pcr技术在食品安全

pcr技术在食品安全（精选14篇）

pcr技术在食品安全 第1篇

PCR及其改进技术在食品安全检测中的应用

当今社会，食品中存在的污染情况越来越严重。猪肉注水、奶粉掺假、蔬菜有机农药含量超标等等，严重影响着人们的身体健康。PCR改进技术可以简化检测步骤、提高检测精准度，具有操作简便、检测速度快、检测精度高等优点，在食品安全检测工作中的使用率高、使用范围广泛。

食品安全检测的主要内容

食品安全检测的内容比较复杂，涉及面广泛，主要的检测内容是：食品污染成分、食品营养成分、食品是否具有添加剂以及食品质量的总体检测等等。食品安全检测的指标主要包括：成分分析、农药残留分析、食品添加剂分析、微量元素分析和有害物质分析等。常用的食品安全就按册方法有两种：一种是传统的常规分析法，一种是仪器分析法。仪器分析法是食品安全检测中的最常用的方法。

食品安全检测人员对食品检测的检验要求有三部分内容：①要严格按照标准中规定的分析步骤依次进行，在实验室中，要对所有的不安全因素采取防护措施，其中，不安全因素都包括：爆炸、腐蚀、烧伤等等；②在实验室中，检测人员需要准确、详细地记录检测的方法和数据等信息；③在食品安全检测完成后，检测人员需要检测数据的统计和整理工作。

PCR及其改进技术概括

PCR的是指聚合酶链反应技术或者多聚酶链反应技术，常用于放大特定的DNA，主要优点有简洁、方便、敏感、重复性好和自动化等.传统的PCR技术在很多方面存在着不足，经过改进后有了很多较为明显的优点，但是，实时定量PCR技术和多重PCR技术在某些方面仍然有问题。使用实时定量PCR技术时首先需要有专门的仪器，技术成本高，存在的检测结果偏差大。多重PCR技术具有非特性结合问题，在使用多重PCR技术时如果不注意观察样本和样本之间的反应和作用，会发生假阳性或者假阴性的问题。

传统的PCR技术在食品检测中的具体应用

检测食品中所含成分。比如，人们在买肉的时候会考虑到肉里面有没有掺假、是否注过水、屠宰前的家畜有没有患有疾病等等。为了保证消费者的合法权益和身体健康，食品安全检测人员可以使用PCR技术方便、快捷的将食品中存在的不合格现象检测出来，降低食品安全隐患。

用于检测食品中的病菌。在1992年，有些相关报道中提出了PCR检测技术，经过多年的研究和实践，将PCR技术应用到食品安全检测中得到了很大的回响。用PCR技术检测食品中携带的病菌，例如，猪羊牛肉中的大肠杆菌。

检测食品中包含的营养成分。随着人们生活水平的逐渐提升，人们越来越注重养生。食物中含有的营养成分和主要物质都是人们关心的重点。在走亲访友的时候，一般会送老人和孩子营养价值比较高的礼品。有很多经过加工的食品，人们对肉眼看不出食品质量的好坏，那么如何判断食品中含有的营养成分，就需要食品检测人员使用PCR技术进行检测。

PCR改进技术在食品检测中的具体应用

PCR-DGGE在食品检测中的应用。DGGE技术又称变性梯度凝胶电泳技术。PCR-DGGE技术是一种聚合酶链反应技术和变性梯度凝胶电泳技术结合在一起的新技术，具有敏感性高、特异性强的优点。使用PCR-DGGE技术进行食品检测技术，可以将食品中DNA提取出来，利用食品的基因和食品的核酸对食品进一步的监测。比如：利用PCR-DGGE技术对奶酪进行检测，可以检测出奶酪中存在乳杆菌、乳酸菌和乳球菌包括污染物等等。

实时定量PCR技术在食品检测中的应用。实时定量PCR技术是在PCR技术的基础上，结合荧光信号来进行实时检测。实时定量PCR技术主要采用的是完全闭管检测，实时定量PCR技术是PCR改进技术中操作最方便、结果最准确、用时最短的一种。在各种食品安全检测中得到了广泛使用。

多重PCR技术在食品检测中的具体应用。多重PCR技术是在传统、单一的PCR技术基础上改进后的技术。多重PCR技术一次可以?z测出多种病菌，像是大肠埃希菌、沙门菌属、霍乱弧菌等菌类均可一次检测出来。多重PCR技术操作简单、快速、结果精准，多用于对番茄、大豆、玉米等转基因食品的检测中。

随着毒豆芽、瘦肉精、地沟油等各种食品污染问题的产生，人们对食品的质量产生了很大的怀疑。一些黑心商家只注重经济效益，违规经营，生产食品质量不合格。通过对食品进行安全检验，分析食品中所含的成分和营养比例，促进食品事物的健康、安全发展，提高人们的饮食安全。在食品安全检测工作中使用PCR技术可以很大程度上解决食品安全中存在的问题。

作者简介：

陈冬梅，硕士，伊犁州食品药品检验所，高级工程师，食品负责人

pcr技术在食品安全 第2篇

多重PCR技术在病原检测中的应用

多重PCR能够同时扩增不同片段,具有普通PCR方法不可比拟的优势.简要论述了多重PCR在细菌病原体的检测、病毒病原体的检测、支原体和衣原体及寄生虫的检测、微生物耐药性检测等方面的应用,分析了多重PCR的.影响因素及条件优化,并进一步综述了多重PCR的应用前景.

