pH调节法范文

pH调节法范文（精选7篇）

pH调节法 第1篇

在甲壳动物中, 绝大多数类胡萝卜素都以类胡萝卜蛋白 (类胡萝卜素结合高密度脂蛋白) 的形式存在[9]。该蛋白被认为有2种作用, 改善色素的水溶性和提供颜色。甲壳动物的类胡萝卜素蛋白分为3种[10,11]:1) 类胡萝卜脂蛋白。主要分布在甲壳动物的卵和卵巢中, 但在血液和表皮中也有少量存在。它们使组织呈现蓝色、绿色和紫色;2) 从甲壳动物外壳中发现的几丁质类胡萝卜素。它们由几丁质和类胡萝卜素通过Schiff碱键结合而成或是由几丁质的氮端和类胡萝卜素上的酮环结合而成;3) 类胡萝卜结合蛋白。主要是虾青素结合脱辅基蛋白而生成的虾青蛋白, 它们主要存在于甲壳动物的体表结构中, 为其提供保护色。

虾壳在虾熟制过程中会发生红变现象, 这是由于虾青蛋白受热变性, 释放了与其共价结合的类胡萝卜素而引起的[12]。虾壳的色泽不仅会左右人们的购买, 而且也在一定程度上反映了整虾的新鲜程度[13]。传统方法提取虾青蛋白主要是经硫酸铵分级沉淀后, 采用高效液相色谱进一步纯化[14]。不仅试验试剂消耗大、目标蛋白得率低, 并且温度对目标蛋白的提取影响大。该试验采用p H调节法对比传统硫铵盐析法从凡纳滨对虾壳中提取β虾青蛋白, 并对所得蛋白在回收率、纯度和光谱性质等方面进行比较, 旨在对p H调节法提取虾青蛋白的可行性进行分析讨论, 为有效提取、利用甲壳动物甲壳中的虾青蛋白提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 虾壳 (亚洲水产, 湛江产) , 运回实验室后立即用冰水洗净、4℃下干燥、粉碎、称质量。

1.2 仪器与试剂

UV-1800紫外可见分光光度计 (日本岛津出品) , CR22GⅡ型高速冷冻离心机 (日本日立出品) , LC-20AD高效液相色谱仪 (日本岛津出品) , AE-7300型电泳仪 (日本帝国理化出品) , Jasco-725型圆二色光谱仪 (日本Jasco出品) , Alpha 2-4型真空冷冻干燥机 (德国Martin Christ出品) , Ettan IPGphorⅡ型等电聚焦仪 (美国GE Healthcare出品) , F-52型p H计 (日本崛场出品) , Immobiline Dry Strip p H 3-10 NL、13 cm型胶条 (美国GE Healthcare出品) 。试验用水为超纯水, 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA和CHAPS等试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 盐析法提取β虾青蛋白

参考ZAGAL-SKY[14]。将虾壳用预冷却的质量分数为10%的EDTA溶液浸泡[m (虾壳, g) ∶V (EDTA, m L) =25∶1 000]10 h (4℃) 。过滤后向滤液中加入55%饱和度的硫酸铵, 4℃静置10 h。离心 (10 000 g, 4℃, 20 min) 后, 用100 m L、50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液 (p H 7.0) 溶解沉淀并加入20%饱和度的硫酸铵, 4℃静置10 h。二次离心后弃沉淀并向清液中加入50%饱和度的硫酸铵, 4℃静置10 h后离心所得沉淀即为粗蛋白。将多次提取的粗蛋白收集后, 通过真空冷冻干燥浓缩、保存。

在使用高效液相色谱纯化前, 需用保存液 (50mmol·L-1, p H 7.0磷酸盐缓冲液) 透析数次, 以尽量减少硫酸铵对纯化的影响。试验选用的是离子交换柱 (5 mm×50 mm Mono Q阴离子交换柱) 。流动相:溶剂A为50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液 (p H7.0) , 溶剂B为含1.0 mol·L-1氯化钠的50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液 (p H 7.0) 。梯度洗脱程序为10~80 min内溶剂B的体积从0上升至70%, 90 min时增加至100%并维持10 min, 115 min时降为0;流速为0.5 m L·min-1, 进样量1 m L。

1.3.2 p H调节法提取β虾青蛋白

将预处理后的凡纳滨对虾虾壳用预冷却的质量分数为10%的EDTA溶液浸泡10 h、过滤。提取液p H设置为3.0~11.0, 以1.0为p H变化梯度。将滤液分为2份, 分别用2 mol·L-1的盐酸 (HCl) 调节至3.0 (酸处理) 和2 mol·L-1的氢氧化钠 (Na OH) 调节p H至11.0 (碱处理) 。4℃、10 000 g离心17 min, 得到不同p H下的溶出物和未溶物。

用2 mol·L-1的HCl或Na OH将溶出物的p H调节至等电点后4℃、10 000 g离心17 min, 得到目标蛋白和未回收的溶出物。

蛋白质溶解度和回收率计算公式为[15]:

其中A为不同p H处理后离心所得清液中虾青蛋白质量 (mg) =清液中蛋白质质量浓度 (mg·m L-1) ×清液体积 (m L) ;A1为等电点沉淀后, 离心所得清液中的虾青蛋白质量 (mg) ;C为总虾青蛋白质量 (mg) , C=EDTA脱钙后滤液中虾青蛋白质量浓度 (mg·m L-1) ×滤液体积 (m L) 。每组试验重复3次取平均值。

1.3.3 β虾青蛋白的基本性质分析

1) 等电聚焦电泳。将经盐析、离子交换色谱纯化后的蛋白质溶于50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液中 (p H 7.0) , 透析数次, 以消除盐对试验结果的影响。向洁净、干燥的胶条槽 (13 cm) 内加入含1.0 m Lβ虾青蛋白纯品 (170.14 mg) 的再水化液250 m L, 将撕去保护膜的IPG胶条置于胶条槽内 (酸性端位于正极) , 尽量避免气泡的形成。最后加入IPG覆盖液以防止蛋白质样品的蒸发和尿素结晶的形成。等电聚焦电泳参数设定为500 V, 60 min;1 000 V梯度, 60 min;8 000 V梯度, 150 min;8 000 V, 25 min。电泳完成后经固定、染色、脱色后拍照、保存。2) SDS-PAGE电泳。预制胶浓度为5%~20% (Atto, 日本产) , Marker范围为10~250 k Da (Bio-Rad, 美国产) 。电泳完成后经考马斯亮蓝R250染色, 脱色。3) 凝胶过滤层析。对经过2种方法纯化后的蛋白质选用Hi Prep 16/60 Sephacryl S-100 HR和S-300 HR预装柱 (GE Healthcare, 美国产) 进一步确认其分子量。洗脱液为50 mmol·L-1、p H 7.0的磷酸盐缓冲液, 流速为15 m L·h-1, 标准品分子量为1.35~670 k Da (BioRad, 美国产) 。4) 蛋白质纯度测定。利用凯氏定氮法 (GB/T 5009.5-2003) 进行测定。每组试验重复3次取平均值。5) 最大吸收波长的测定。利用紫外可见光谱仪对蛋白质的最大吸收波长进行测定。6) β虾青蛋白二级结构的测定。在Jasco-725型圆二色光谱仪上进行圆二色光谱测量, 光源系统用氮气保护 (流量为15 L·min-1) , 试验均采用2 mm光程石英样品池。测量参数:扫描波长范围200~240 nm, 扫描时间50 nm·min-1, 分辨率0.1 nm, 响应时间1 s, 累积次数3次, 在室温下进行测定[16]。CD谱用平均残基摩尔椭圆度表示, 单位deg·cm2·dmol-1。利用圆二色光谱仪附带的杨氏法二级结构分析软件对二级结构含量进行计算[17]。

