海丰恒生物科技有限公司进行测序鉴定。

2） 重组腺病毒的包装、扩增和滴度测定。 Pac I酶切线性化重组腺病毒质粒，用Lipofectamine 2000脂质体转染细胞密度约80%的293细胞。3～5 d后，开始出现明显噬斑，待大部分细胞病变（cyto-pathic effect，CPE）时，收集细胞混悬液，于-80℃/25℃反复冻融3次，再离心收集上清，继续感染293细胞扩增病毒以提高腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4）滴度，TCID 50法测定病毒滴度。

3） ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs与目的基因表达。 于六孔板接种MSCs细胞5.0×105/孔，细胞密度达80%时，按感染指数为10PFU/细胞、50PFU/细胞、100PFU/细胞加入相应量的腺病毒液；同时设ADxsi-CMV-GFP感染的空病毒对照组。当实验进行到相应阶段时，即培养到24h、48h和72h等阶段分别收集细胞行WB、免疫细胞化学与间接荧光检测；同时RT-PCR检测目的基因表达，引物分别如下PDX1 的F：5′-AAGCTAGCCCGCAGCCATGA-3′、R：5′-TCCTCGAGTCATCGTGGTTCCTG-3′，Tm为61.5℃，扩增目的片段为882bp；PAX4：F：5′-TCCCAGTGTCTCCTCCATC-3′、R：5′-ACCTTTCCGGTGCTGTTGC-3′，Tm为60 ℃，扩增目的片段为515 bp；内参照分子GAPDH：F：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′、R： 5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′。

（4）Western blotting检测

胰酶消化，收集目的细胞，裂解细胞并离心取上清液，应用15%的SDS-PAGE胶电泳2h后，湿转移法至PVDF膜，脱脂牛奶TBST液封闭1h，再分别加抗人PAX4、PDX1抗体IgG液振荡过夜，HRP标记相应二抗亲合反应后ECL显色。

2结果

2.1鉴定重组腺病毒质粒

Xho I酶切pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4病毒质粒，阳性克隆pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4由以下6条带组成即：14 kb、11.8 kb、5.9 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；而阴性克隆（pADxsi骨架质粒）只有以下6条带组成：14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；酶切结果阳性质粒均与理论预期一致，具体酶切结果（见图1）。

2.2重组腺病毒的包装和滴度测定

Pac I酶切线性化的pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4重组腺病毒质粒经脂质体Lipofectamine2000转染293细胞后3 d，开始出现病变效应（见图3）。120 h后，此时约70%细胞悬浮，收集细胞与上清液体，冻融后，再应用293细胞重复扩增、收集病毒液。空斑计数法（PFU）测定病毒滴度为1.0×108 PFU/mL；使用同样方法测定对照组。空载腺病毒ADxsi的滴度为2.0×108 PFU/mL。

2.3 目的基因表达

MSCs在光学显微镜下呈典型的长梭形，呈漩涡状或放射状平行排列（见图4）； ADxsi-CMV-GFP空病毒感染后24 h即可在荧光镜下观察到GFP表达。免疫细胞化学染色与间接荧光分别证实ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒以感染复数（MOI）=100感染目的细胞 （MSCs）24 h后，实验组MSCs的细胞核中即可检测到PDX1与PAX4 mRNA；细胞化学检测显示，PDX1与PAX4 主要定位于细胞核内，阳性率高于75%。间接荧光同样证实细胞核中PAX4（FITC）与PDX1 （CY5）均稳定表达（见图4）。

转染后光镜下的细胞形态相同于正常的MSCs细胞形态，呈梭形排列，应用ADxsi-CMV-EGFP空病毒感染细胞后，可见到细胞内绿色荧光表达，分别应用抗体检测PDX1与PAX4表达与定位，荧光结果显示PDX1与PAX4均定位于细胞核内，且免疫细胞化学检测也证实两转录因子定位于细胞核内，且稳定表达。

2.4 目的基因转录与表达

RT-PCR法与WB分别检测重组腺病毒ADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4转染后不同时段细胞内目的基因mRNA和蛋白表达结果显示：MSCs胞质内PDX1与PAX4 mRNA水平稳定；进一步Western blotting（WB）法检测感染后12 d的细胞核内PDX1与PAX4蛋白一直稳定表达（见图5），提示重组腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4可以有效感染MSCs，且目的基因均能稳定表达，这为后续研究目的基因在MSCs转分化过程中的功能奠定实验基础。

3讨论

MSCs具有多向分化潜能，为探讨MSCs分化为合成与分泌胰岛素功能的胰腺β细胞，选用了在胰腺前体细胞向β细胞分化过程中起关键作用的两个转录因子PDX1与PAX4[8-11]，并构建对MSCs具有稳定转染能力的Ⅴ型腺病毒载体[12-13]，用PDX1换去示踪基因EGFP，把PAX4基因插入到多克隆位点，构建并包装成带PDX1与PAX4双目的基因的活性重组腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4），酶切结果与测序结果证实重组腺病毒构建成功，目的基因连接正确。

应用ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs结果显示，重组病毒可以稳定高效感染MSCs，间接荧光检测结果显示，转染的MSCs在细胞核稳定表达PDX1与PAX4分子，细胞化学染色结果同样证实PDX1与PAX4分子定位于在MSCs细胞核内，这提示带PDX1与PAX4转录因子基因的重组腺病毒不仅可以高效感染目的细胞，并且稳定表达目的转录因子，而且所带的转录因子均具有核定位功能。

另一方面应用RT-PCR技术检测转录重组腺病毒的MSCs细胞内目的基因的转录水平表明目的基因在重组腺病毒感染细胞后仍可以检测到转录目的基因的mRNA水平稳定，提示在腺病毒的CMV启动子的作用下，目的基因在细胞内稳定转录。进一步抽提感染腺病毒的MSCs的细胞核蛋白，并行WB检测PDX1和PAX4转录因子蛋白水平，发现两种转录因子在细胞核水平稳定，这一方面提示腺病毒的CMV启动子具有强的启动目的基因转录功能，另一方面，目的转录因子稳定定位于细胞核，说明表达的转录因子具有核定位能力。的并且能稳定转录与表达PDX1与PAX4分子。

综上检测结果证实， PDX1与PAX4双带目的基因的Ⅴ型重组腺病毒被成功构建，重组腺病毒所带的目的基因均能稳定转录与翻译成功能转录因子PDX1与PAX4，且两功能转录因子均具有核定位功能，这为下一步研究2功能转录因子在诱导MSCs定向向胰腺β细胞分化过程中的功能与分子机制奠定了实验基础。

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慢病毒载体的发展历程及现状 第4篇

1 慢病毒载体概况

慢病毒是逆转录病毒科亚科之一, 分为两类:灵长类和非灵长类慢病毒。灵长类慢病毒包括HIV-1、HIV-2、猴免疫缺陷病毒 (SIV) , 非灵长类慢病毒包括猫免疫缺陷病毒 (FIV) 、牛免疫缺陷病毒 (BIV) 、马免疫缺陷病毒 (EIAV) 等。

多项研究表明慢病毒载体具有可感染非分裂期细胞、可长期表达、而且宿主细胞免疫反应小、细胞毒性小等优点。因其自身结构特点, 可包装8~10kb, 适用于多基因表达系统, 而且基因组包含较少的CpG二核苷酸, 抵抗基因沉默能力较强, 宿主体内更以表达, 而且在整合时整个转录区域都可以整合, 降低了慢病毒对启动子的激活机会。

2 慢病毒载体历史及构建

目前, 使用不同种属来源的慢病毒载体:

第一代慢病毒载体系统是以Naldini及Kafri构建的三质粒系统为代表, 该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。

载体质粒携带了5'端LTR和全部5'端非翻译区域、以及rev应答元件 (RRE) 及3'端LTR。

包装质粒由HIV-1前病毒基因组做简单修改得到, 其5'端LTR由异源病毒启动子/增强子元件取代。包膜质粒的改进 (引入了VSV-G基因) 降低了HIV-1恢复成野生型病毒的可能, 扩大了所能感染细胞的类型, 同时VSV包膜提高了HIV载体稳定性, 从而使HIV-1载体滴度由105TU/mL转录单位达到了108TU/mL。