作 者：赵红庆 苑锡铜 黄留玉 ZHAO Hong-qing YUAN Xi-tong HUANG Liu-yu 作者单位：军事医学科学院,疾病预防控制所传染病控制中心,北京,100071刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：18(5)分类号：Q503 R372关键词：多重PCR 病原 检测 影响因素

pcr技术在食品安全 第3篇

聚合酶链式反应技术即指PCR技术, 起源于1985年, 该技术是通过体外特定基因或者DNA序列的扩增而实现食品的检测, 具有一定的精确性与快速性, 基因克隆与转基因的检测是其最早的应用领域。近几年来, 食品安全检测中PCR技术的应用也越来越成熟与广泛。随着我国社会经济的迅猛发展, 人们对食品安全的要求也越来越高, 这就为PCR技术带来了极大的发展空间, PCR技术的发展具有十分良好的发展前景。

PCR改进技术在食品安全检测中的应用

定时定量PCR技术

将荧光基团加入PCR反应体系, 借助荧光信号实现实时检测PCR进程的积累, 最终利用标准曲线来定量位置未知模板, 这就是定时定量PCR技术。采用完全闭管检测是定时定量PC技术的特点, 不需要进行PCE后处理, 仅依靠实时检测以及稳定无干扰的荧光激发光源就可以实现检测, 显然这就使交叉污染的问题得以避免。检测的整个过程不会耗费过多的时间, 并且其操作也具有一定的便捷性与准确性。在进行食品加工时, 该技术在各个方面的应用都具有十分重要的意义。

多重PCR技术

多重PCR技术实在单一PCR技术的基础之上, 通过改进而得到的一种技术。相比于传统的单一PCR技术, 多重PCR技术在效率、经济性与系统性等方面都有着显著的优势。该技术起源于1988年, 经过长期的发展, 逐步应用到生物医药方面, 对于生物医药领域的发展有着十分重要的意义。近几年来, 多重PCR技术在食品检测领域中的应用越来越广泛, 起到了十分重要的作用。

PCR-DGGE技术

PCR-DGGE技术的首次提出是在1989年, Sheffie将PCR技术结合了变形梯度凝胶电泳技术, 即DGGE技术, 可将具有相同长度与不同碱基的DNA片段混合物进行分离。在适当变形条件下, PCR-DGGE技术借助两种技术的结合来实现碱基对的分辨, 具有很强的特异性以及较高的敏感性。在食品微生物检测中, PCR-DGGE技术的应用流程首先是食品样品RNA或者DNA的提取, 将保守的基因片段作为模板, 样品中微生物的DNA或者RNA会受到特异性引物的影响而进行PCR或者逆转录PCR扩增, 扩增后的核酸进行电泳而得到指纹图谱, 指纹图谱中有纯化与序列分析的重要内容, 即多种微生物相对应的一系列条带, 以此就能够对微生物的种类进行鉴定。

PCR改进技术存在的问题与优化措施

目前, 随着社会经济的迅猛发展, 人们对生物科技以及食品安全有着更高的要求, 这就必然会出现更多的PCR改进技术, 并且现有的PCR改进技术也必然得到优化。具体介绍如下:

定时荧光定量PCR技术的问题与改进

该技术在检测的过程中会到不同因素的影响, 例如细胞裂解效率、m RNA的部分降解、PCR产物长度的长短等, 导致其定量结果受到一定的影响。因此, 为了避免这一问题, 在进行检测的过程中就必须验证设计引物的特异性, 并优化检测条件。此外, 该技术采用的仪器设备成本较高, 例如专门的定时定量PCR仪器, 因此必须加强研究, 使仪器成本降低, 并保证分析的灵敏度与实验的重复性, 同时使样品制备朝着简单化、程序化与机械化的方向发展, 使检测效率与检测成本同时得到充分的保障。

多重PCR技术的问题与改进

多重PCR技术存在的问题为在食品检测的过程中, 会受到引物的抑制、其他模板间与引物存在非特异性结合等。因此, 如果食品安全检测采用了多重PCR技术, 就需要对引物以及模板间的作用因素进行充分考虑与细致的分析, 使引物设计与PCR反应条件得以最大程度的优化, 进而降低假阳性与假阴性结果出现的概率。

PCR-DGGE技术的问题与改进

由于食品成分具有一定的复杂性, 在采样与样品处理使一旦操作不当, 就容易造成DNA提出偏差的问题, 进而影响模板与扩增引物的选择。因此, 必须限制DGGE处理片段的大小, 降低控制在500bp以内。此外, PCR-DGGE检测的分析结果还会受到各种因素的影响, 进而影响到其检测范围。为了使r DNA电泳图谱混杂的情况得以避免, 对其进行测序是最好的方法, 还有改变16Sr RNA的可变区也是可行的。

结束语

pcr技术在食品安全 第4篇

关键词：PCR技术 食品检测 微生物 多重PCR技术

中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）04-0014-02

1 概述

PCR多聚酶链式反应（polymerase Chain Reaction），是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术。自从其问世就快速的应用于食品科学的许多领域中。

2 PCR技术

2.1 PCR技术的原理和基本步骤

2.1.1 PCR技术的原理

PCR技术的基本原理是在体外对已知的，待扩增的双链DNA片段，人工合成与该DNA两条链末端互补的两条寡核苷酸引物，在体外将待检的DNA序列在酶促作用下进行高效扩增。

2.1.2 PCR技术的主要检测步骤

PCR技术的主要检测步骤包括：运用化学手段对目标DNA提取，设计并合成引物，进行PCR扩增，克隆并筛选鉴定PCR产物，DNA序列分析。

2.2 PCR技术的优点

（1）快速，PCR技术用于食品检测，仅一天就能完成检测。（2）灵敏，PCR技术能够比较准确的检测出食品中的微生物，可以避免传统检测分离所有微生物的困难。（3）操作方便，PCR技术检测食品的操作简单方便，仅一人就能完成检测。

3 PCR 技术在食品检测中的应用

3.1 食品中成分种类及有效成分的检测

进行食物中动物成分种类的鉴定，是为了防范某种特定的动物病，例如：上个世纪的疯牛病，食品、药品、饲料中的牛源性成分开始受到严格限制，2004年，李林等应用PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成分种类。进行食品有效成分的检测是因为食品中各种营养成分有了数字指标。特别是对于那些加工后的食品，如果通过传统的方法，不能判断出食材的优劣以及相关成分，而PCR技术则不受限，对于加工后的产品有效成分的鉴定有重要的作用。