2 结果与分析

2.1 p H调节法分离蛋白质的回收率、溶解度和纯度

p H处理对蛋白质溶解度的影响呈现先下降后上升的趋势 (图1) 。当p H为3.0~5.0时溶解度呈逐渐下降趋势;p H为5.0~11.0时溶解度呈上升趋势;5.0~9.0时上升较为缓慢。酸性溶液中蛋白质溶解度在p H 3.0时最大为60.5%, 碱性溶液中蛋白质溶解度在p H 11.0时最大为55.7%;p H为5.0时溶解度最小为15.4%。

p H调节法对蛋白质回收率的影响趋势与溶解度一致。最大回收率为p H 3.0时的47.5%, 高于传统硫铵盐析的24.3%。同时, p H调节法所得β虾青蛋白的纯度经凯氏定氮法测得为78.23%, 也高于盐析法的74.06%。

2.2 β虾青蛋白的光谱性质

盐析法所得虾青蛋白粗品经高效液相分离纯化, 按洗脱先后顺序共有3个峰:1) 在20%B液条件下洗脱出, 在520 nm处有最大吸收, 被定义为α虾青蛋白;2) 在40%B液条件洗脱出, 在580 nm处有最大吸收, 被定义为β虾青蛋白;3) 在100%B液条件下被洗脱出, 在500 nm处有最大吸收, 被定义为虾青蛋白的变性产物 (图2) 。这与ZAGALSKY[14]的研究一致, α虾青蛋白在0.25mol·L-1浓度下被洗脱。而TIMME等[18]对南非龙虾 (Jasus lalandii) 的研究认为α与β虾青蛋白的洗脱浓度分别为0.4 mol·L-1和0.2 mol·L-1B液浓度, 且最大吸收峰分别为525 nm和560 nm。产生洗脱差异的原因仍需进一步研究, 初步推断是组成蛋白质的氨基酸序列和数量的不同所引起。

图3为不同提取方法获得的β虾青蛋白的紫外可见光谱图。可见2种方法获得的目标蛋白在最大吸收波长上无差异, 均为580 nm。TIMME等[18]发现南非龙虾壳中提取的β虾青蛋白的最大吸收波长为560 nm;ZAGALSKY[14]在对无脊椎动物中提取的类胡萝卜蛋白研究后指出, 美国龙虾壳中提取的β虾青蛋白的最大吸收波长为580~590 nm;CHAYEN等[19]研究发现欧洲龙虾 (Homarus gammarus) 壳中提取的β虾青蛋白的最大吸收波长为585 nm。不同地区虾壳中提取的β虾青蛋白最大吸收波长差异的原因仍需进一步研究。

标准蛋白质二级结构的圆二色光谱为:α螺旋在222 nm和208 nm处呈现负峰, 在192 nm附近显示一个正峰;β折叠在215 nm处呈负峰, 在198nm附近有一正峰;无规则卷曲则在198 nm有一负峰, 在220 nm附近有一正峰。试验得到的圆二色光谱可以看作一定百分比的α螺旋、β折叠和无规则卷曲的线性迭加图谱[20]。通过对比标准二级结构的远紫外圆二色光谱图, 试验结果显示β虾青蛋白二级结构主要是α螺旋 (盐析法) , 含量为65%~70% (25℃) (图4) 。p H调节法所得β虾青蛋白与传统盐析法提取的β虾青蛋白在二级结构含量上无明显差异, 分别为70.1%和67%。

2.3 β虾青蛋白的等电点与分子量

盐析法所得β虾青蛋白等电聚焦电泳仅显示1条条带 (图5) , 证明凯氏定氮中盐析法所得蛋白质纯度为74.06%是可靠的。以标准蛋白质等电点为对照计算得知β虾青蛋白等点电为5.6, 这也符合p H 5.0~6.0时蛋白质溶解度最低。

凝胶色谱结果显示, 在20%B液下收集的520 nm处有最大吸收峰, 被定义为α虾青蛋白的物质, 分子量为380 k Da;在40%B液下收集的580 nm处有最大吸收峰, 被定义为β虾青蛋白的物质, 分子量为45 k Da, 这与TIMME等[18]的研究结果较为一致。

聚丙烯酰胺凝胶电泳粗蛋白显示3个特征条带区 (图6) , 分布在相对分子量为350 k Da、75k Da和37 k Da处。β虾青蛋白是由2个分子量约为20 k Da的亚基组成的二聚物[14,19], 因此推断37 k Da附近的条带为β虾青蛋白。而α虾青蛋白是由8个β型组合而成的一个八面体结构[14,19], 因此350 k Da的条带推断为α虾青蛋白。75 k Da的条带仍需进一步研究, 推测为α型的降解产物[19]或是纯化过程中得到的其他蛋白质亚基[14]。2种方法纯化后的蛋白质在37 k Da附近的条带均被稀释, 说明SDS-PAGE不适合用来鉴定β虾青蛋白分子量。

3 讨论

蛋白质的溶解度对优化酸碱法回收蛋白质有决定性作用。在酸性或碱性条件时, 蛋白质由于携带不同电荷会发生沉淀或溶解的现象[21]。极端p H条件下, 由于强烈的排斥作用蛋白质很难发生沉淀 (尽管此时已有蛋白质发生变性) , 它会与水分子结合而使溶解度升高。当溶液p H处于蛋白质等电点附近时, 蛋白质净电荷为零而产生聚合现象使溶解度降低[19]。溶解度高有利于将目标蛋白从杂质中分离出来, 而等电点时的低溶解度则有利于提高目标蛋白的回收率[22]。从凡纳滨对虾壳中提取的β虾青蛋白溶解度曲线呈U型, 这与尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) [23]和南极磷虾[15]肌肉中回收的蛋白质溶解度曲线一致。随着p H的降低, 溶解度逐渐增加的原因是蛋白质在酸度系数2.5~7.0时比7.0~11.0含有更多的离子化基团[2]。

β虾青蛋白通过萃取和沉淀从凡纳滨对虾壳中获得, 在p H 3.0和11.0时其回收率约为40%~47%。PALAFOX等[22]使用p H调节法从巨型鱿鱼 (Dosidicus gigas) 中提取肌肉蛋白的回收率约为75%;KRISTINSSON等[24]采用p H调节法从石首鱼 (Micropogonias undulates) 中提取肌肉蛋白的回收率约为65%~78%。β虾青蛋白回收率较低的原因是虾壳主要由虾青素和几丁质构成, 蛋白质含量相对较低[25];CHEN和JACZYNSKI[26]报道了p H调节法提取蛋白质的回收率与溶液离子强度有关。类胡萝卜素在结合载脂蛋白后会增强其水溶性[10,12], 同时蛋白质在p H 3.0和11.0时的高溶解度会进一步提高β虾青蛋白的回收率。

p H调节法在目标蛋白的纯度和产量上均优于传统盐析法。这主要是由于p H调节法可以减少提取步骤从而降低杂蛋白的产量和不利影响。同时, 蛋白质具有酸碱基团的特性也有利于增加产量、提高目标蛋白纯度。

pH调节法 第2篇

控制分析试样的pH值对测定Fe2O3的分析结果的准确度有着非常关键作用。实际分析过程中, 一般通过用精密pH试纸来判断p H值, 操作起来不方便, 也难控制。本试验通过对调节试液pH值方法的改进, 使测定Fe2O3中调节试液的pH值快速又准确。