第二代慢病毒载体系统又去除了包装质粒的4个辅助基因, 进一步降低了野生型病毒的可能性, 最大的优点是对病毒滴度影响不大。

自身失活型 (SIN) 慢病毒载体:3'端LTR的U3区启动子发生失活突变后, 将在逆转录过程中转移至5'LTR。如果这样的载体整合入靶细胞, 将不会产生完整长度的载体RNA。自身失活型载体技术最先应用于莫洛尼氏小鼠白血病病毒 (Mo MLV) 载体和鸟类的脾坏死病毒 (SNV) 载体。

3 慢病毒载体应用

3.1 慢病毒载体在基因治疗中的应用

慢病毒载体中的外源基因能够在组织特异性的启动子和增强子的驱动下在特定的组织细胞中表达, 利用这一理论依据逐渐发展起来一种新型的以慢病毒载体介导的基因治疗法。 (1) 利用RNA干扰技术治疗RNA干扰技术是近几年发展起来的一种全新的阻遏基因表达的方法, 通过双链RNA的作用特异性地阻断或降低目的基因的表达。 (2) 利用自杀基因治疗在细菌、真菌、病毒中的一些酶, 能将原先对细胞无毒的物质转变为细胞毒性物质, 导致细胞“自杀”, 起到杀伤靶细胞的作用。编码这种酶的基因就是自杀基因。通过慢病毒载体转导入靶细胞内后表达该自杀基因从而达到杀死病变细胞的目的。 (3) 利用免疫基因治疗树突状细胞 (DC) 是人体内抗原呈递功能最强的特异性抗原呈递细胞, 由慢病毒载体介导基因转移可使被转染的DC具有呈递特异性抗原的能力从而引发集体的免疫反应。

3.2 慢病毒载体的其他应用

在生产具有不同组织特异性表达GFP的转基因动物时, 利用含不同组织特异性表达蛋白启动子的慢病毒载体转染胚胎细胞来进行转基因动物制备, 可以使得转基因的效率获得显著提高。此外慢病毒载体的生物学特性结合可调控元件使得它很适合用于确定未知基因的结构和功能, 使其在发育生物学, 细胞生物等基础理论研究中发挥重要作用[1]。

4 慢病毒载体

4.1 由于慢病毒载体广泛的应用方向性以及需要经过超速离心来收集, 所以目前普遍应用的是第三代四质粒系统载体, 一般来说载体包膜由水泡性口炎病毒的VSV-g基因表达得到, 但是许多其他的病毒蛋白经过研究证实也适合HIV颗粒准型。另外, 最大的优点是此载体不能够转导人293T细胞, 这不仅降低了载体不稳定性而且更进一步的减少了产生复制竞争性慢病毒的可能性。

4.2 为了进一步提高慢病毒载体的基因表达调控效率、扩大治疗应用范围和增强生物安全性, 可诱导基因系统逐渐应用于慢病毒载体并作了进一步的结构改进。目前应用最广泛的可诱导系统为四环素诱导的慢病毒载体系统。

4.3 现在在基因工程由逆转录转到系统转染的动物的生产已经发展成了更容易了解基因功能的优质策略。因此, 转导的基因在宿主细胞核型中的插入整合位点是一个随机事件。因此在不同的实验动物中相同基因的插入位点也是不同的。如果基因整合时发生在单细胞期, 可传给后代, 发生在后期, 则不可传递给后代。然而Elizabeth C Bryda等假设存在整合位点。确定转导基因的插入位点对基因的表达是有重要意义的。不仅与转导基因的类型也与插入的位点有关。Elizabeth C Bryda等总结了互逆PCR、LM-PCR、RPL-PCR和T-linker PCR。他们用的是3个引物来制备的DNA、PCR、整合。最后他们发现在不同的实验鼠内发现9号染色体、5号染色体、7号染色体和1号染色体的转导基因可以传递给后代。他们提供了一种快速直接的方法来确定转基因的整合位点, 但是仅局限于少的随机整合位点[2]。

4.4 HIV-1需逆转录并整合到宿主细胞基因组内并建立原病毒。整合位点的确定对病毒的生命周期有重要作用。染色质的组成决定着病毒翻译的有效性, 而且涉及到了利用现代抗病毒理论消灭整合后的HIV-1的可能性。

总之, 慢病毒载体克服了一般病毒载体的缺陷, 在临床及科研中起到非常重要的作用, 是一个前景广阔的领域, 但是仍然存在一些问题需要解决, 科研工作者应努力解决这些问题。

参考文献

[1]Trono D.Lentiviral vectors:turning a deadly foe into a therapeutic agent[J].Gene Ther, 2000, 7 (1) :20-23.

病毒载体 第5篇

腺病毒载体介导的GFP基因在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干扰

目的:建立在鸭胚成纤维细胞(DEF)中进行RNA干扰(RNAi)的技术平台,为鸭基因组功能的研究提供新的技术手段.方法:以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,脂质体转染化学合成的GFP特异小于扰RNA(GFP-siRNA),用流式细胞仪测定GFP-siRNA对重组腺病毒(Adv-GFP)介导的GFP基因在DEF中表达的干扰效果.结果:200 MOI(感染复数)Adv-GFP介导的GFP基因在DEF中表达效率最高,为31.20%+3.11%,对DEF的`活力无明显影响;GFP-siRNA能有效干扰GFP基因在DEF中的表达,相对抑制率为98.56%.结论:在DEF中进行RNAi是可行的,Adv-GFP是介导外源基因在DEF中表达较为理想的载体;首次建立了在DEF中进行RNAi的技术平台,为鸭基因组的功能等研究提供了新的技术手段.

作 者：孟宇航 汤承 杨发龙 邓书 岳华 于学辉 MENG Yu-Hang TANG Cheng YANG Fa-Long DENG Shu YUE Hun YU Xue-Hui 作者单位：西南民族大学,生命科学与技术学院,四川,成都,610041刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：19(3)分类号：Q78 R394关键词：鸭胚成纤维细胞 RNA干扰 腺病毒载体 绿色荧光蛋白 鸭

病毒载体 第6篇

A1型短指(趾)症(Brachydactyly Type A1, BDA1)是第一例符合孟德尔遗传规律的常染色体显性遗传病,该疾病的主要特征为患者的中间指(趾)节显著缩短,甚至与远端指节相融合[1,2,3,4,5]。本世纪初,研究人员发现编码IHH(Indian hedgehog)蛋白的基因上几个点突变(E95K, D100E和E131K)导致了A1型短指/趾症的发生[6]。近年来,IHH基因的第95位谷氨酸是一个研究热点,它在不同家系中存在三种突变方式:E95K、E95G和△E95,而且,这三种突变的导致的患者表型存在明显的差异。研究结果已经揭示了E95K导致A1型短指(趾)症的详细分子机制[7,8,9]。不过遗憾的是,E95G的表型至今还没有相关详细的描述。

为了探究E95G和△E95影响Hedgehog信号通路的方式以及导致短指(趾)症的分子机理,本研究构建了携带IHH WT和E95K、△E95、E95G、D100E突变体的RCAS病毒载体,并验证其能够在鸡胚细胞表达。在这个过程中,优化了RCAS(Avian Replication-Competent Retroviruses)病毒收集方法,使最终滴度达到108 IU/ml,并通过体内实验证明该滴度能感染鸡胚[10],该研究为在鸡胚肢芽中过表达不同IHH突变体蛋白打好了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

鸡蛋(SPF级),pGEM-T(Promaga), 细胞培养板、细胞培养瓶(corning),细胞刮(costar)等。

1.1.2 试剂

FBS、CS、Penicillin/Strephtomycin(Gibco);Multisite Gateway Pro Kit (Promega);DIG-Labeling-kit(Roche);Trizol试剂(Invitrogen);SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System(Invitrogen);FuGENE 6 Transfection Reagent(Roche)。