3.2 PCR技术在食品微生物检测中的应用

3.2.1 PCR技术检测食品微生物的优势

PCR技术的优势是监测时限短，操作简单，灵敏度高。例如在单核细胞增生李斯特氏菌检测中，在金黄色葡萄球菌的检测中，在顽固性梭状芽孢杆菌的检测中都显现出较之传统技术其具有极高的特异性和敏感性的特点。

3.2.2 传统PCR技术及其在食品微生物检测中的应用

PCR技术在食品检验中最早是用来监测食品中的病原体，但是传统PCR检测技术需要依赖不同类型的后处理过程来解决假阳性污染和定量准确度的难题。而且处理过程繁琐，可能产生有害物质，影响操作者的健康，所以近年来，PCR改进技术迅速发展起来，通常采用传统常规型与改进型相结合的方法进行研究。

4 PCR 改进技术在食品检测中的应用

4.1 实时定量PCR技术及其在食品检测中的应用

实时定量PCR技术是在反应体系中加入荧光染料或者荧光探针，通过信号的积累来监测整个进程，然后再通过标准曲线对未知的模板进行定量分析的方法。有很多优点：快速灵敏，操作方便，全封闭反应，减小环境污染，不使用有毒试剂，操作安全，定量准确，监测结果直观等优点。

4.2 多重PCR 在食品检测中应用

4.2.1 多重PCR技术在食品病原微生物检测中的应用

食品污染的病原菌包括多种，例如：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌等。在检测时，易受其他微生物和本身的变异株的干扰。使实验结果呈现出假阳性和准确率低的现象。目前研究多采用多重PCR检测。如：肠出血性大肠杆菌利用多重PCR检测与传统的血清学方法检测相比，更高效灵敏。沙门氏菌利用多重PCR检测，可以提高食品沙门氏菌的检测率，还可以鉴定沙门氏菌的血清型和突变情况。金黄色葡萄球菌利用多重PCR检测，虽然检测结果与免疫学检测结果基本一致，但是多重PCR还可以检测一些免疫学方法不能检测的肠毒素基因。多重PCR在复杂的食品样品检测中有很好的重复性和高度的敏感性表明其是检测食品致病菌的可行性方法。

4.2.2 多重PCR技术在食品非致病菌检测中的应用

乳酸菌（LAB）是真空环境下存在的主要微生物，对致病菌的生长有着较强的抑制作用，但是乳酸菌的存在也是食品腐败的信号。乳酸菌在真空的包装中含量一般都很低，Yost等（2000）用16S rRNA、16S-23S rRNA ISR建立多重PCR检测与真空包装牛肉产品腐败相关的乳酸菌，Kye等（2006）用种特异性基因代替16S rRNA设计引物同时检测韩国泡菜发酵过程中的10种重要的LAB，随发酵的时间和菌群的变化多重PCR的检出率不断提高，试验建立的多重PCR技术重复性好，同时又解决了16S rRNA不能有效检测韩国泡菜乳酸菌的问题。

5 PCR技术在应用过程中可能存在的问题及解决方法

5.1 应用过程可能存在的问题

样品的预处理、样品DNA的提取等具体的操作过程可能会遇到不同的问题，PCR的反应过程中具体的操作，比如确定退火的温度、适温延伸时间的长短和循环数的确定等问题都是复杂的。

5.2 解决方法

在不同的反应体系中，为避免假阴性、假阳性的现象的出现，应该确定好与之相适应的反应条件。试验操作要规范化。在检测前，要进行预实验来进一步完善检测方法。

6 结语

PCR检测技术作为现代生物学技术的手段应用于食品检测，克服了传统检测方法的缺点和不足，尤其方便快捷，灵敏度高的特点，如果可以克服其缺点，前景一定会很广阔。

参考文献

[1]刘红芳，宋慧. PCR及其改进技术在食品微生物检测中的应用[J].现代化农业，2012，26（5）：34-36.

PCR技术在微生物鉴定中的应用 第5篇

课程论文

学

院: 课

程: 学

号:

姓

名:

植物保护学院

昆虫分子生物学

任课教师:

职称:

教授

成 绩:

2015年8月29日

PCR技术在微生物鉴定中的应用

摘要 随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，特别是在微生物检测中的应用。细菌16S rDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表型鉴定更高，从鉴定的准确率来看，其具有的优势毋庸置疑。同时，随着微生物检测技术的不断发展,BOX-PCR技术在微生物的多样性研究中也已得到应用。使用真菌ITS区域序列通用引物PCR扩增和DNA序列测定的方法，简便快速、成本低稳定性好、结果可靠，适合实验室常规使用，可用于常见的和疑难真菌菌种快速鉴定。

关键词 PCR；16S rDNA；BOX-PCR；ITS；细菌；真菌

PCR(polymerase chain reaction, PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成扩增特定DNA片段的方法，1985年美国Karray等学者首创了PCR技术并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖、环境科学、食品安全等领域，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库、遗传病传染病的诊断、法医学鉴定、物种起源、生物进化分析、流行病学调查等。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR（mutiplex，PCR）技术[4]、实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）技术[5]、单分子PCR技术[6]等。PCR技术原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列，人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸，引物在体外将待检DNA序列模板在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’~3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后合成了新链可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中扩增产物的量，以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR技术在细菌鉴定中的应用

pcr技术在食品安全 第6篇

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种已知全序列的重要模式生物,具备单双倍体特性、乙醇耐受性强、高效体内重组的能力、可操作性强等优点.同时酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物,各种遗传操作技术业已成熟,因此它在基因操作和生物能源方面是首选的研究对象.以PCR为基础的基因破坏方法第一次在酿酒酵母中被报道后,其方法和技术得到了迅速的改进和发展,目前在酵母中已经广泛应用.文章主要介绍这种方法在酿酒酵母中应用的`基本原理和研究方法,以及与其他传统基因破坏方法相比较的优缺点、存在的问题等.说明以PCR为基础的基因破坏方法能够避免繁琐的基因克隆操作,省时、省力、方便.