1 水泥试样Fe2O3的测定 (基准法) 中试液的pH值调节方法与该方法存在的弊端

在测定水泥试样中铁含量时, 要求pH值控制在1.8~2.0。在实际操作中, 是通过滴加氨水 (1+1) 与盐酸 (1+1) 来调节试液的pH至1.8~2.0, 如何检测只相差0.2个单位范围的pH值呢?国家标准中是用精密试纸或酸度计, 来判断所调试液的pH值。一般实验室很少有便携式酸度计, 而且便携式酸度计检测不方便, 特别是进行大批量分析铁的含量, 更加不方便, 所以大多数实验室采用精密试纸来判断。

但精密试纸检验不是很准确, 原因一:精密试纸要检验1.8~2.0这么窄的pH范围, 存在着视觉误差大, 特别对了初学者;原因二:在检验试液pH值时, 用水把试纸上粘有的试液冲回试液内 (否则待测试液就会有损失) 、或把试纸直接留在试液内, 都会对试液本色有影响, 且对后续实验有影响;原因三:用精密试纸检测次数多的话, 会使铁的测定时间过长, 不能及时出分析报告, 不利于指导生产, 同时给后面测三氧化二铝终点颜色判断带来影响。

2 调节PH值试验

2.1 试液情况

从试样浸出定容至250.00mL容量瓶中, 此时制备的试液酸度约为1.0mol/L~1.5mol/L范围 (由高温熔样时加入氢氧化钠的量与浸出时加入盐酸的量变化而变化) , 从制备的250mL容量瓶中, 移取25.00mL溶液放入300mL烧杯中, 加水稀释至约100mL, 此时试液的pH值为1.0~1.3。

2.2 调节PH试验

磺基水杨酸遇微量铁时, 与Fe3+生成的配合物的颜色与溶液的pH值有关。当p H值小于2.5时, 为紫红色 (以FeIn+为主) ;当p H值为4~8时, 为橘红色 (以FeIn-为主) 。

所以选择磺基水杨酸为指示剂, 滴加1-2滴磺基水杨酸, 加氨水调至试液刚好呈橘红色, 此时试液pH值为4.6~6.8范围内, 再用盐酸调回试液刚好为酒红色, 此时试液的pH值为2.9~4.0范围。再一滴一滴地滴加盐酸, 调到试液pH值为1.8~2.0范围, 但滴加多少滴盐酸, 才能调到此范围呢?考滤到滴管孔径大小, 分别选用不同的滴管滴加盐酸, 用酸度计测试试液pH值。以下的数据为试液调至酒红色后, 分别选用125mL胶头滴瓶滴管、75mL胶头滴瓶滴管、50mL胶头滴瓶滴管、2mL通用塑料滴管等孔径不同的滴管滴加盐酸, 滴加盐酸的滴数与对应的体积、所测量到的pH值, 情况如下。

1) 125mL胶头滴瓶滴管 (孔径大)

对应的体积为 (mL) : (1) 0.06, (2) 0.12, (3) 0.18, (4) 0.24, (5) 0.30, (6) 0.36, (7) 0.42, (8) 0.48, (9) 0.54, (10) 0.61, (11) 0.67, (12) 0.73, (13) 0.79, (14) 0.84, (15) 0.91;

测量的pH值: (1) 2.7, (2) 2.4, (3) 2.2, (4) 2.2, (5) 2.0, (6) 2.0, (7) 1.9, (8) 1.9, (9) 1.8, (10) 1.8, (11) 1.7, (12) 1.7, (13) 1.7, (14) 1.7, (15) 1.6。

2) 75mL胶头滴瓶滴管 (孔径中等)

对应的体积为 (mL) : (1) 0.06, (2) 0.12, (3) 0.18, (4) 0.24, (5) 0.30, (6) 0.35, (7) 0.42, (8) 0.48, (9) 0.54, (10) 0.60, (11) 0.65, (12) 0.71, (13) 0.77, (14) 0.83, (15) 0.89;

测量试液的pH值: (1) 2.5, (2) 2.3, (3) 2.2, (4) 2.1, (5) 2.0, (6) 1.9, (7) 1.9, (8) 1.8, (9) 1.8, (10) 1.7, (11) 1.7, (12) 1.7, (13) 1.6, (14) 1.6, (15) 1.6。

3) 50mL胶头滴瓶滴管 (孔径小)

对应的体积为 (mL) : (1) 0.04, (2) 0.08, (3) 0.13, (4) 0.17, (5) 0.22, (6) 0.27, (7) 0.31, (8) 0.35, (9) 0.39, (10) 0.44, (11) 0.49, (12) 0.53, (13) 0.58, (14) 0.62, (15) 0.66, (16) 0.71, (17) 0.75, (18) 0.81;

测量试液的pH值: (1) 2.9, (2) 2.6, (3) 2.4, (4) 2.3, (5) 2.2, (6) 2.1, (7) 2.1, (8) 2.0, (9) 2.0, (10) 1.9, (11) 1.9, (12) 1.8, (13) 1.8, (14) 1.8, (15) 1.8, (16) 1.7, (17) 1.7, (18) 1.7。

4) 2mL通用塑料滴管

对应的体积为 (mL) : (1) 0.04, (2) 0.08, (3) 0.12, (4) 0.16, (5) 0.20, (6) 0.25, (7) 0.29, (8) 0.33, (9) 0.37, (10) 0.41, (11) 0.44, (12) 0.48, (13) 0.52, (14) 0.55, (15) 0.59, (16) 0.63;

测量试液的pH值: (1) 2.9, (2) 2.6, (3) 2.4, (4) 2.3, (5) 2.2, (6) 2.1, (7) 2.0, (8) 2.0, (9) 1.9, (10) 1.9, (11) 1.9, (12) 1.8, (13) 1.8, (14) 1.8, (15) 1.7, (16) 1.7。

3 数据分析与结论

从试验数据可知:试液调至酒红色后, 使用不同的滴管滴加盐酸调节试液的pH值至1.8~2.0, 所消耗盐酸滴数与所对应体积为:125mL胶头滴瓶滴管, 滴数在5滴~10滴, 对应的体积为0.30mL~0.61mL;75mL胶头滴瓶滴管, 滴数在5滴~9滴, 对应的体积为0.30mL~0.54mL;50mL胶头滴瓶滴管, 滴数在8滴~15滴, 对应的体积为0.35mL~0.66mL;2mL通用塑料滴管, 滴数在7滴~14滴, 对应的体积为0.29mL~0.55mL。

根据以上实验数据来分析:应加8~9滴或体积.35mL~0.5mL盐酸, 此时试液的pH值就在1.8~2.0范围内。

通过本次实验研究, 水泥试样Fe2O3的测定 (基准法) 中用精密试纸来判断试液pH值的方法, 可改进为以磺基水杨酸为指示剂, 以氨水与盐酸调至试液为酒红色后, 再加盐酸8滴~9滴, 就可使试液的pH值在1.8~2.0范围内。本方法改进, 不仅缩短了Fe2O3的测量分析时间, 更重要的是增加了Fe2O3的测量的准确性。

摘要：水泥试样中Fe2O3的测定是水泥分析中的一个常规分析, 分析要求快速准确。本文通过对调节试液pH值方法的改进, 使测定Fe2O3中调节pH值快速又准确。

关键词：水泥,三氧化二铁,pH值

参考文献

[1]马振珠, 王雅明, 王瑞海主编.水泥实验室工作手册[M].北京, 中国建材工业出版社, 2010.