1.1.3 仪器

PCR仪(Applied Biosystems);孵化机(无锡万利畜牧机械有限公司9WF-320型);超声波破碎仪(南京新辰生物科技有限公司);激光共聚焦显微镜(LEICA TCS SP5);冷冻切片机(LEICA CM3050S); 体视镜(LEICA S8APO);体视镜(LEICA S8APO);显微镜(LEICA DM2500)。

1.1.4 培养基

DMEM(High Glucose)(Hyclone)。

1.2 方法

1.2.1 原位杂交

探针用地高辛标记(DIG-Labeling-kit(Roche)),浓度1～2μg/ml。用到的引物序列:RCAS-IHH probe primer:F:5’-CGCCTGAACTCGCTGGCTATCT-3’,R:5’-CCTGAGTCTCGATGACC TGGAAGG-3’,每个样品2次重复。

1.2.2 反转录实验

抽提总RNA参照Trizol试剂(Invitrogen)。RT-PCR 参照SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System(Invitrogen)。

1.2.3 滴度测试

病毒载体构建:IHH gateway primer:F:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGCCTATGTCTCCCGCCC GGCTC-3’,R:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGCTCCCTGCCCCGGA-3’。PCR得到两端含有attB的IHH基因,病毒载体构建过程参照Multisite Gateway Pro Kit(Promega)。

病毒收集:分离CEF(Chicken embryonic fibroblast)细胞(HH stage36[10]),转染(FuGENE 6 Transfection Reagent(Roche))RCAS-GFP,传代扩增。上清浓缩法:待长满后更换至低血清培养基(DMEM基本培养液+1%FBS+0.2%CS+1% Pen/Strep),继续培养24h, 刮下细胞,冰上超声破碎1min,液氮冷冻,-80℃保存。细胞裂解法:收集细胞裂解液,4 000r/min离心10min,取上清于冰上超声破碎30s,过滤(0.45μm),35 000r/min离心1.5h。弃上清,冰上摇2h,-80℃保存。

滴度测试:细胞密度达到70%左右,DMEM梯度稀释RCAS-GFP病毒浓缩液至10-3 、10-5、10-6、10-7,每孔加入100μl上述稀释液,低血清培养基培养48h,激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.4 鸡胚注射和冰冻切片

鸡胚注射:鸡蛋(HH Stage17-18[10])时,注射RCAS-GFP病毒(病毒浓缩液4～6μl+ 0.5μl甲苯胺蓝工作液),继续孵化至HH Stage34-35[10],取肢芽,荧光显微镜观察,并冰冻切片。

冰冻切片:固定(4%PFA,4℃, 12h),平衡(30%蔗糖,4℃, 12h), 平衡(30%蔗糖:OCT= 1:1 ,4℃, 12h),包埋(100%OCT,-70℃,12h),切片(10μm),荧光显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 原位杂交

我们参照IHH蛋白三个点突变(图1-A),构建了携带IHH基因突变体(E95K、△E95、E95G、D100E)的RCAS-IHH病毒载体,并通过细胞原位杂交实验来检测上述病毒载体能否在CEF细胞中过表达IHH mRNA(RCAS-IHH-△E95还在实验中,数据未显示)。

从携带有人IHH基因的pGEM-T载体中分别用不同酶切位点单酶切,及相对应的T7,SP6 RNA聚合酶体外转录得到500bp左右的正反义链RNA探针(图1-B)。正义链探针的杂交结果显示,携带IHH WT和E95K、E95G、D100E突变的RCAS-IHH病毒和RCAS-GFP病毒感染的CEF细胞孔内均无明显的信号(数据未显示),说明阴性对照成立。从图1-C的结果来看,携带WT和E95K、E95G、D100E突变的RCAS-IHH病毒感染的CEF细胞孔较阴性对照(RCAS-GFP)显示更多的信号(褐色)。从这个结果我们可以知道,携带WT和E95K、E95G、D100E突变的RCAS-IHH病毒可以在细胞内过表达相应的IHH mRNA。

A 在IHH基因上的点突变(IHH基因有三个外显子,E95位于第一个外显子区域);B 体外转录人IHH基因RNA探针;C IHH特异性RNA探针杂交不同RCAS-IHH病毒载体感染的CEF细胞(LEICA S8APO,8)。

A.Mutations in Human Indian Hedgehog gene(E95 is located in the first one of the three exons in IHH); B Transcription of Human IHH-specific-RNA probe in vitro;C IHH specific RNA probes CEF infected by different RCAS-IHH vectors(LEICA S8APO,8).

2.2 反转录实验

为了从另一个角度验证原位杂交实验的结果,我们采用半定量PCR的方法来验证携带IHH WT和E95K、E95G、△E95、D100E突变的RCAS病毒载体能过表达相应的IHH mRNA。分别携带有IHH WT和E95K、E95G、△E95、D100E的RCAS-IHH病毒感染CEF细胞后,用IHH特异性引物扩增总RNA反转录产物。结果(图2)显示,与GFP相比,IHH WT和E95K、E95G、△E95、D100E均有明显的目的条带出现。说明携带有IHH WT和E95K、E95G、△E95、D100E突变的RCAS病毒载体能过表达上述IHH突变体的mRNA(E95K目的条带较暗,可能是过表达能力较弱,WT目的条带明显,故其对应的GAPDH条带较暗并不影响实验结果的判断),这与上面的细胞原位杂交实验结果一致。

2.3 滴度测试

分别用细胞裂解法和上清浓缩法收集病毒,进行滴度测试。结果(图3)显示,10-3倍稀释测试孔内,细胞裂解法(图3-A)和上清浓缩法(图3-E)得到的病毒均有较多细胞发出绿色荧光;10-5倍稀释测试孔内,上清浓缩法(图3-F)得到的病毒仅有一个视野里有一个细胞克隆发出绿色荧光,在更高的稀释倍数测试孔中,没有发现到绿色荧光(数据没有显示出来),说明上清浓缩法得到的病毒滴度仅能达到106IU/ml数量级。而细胞裂解法浓缩得到的病毒在10-7倍稀释(图3-D)孔内有一个视野里有一个细胞克隆发出绿色荧光,虽然未对细胞裂解法浓缩得到的病毒进行更高的滴度的测试,但可以肯定细胞裂解法浓缩的病毒滴度至少能达到108IU/ml数量级,这个滴度足以感染鸡胚(这在我们后面的试验中得到验证)。因此,细胞裂解方法将是一个很好的病毒浓缩方法。

2.4 鸡胚注射和冰冻切片

虽然体外实验已经证明了细胞裂解法收集RCAS病毒的可行性,但是这个滴度能否感染鸡胚仍需进一步证明。我们采用微注射的方法,将RCAS-GFP病毒注入Stage 17-18时期鸡胚肢芽,通过冰冻切片观察的方法来了解鸡胚感染情况。

A、B、C、D图分别为细胞裂解法得到的病毒浓缩液稀释至10-3、10-5、10-6、10-7;E和F图为上清浓缩法得到的病毒浓缩液稀释至10-3、10-5。取100μl稀释液加入24孔板内,48h后激光共聚焦显微镜观察。(C:细胞裂解法;S:上清浓缩法LEICA TCS SP5,1:250)。

RCAS-GFP concentrated from cell lysate(A,B,C,D)and supernatant(E,F)was diluted to 10-3,10-5,10-6and 10-7with DMEM.100μl diluted RCAS-GFP was added into 24-well plates.The titer was analyzed by Confocal Microscopy after 48 h(LEICA TCS SP5,1:250).

A.RCAS-GFP病毒注射鸡胚肢芽(HH stage17-18), HH stage 34-35时期在肢芽远端处拍摄(10),绿色指示区域为GFP表达区域。 B.A图肢芽在近端处拍摄(10)。 C.上述肢芽冰冻切片图(暗场拍摄40);D. C图区域明暗场叠加结果(40)。(LEICA DM2500)。

A.Distal chick embryo limb bud of HH stage34-35 with RCAS-GFP injection in the HH stage 17-18(10);B.The green area indicated cells infected by RCAS-GFP;B.The proximalof the same limb bud in Figure A (10);C.Frozenslices of the limb bud above (dark field 40).D.Superposition of light and dark-field(10).(LEICA DM2500).