作 者：龚根强 崔玉东 张薇 杨科 Gong Genqiang Cui Yudong Zhang Wei Yang Ke 作者单位：龚根强,崔玉东,Gong Genqiang,Cui Yudong(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆,163319)

张薇,Zhang Wei(河北省产品质量监督检验院)

杨科,Yang Ke(河北中润制药有限公司)

实时荧光定量PCR技术综述 第7篇

实时荧光定量PCR技术综述

实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的.一种高度灵敏的核酸定量技术.与传统PCR相比,实时定量PCR能够更加快速、灵敏,并有效地对核酸进行定量检测.

作 者：邓文星 张映 Deng Wenxing Zhang Ying 作者单位：山西农业大学动物科技学院,太谷,030801刊 名：生物技术通报 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN年，卷(期)：“”(5)分类号：Q5关键词：实时荧光定量PCR 标准曲线

PCR技术在食品检验中的应用 第8篇

1 常规PCR检测

常规PCR检测原理是在存在DNA模板、引物、d NTP、适当缓冲液和Mg Cl2溶液的反应混合物中, 在热稳定DNA聚合酶的催化下, 对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火 (复性) 、延伸等三步反应为一个周期, 循环进行, 使目标DNA片段得以扩增。其三个基本反应步骤为: (1) 模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后, 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离, 使之成为单链, 以便它与引物结合, 为下轮反应做准备; (2) 模板DNA与引物的退火 (复性) 模板DNA经加热变性成单链后, 温度降至55℃左右, 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; (3) 引物的延伸DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下, 以d NTP为反应原料, 靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理, 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这就完成了一个PCR循环, 新合成的链都可作为下一次反应的模板, 因此扩增产物的量是以指数级方式增加[5,6,7]。

2 多重PCR

多重PCR是PCR技术的一种, 是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物, 同时扩增多个目的基因或DNA序列。首先将双链DNA热变性成单链DNA, 然后, 人工合成的引物与单链DNA靶序列结合, 在4种碱基d NTPs底物存在下, 在DNA聚合酶作用下, 引物沿着DNA单链从5′末端到3′末端方向延伸, 合成新的双链。新合成的双链又作为模板, 重复上面的聚合酶反应, 合成新的DNA双链, 经过20~35个循环扩增出大量拷贝。

2.1 多重PCR的特点。

高效性;系统性;经济简便性。

2.2 多重PCR在食品微生物检测中应用。

(1) 多重PCR在食品病原微生物检测中的应用。食品污染的病原菌主要包括肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、耐药球菌等, 在检测这些微生物过程中, 很容易受到其它微生物和本身变异株的干扰, 造成假阳性和准确率不高的现象。目前, 越来越多的研究使用多重PCR检测这些病原菌。 (2) 多重PCR在食品非致病菌检测中的应用。乳酸菌 (LAB) 是真空环境下的主要微生物, 真空食品包装中的乳酸菌含量一般很低, 但它可以在储藏过程中繁殖。采用多重PCR方法检测真空包装中的微生物对检测食品腐败有重要意义。 (3) 多重PCR技术在食品微生物检测中存在的问题。多重PCR在食品微生物的检测中可能存在多对引物之间的相互抑制, 引物与非靶序列的结合产生非特异性扩增。因此, 在多重PCR的应用中, 如何合理设计引物, 优化最佳多重PCR体系及反应条件可以减少非特异性扩增、假阴性、假阳性结果。

2.3 RT-PCR。

逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 的原理是提取组织或细胞中的总RNA, 以其中的m RNA作为模板, 采用Oligo (d T) 或随机引物利用逆转录酶反转录成c DNA。再以c DNA为模板进行PCR扩增, 而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级, 使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

2.4 巢式PCR。

巢式PCR (nesting PCR) 是指先后用两套引物进行扩增的PCR技术, 用内外两对引物先后扩增靶基因片段。通常是先用第一套引物扩增15~30个循环, 再用已扩增的DNA片段内设定的第二套引物扩增15~30个循环。

2.5 免疫-PCR。

免疫-PCR由Sano等首创, 是指用DNA分子作为标记物, 在做一般的免疫反应的同时进行PCR扩增和电泳分析的免疫试验。在免疫-PCR中, 多用生物素作为连接分子。生物素具有两个独立的结合位点, 一个可与DNA分子结合, 另一个能与抗原2抗体复合物上的亲和素结合, 由此将DNA分子和抗原-抗体复合物专一性地连接在一起, 形成抗原-抗体-亲和素-生物素-DNA复合物, 然后加入PCR扩增系统, 标记的DNA便可。

2.6 荧光定量PCR。

实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术 (FRET) 应用于常规多聚酶链式反应仪中, 通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用, 能量从供体发色团转移到受体发色团, 受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比, 检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度, 从而达到定量目的。

2.7 热起动PCR。

热起动PCR指的是使Taq DNA聚合酶只在样品温度超过至少70℃时才发挥作用的PCR。热起动可减少非靶序列的扩增, 从而提高反应的特异性。热起动的基本方法是在进行PCR反应之初, 将Taq DNA聚合酶、氯化镁和引物这些DNA合成所必需的关键性试剂先不要加入样品管内;而将样品管加热, 待温度上升至70℃以上时。再将上述试剂加入, 开始PCR反应。

3 结论

食品安全受到人们的广泛关注。食品在生产、包装、运输、销售等环节都会受到微生物得感染, 对微生物的检测是食品安全检测中的一个中要组成部分, PCR技术的广泛使用可以很好的对微生物进行检测, 解决人们的食品安全问题。而PCR技术也随着近几年技术的不断进步, 不断进行了改进, PCR技术都在食品检验中发挥了重要作用。

参考文献

[1]王华, 刘斌.PCR技术在食品微生物检测中的应用[J].生物技术通报, 2010, (2) :63-67.

[2]朱昊浩.基于生物技术的快速食品检测研究动态[J].科技资讯, 2011, (9) :2-2.

[3]王文娟, 周明东, 姜彦君等.食源性致病菌快速检测试剂盒的研制[J].中国食品学报, 2012, 12 (2) :144-150.

[4]张京宣, 梁炜, 曹秀芬等.食品检测中PCR改进技术的应用[J].中国农业信息 (上半月) , 2011, (11) :92-93.