pH调节法 第3篇

1 pH值对菌体生长和代谢产物合成的影响

微生物生长的p H值范围很广, 大多数pH值在5~9之间, 其活动的pH值范围也存在最高、最适、最低三基点。pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面:一是影响酶的活性, 当pH值抑制菌体中某些酶的活性时, 会阻碍菌体的新陈代谢;二是影响微生物细胞膜所带电荷的状态, 改变细胞膜的通透性, 影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄;三是影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解, 从而影响微生物对这些物质的利用;四是pH值不同, 往往引起菌体代谢过程的不同, 使代谢产物的质量和比例发生改变。另外, pH值还会影响某些霉菌的形态。

根据不同微生物生长的最适pH值不同, 可将微生物分为嗜酸性、嗜碱性、嗜中性微生物;同种微生物的生长最适pH值和产物积累pH值往往不一致, 即使在产物积累阶段, 由于pH值不同, 也可能会得到不同的发酵产物。

2 柠檬酸深层发酵过程pH值的适宜范围

确定微生物发酵的最适pH值范围, 目的是促使发酵产物的产量最大。最适pH值是根据试验结果并经生产实践检验确定的。

柠檬酸发酵用的生产菌主要是黑曲霉, 为嗜酸性的微生物。黑曲霉的生长以及在发酵过程中的不同阶段都需要不同的酸度条件。理论研究和生产实践证明, 黑曲霉可以在很宽的pH值范围 (pH值1.5~11.0) 内发育, 但在 H值3~7之间比较适宜。黑曲霉发育的适宜pH值与培养基中的氮源有关, 在糖合成培养基中, 黑曲霉的分生孢子在p H值6.2~7.2之间发芽良好, 如果起始pH值<4.5时就会抑制分生孢子的发育, 在pH值<2.5时分生孢子甚至不能发育, 但如果pH值>7.5时, 分生孢子会剧烈膨胀甚至破裂。

对于不同原料的发酵培养基, 适宜发酵的初始pH值有较大的区别。试验证明利用黑曲霉在合成培养基 (去离子糖140g/L, NH4NO32.5g/L, Mg SO40.25g/L) 中发酵, 培养基需要用HCl调节到p H值2.5产酸效果最好。在发酵生产实践中利用糖蜜原料进行发酵的初始p H值要求在6.8左右。薯干粉培养基由于在发酵前期要利用黑曲霉丰富的酶系使培养基中的淀粉进一步转化成可利用的葡萄糖, 需要把初始p H值控制在糖化酶适宜范围之内 (糖化酶最适宜的p H值在4.0~4.6之间) , 一般要求其pH值在4.5左右。目前柠檬酸生产多采用玉米糖液 (玉米糖化后的过滤液) 发酵, 其初始pH值可在糖化过程中利用硫酸或者柠檬酸母液调节到4.8~5.2, 这样对糖液的过滤和发酵都很有利。

对于发酵进入产酸期的最适宜pH值, 试验研究和生产实践相一致。进入产酸气的pH值在3.0以上容易代谢产生副产物草酸, 由于葡萄糖氧化酶最适宜p H值为5.6, 在该pH值附近容易形成葡萄糖酸。黑曲霉合成积累柠檬酸是在p H值3.0以下进行的, 因此当菌体生长完成后进入产酸期要求p H值降到3.0左右是发酵成败的关键因素, 生产中最少要降到3.5才能实现高的产酸率。

发酵液中氮源和磷源种类或数量对发酵最适p H值有很大影响。例如, 以Na NO3、 (NH4) 2CO3、尿素为氮源时, 即使发酵液在p H值2.6仍然产生很多草酸, 最高达11.8g/L。这是因为在NO3-被利用, 碳酸铵和尿素被分解放出氮时, 会使细胞内微环境变碱。在磷酸盐含量少时, 蔗糖发酵起始p H值5与p H值2比较, 草酸比柠檬酸多;而碳酸盐含量高时, 不论p H值在什么水平, 所产生的柠檬酸极少而草酸很多。

总之, 发酵微生物生长的最适宜pH值范围取决于微生物的生态学特性、培养基的成分构成。发酵过程中的不同阶段也需要控制相应的最适宜pH值范围。

3 发酵过程pH值的变化

发酵过程中pH值的变化是微生物代谢反应的综合结果, 与培养基的组成、微生物的代谢途径有着密切的关系。培养基中碱性物质的消耗和酸性物质的生成自然会引起发酵液pH值的下降, 而酸性物质的消耗和碱性物质的生成又可引起pH值的上升。同时其他发酵条件的改变、菌体的自溶以及杂菌污染也将引起发酵液pH值的变化。因此, pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。

在柠檬酸深层发酵过程中, 随着生产菌种 (黑曲霉) 对培养基中碳、氮源的利用, 以及柠檬酸和其他代谢产物的积累, 在正常发酵过程中不同的发酵阶段p H值的变化具有一定的规律。一是发酵前期 (生长阶段) :菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质, 生成铵离子, 使pH值呈上升的趋势;但随着菌体量增多, 铵离子的消耗也增多, 但由于糖被微生物利用合成有机酸使p H值下降而进入产酸期。二是主发酵 (产酸阶段) :其变化与发酵控制的条件 (通风量) 和消泡剂的添加量有关。但由于柠檬酸积累量是影响pH值的主要因素, 正常发酵中这个阶段pH值趋于稳定。三是发酵后期 (自溶阶段) :随着养分的耗尽, 菌体蛋白酶的活跃, 致使pH值又呈上升趋势, 此时菌体趋于自溶而代谢活动终止。但大量柠檬酸产物的积累总的pH值没有明显的变化。

正常发酵过程中, 长菌期以后pH值的下降都能达到柠檬酸积累所希望的水平, 但pH值的下降速度是值得重视的问题, 不能降得太快, 否则会导致菌体生长不足和菌体早衰。尤其是在薯干粉直接发酵的情况下, 还对糖化酶活力有很大的影响, 使糖化不彻底导致发酵残糖过高, 产酸率下降。

引起发酵液pH值下降的因素: (1) 培养基中碳、氮比例不当。碳源过多, 特别是葡萄糖过量, 或者中间补糖过多加上溶氧不足, 致使有机酸大量积累而pH值下降; (2) 消泡剂加得过多; (3) 生理酸性物质存在, 铵被利用, pH值下降。

引起发酵液pH值上升的因素:①培养基中碳、氮比例不当, 氮源过多, 氨基氮释放, 使pH值上升;②生理碱性物质存在;③添加中和剂;④菌种退化和发酵过程中存在污染杂菌。

4 发酵过程中pH值的检测

发酵过程中pH值的检测十分重要, 只有通过检测pH值才能及时发现发酵p H值的变化规律, 判断发酵是否处在相应的最适宜pH值范围之内, 并及时做出相应的调节和控制。实际生产中, 通常采用pH试纸和pH电极对pH值进行测量。笔者所接触的多家柠檬酸生产企业均采用取样测量发酵pH值, 正常发酵每班间断取1~2次, 由于间断取样不能及时反映发酵过程的p H值, 不利于发酵控制, 而且多次取样会造成发酵液的浪费和环境的污染。目前已试制成功适合于发酵过程适时监测pH值的电极, 能连续测定并记录pH值的变化, 将信号放大输出并显示或者记录下来, 实现在线检测。

5 发酵过程中pH值的调节及控制

(1) 微生物生长增殖发育的pH值调节与控制。首先考虑和试验发酵培养基的基础配方, 使它们适当配比, 使发酵过程中的pH值在合适范围内变化。采用淀粉或薯干粉等原料的柠檬酸发酵过程, 淀粉的糖化和柠檬酸的合成与积累是处在同一个环境中, 都是由柠檬酸产生菌黑曲霉完成的。发酵的技术关键是兼顾糖化和产酸, 保证糖化速度和产酸速度之间的衔接与平衡。黑曲霉柠檬酸生产菌的酸化糖化酶的最适pH值为4.0~4.6, 随着pH值的下降, 尤其当pH值降到2.2时, 液化酶和糖化酶会大量被破坏, 而柠檬酸发酵的最佳pH值是2.0以下。要解决两者矛盾, 可采用下列方法:一是采用酸化平板驯化, 分离在高柠檬酸浓度下糖化酶活力高的菌株;二是通过调节风量来控制, 通常在16~18h前控制风量, 使pH值维持在有利于菌种生长和糖化作用的范围。