从图4-B可知,在微注射区域,即靠近体节处有较多的细胞被RCAS病毒感染,而随着肢芽发育过程的进行,远端肢芽(图4-A)只有较少的细胞被感染,且从近端到远端呈现直线型感染,这符合RCAS病毒感染的模式,同时,从图4-D可以看出,在肢芽内细胞感染情况也并非是均匀的,这与其他研究人员的发现[11]一致。另外,在Stage 10时期尽管不容易引起大血管破裂,使鸡胚存活率上升,但由于鸡胚体节上没有肢芽突起,很难准确判断肢芽位置,因此操作难度大,感染效率低。在本研究中,我们采用Stage 17-18多点注射,取得了更好的效果。

3 讨论

A1 型短指(趾)症是 1903 年由美国哈佛大学博士生William Curtis Farabee发现的第一例符合孟德尔遗传规律的人类常染色体显性遗传病[4]。我们实验室首次在国际上对该疾病的致病基因进行了定位并发现IHH基因上的三个点突变(E95K, D100E, E131K)是导致疾病的原因,由此揭开了 A1 型短指(趾)症的致病之谜[5,6]。随后,国内外又有多个研究小组对他们采集的 A1 型短指(趾)症家系进行了研究,同样发现是 IHH 基因上的点突变导致了短指(趾)症的发生,不过他们发现的是不同位置的点突变或者是同一位置不同的点突变[12,13,14,15,16]。尤其让人感兴趣的是,IHH 基因的第 95 位谷氨酸在不同家系中存在三种突变方式:E95K、E95G和 △E95,这说明第 95 位谷氨酸是一个突变热点。而且这三个突变导致的患者表型存在明显的差异,其中 E95K 突变导致严重的中间指节缩短甚至与远端指节相融合,而 △E95 突变却只是导致轻微的中间指节缩短现象,说明该位置的氨基酸的完全缺失导致的临床表型反而没有氨基酸置换所导致的表型严重,这是一个非常有意思的现象,不过遗憾的是,E95G突变所导致的患者表型没有相关详细的描述。

本研究成功构建了携带有IHH WT 和E95K、E95G、D100E突变体的RCAS病毒载体,并且在鸡胚细胞中成功表达。在此过程中,我们优化了RCAS病毒收集方法,使滴度达到108IU/ml,并通过鸡胚体内实验证明该病毒具有非常好的感染效果,为在鸡胚肢芽中过表达不同IHH突变体蛋白打好了基础,也为我们继续研究这些点突变的生理功能提供了工具。

病毒载体 第7篇

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是猪伪狂犬病的病原体,具有广泛的宿主范围,可以感染猪、牛、羊等多种家畜和野生动物,但不感染人。PRV基因组为双链线性DNA,大小约为150 kb,含有许多病毒复制的非必需基因。因此,PRV是表达外源基因的优良载体[6,7,8,9]。蛋白激酶PK基因是PRV的一个非必需基因,同时又是一个重要的毒力基因,PK基因缺失的重组病毒不仅能显著降低毒力和减少排毒,而且还可以在一定程度上降低潜伏感染,同时PK基因缺失后不影响PRV的免疫力[10,11]。因此,缺失PK基因并在此插入其他外源基因是可行的。

试验旨在利用伪狂犬病毒表达系统,在体外对口蹄疫非结构蛋白3AB 基因进行表达,使表达的蛋白结构更接近于感染口蹄疫病毒细胞中3AB蛋白的某些抗原表位,从而为感染口蹄疫病毒的试验诊断提供更准确易行的方法,为建立区分口蹄疫感染动物和疫苗免疫动物的ELISA方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞系

PRV TK/gⅠ缺失疫苗株(批准文号[2002]077718),购自黑龙江省生物制品一厂;PK-15细胞系,由辽宁医学院畜牧兽医学院动物防疫检疫实验室保存,生长液系含5%胎牛血清的MEM,维持液系含2%胎牛血清的MEM。

1.2 质粒、菌株及试剂

质粒pPolyⅡ、质粒pEGFP-CI、E.coli DH5α感受态细胞,由辽宁医学院畜牧兽医学院动物防疫检疫实验室保存;限制性内切酶、反转录酶、Klenow大片段、小牛碱性磷酸酶(CIP)及T4 DNA连接酶,均为NEB公司产品;Trizol、MEM细胞培养基,购自Invitrogen公司;新生犊牛血清,购自Hyclone公司;蛋白胨及酵母浸出物,OXOID公司产品。

1.3 病毒增殖

按照常规方法培养PK-15细胞,以5～10 pfu/mL细胞感染PRV病毒,当细胞病变(CPE)达80%左右时收获病毒液,用于提取病毒基因组DNA。

1.4 质粒pEGFP-3AB的构建

1.4.1 引物的设计

根据GenBank已发表的亚洲Ⅰ型FMDV的基因序列分段合成其3AB基因[由宝生物工程(大连)有限公司合成],通过重叠PCR的方法连接获得全长的3AB基因,并在该基因上游末端引入ApaⅠ酶切位点,下游引物末端引入EcoRⅠ位点,合成后由宝生物工程(大连)有限公司进行3AB基因序列测定。

1.4.2 3AB基因的克隆

用限制性内切酶ApaⅠ+EcoRⅠ双酶切3AB基因,回收623 bp的3AB基因片段并将其按正确的阅读框顺序克隆入pEGFP-CI质粒的ApaⅠ+EcoRⅠ的多克隆位点中,转化E.coli DH5α感受态细胞。感受态细胞的制备及质粒的连接、转化按照参考文献[10]介绍的方法进行,阳性重组质粒即为pEGFP-3AB。

1.5 PRV基因组DNA的提取

将收获的病毒液离心,弃细胞渣,上清液用硫酸铵于4 ℃搅拌过夜;用TE(Tris-EDTA)缓冲液溶解后,100 000g甘油梯度超速离心;沉淀用TNES(Tris-EDTA-NaCl-SDS)缓冲液溶解后,分别用RNase A、蛋白酶K消化;再用酚︰氯仿抽提,无水乙醇沉淀,70%乙醇洗涤;最后以水溶解,-20 ℃贮存,备用。

1.6 PK基因的克隆

反应体系(30 μL):Buffer 3 μL,基因组DNA 2 μg,水20 μL,65 ℃水浴放置5 min,然后加入AscⅠ酶5 U,37 ℃酶切消化4 h。用琼脂糖凝胶电泳检测,回收含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段与同样经AscⅠ酶切的载体pPolyⅡ用T4 DNA连接酶连接,并转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取转化菌落用碱裂解法小提质粒,酶切鉴定,将阳性克隆命名为P8-AA。

1.7 转移载体的构建

用SacⅠ+NdeⅠ双酶切P8-AA质粒,切去PK基因中的2 218 bp片段,在保证酶切充分的情况下进行Klenow+dNTP补平,用CIP去磷;然后以1%琼脂糖凝胶电泳,回收含pPolyⅡ载体和部分PK基因的8.7 kb片段并作为载体。同时将已构建好的质粒 pEGFP-3AB用AseⅠ+ MluⅠ双酶切,在保证酶切充分的情况下用Klenow+dNTP补平,回收含巨细胞病毒(CMV)启动子、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、3AB基因和PolyA尾的2 487 bp的目的基因片段。载体和目的片段用T4 DNA连接酶进行平端连接并转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取转化后的细菌用碱裂解法小提质粒,酶切鉴定,阳性重组质粒即为转移载体P8-EGFP-3AB。