[5]汪月霞, 赵会杰, 赵一丹等.PCR方法检测食品中沙门氏菌研究进展[J].安徽农业科学, 2009, 37 (24) :11435-11436, 11445.

[6]刘辉, YANGLi-ping, 张滨等.PCR及其改进技术在食品检测中的应用[J].食品与机械, 2008, 24 (4) :166-169.

pcr技术在食品安全 第9篇

关键词：PCR 原理与技术 食品检验 应用

中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0038-01

1 引言

上世纪80年代中期，分子生物学领域诞生了一项新技术，称作DNA体外扩增法，简称为PCR技术。其基本原理是在生物体的体外，对指定DNA双链片断进行扩增。第一步：挑选出指定DNA双链片断，人工合成指定DNA双链片断端头邻近序列互补的寡核苷酸片断，将该互补片段称作引物（Primer），引物也是双链结构，分作左端引物和右端引物。第二步：加热指定DNA双链片断，使之发生变性，分裂成单链，把左右引物与之分别配对进行互补结合。第三步：在DNA聚合酶和4种dNTPs底物的共同作用下，引物沿模板DNA链按5/→3/方向延伸，合成DNA双链，这个步骤被称为DNA多聚酶链反应。第四步：以新合成的DNA双链作为扩增模板，重复DNA多聚酶链反应步骤。历经25～35次循环，可将DNA序列扩增到近百万倍。该技术具有特异性强、灵敏度高、扩增快速准确等优点，自诞生之日起，其实用性在医学、农学、环境科学、食品检验等领域得到了很好的印证。

2 PCR技术在食品检测方面的应用

2.1 PCR技术的检测原理

PCR技术最根本的鉴定依据是生物的DNA结构具有唯一性。在食品检测中，起到鉴定标准模板作用的是引物，从理论上说，①如果引物来自DNA保守区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA保守区的片段；②如果引物来自DNA特异区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA特异区的片段。以上两种理论依据就是PCR技术的检测原理。

在实际应用中，人工有选择地截取DNA片段，使用DNA多聚酶链反应，可以在2～3小时之内达到常规检测需要数天才能达到的培养效果，另外还省去了繁琐的种属鉴定等工作，简化了检测流程。

2.2 PCR技术的操作程序

（1）待检样品的浓集（增菌）。食品中待检的微生物群落浓度一般都是比较低的，达不到检测要求。这就需要进行待检微生物的浓集。

（2）核酸的提取。为了实现PCR扩增，必须提取待检样品的核酸。常用的处理方法包括：加热、反复冻融、化学裂解。

（3）PCR扩增。在扩增过程中，最关键的莫过于引物，它直接关系到PCR检测的成败。扩增需要20—40个反应循环，每个循环都由高温变性、低温退火、适温延伸组成。高温时，氢键打开，双链变为单链，生成扩增模板；低温时，左引物和右引物分别与模板DNA的2条单链做互补结合，完成配对；适温时，在聚合酶作用下，4种三磷酸脱氧核苷（A、T、G、C）按碱基互补配对原则不断进行配对添加，按5/→3/方向自动合成新的DNA双链片段。

变性温度一般需保持在94℃左右，如果待扩增区域DNA的G+C含量太高，则可考虑适当提高变性温度。

退火温度与引物的G+C含量有关，根据公式：Ta=4×（G+C）+2×（A+T）-5。

延伸温度一般需保持在72℃左右，此时DNA聚合酶的聚合速度约1000（碱基）/min。

（4）扩增产物的检测。常用的检测方法为琼脂糖凝胶电泳法，琼脂糖质量分数在0.8%～2%之间。待分离DNA片断的分子量越小，所需琼脂糖质量分数则越大，反之亦然。

3 PCR技术用于食品检测的优缺点

3.1 PCR技术的优点

传统检测方法多采用平板培养法，通过菌落计数来判断菌体浓度。传统方法的优点是操作简单，其最大的缺点是消耗的时间太长，检测周期一般在3——10天。

PCR技术的最大优点就是检测速度快，使用特异区扩增检测，只要在几个小时内成功扩增，即可检验并判断出待检测样品的种类，非常迅捷、灵敏。

3.2 PCR技术的缺点

任何事物都不是完美的，PCR技术一样存在缺点，正是这些缺点的存在，导致其不能完全取代传统检测法。其主要缺点包括：（1）假阳性问题。核酸受到污染而造成假阳性的问题，是PCR技术的最大缺点。这个缺点来自扩增本身，在扩增的过程中，即使只有一个污染源，结果也会出现成十万成百万倍的污染现象，造成检测结果出现阳性，称之为假阳性。

防止假阳性问题，目前只有做好隔离这一种办法。（2）假阴性问题。假阳性问题来自PCR技术本身，假阴性问题则来自待测样品。食品成分复杂，其中多种成分发生了复杂的化学反应，不能排除模板液中带有某种或某些抑制PCR反应的成分。防止假阴性问题的办法是设置阳性对照环节。（3）定量检测困难。由于影响PCR产率的原因比较多，在定量检测方面不能提供较为精准的数据，导致PCR技术无法胜任定量检测。直至目前，尚没有实质性的突破与进展，限制了PCR技术在检测方面的应用范围。

4 结论

PCR检测有一定的局限性，但是，其高灵敏度的检测反应、明显的特异性辨别、快速简便的检测流程，是其它检测方法所不能替代的。相信随着生物技术的快速进步，PCR检测技术的应用范围會越来越广泛。

参考文献

[1]常玉华，仇农学.基于PCR技术快速检测食品微生物的原理方法与应用[J].农产品加工，2011（11）.

[2]张泽民，李曼.PGR技术在转基因食品检测中的应用与发展趋势[J].农牧产品工程，2011（7）.

实时荧光定量PCR技术及其应用 第10篇

实时荧光定量PCR技术及其应用

实时荧光定量PCR技术是一种多色荧光检测核酸定量技术,该文简要介绍实时荧光定量PCR技术的原理及其应用.