在薯干粉的柠檬酸发酵中, 初始不调节p H值, 为自然p H值, 约为5.5。当接入菌种后, 菌种生长繁殖消耗氮源和铵离子, 使培养基的p H值下降, 前期 (12h) p H值下降较快, 活力强的菌种培养12h, p H值可以降至2.3~2.5, 这时会有少量的柠檬酸产生, 但是由于发酵液固形物较多, 原料成分繁杂, 其中金属离子含量较多, 缓冲作用大, 再加上柠檬酸是3个羧基的有机酸, 氢离子释放是逐步的, 所以有时培养48h, 才能使p H值降至2.0以下。这样就有充分的时间让酸性糖化酶作用, 使原料中的淀粉糖化较彻底, 进而转化为大量的柠檬酸。当柠檬酸产量和残糖含量之和等于或接近起始还原糖时, 才能提高通风量, 迅速进入产酸期, 使p H值迅速降至2.0以下, 保证柠檬酸发酵的正常进行。

糖蜜原料本身有酸性的, 也有碱性的, 在黄血盐或其他方法处理前要根据不同的情况加以调节。为了得到较高和稳定的发酵产酸率, 调酸度时还要考虑加热时间的影响。对于酸性原料, pH值应调得比碱性原料高些, 因为它具有延时缓冲性, 它配制的培养基在灭菌后会酸化, 称为返酸, 而碱性原料的性质正好相反。pH值调节一般用H2SO4或Na2CO3, 参与调节范围为pH值6.0~7.2。

(2) 发酵进入产酸期pH值的调节与控制。为了确保发酵的顺利进行, 必须使其各个阶段经常处于最适pH值范围之内, 这就需要在发酵过程中不断地调节和控制pH值的变化。正常发酵过程中, 长菌期以后p H值的下降都能达到柠檬酸积累所希望的水平。如果达不到要求, 还可在发酵过程中补加酸或碱。过去是直接加入酸 (如H2SO4) 或碱 (如NaOH) 来控制, 现在常用的是以生理酸性物质 (NH4) 2SO4和生理碱性物质氨水来控制, 它们不仅可以调节pH值, 还可以补充氮源。

经试验证明, 黑曲霉偏好于无机氮, 当有机氮和无机氮同时存在时, 它首先利用无机氮。在无机氮中, 生理酸性氮比碱性氮好, 这是因为生理酸性氮中铵离子被利用后, 使培养基变酸, 可以使发酵中的黑曲霉生长阶段结束, 转入产酸阶段, pH值下降到较低水平有利于柠檬酸的积累。因此, 铵盐既可以调节代谢, 也可以控制pH值。简单的有机氮比复杂的好, 如尿素比氨基酸好, 氨基酸比蛋白胨好。在蔗糖合成培养基上, NH4NO3是最好的氮源。黑曲霉以同样的速度消耗2种氮, 所以培养基酸度不变。但糖蜜发酵培养基中还需添加少量NH4Cl。若原料中有机氮含量过于丰富, 菌生长代谢加快, 对缩短发酵周期有利, 但是不利于柠檬酸积累, 产酸率不高。这就是不能直接利用含蛋白质丰富的粗玉米粉的原因。

另据报道, 在柠檬酸发酵中途添加铵盐, 尤其是当发酵中柠檬酸生成速度开始下降时, 添加铵离子最为有利, 且对菌体无影响, 这种效应可能与铵离子对柠檬酸积累调节作用有关。近年来, 我国采用高浓度薯干粉发酵, 为缩短发酵周期, 提高柠檬酸产酸速率, 有时也添加0.01%~0.05%的 (NH4) 2SO4。

(3) 发酵过程通风量对pH值的调节作用。在薯干粉发酵中, 黑曲霉还担负着糖化的任务, 糖化的适宜pH值在4.0左右, 虽然工业上并不严格控制在4.0水平, 但在糖化基本完成之前, 必须控制低风量使p H值缓慢降到2.5, 这个过程需16~18h。当产酸量加上还原糖量接近起始可发酵总量 (其差比大于10g/hL) 时, 则可以认为糖化已经完成, 这时可适当加大风量使发酵进入产酸期。在产酸期内控制风量使产酸速率维持在2~3g/hL, 不得过快, 以进一步利用糖化作用和防止菌体过早衰老。

(4) 中和剂对发酵pH值调节的应用。为了防止p H值下降过快造成不利影响, 也可以在发酵的第18~40h加入少许Ca CO3 (5~10g/L) 以中和酸度, 但不得使p H值超过3.0, 否则会多产草酸。当用NH4+盐作为氮源时, 可在培养基中加入Ca CO3, 用于中和NH4+被吸收后剩余的酸, 但在操作中应注意控制染菌危险。

(5) 发酵过程pH值的自动控制。柠檬酸深层发酵过程中, 生产菌黑曲霉比生长速率和产物柠檬酸合成比生产速率分别有各自的最适宜pH值范围。因此, 应分阶段控制生长最适p H值和产物最适pH值。可把检测的pH值结果输送到pH值控制器以指令加糖、加酸或加碱, 实现自动控制, 使发酵液的pH值控制在预定的数值。

参考文献

[1]金其荣, 张继民, 徐勤.有机酸发酵工艺学[M].北京:中国轻工业出版社, 1989.

[2]张克旭.氨基酸发酵工艺学[M].北京:中国轻工业出版社, 1992.

pH调节法 第4篇

1 材料与方法

1.1 材料

250mL烧杯、250mL量桶, 100～1 000μL可调式移液器 (芬兰) 、pH值检测仪 (上海理达仪器厂) , 不同pH值的口蹄疫病毒培养悬液、7.5%碳酸氢钠溶液1 000mL。

1.2 方法

在室温环境下, 用量桶准确量取抗原液100mL置入烧杯内, 用pH值检测仪检测pH值, 然后用微量移液器添加不同量的7.5%碳酸氢钠溶液, 充分混合后测定抗原液的pH值。

2 结果

2.1 按抗原液体积的1%梯度添加时pH值的测定结果 (见表1、图1)

2.2 按抗原液体积的0.2%梯度添加时pH值的测定结果见表图

2.3 按抗原液体积的0.05%梯度添加时pH值的测定结果 (见表3、图3)

从图2、图3看, 7.5%碳酸氢钠溶液调节的pH值在7.4～8.4这个范围内呈线性相关, 且图3更加明显。

3 分析

3.1 对表3作进一步的统计学分析

3.1.1 相关系数法

对表3求和﹑积和平方、平方和后得出表4。

3.1.2 相关系数的计算具体如下:

计算得出表5。

3.1.3 相关系数的显著性检验

为了证明试验组样品相关系数r是相关系数ρ=0的无相关总体得来的组样, 还是从ρ≠0的有相关总体得来的组样, 即r存在的整体 (7.5%碳酸氢钠调节后的pH值) 在一定范围内是否存在线性相关, 故对相关系数r进行显著性检验。假设H0∶ρ=0, 由于r与ρ=0之差同r的标准差Sr的比值呈t分布, 故按下述公式t= (r-ρ) /Sr=计算相关系数的自由度 (df) , df=n-2=7-2=5, 计算出6组样品的t值及标准t值, 具体见表5。