1.8 质粒的瞬时转染

PK-15细胞于转染前1天传至6孔细胞培养板,待细胞长至60%～80%汇合时倾弃培养液;用新鲜的不含血清和抗生素的培养液洗涤细胞,倾弃培养液,反复洗涤细胞3次以上,然后用于转染。取Eppendorf管,加入5 μg纯化的质粒与100 μL无血清和抗生素的MEM,混匀;另取Eppendorf管,加入5 μL脂质体(Lipofectin)与100 μL无血清和抗生素的MEM,混匀;然后将上述两管内的溶液混匀,室温下作用30 min;再向溶液中加入800 μL无血清和抗生素MEM,充分混匀;弃去6孔细胞培养板中的培养液,每孔加入质粒与脂质体的混合液1 mL,于37 ℃、5% CO2条件下感作12 h;然后将6孔细胞培养板中的液体吸出,各加2.5 mL含10%胎牛血清的MEM,继续培养;24 h后弃掉培养液,并在荧光显微镜下观察荧光。

2 结果

2.1 质粒pEGFP-3AB酶切鉴定结果

用NsiⅠ+PvuⅡ双酶切鉴定,切出的片段长为3.0 kb、2.3 kb、0.5 kb,与预期结果相符,见图1。在质粒P8-EGFP-3AB中,EGFP基因带有CMV强启动子,可以启动外源基因实现融合表达。这样以 pEGFP-3AB的表达盒为基础构建的转移载体,既可以实现EGFP基因与3AB基因的融合表达,又有标记基因,还可以克服使用病毒本身启动子启动外源基因表达效率低的弱点。

2.2 基因组酶切结果

用AscⅠ酶切PRV基因组,理论上能切出67个片段,其中有2个大片段分别为12 kb、8.7 kb,其余为4.0 kb以下,所要回收的8.7 kb片段中包括完整PK基因大小为3 900 bp,PK基因左侧序列长为4 122 bp,PK基因两侧序列可以构成同源重组臂。酶切完全后电泳回收得到8.7 kb片段,见图2。

1.质粒pEGFP-3AB;2.NsiⅠ+PvuⅡ双酶切质粒pEGFP-3AB; 3.PT13/HindⅢ Marker。

1.PT13/HindⅢ Marker;2.AscⅠ酶切PRV 基因组。

2.3 质粒P8-AA酶切鉴定结果

用BamHⅠ酶切质粒P8-AA,如果是正向连接切出的片段长应为5.1 kb、4.0 kb、0.7 kb,用XhoⅠ酶切使质粒P8-AA打开环状结构成线形,与预期结果相符,见图3。

1.PT13/HindⅢ Marker;2.BamHⅠ酶切质粒P8-AA;3.XhoⅠ 酶切质粒P8-AA;4.质粒P8-AA。

2.4 P8-EGFB-3AB转移载体的酶切鉴定结果

鉴定获得的质粒P8-EGFP-3AB的正确性,为正向连接(见图4)。质粒P8-EGFP-3AB大小为11.0 kb,同源重组左臂为4 660 bp(因为PK基因只缺失了2 218 bp),含绿色荧光蛋白基因和3AB基因的完整表达盒为2 487 bp,可以满足同源重组的需要。

1,4.质粒 P8-EGFP-3AB;2.AscⅠ酶切质粒P8-EGFP-3AB; 3. PT13/HindⅢ Marker;5.HindⅢ酶切质粒P8-EGFP-3AB; 6.BamHⅠ酶切质粒P8-EGFP-3AB;7.PT13/HindⅢ Marker。

2.5 转移载体的构建结果

首先将含目的基因PK的8.7 kb片段克隆入pPolyⅡ载体,获得中间载体P8-AA,然后用SacⅠ+NdeⅠ双酶切质粒P8-AA切去完整PK基因共2 218 bp片段,最后在此缺失区插入来自质粒pEGFP-3AB的表达盒,构建出转移载体P8-EGFP-3AB,见图5。

2.6 质粒的瞬时转染结果

转移载体在转染PK-15细胞24 h后,可观察到绿色荧光,说明EGFP基因得到表达,见182页彩图6。

3 讨论

在从病毒基因组中获得所要缺失的目的基因PK时,为了避免由于PRV基因组过大(150 kb)、G+C含量过高(73%)而在进行PCR扩增过程中容易出现误配或者非特异性条带,本试验采用酶切PRV基因组的方法获得目的基因PK,这样既简单又快速。因此,内切酶的选择十分关键,既要保证切出完整的PK基因,又要保证切出的片段比较容易回收。在PRV基因组酶切图谱分析中,AscⅠ酶切基因组所要回收的PK基因包含在8.7 kb酶切片段中,远大于其他的AscⅠ酶切片段(多数为4.0 kb以下),这样比较方便回收目的片段,所以本试验选择内切酶AscⅠ。在进行基因组酶切时,首先将基因组DNA在65 ℃水浴中放置5 min,以避免因基因组纯化不彻底残留的一些杂蛋白而影响酶切反应。同时采用酶切的方法缺失PK基因SacⅠ与NdeⅠ之间的2 218 bp片段,这样缺失片段比较明确,并以此作为外源基因插入部位。

绿色荧光蛋白基因作为一种标记基因具有活体实时表达、无需另外增加底物或辅助因子协助指示、检测方便等优点,在分子生物学领域已应用广泛。所以本试验以绿色荧光蛋白基因为标记基因,外源绿色荧光蛋白基因作为标记基因本身带有CMV强启动子,将3AB基因插入其下游可以实现融合表达。目前,转移载体与基因组DNA的同源重组及病毒筛选工作正在进行之中。

摘要：为了获得口蹄疫病毒3AB基因重组伪狂犬病毒载体,试验以伪狂犬病毒TK/gⅠ缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA;用限制性内切酶SacⅠ+NdeⅠ酶切质粒P8-AA,切去PK基因中的2 218 bp片段,在质粒P8-AA的PK基因缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-3AB中含绿色荧光蛋白(EGFP)基因和3AB基因的完整表达盒,转染于猪肾细胞。结果表明:成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并且在猪肾细胞中成功表达了绿色荧光蛋白基因。

关键词：伪狂犬病毒,PK基因,口蹄疫病毒,3AB基因

参考文献

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病毒载体 第8篇

RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 技术是生物体内一种高度保守的, 由双链RNA (double-strands RNA, dsRNA) 引起靶基因特异性沉默的应答反应。RNAi能特异性地抑制生物体内某种功能基因的表达, 通过表型的改变或生理生化指标的变化来反映该基因的功能。整个过程涉及多种特定酶的参与, dsRNA被切割成若干可沉默靶基因表达的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA) , 而应用带有RNA酶polⅢ类启动子的质粒载体表达短发卡RNA (short-hairpin RNA, shRNA) 可在细胞内产生激活的siRNA。近些年来, 随着研究的不断深入, 科研人员将RNAi技术成功运用于哺乳动物细胞中, 并使其稳定参与对目的基因的表达抑制。

试验建立了真核表达载体介导的针对BVDV的RNA干扰体系, 并对其进行鉴定, 为进一步研究RNA干扰在BVDV复制与表达研究中的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和细胞

质粒p SGH1, 由河南省动物免疫学重点实验室构建;用于质粒克隆与扩增的大肠杆菌DH5α感受态细胞, 购自TIANGEN公司;牛肾细胞系MDBK, 由河南省动物免疫学重点实验室保存。p SGH1质粒图谱见图1。

1.2 试剂和引物

用于配制LB培养基的胰蛋白胨及酵母提取物, 购自OXOID公司;限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ、T4DNA连接酶、Taq酶, 购自Ta KaRa公司;质粒提取试剂盒, 购自Axygen公司;胶回收试剂盒, 购自OMEGA公司;DMEM基础培养基和胎牛血清 (FBS) , 购自GIBCO公司。引物的合成和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