作 者：欧阳松应 杨冬 欧阳红生 马鹤雯 作者单位：解放军军需大学军事兽医系,长春,130062刊 名：生命的化学 ISTIC PKU英文刊名：CHEMISTRY OF LIFE年，卷(期)：24(1)分类号：Q52关键词：实时荧光定量PCR 基因 荧光探针 SYBR Green

pcr技术在食品安全 第11篇

PCR技术检测金黄色葡萄球菌进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,其传统方法包括选择性培养、生化鉴定等步骤,耗时长、灵敏性差,很难满足食品安全快速检测要求.PCR技术是近年来广泛应用于食品中致病微生物快速检测的现代方法之一,其目的基因多种多样,主要包括耐药性相关基因、毒素基因、酶基因及多种特异性鉴别基因.本文综述了PCR技术应用于金黄色葡萄球菌检测的.各种目的基因,并简要介绍了多重PCR及实时定量PCR等新技术的应用.

作 者：姜延龙 张宇 田波 霍贵成 JIANG Yan-long ZHANG Yu TIAN Bo HUO Gui-cheng 作者单位：东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150030刊 名：食品科学 ISTIC PKU英文刊名：FOOD SCIENCE年，卷(期)：27(5)分类号：Q939.11关键词：金黄色葡萄球菌 PCR 基因

pcr技术在食品安全 第12篇

PCR实验指的是基因扩增实验，其特点是能将微量的DNA大幅增加，是分子生物学研究和实验的常规方法，PCR实验室广泛应用于生物学各个领域，例如：乙型肝炎，禽疫病、艾滋病检测，癌基因的检测和诊断，个体识别，DNA指纹，亲子鉴定及法医物证等等。SLD中检实验室技术就PCR实验室设计和建设要求逐一给大家解释：

一、PCR实验室布局

1、PCR实验室原则上分为：①试剂准备区；②样品制备区；③扩增区；④扩增产物分析区，共四个单独的工作区域。并设有专用走廊，各工作区域应设缓冲间，工作区与缓冲间宜安装连锁装置。

2、不同功能的工作区应是分隔独立的，各工作区有明显的标志，不能直通，如果紧密连接，需安装物品传递窗。

①试剂准备区和样品制备区为扩增前区；

②扩增区和扩增产物分析区为为扩增后区，即从：试剂准备区——样品制备区——PCR扩增室——产物分析室，不得逆向流动。

3、实验室的气流也应从扩增前区流向扩增后区，不得逆向流动。

4、各工作区的顶部应该安装紫外灯，紫外灯波长一般为254mm,配置要求为每20㎡一支40W的紫外灯。

二、实验室各区功能及主要设备

1、试剂准备区：

①主要进行试剂的制备，分装和主反应混合液的制备。试剂盒用于样品制作的材料应直接运送至该区域。②试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的试剂。③本区主要设备有冰箱，天平，离心机，加样器，振荡器等。④本区对气流压力的控制，并没有严格的要求，一般为+10Pa。

2、样品制备区：

①主要进行样品的保存，核酸提取，贮存及其加入至扩增反应管和测定DNA的合成。

②本区主要设备有冰箱，生物安全柜，离心机，加样器，振荡器等。③本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染，压力一般设计为+10Pa。

3、扩增区：

①主要进行DNA扩增项目。

②已制备的DNA模板(来自样品制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂准备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。

③本区主要设备有：冰箱，加样器，离心机，扩增仪等。

④本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶从本区漏出，压力一般设计为-25Pa。

4、扩增产物分析区： ① 主要进行扩增产物的测定。

②本区主要设备有加样器，洗板机、酶标仪和水浴箱等。

③本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域，压力一般设计为-25Pa。

三、PCR实验室通风系统及压力控制

①各区域之间应具备单间的实验工艺流、气流、物流与人流，形成单向流程的保护屏障。避免实验室之间的相互干扰，也防止气溶胶扩散对实验过程造成污染。

②PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式，严格控制送风、排风的比例，以保证整个实验区的压力要求。

四、PCR实验室装饰

①实验室围护结构应牢固，气密性好;②所有阴阳角宜采用圆弧过度;③墙体内壁光洁，不积尘、易清洗、易消毒、耐腐蚀;④地面使用环氧树脂自流坪或PVC卷材，材料应满足光洁、耐腐蚀、无缝隙、无渗漏的基本要求。

五、PCR实验室注意事项

1、区域大小设置：样品制备区要放置生物安全柜和低温冰箱，空间应大一些。而试剂准备区，扩增区，扩增产物分析区，空间可以相对小一些。

2、应急装置配备：试剂准备区，样品制备区应设紧急洗眼器，以保证操作人员的安全。

pcr技术在食品安全 第13篇

1 PCR在肉中致病微生物检测的应用

加强畜禽肉和水产品的检验检疫,保证其食用安全,是预防食源性疾病暴发的重要途径。PCR技术有快速、特异、敏感等特点,因而该技术在肉食品中致病菌的检测方面具有很大的应用潜力。部分常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。大量研究表明,PCR技术在对食品中病原微生物的确证试验方面与传统培养方法相比至少具有相同的灵敏度,而多数情况下则表现出更高的灵敏度,而且检测周期大为缩短。建立荧光PCR方法、实时PCR方法、多重PCR等方法可简便、快速、灵敏地实现对肠出血性大肠杆菌,单增李氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的细菌学诊断快速、简便、经济,有较大的应用价值。

随着分子生物学技术的不断发展,多重PCR、标记PCR、不对称PCR等多种不同的PCR方法都被应用于畜产品检测中,它们的应用使PCR技术拥有了更高的灵敏度和更短的周期。

2 PCR在鲜肉及肉制品肉的种属来源鉴定的应用

随着社会经济的快速发展,消费者对食品质量与安全性的要求也越来越高,席卷欧洲“马肉风波”、疯牛病、禽流感等疾病的出现以及宗教、经济健康原因和市场监管,都急需一种快速、准确的检测方法以对肉制品、宠物食品和肉骨粉等所含肉的成分进行种属鉴定。当前,对研究者、消费者、食品工业和政策制定者等各个方面来说,食品的真伪都是一个热点问题,尤其是肉类工业。PCR技术具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点,在肉类掺假检测方面具有巨大的应用价值。目前所采用的感官检验和免疫学方法可鉴别生鲜肉的种属,但对热加工处理的肉类,由于其感官性状、蛋白质成分和其他免疫原性物质被破坏而难以鉴别,因此熟肉种类与饲料中牛羊肉成分的种属鉴别一直是亟待解决的难题。