3.1.4 小结

1号样品的t﹥t (0.05, 5) =2.571, 即P<0.05, 表明7.5%碳酸氢钠溶液添加量与调节后的pH值相关显著;2～6号样品的t﹥t (0.001, 5) =6.859, 即P﹤0.001, 表明7.5%碳酸氢钠溶液添加量与调节后的pH值相关非常显著。相关程度:1号样品r=0.756 9, 2～6号样品均在0.990 0以上。

3.2 回归分析

通过显著性检验已经证明, 用7.5%碳酸氢钠溶液调节后pH值呈线性相关, 为了能从一个变量的变化估测另一变量的具体变化, 因此建立回归方程来确定它们的函数关系。

回归系数即斜率的计算公式:b==

具体计算值见表5

由于试验过程有操作误差, 故6个样品的回归系数有所不同, 为了减少误差, 取6个样品回归系数的平均值作为总体回归系数 (即方程的斜率) , b= (b1b2+b3+b4+b5+b6) /6=1.088。

由于被测样品抗原液的pH值是不固定的, 因此直线的pH值即方程的a值是不固定的, 故直线的回归方程为:y=a+1.088x。式中:a为抗原液调节前的pH值;y为调节后的pH值, 根据工艺要求可确定之;x为7.5%碳酸氢钠溶液的添加量 (V/V) 。

4 结论

经统计学分析, 7.5%碳酸氢钠溶液的添加量与抗原pH值变化的相关直线方程为y=a+1.088x。将方程转换成x= (y-a) /1.088即可求7.5%碳酸氢钠溶液的添加量, 这样就可以精确地指导实际生产中pH值的调节。

溶液pH值的快速软件计算法 第5篇

1 计算溶液pH的经典公式法

对于酸碱溶液中H+浓度的计算,目前常用的方法就是所谓的公式法,至少包括27个以上的公式(我们将主要的公式列于表1)。尽管公式可以在一定程度上减少酸碱溶液中H浓度计算的难度,但是一方面由于不同的公式只能适合不同的类型的酸碱溶液;另一方面,每一种溶液类型的公式还包括所谓的精确式、近似式和最简式。因此,公式类型及溶液类型过多分类给公式法的使用带来很多不便,需要较多的训练才能达到熟练的程度,这些计算对于那些离校已久的在职人员更是一种挑战。所以,在接下来的内容中,我们将向大家介绍如何使用PeakMaster软件(免费的)实现酸碱溶液pH值的快速计算。

2 计算溶液pH的PeakMaster软件法

2.1 PeakMaster的下载、安装

登陆PeakMaster软件官方网址http://web.natur.cuni.cz/～gas/,在这个界面上就可以看到下载的网址,点击下载之后,将压缩包解压后,直接点击扩展名为.exe的文件夹即可立即使用,并且不用安装。此软件目前最新的版本是PeakMaster 5.3,最早的版本还有PeakMaster 5.0、 PeakMaster 5.1和PeakMaster 5.2,可以在网站上根据自己的需求任意免费下载。这个软件不仅可用于溶液pH的计算,还可以用于毛细管电泳分离实验的模拟和优化。

2. 2 PeakMaster的使用

2.2.1 PeakMaster的基本使用

这款软件使用起来也特别方便,其操作步骤如下:

双击运行软件→单击中的→单击→从数据库中找出待计算的物质,双击即可添加物质,然后在浓度栏中添加浓度(默认的浓度是mM,注意单位换算),如图1(a)所示→单击最下面中的进入下一个界面→单击第一行的,在整个页面的左下角即可出现此溶液的各种性质,如图1(b)所示,比如pH值、离子强度、电阻率、电导率等等各种性质。

2.2.2 PeakMaster中物质的添加

对于那些PeakMaster数据库找不到的酸性或碱性化合物,可以通过添加的方法更新数据库,主要是这些化合物的pKa和u值两个量。因此首先要搞清楚PeakMaster软件中各符号的意义。在PeakMaster中,pKa(-1),pKa(-2),pKa(-3)相当于传统意义上的pKa1,pKa2,pKa3;pKb(+1),pKb(+2),pKb(+3)相当于传统意义上的pKb1,pKb2,pKb3。所以,我们只需将pKa(-1),pKa(-2),pKb(+1) ……填入到相应的空格内,我们在填入pKa(-1),pKa(-2),pKb(+1)……的同时,还需要填入相应的淌度值,即u(-1),u(-2),u(+1)……

pKa值可以从《兰氏化学手册》中查到,pKb值是由“pKb=14-pKa”得来的。u可以查《兰氏化学手册》,从中得到极限离子当量电导值λ,根据u=λ/F,算出对应的u值。

下面以NaH2PO4为例来展示物质的添加过程:

磷酸为三元酸,因此磷酸有三级解离常数,分别为:

H3PO4=H++H2PO-4 pKa1=2.16

H2PO-4=H++HPO${}_4^{2-}$pKa2=7.21

HPO${}_4^{2-}$=H++PO${}_4^{3-}$pKa3=12.67

H2PO-4既可以作为碱结合氢离子,也可以作为酸电离出氢离子。作为酸,从《兰氏化学手册》查出它的pKa1=7.21,pKa2=12.67;作为碱,可以算出它的pKb1=14-pKa2=1.33。另外,从《兰氏化学手册》中可查得H2PO-4、HPO${}_4^{2-}$和PO${}_4^{3-}$的极限离子当量电导值分别为33、57和69,代入u=λ/F中,即可得到相应离子的淌度。

添加步骤:

单击→单击第一行的→单击下拉菜单中的“Modify database…”→单击左上角的→在Name栏填入物质的名字,然后填入相应的淌度值和pKa值→单击→点击右下角的“OK” →关闭此界面,进入正常的计算界面,计算方法如2.2.1中所述。将相应的数值填入其中即可,如图2所示。

2.3 PeakMaster计算溶液的pH值

2.3.1 单一弱酸(碱)pH值的计算

例如计算0.10 M HAC(pKa=4.76)溶液的pH。计算步骤如2.2.1所述,从图1中,可以看出,用PeakMaster算出来的结果与传统的计算方法算出来的结果一样,然而,用传统的计算方法,会将大量的时间花费在计算上,如果采用PeakMaster来计算,不仅简单而且准确。

2.3.2 混合酸(碱)pH值的计算

为了与现行的公式法相对照,将混合酸碱pH值的软件计算法分三种类型来讨论:

类型一:简单混合酸(碱)混合物。两种或多种同类的物质的pH计算,比如两种或多种弱酸、两种或多种弱碱等,对于这类物质,需要在添加完一种物质后继续按添加另外的几种物质,添加完之后,单击,即可得出混合溶液的pH值。

类型二:一般缓冲溶液(包括弱酸和强碱弱酸盐)pH的计算。例如计算0.040 M HAc-0.060 M NaAc溶液的pH。需要通过化学方程式的反应来进行相关计算,步骤如下:

HAc+NaOH=NaAc+H2O

0.060 M 0.060 M 0.060 M

在这里,可以把NaAc看成是由HAc和NaOH反应得来的,根据生成的NaAc的浓度,计算出HAc和NaOH的浓度均为0.060 M,因此,溶液中HAc的总浓度为0.100 M,NaOH的总浓度为0.060 M,然后按照两种物质的计算方法进行计算。

要计算0.025 M KH2PO4和0.025 M Na2HPO4溶液的pH值,也可通过与上述例子相似的方法进行计算。将KH2PO4 也可看成是H3PO4和KOH反应产物,将Na2HPO4看成是由H3PO4和NaOH反应产物,根据生成的磷酸盐的量推出参加反应的磷酸和碱的量,然后根据四种物质的计算方法进行计算。即有:

H3PO4+KOH=KH2PO4+H2O

0.025 M 0.025 M 0.025 M

H3PO4+2NaOH=Na2HPO4+2H2O

0.025 M 0.05 M 0.025 M

因此,混合液0.025 M KH2PO4和0.025 M Na2HPO4相当于0.05 M H3PO4、0.025 M KOH和0.05 M NaOH三种物质的混合,计算结果如图5所示。

类型三:硼砂缓冲溶液的计算。例如计算20 mM硼砂溶液的pH值。由于硼砂在酸性水溶液中会发生化学反应,因此我们可以根据它的生成物来计算硼砂的pH值,发生的化学方程式如下:

B4O${}_7^{2-}$+5H2O=2H3BO3+2H2BO-3

20 mM 40 mM 40 mM

从上面的方程式可以看出,我们可以将硼砂的浓度转化成H3BO3和H2BO-3的浓度,将二者的浓度输入到PeakMaster中,按两种物质进行pH值的运算。这里需要特别强调的是H3BO3是一元弱酸,但在某些较早出版的手册中,会把它错误地当成多元酸,而且错误地给出了多级离解常数值,这是在查找基础pKa数据时应当注意的地方。

3 结 论

将PeakMaster软件引入到溶液pH计算的教学中,可以缓解教学时数压缩对传统教学内容所造成的压力,从而为基础知识的传授和前沿知识的介绍提供了更加充足的教学时间。PeakMaster软件的使用还可为已经远离基础知识学习阶段且对很多基本公式已经淡忘的化学相关领域的工作人员,提供了一种快速计算溶液pH的途径。

参考文献

[1]大连理工大学无机化学教研室.无机化学(第五版)[M].北京:高等教育出版社,2006:112-130.

[2]彭崇慧,冯建章,张锡瑜,等.定量化学分析简明教程(第3版)[M].北京:北京大学出版社,2009:39-69.

[3]李克安,赵凤林,江子伟.分析化学的发展及教学改革[J].大学化学,1997,12(5):9-12.

[4]陈恒武.分析化学基础课教学与社会需求的调查和思考[J].大学化学,2009,24(6):6-11.

pH调节法 第6篇

p H试纸是检测溶液酸碱性的最方便的工具, p H试纸遇到不同酸碱性溶液时, 会显示不同的颜色, 可通过将其颜色与标准比色卡对照确定溶液的酸碱度, 使用十分方便。广泛p H试纸的检测范围是1-14, 以p H7为中性, 小于7为偏酸性溶液, 大于7为偏碱性溶液。次氯酸钠具有强碱性和强氧化性的特点, 当次氯酸钠液滴接触到p H试纸时, 试纸会迅速变色显示其p H值, 但由于次氯酸钠的强氧化性使得试纸的颜色继续发生变化。根据这一现象, 本文拟建立起p H试纸的颜色变化规律与药物浓度之间的简单直观的对应关系, 寻找快速有效的检测方法, 为生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂测试病原:

家蚕微粒子孢子:蚕育种与蚕病研究室继代保存, 配制成浓度108个/m L。

家蚕核型病毒多有体:蚕育种与蚕病研究室继代保存, 配制成浓度109个/m L。试剂:

次氯酸钠:佛山市顺德区康源日用化工有限公司生产, 分别配制成0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和1%5级浓度。

材料:

p H广泛试纸:上海三爱思试剂有限公司生产, 检测的p H值范围1-14。

仪器:

p H计PB-10:德国Sartorius股份公司生产。

1.2 方法

1.2.1 次氯酸钠溶液p H值测定

用p H计测定各浓度溶液的p H值。

1.2.2 次氯酸钠溶液p H试纸显色观察

用玻棒沾取少量药液滴于试纸中间, 观察药液在试纸上的颜色变化情况。

1.2.3 次氯酸钠溶液的消毒效果观察

分别吸取上述不同浓度药物4.5m L于10m L离心管内, 然后分别加入0.5 m L病原液 (孢子液或多角体液) , 振荡充分混合, 于混合后5min取混合液进行显微镜观察。

由图1可以看出, 浓度从0.1%到1%的次氯酸钠液, p H值均超过10.5, 呈强碱性, 且p H值随着药液浓度的增大而升高。

2.2 次氯酸钠溶液pH试纸显色观察

观察发现次氯酸钠溶液的p H试纸颜色变化因浓度不同而有差异, 变化的临界点在0.2%和0.3%浓度之间。

0.3%、0.4%和1%浓度药液的试纸颜色变化特征:药液滴于试纸的瞬间, 试纸上出现一个圆形水迹, 圆形水迹中间立即呈现深紫色 (1%溶液呈红紫色) , 而水迹边缘呈绿色;随后深紫色水迹的面积向内部迅速缩小, 在紫色与绿色边缘之间出现一圈浅色的环状带, 随着紫色的不断缩小, 浅色环状带的范围也相应地不断扩大, 30s左右, 水迹中间的紫色基本消失。

0.1%和0.2%药液的试纸颜色变化特征:药液在滴在试纸的瞬间呈现紫色, 液滴边缘呈绿色, 但随后中间紫色部分未出现缩小的现象, 也未能出现环状的浅色环状圈, 中间部分整体逐渐颜色变淡, 1min左右时, 中间的紫色基本消失, 呈现出接近试纸本身的黄色。

以上检测试纸在自然条件下继续放置5min后, 试纸均呈不同程度的漂白, 且随浓度升高漂白的程度越明显。

2.3 次氯酸钠对家蚕微粒子孢子的消毒效果观察

对家蚕微粒子孢子的消毒效果:相差显微镜观察发现, 0.1%和0.2%浓度试验区的少数孢子变黑, 多数孢子在相差显微镜下仍可见较明亮的光泽, 而0.3%、0.4%和1%药液试验区的孢子在相差显微镜几乎均呈黑色, 完全失去光泽。从反应试管混合液的颜色观察, 作用5min后, 0.1%和0.2%浓度试验区的试管混合液呈乳白色悬浮液, 而0.3%、0.4%和1%浓度试验区的试管混合液呈透明状。光学显微镜下观察发现, 0.3%及以上浓度试验区的孢子明显变薄变透明, 与活性孢子区别明显, 在检毒时有可能被忽视。

对家蚕核型病毒多角体的消毒效果:以上各浓度药液处理病原10s内, 肉眼均可见到病原-消毒液混合液从混浊变得透明, 取样进行显微镜观察, 未能见到完整的多角体。

3 讨论

次氯酸钠是一种高效广谱的蚕用消毒剂, 对家蚕各种传染性蚕病病原均有显著的消毒效果。但次氯酸钠也存在不足:有效成分易降解。据调查结果显示:原浓度为6.83%的次氯酸钠溶液, 在夏季室内自然条件下放置1个月后, 其有效浓度降至4.88%, 降幅非常大。因此, 从化工厂购置回来后, 次氯酸钠必须尽快使用, 否则, 放置一段时间后再按常规方法直接配制的药液难以保证浓度, 消毒效果自然受到影响。

由于次氯酸钠具有强碱性和强氧化性的特点, 课题组在用p H试纸检测次氯酸钠酸碱度时发现, p H试纸的显色反应有别于一般化学溶液的特征。次氯酸钠溶液在与试纸反应时, 首先表现出强碱性特点:试纸颜色立即呈现紫色。但紫色在试纸上的保留时间很短, 只需1min时间, 甚至更短的时间, 紫色消失, 从而表现出其强氧化漂白的特性。通过充分观察还发现, 药物浓度在0.2%和0.3%之间的p H试纸的显色反应有明显的差异。因此, 通过p H试纸的显色反应特点, 可以快速直观地判断药物的浓度范围。