2 方法

2.1 靶向BVDV shRNA寡核苷酸链的设计与合成

针对BVDV的mRNA序列 (Gen Bank登录号为NC_001461) , 选择其中的保守序列作为靶基因, 在靶基因的编码区, 根据shRNA设计原则及Oligoengine Workstatioin 2软件选择2条21 nt靶序列, 经Blast同源性比对分析, 2条靶序列与其他基因编码序列无同源性。发夹shRNA模板寡核苷酸链采用化学合成法合成, 插入到H1启动子上游, 由正义链+发夹 (TTCAAGAGA) +反义链组成, 将2个互补的反向重复序列之间插入9 bp非同源序列TTCAAGAGA, 3'末端是5个胸腺嘧啶 (T) , 作为RNA polⅢ的终止信号, 两端再加上BglⅡ和HindⅢ限制性内切酶酶切位点, 具体序列见表1。

2.2 shRNA模板寡核苷酸退火

将合成的模板寡核苷酸链top strand和bot strand用退火缓冲液溶解稀释, 取等摩尔数的top strand和bot strand各10μL混合配制成总体系为20μL的退火PCR反应液, 95℃变性2 min, 94℃90 s, 共进行69个循环, 每个循环退火温度降低1℃, 最终降温至25℃, 形成5'端带BglⅡ、3'端带HindⅢ黏性末端的双链DNA。

2.3 连接shRNA模板寡核苷酸链和线性化的质粒载体p SGH1

取p SGH1质粒载体用BglⅡ和HindⅢ限制性内切酶于37℃双酶切3 h, 酶切后用胶回收试剂盒回收凝胶线性片段。10μL连接反应体系由退火后的双链shRNA模板寡核苷酸链1μL、回收的线性片段载体p SGH12μL、T4 DNA连接酶1μL及10T4DNA酶连接缓冲液6μL组成, 16℃连接过夜。同时设阴性对照。

2.4 连接产物的转化

取成品化的大肠杆菌DH5α感受态细胞100μL放在冰上融化, 加入10μL连接产物, 冰上放置30 min;42℃热击90 s后迅速冰浴3 min;每管加无抗生素的普通LB培养基900μL, 37℃、200 r/min振荡90 min;4 000 r/min离心5 min;留100μL上清悬浮菌液, 用无菌弯头玻璃铺菌器将菌液均匀铺于含卡那霉素的琼脂平板表面, 室温平放30 min;在37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。

2.5 阳性菌落的挑取与重组质粒的提取

挑取白色单克隆接种于含卡那霉素的LB培养基中, 37℃恒温培养约16 h;收集菌液, 取6 m L按照Axygen公司质粒抽提试剂盒说明书步骤小量快速抽提重组质粒。

2.6 重组质粒载体的PCR鉴定

PCR反应体系:上游引物H1scan F与下游引物H1sanR各1μL, 单克隆菌液1μL, Taq酶10μL, 用去离子水补足20μL。反应程序:95℃预热5 min;94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 共30个循环。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 加入1TAE电泳缓冲液, 以DL-2 000 Marker作为对照, 105 V作用30 min后在凝胶成像系统中照像并分析结果。

2.7 重组质粒载体的双酶切鉴定

取小量提取的重组质粒DNA进行双酶切法鉴定。酶切反应体系如下:重组质粒DNA 5μL, 10H缓冲液2μL, EcoRⅠ和BglⅡ限制性内切酶各1μL, 用dd H2O补足20μL。混合后37℃酶切3 h, 取7μL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。

2.8 重组质粒载体的序列测定

将上两步鉴定的阳性结果送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。随样附正向测序引物 (H1scan F 5'-CGTGAATTCGAACGCTGA-3') 与反向测序引物 (H1sanR 5'-TTTTCGGATACCCT-TCGTTC-3') 。

2.9 重组质粒载体的纯化

在提取的60μL质粒载体中加入3 mol/L乙酸钠6μL, 再加入预冷无水乙醇165μL, -20℃放置1 h;4℃、12 000 r/min离心30 min;弃上清液, 回收沉淀, 用70%冷乙醇1 m L清洗沉淀, 12 000 r/min离心2 min;弃上清液, 用dd H2O溶解沉淀, 测定含量, 备用。

2.1 0 重组质粒在MDBK细胞中的转染表达

将酶切及测序鉴定正确的重组质粒转染至MD-BK细胞中并设置空白对照组。转染前用PvuⅠ限制性内切酶单酶切重组质粒p SGH1-sh278和p SGH1-sh311, 使其线性化, 并将MDBK细胞按1106的密度接种于6孔板, 每孔含加入10%FBS的DMEM培养基500μL, 当细胞融合度达80%时用100μL的反应缓冲液XfectTMReaction Buffer分别稀释5μg重组质粒和1.5μL的转染试剂XfectTMPolymer, 将两者轻轻混匀后室温放置10 min;均匀滴加至MDBK培养基中, 之后将其放入37℃、5%CO2培养箱中培养4 h;换成含有10%FBS的DMEM继续培养。

2.1 1 用e GFP标记和Neomycin抗性标记筛选细胞克隆

转染后48小时转染效率达到最高值, 此时换液加入含有800μg/m L G418的DMEM进行抗性压力筛选, 大约10 d后, 大部分细胞死亡, 只有成功转入重组载体并与细胞染色体发生随机整合的少数转染细胞得以存活, 利用存活细胞表达e GFP蛋白产生的绿色荧光, 筛选细胞单克隆。

3 结果

3.1 靶向BVDV的重组shRNA表达载体PCR鉴定结果

将转化阳性的单克隆PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像显示阳性重组质粒PCR扩增无条带产生, 而阴性对照PCR可以扩增出片段大小为270 bp的条带, 结果证实阳性重组质粒的存在, 见图2。

1.阴性对照;2, 3.阳性重组体;M.DL-2 000 Marker。

3.2 靶向BVDV的重组shRNA表达载体双酶切鉴定结果

将阳性克隆的重组质粒用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后, 经琼脂糖凝胶电泳进一步鉴定, 结果表明, 可切出片段大小为270 bp的条带, 而阳性重组载体酶切结果无条带产生, 证实有阳性重组子, 结果见图3。

M.DL-2 000 Marker;1.阴性重组载体酶切结果;2.阳性重组载体酶切结果;3.阳性重组体酶切结果。

3.3 靶向BVDV的重组shRNA表达载体测序法鉴定结果

将经过PCR鉴定与双酶切鉴定的阳性重组载体送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序, 测序结果与设计的模板寡核苷酸片段序列比对结果相符, 证实阳性重组表达载体的存在。将测序正确的重组shRNA表达载体分别命名为p SGH1-sh278和p SGH1-sh311, 结果见177页彩图4。

3.4 联用绿色荧光蛋白和抗性压力筛选的细胞单克隆

将重组质粒p SGH1-sh278和p SGH1-sh311转染入MDBK细胞48 h后, 荧光蛋白表达量达到最高值, 随后进行抗性压力筛选出阳性细胞克隆, 最后以有限稀释法挑取阳性细胞单克隆, 扩大培养, 建立稳定转染重组质粒p SGH1-sh278和p SGH1-sh311的单克隆细胞系, 结果见177页彩图5。

4 讨论

2001年, S.M.Elbashir等[2]和N.J.Caplen等[3]首次引入人工合成小干扰RNA (siRNAs) 使RNAi技术成功运用于哺乳动物细胞中。这些化学合成的siRNA导入细胞系可诱导快速有效的RNAi, 但所诱导的RNAi只能实现瞬时表达, 沉默效果会随细胞传代过程中siRNA被不断稀释而逐渐消失。受内源性miRNA结构的启发, 有人在哺乳动物细胞内表达的载体引导细胞内siRNA的合成, 最终形成稳定表达siRNA的体系, 解决了以上问题[4]。通常情况下, 转入的载体由2个反向互补排列的19 nt特异性序列以及1个9 nt用于形成茎环结构的间区构成, 转录后形成带有发夹结构的shRNA, 体内的Dicer酶将其切割成siRNA, 通过RNAi通路下调目的基因的表达[5]。构建载体时, 常将PolⅢ类启动子U6或H1构建在质粒上表达shRNA, 同时在其5'端加上poly A尾巴, 3'端加上5个T的终止信号, 转录产物经剪辑后最接近于siRNA, 在几乎所有类型的细胞中均具有活性[6]。由此构建的质粒载体价格便宜并且能够在细胞中持续表达。这些重组载体通常带有选择标记, 可用于转染后细胞的筛选, 最终选出可稳定表达RNAi的细胞系。