动物品种的鉴定方法主要从蛋白和核酸两个层次进行。以蛋白为基础的方法主要包括十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)等电聚焦电泳和免疫学方法。以核酸为基础的方法包括物种特异引物多重PCR、荧光PCR、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)等。

20世纪80年代,国外开始对肉的种属鉴定进行研究,初期的研究对象主要是生猪肉和牛肉。采用的方法主要有DNA杂交、免疫扩散和等电点聚焦等。这些方法中,DNA杂交和免疫扩散灵敏度高。但DNA杂交试验方法复杂,耗时长;免疫扩散不能够检测出有亲缘关系的肉类品种,比如山羊与绵羊,水牛与普通黄牛。同时对经过加工的制品检测效果不佳;等电聚焦速度快,但灵敏度稍差,成本高,工作量大且不易准确定量。

物种鉴定的关键因素是选择合适的分析基因。肉类食品在加工过程中经过加热、高压、辐射等处理后,DNA发生断裂,提取的DNA减少。Arslan A研究证实,烹煮、烘烤、压力处理、油煎等烹饪过的牛肉制品通过提取其线粒体中271bp的DNA片段,而后经过PCR扩增也可以鉴别出来,但是高温的非水烹调肉可能用PCR无法检测,因为高温使肉碳化、DNA变性。

目前用于肉类食品成分鉴定的基因通常位于线粒体(mtDNA)上,包括细胞色素b(Cytb)基因、12SrDNA、16SrDNA、D-loop基因等。T.Matsunaga等(1999)利用Cytb来设计引物扩增基因片段,并将山羊、鸡、牛、绵羊、猪和马的基因混合,正向引物(Forward primer)在Cytb的保守DNA序列上设计,反向引物(Reveserprimer)采用几个物种各自特有的DNA序列来进行多元PCR反应,所得的扩增片段可用于鉴别几种物种。高琳(2008)等以动物线粒体DNA中Cytb区段的保守序列为目的基因进行PCR-RFLP,从6种生肉及7种加工肉制品中鉴别出猪源性和牛源性成分。所有样品经PCR扩增均产生359bp的片段。扩增子采用Alu I限制性酶切所产生的片段差异可用于区分猪肉和牛肉。

肉骨粉是牲畜屠宰后其毛纤维、皮革、角质、骨骼、脏器等非食用组织经由高温蒸煮后再挥干水分的成品,是重要的动物蛋白饲料,在养殖领域使用极为广泛。目前国内外已经建立了许多从饲料里鉴别动物源性成分的方法,其中以PCR方法最为灵敏和准确。李文静等分别运用特异性引物,针对牛、羊、猪和鸡的线粒体基因中的某一片断进行扩增,建立了鉴别四种动物源性成分的PCR方法,用每种动物的特异性引物跟其它动物的DNA进行PCR扩增,结果没有扩增出非特异条带,说明选用的牛的引物和自己设计的三种引物都具有特异性,检出的牛肉骨粉的最低含量约为0.001%。证明该方法具有快速、灵敏度高和特异性强等优点,可以作为鉴定肉骨粉种类的常规方法。

pcr技术在食品安全 第14篇

在诞生后二十几年的时间里，PCR技术因其实用性和极强的生命力，从无到有，从只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，发展到应用于各个领域的几十种PCR方法，在生物学、基础医学、法医学、考古学等领域作出突出贡献。这一推动生命科学和社会迅猛发展的新技术必然影响到学校教育。高中生物教材与时俱进，选用“利用PCR技术扩增目的基因”一节，介绍PCR的反应原理及操作，力图表达生命科学前沿知识，引导学生关注现代生物技术新进展和学科发展方向，增强科技创新意识，发展学生的思维能力。现笔者谈谈PCR技术在高中生物中的重要作用。

一、PCR技术的发明是培养学生科学态度和树立学生正确价值观的良好素材

PCR的产生倾注了发明者穆里斯的全部心力。1983年春天，穆里斯前往乡间度周末，他驱车行驶在蜿蜒的州际高速公路上，灵感闪现，孕育出PCR技术的原型，即DNA分子能在适当条件下摆脱染色体结构的束缚并获得指数扩增。穆里斯对这一新奇念头充满热切希望，回到西特斯，穆里斯做了关于先有技术的文献检索，没找到任何有价值的、有助于确定他所需要的实验参数的技术文献，但他坚信自己所走的是一条创新的道路，于是坚持不懈地对此设想进行了大量实验。开始时，他使用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段扩增目的基因，因该酶不耐热，每次加热变性DNA后需重新补加，而多份标本的操作更是耗时、费力且易出错，所以使得PCR技术在当时成了一种笨拙且中看不中用的实验室方法。

穆里斯苦苦思索，他曾写道：“我当然不知道什么是‘适当条件，也不知道自己所选择的条件是不是发生PCR所必需的。我能做的只是不断改进实验方法和程序，直到扩增反应能够顺利进行。在没有获得确切的DNA扩增结果前，我完全是在黑暗中摸索。只要有哪怕一丁点儿的扩增，我就能够通过改变部分实验参数的方法迅速优化反应体系。”正是穆里斯的执著和敏锐，努力不懈探索未知，使得耐热的TaqDNA聚合酶应用于PCR反应，实验条件逐步成熟完善，继而第一台PCR热循环仪实现了该技术的自动化，促成PCR技术迅速发展和广泛应用。