根据本试验消毒效果观察发现:0.3%及以上浓度的次氯酸钠溶液对孢子的消毒快速明显, 只需作用5min, 在光学显微镜下, 孢子变薄变透明, 容易与正常活性孢子区别。而在相差显微镜下, 区别更加明显, 孢子完全变黑失去光泽 (根据相差显微镜的成像特点可知, 病原在相差显微镜下变黑失去光泽可判定该病原已完全失活) 。而0.1%及以上浓度的次氯酸钠溶液均可快速融解病毒多角体外壳, 杀灭病毒。

次氯酸钠最早的研究结果表明:在试验室条件下, 只需0.1%有效氯消毒10min即可使孢子失去致病力, 0.4%有效氯消毒30min可使微粒子孢子溶解消失。考虑到农村生产条件的复杂性, 推荐该消毒剂的使用浓度为0.4%。

pH调节法 第7篇

ICMA目前在我国临床诊疗工作中应用广泛, 然而尿p H是否影响其尿LH和FSH检测值尚不清楚, 使其临床应用受到一定限制。本研究旨在通过观察不同尿p H对尿LH和FSH检测值的影响, 建立尿p H对ICMA检测尿LH和FSH值影响的基础数据, 为ICMA检测尿LH和FSH的新技术应用于临床奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

酸度计及其配套缓冲剂购自上海仪电科学仪器有限公司, 酸度计型号为p HSJ-3F, 配套的3种缓冲剂分别为邻苯二甲酸氢钾缓冲剂 (p H 4.00, 批号2012-08) 、混合磷酸盐缓冲剂 (p H 6.86, 批号2012-08) 和四硼酸钠缓冲剂 (p H 9.18, 批号2012-08) 。Access全自动微粒子ICMA分析仪 (Dxi800) 及配套的LH试剂盒 (批号122971) 和FSH试剂盒 (批号122081) 均购自美国Beckman公司。

1.2 尿样的收集

尿样来源于自愿参与本实验的2例健康男性志愿者, 年龄分别为30和33岁, 肝肾功能、尿常规和尿微白蛋白检查均无异常, 在留取尿样期间亦未服用任何影响内分泌 (下丘脑或垂体等) 、肾功能、血液酸碱度的食物及药物。收集到新鲜过夜晨尿共1 100m L, 混合后等分为11份, 尿样收集后5 h内检测。

本研究得到志愿者同意并签署知情同意书, 经本院医学伦理委员会批准后实施。

1.3 质量控制

测量尿p H前选用两种缓冲剂对酸度计的电极系统进行两点标定。若测量的尿p H为2.5~6.5之间, 则在测量p H前使用邻苯二甲酸氢钾缓冲剂和混合磷酸盐缓冲剂进行两点标定;若测量的尿p H为7.0~10.5之间, 则在测量p H前使用混合磷酸盐缓冲剂和四硼酸钠缓冲剂进行两点标定。所有尿样均在同日同一台ICMA分析仪上进行尿LH和FSH的检测。考虑到尿样滴定前后容积的变化会影响到尿LH和FSH检测值, 故使用校正公式来校正尿LH或FSH检测值, 即尿LH或FSH检测值 (IU/L) = (滴定后尿样容积×滴定后尿LH或FSH检测值) /滴定前尿样容积;实验与结果中所列为滴定前尿LH和FSH检测值, 简称尿LH和FSH检测值。

1.4 尿p H滴定

使用盐酸或氢氧化钠将11份原尿样p H滴定至2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和10.5, 并记录滴定前后尿样容积的变化。

1.5 尿LH和FSH的检测

不同p H的尿样分别检测6次LH和FSH。LH和FSH浓度的灵敏度均为0.2 IU/L, LH浓度分别为1和2 IU/L时, 其批内差分别为5.2%和5.4%, 批间差分别为3.4%和3.8%, 总不精密度分别为5.8%和6.3%;FSH浓度分别为1和10 IU/L时, 其批内差分别为9.1%和6.7%, 批间差均为0%, 总不精密度分别为10.7%和8.2%。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 两两比较用Dunnett T3检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尿样p H滴定结果

原始尿样的p H为6.28±0.01, 用酸度计将尿样p H滴定至2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和10.5, 实际滴定p H分别为2.50±0.00、3.51±0.00、4.51±0.00、5.50±0.00、5.98±0.00、6.51±0.00、7.02±0.01、7.47±0.00、7.88±0.01、8.45±0.00和10.45±0.01。

2.2 尿LH和FSH检测值比较

p H 2.5~10.5范围内的尿样LH检测值与p H7.5 (LH和FSH标准品的p H) 的尿样比较差异无统计学意义 (P>0.05) ;p H 3.5~10.5范围内的尿样FSH检测值与p H 7.5的尿样比较差异无统计学意义 (P>0.05) ;在p H 2.5时尿FSH检测值明显下降, 与p H7.5的尿样比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。ICMA检测不同p H尿样的LH和FSH的均数和标准差见附表, 其箱式图见图1、2。

p H 2.5、p H 3.5、p H 4.5、p H 5.5、p H 6.0、p H 6.5、p H 7.0、p H 8.0、p H 8.5和p H 10.5的尿LH检测值占p H 7.5尿样的百分比分别为104%、109%、108%、105%、103%、100%、99%、99%、99%和99%, 尿FSH检测值占p H 7.5尿样的百分比分别为14%、89%、95%、101%、102%、102%、99%、100%、99%和95%。不同p H尿样的LH和FSH分别占p H 7.5尿样的百分比见图3。

注:1) 原始尿样的p H;2) 与p H 7.5的尿卵泡刺激素比较, P<0.01

3 讨论

目前ICMA检测技术不仅应用于成年运动员尿LH的检测[9,10], 近年来其检测范围亦逐渐扩大至儿童、婴儿甚至新生儿。MCNEILLY等[5]采用ICMA对161例4~19岁正常儿童随机尿进行LH和FSH检测, 认为其可用于临床青春期状态的评估。KUIJPER等[11]采用ICMA检测婴儿 (0~4个月) 自发性尿LH和FSH的研究显示, 自发性血LH与采血前18~20h的自发性尿LH的相关系数为0.507, 自发性血FSH与采血前18~20 h的自发性尿FSH的相关系数为0.704, 提示自发性尿LH和FSH能很好地反映血清Gn水平。DE JONG等[12,13]的研究显示, 极低出生体重儿 (男、女婴) 的尿LH和FSH在生后1~4周达峰值 (校正胎龄约32周) , 提示系列尿LH和FSH水平为其生后下丘脑-垂体-性腺轴的激活提供准确信息。可见, ICMA检测的尿LH和FSH可反映机体不同生理或病理情况的下丘脑-垂体-性腺轴功能状态。

但是, ICMA检测技术的初始开发和研究[14]的主要对象为人血清。正常人血p H为7.35~7.45, 而生理情况下尿p H较血p H波动范围大, 为4.6~8.0, 标本存放时间也对尿p H有一定影响。SAKETOS等[15]研究时间分辨免疫荧光分析法对不同储存条件下尿LH和FSH检测值的影响显示, 尿p H于4.5~10.5范围内对尿LH和FSH检测值无明显影响, 但p H 2.5时尿LH和FSH检测值明显下降。本研究显示, p H2.5~10.5范围内的尿p H对ICMA检测的尿LH检测值无明显影响, p H 3.5~10.5范围内的尿p H对尿FSH检测值也无明显影响;在p H 2.5时尿FSH检测值明显下降, 提示ICMA检测技术检测尿LH和FSH的尿p H适用范围, 不低于时间分辨免疫荧光分析技术。