试验采用前期构建的p SGH1真核表达载体连接设计好的shRNA, 成功构建针对BVDV的RNAi重组表达载体, 并对其进行了鉴定。若后期将干涉载体导入细胞, RnaseⅢ活性的核酸酶Dicer会将其切割成约含21个碱基对的siRNA[7], 这些siRNA的5'端为磷酸基, 3'端有2个悬挂的核苷酸[8], 它们可与具有核酸内切酶活性的Argonaute (Ago) 蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体 (RNAi-induced silencing complex, RISC) 。在ATP供能的前提下, RISC将siRNA的双链打开, siRNA中的反义链引导RISC识别互补的BVDV mRNA, 替换掉其正义链, 与其配对后在距离3'端12个碱基的位置上对BVDV mRNA进行序列特异性降解[9], 抑制其表达, 使BVDV表达沉默。与此同时, siRNA还可以作为引物, 在依赖于RNA的RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase, RdRP) 的作用下, 重新形成新的dsRNA, 随后被Dicer切割, 继续以上相同的信号通路, 如此循环使沉默信号不断扩大, 最终形成整个生物体内的针对BVDV特异性沉默[10]。

利用RNAi技术针对病毒基因组的保守序列设计siRNA或shRNA在体外导入动物细胞可有效抑制病毒复制, 注入体内产生RNAi效应, 进一步构建动物模型。鉴于传统的捕杀和灭活疫苗免疫等方法对疫病的控制和消灭十分有限, 靶向病毒不同区域的RNAi成为可供选择的控制动物疾病的新策略。

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病毒载体 第9篇

1 禽流感的简述

禽流感是禽流行性感冒的简称, 由甲型流感病毒的亚型 (也称禽流感病毒) 引起的传染性疾病, 被国际兽疫局定为甲类传染病, 又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按病原体类型的不同, 禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状, 仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状, 食量减少, 产蛋量下降, 出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重, 发病率和死亡率均高, 人感染高致病性禽流感死亡率约是60%, 家禽感染的死亡率几乎是100%。

2 禽流感疫苗需要的特点

禽流感作为一类病毒性传染病药物治疗效果并不是特别理想, 并且治疗病毒病的药物往往价格较为昂贵不适合在禽类广泛应用。疫苗接种成为防控禽流感的关键, 禽流感疫苗需要具有以下几个特点:其一疫苗株基因型需和流行毒株相近;其二流感疫苗需能很好减少病毒排出, 阻断病毒传播;其三, 血清学检测能够很好的和野毒区分, 利于制定免疫程序和区分野毒感染与疫苗免疫;其四, 为现代大规模集约化养殖的需要, 应考虑合适的疫苗接种方式;其五, 必须考虑疫苗的经济效益, 包括疫苗价格。

生产中广泛应用的痘病毒载体禽流感疫苗, 虽然有良好的免疫效果但是须经肌肉或皮下接种, 在集约化养殖中很难推广。随着基因工程的飞速发展, 重组蛋白苗也满载着学术界和养殖界的期盼应用于生产, 但重组蛋白苗不仅免疫方式繁琐, 需和佐剂共同免疫且免疫途径为肌肉注射, 而且免疫效果不是特别理想。综上, 禽流感疫苗的研制任重道远。

3 艾美耳球虫作为抗原表达载体开发疫苗的优势

作为一种真核的原生生物, 将艾美耳球虫用作某些致病生物的抗原表达载体从而开发新型活载体疫苗是一种很好的设想, 与其他细菌或病毒载体相比具有理论上的多重优势:其一, 球虫的基因组较大, 有更多潜在的插入位点;其二, 可对抗原进行一些真核生物特有的化学修饰, 更好地保留抗原的活性;其三, 具有多层卵囊壁和孢子囊壁等作为保护结构, 经口接种后最终到达盲肠部位发挥作用, 疫苗活性不会受到损失;其四, 疫苗经口服用接种, 方便快捷;其五, 繁殖周期短, 发育到卵囊阶段后即可排出体外, 不会引起免疫耐受;其六, 宿主特异性高, 不会跨种传播, 因此生物安全性好;其七, 转基因球虫是理想的二价疫苗, 既可防治球虫病, 又可抵御其他病原的侵袭。

4 和缓艾美耳球虫作为疫苗载体的特点

和缓艾美耳球虫是鸡七种常见致病性球虫中致病力较弱的一种, 但繁殖能力强, 少量接种即可获得大量卵囊, 以其作为疫苗载体, 免疫鸡群时可以加大免疫剂量, 同时, 表达的外源抗原的免疫剂量也得到加大。由于和缓艾美耳球虫的致病力弱并且表达病原蛋白而非活的病原体, 因此大剂量免疫不会对鸡的免疫系统造成严重损伤, 这是和缓艾美耳球虫较其他种的艾美耳球虫作为疫苗载体的独特优势。和缓艾美耳球虫作为疫苗载体的另一优势在于, 其寄生于盲肠前段和回肠末端, 转染后的子孢子可经泄殖腔接种, 操作简单易行, 易获得转基因球虫卵囊。

5 异源蛋白在球虫体内表达的优势

病毒载体 第10篇

关键词：CD226,siRNA,慢病毒载体

血小板/T细胞活化抗原1(plateletandTcell activationantigen 1,PTA 1)属于免疫球蛋白超家族IgSF成员。在2000年召开的第七届人类白细胞分化抗原国际协作组会议(HLDA 7)上获得编号CD 226,其基因产物是分子量约为65kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白,广泛表达于T细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨核/血小板谱系及活化的血管内皮细胞;参与了免疫系统的生理和病理学功能,如T细胞、巨核细胞的分化,NK细胞对肿瘤细胞、病毒感染细胞的杀伤,血小板的活化与聚集,单核/巨噬细胞穿越血管内皮细胞等过程,并参与其中的信号转导[1,2,3,4]。通过与配体CD 112和CD 155分子的相互作用,CD 226分子可以向细胞内传递活化型信号,参与固有免疫和适应性免疫应答,引发多种免疫学效应,包括细胞间的黏附、浸润及杀伤活性的发挥等过程[5,6]。研究特定分子的生物学功能需要采取多种技术路线,包括了中和活性抗体、具有生物学活性的重组蛋白,异源过表达功能分子以及近年来兴起的siRNA技术等,本实验针对人CD 226分子设计验证了可以有效下调其表达的siRNA,并构建了相应的慢病毒载体,可以有效地抑制天然分子的表达,为今后功能实验研究提供了有力的工具。

1材料和方法

1.1细胞系、菌种及质粒

293T、Jurkat/E 6、CHO细胞系为本室保存,培养于含100mL/L新生牛血清的RPMI 1640培养基。含有CD 226基因ORF全长的表达载体pFlagCD 226及E.coliDH 5α菌种为本室保存,pMD 18T载体购自宝生物工程(大连)有限公司,shRNA慢病毒表达载体pLKO.1购自Openbiosystems公司。

1.2工具酶、抗体、试剂及主要仪器

限制性内切酶、DNA连接试剂盒、dNTPs、DNAMarker(DL2000)、rTaq酶及Pyrobest高保真DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司,质粒小量制备试剂盒和琼脂糖凝胶核酸纯化回收试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品,RPMI 1640培养基和DMEM培养基为Hyclone公司产品,新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;磷酸钙法细胞转染试剂盒购自碧云天生物技术公司。寡核苷酸DNA合成和质粒DNA序列测定由北京奥科生物技术有限责任公司进行。针对人CD 226分子siRNA序列的设计与寡聚核苷酸的合成由上海吉玛制药技术有限公司完成。抗人CD 226分子单抗LeoA 1为本室制备并标记FITC,BD Calibur流式细胞仪为BD公司产品。

1.3人CD 226分子siRNA序列的设计与验证

为了利用RNAi原理下调CD 226分子的表达,我们委托上海吉玛制药技术有限公司设计并合成了四条双链寡聚RNA,分别针对人CD 226分子基因开放读框ORF的不同预测位点,依据序列起始位点分别命名为siRNA513、siRNA549、siRNA573、siRNA990。常规培养293T细胞,在不同培养孔中分别同时转染pFlagCD 226表达载体和各组双链RNA,48h后收获各组转染细胞,用单抗FITCLeoA 1进行染色,检测CD 226分子表达水平。

1.4人CD 226siRNA慢病毒载体的构建和鉴定

根据鉴定有效的siRNA序列和pLKO.1载体多克隆位点,设计合成一对寡核苷酸,分别为A 1sS:CCGGAGATCGACCTCTTAACTTACTCTCGAGAGTAAGTTAAGAGGTCGATCTTTTTT,A 1sS:AAT-TAAAAAAGATCGACCTCTTAACTTACTCTCGAGAGTAAGTTAAGAGGTCGATCT,序列中含有XhoI酶切位点,用于连接后鉴定阳性克隆。以退火液(10mmal TrisCl,50mmalNaCL,1mmalEDTA,pH 8.0)溶解合成的寡核苷酸冻干粉,等比例混合后置PCR仪上,设定退火程序,按照1℃/2min的速度,由95℃缓慢降温至4℃,取出置4℃。以AgeI/EcoRI双酶切pL-KO.1载体,与退火双链进行连接,转化DH 5α感受态菌,转化子在氨苄抗性LB琼脂平板上进行筛选,随机挑取数个抗性克隆进行XhoI酶切鉴定,挑取阳性克隆送测序。构建成功的载体命名为pLKOCD 226。

1.5慢病毒载体的包装

293T细胞用含有100mL/L新生牛血清的DMEM培养基在37℃、50mL/LCO2的孵箱中培养,小量提取表达shRNA的重组质粒pLKOCD 226和封装载体VSVG、Δ8.9,瞬时转染按照碧云天磷酸钙法细胞转染试剂盒说明书进行操作简言之,以1106细胞/瓶接种处对数生长期的293T细胞于25cm 2细胞培养瓶中,培养24h细胞贴壁后更换5mL新鲜完全培养基继续培养。将取pLKOCD 226载体4μg、VSVG载体4μg、Δ8.载体0.4μg与500μLCaCl2溶液混匀,加入500μBBS溶液,室温静置15min,逐滴均匀加入细胞培养瓶中,轻柔混匀,常规培养15h后缓慢移去上清,并加入新鲜完全培养基6mL,继续培养72h后收集培养上清即为病毒液,0.45μm滤膜过滤后分装置-70℃保存。

1.6慢病毒活性鉴定

Jurkat/E 6细胞常规培养于含有100mL/L新生牛血清的RPMI 1640培养基中,按2105细胞/孔密度接种处对数生长期的细胞于24孔板中,加入1ml病毒液培养36h,添加1mL新鲜完全培养基继续培养24h,换为含有抗生素puromicine的1640培养液进行抗性筛选,在药物选择压力下培养14d,收获细胞用单抗FITCLeoA 1进行染色,检测CD 226分子表达水平,同时使用抗CD 3、CD 4、CD 8分子的荧光标记抗体对存活的Jurkat/E 6细胞进行免疫荧光染色和流式细胞术分析。

2结果

2.1人CD 226分子siRNA序列的鉴定

设计了针对CD 226分子的四条siRNA序列(表1),利用共转染实验,发现当同时转染双链siRNA513和pFlagCD 226载体时,外源性CD 226分子的表达受到了完全的抑制,双链siRNA549和siR-NA573只能部分抑制CD 226的表达,而siRNA990与对照序列RNA相似,对CD 226的表达几乎没有影响(图1)。故而可以初步确定,针对513位点的双链RNA可以有效地阻止CD 226分子的表达。

白色为单独转染pFlagCD 226载体,灰色为共转染双链RNA,LeoA 1FITC染色

2.2 pLKOCD 226慢病毒载体的包装和鉴定

根据pLKO.1慢病毒载体使用说明和磷酸钙转染试剂说明书,将pLKOCD 226、VSVG和Δ8.9载体常规转染293T细胞,收集培养上清以获得包装病毒病毒感染Jurkat/E6细胞后3d,换为puromycin抗性培养基进行筛选,继续培养14d后获得感染阳性的细胞系,该感染细胞CD 226表达转为阴性,说明慢病毒pL-KOCD 226可以完全抑制Jurkat/E6细胞表面CD 226的表达。同时对感染后的Jurkat/E6细胞进行CD 3CD 4、CD 8等分子免疫荧光染色和流式细胞术分析,发现对这些分子的表达没有影响(图2),慢病毒pLKOCD 226特异性的下调了CD 226分子的表达。

3讨论

黏附分子CD 226属于免疫球蛋白超家族成员,表达于多种免疫细胞,广泛参与了免疫系统的生理和病理学功能,如T细胞、巨核细胞的分化,NK细胞对肿瘤细胞、病毒感染细胞的杀伤,血小板的活化与聚集,单核/巨噬细胞穿越血管内皮细胞等过程。通过与配体CD 112和CD 155分子的相互作用,CD 226分子可以向细胞内传递活化性信号,引发多种免疫学效应。对于该分子的研究,有助于理解黏附分子在机体免疫系统发育和功能中的意义。现阶段研究特定分子的生物学功能需要采取多种技术路线,从不同层次、不同角度进行论证研究。除了建立合适的体内体外实验模型外,所需的材料还包括具有中和活性的单克隆或多克隆抗体、可以发挥天然分子生物学活性的重组蛋白,适当水平过表达异源功能分子的载体以及近年来兴起的siRNA技术等。其中siRNA技术以其特异性好、方便实用,日益成为功能研究过程中不可或缺的技术方案。本实验针对人CD 226分子设计验证了可以有效下调其表达的siRNA,并构建了相应的慢病毒载体,可以有效地抑制天然分子的表达,为今后功能实验研究提供了有力的实验工具。

RNA干扰是近年来迅速发展起来的新技术,利用序列特异性的短片段双链RNA可以通过促使靶基因的mRNA降解来高效、特异性的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型siRNA(smallinterferingRNAs)就是这种短片段双链RNA分子,能够结合并降解序列同源互补的靶标mRNA。RNAi的发现不仅深入揭示了细胞内基因转录后调控的机制,而且还为后基因组时代基因功能分析提供了有力的工具。越来越多的研究工作是基于RNAi来研究生物体的基因表达及其生物学功能。有效的RNAi需要根据生物信息学原理设计双链RNA片段,并筛选出合适的靶序列[7],进一步在分子水平的筛选检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行:检测靶mRNA水平,可以采用RTPCR、qRTPCR或Northern杂交等;但由于研究的是特定蛋白的功能,所以还要在蛋白水平进行检测,最常用的技术是Westernblot。在本实验中,鉴于CD 226分子是表达干细胞膜表面的I型跨膜糖蛋白,故采用了免疫荧光染色加流式细胞术分析的方案进行检测,该方法简便易行,并且可以定量检测特定膜分子的表达水平。另外,由于膜分子的代谢速度相对胞质分子比较慢,如果在对siRNA序列进行初步筛选的时候,选择目的分子阳性的细胞,就有可能在转染的siRNA失效之后仍然观察不到目的蛋白的显著下调,所以本实验首先选取了目的基因阴性的细胞,同时转染不同序列特异性双链siR-NA和过表达载体,观察目的基因的表达水平,成功筛选到有效的siRNA序列,进而构建慢病毒载体,感染CD 226阳性的Jurkat/E 6细胞系,经过puromycin抗性筛选之后,获得了CD 226敲除的细胞系,证明该序列和相应慢病毒载体构建成功,为进一步研究CD 226分子的生物学功能提供了有力的技术支持。

参考文献

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