杰出生物学家穆里斯的卓越事迹对培养学生的科学态度和树立学生正确的价值观具有重要意义。在学习PCR技术发明的过程中，学生必然为科学家坚忍不拔的毅力、精益求精的劳作、勇敢超越的精神、举世瞩目的成就所震撼，由此转化为科学的态度和正确的价值观。同时，PCR技术发明的过程富含科学家的心路历程、科学发现的奇闻轶事，因而在培养学生的兴趣、好奇心、求知欲等方面具有极其重要的价值。并且，科学探索的艰难和曲折及科学发展承受的误区和歧义，会引发学生理性反思和审慎思考，进而培养学生不屈的进取精神、乐观的生活态度及对真理的追求与热爱。endprint

PCR，即聚合酶链式反应的缩写，是由美国“西特斯”（Cetus）生物技术公司的穆里斯（K.Mullis）等人于1988年发明的一种DNA（包括RNA）体外扩增技术，能在短时间内将极微量的特定核酸片段精确复制出成百万份的拷贝。在PCR技术问世前，要获得一个靶基因，必须依赖克隆技术，以活的生物体作为复制遗传物质的载体，先建立基因组文库，再从成千上万的菌落中通过Southernblot杂交筛选出含有靶基因的克隆，既费时又费钱，特别是真核基因的克隆难度更大。而PCR技术在摆脱活体依赖性方面前进了一大步，基因操作效率及灵活性等方面也明显提高，使微量的核酸操作变得简单易行。

在诞生后二十几年的时间里，PCR技术因其实用性和极强的生命力，从无到有，从只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，发展到应用于各个领域的几十种PCR方法，在生物学、基础医学、法医学、考古学等领域作出突出贡献。这一推动生命科学和社会迅猛发展的新技术必然影响到学校教育。高中生物教材与时俱进，选用“利用PCR技术扩增目的基因”一节，介绍PCR的反应原理及操作，力图表达生命科学前沿知识，引导学生关注现代生物技术新进展和学科发展方向，增强科技创新意识，发展学生的思维能力。现笔者谈谈PCR技术在高中生物中的重要作用。

一、PCR技术的发明是培养学生科学态度和树立学生正确价值观的良好素材

PCR的产生倾注了发明者穆里斯的全部心力。1983年春天，穆里斯前往乡间度周末，他驱车行驶在蜿蜒的州际高速公路上，灵感闪现，孕育出PCR技术的原型，即DNA分子能在适当条件下摆脱染色体结构的束缚并获得指数扩增。穆里斯对这一新奇念头充满热切希望，回到西特斯，穆里斯做了关于先有技术的文献检索，没找到任何有价值的、有助于确定他所需要的实验参数的技术文献，但他坚信自己所走的是一条创新的道路，于是坚持不懈地对此设想进行了大量实验。开始时，他使用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段扩增目的基因，因该酶不耐热，每次加热变性DNA后需重新补加，而多份标本的操作更是耗时、费力且易出错，所以使得PCR技术在当时成了一种笨拙且中看不中用的实验室方法。

穆里斯苦苦思索，他曾写道：“我当然不知道什么是‘适当条件，也不知道自己所选择的条件是不是发生PCR所必需的。我能做的只是不断改进实验方法和程序，直到扩增反应能够顺利进行。在没有获得确切的DNA扩增结果前，我完全是在黑暗中摸索。只要有哪怕一丁点儿的扩增，我就能够通过改变部分实验参数的方法迅速优化反应体系。”正是穆里斯的执著和敏锐，努力不懈探索未知，使得耐热的TaqDNA聚合酶应用于PCR反应，实验条件逐步成熟完善，继而第一台PCR热循环仪实现了该技术的自动化，促成PCR技术迅速发展和广泛应用。

杰出生物学家穆里斯的卓越事迹对培养学生的科学态度和树立学生正确的价值观具有重要意义。在学习PCR技术发明的过程中，学生必然为科学家坚忍不拔的毅力、精益求精的劳作、勇敢超越的精神、举世瞩目的成就所震撼，由此转化为科学的态度和正确的价值观。同时，PCR技术发明的过程富含科学家的心路历程、科学发现的奇闻轶事，因而在培养学生的兴趣、好奇心、求知欲等方面具有极其重要的价值。并且，科学探索的艰难和曲折及科学发展承受的误区和歧义，会引发学生理性反思和审慎思考，进而培养学生不屈的进取精神、乐观的生活态度及对真理的追求与热爱。endprint

PCR，即聚合酶链式反应的缩写，是由美国“西特斯”（Cetus）生物技术公司的穆里斯（K.Mullis）等人于1988年发明的一种DNA（包括RNA）体外扩增技术，能在短时间内将极微量的特定核酸片段精确复制出成百万份的拷贝。在PCR技术问世前，要获得一个靶基因，必须依赖克隆技术，以活的生物体作为复制遗传物质的载体，先建立基因组文库，再从成千上万的菌落中通过Southernblot杂交筛选出含有靶基因的克隆，既费时又费钱，特别是真核基因的克隆难度更大。而PCR技术在摆脱活体依赖性方面前进了一大步，基因操作效率及灵活性等方面也明显提高，使微量的核酸操作变得简单易行。

在诞生后二十几年的时间里，PCR技术因其实用性和极强的生命力，从无到有，从只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，发展到应用于各个领域的几十种PCR方法，在生物学、基础医学、法医学、考古学等领域作出突出贡献。这一推动生命科学和社会迅猛发展的新技术必然影响到学校教育。高中生物教材与时俱进，选用“利用PCR技术扩增目的基因”一节，介绍PCR的反应原理及操作，力图表达生命科学前沿知识，引导学生关注现代生物技术新进展和学科发展方向，增强科技创新意识，发展学生的思维能力。现笔者谈谈PCR技术在高中生物中的重要作用。

一、PCR技术的发明是培养学生科学态度和树立学生正确价值观的良好素材

PCR的产生倾注了发明者穆里斯的全部心力。1983年春天，穆里斯前往乡间度周末，他驱车行驶在蜿蜒的州际高速公路上，灵感闪现，孕育出PCR技术的原型，即DNA分子能在适当条件下摆脱染色体结构的束缚并获得指数扩增。穆里斯对这一新奇念头充满热切希望，回到西特斯，穆里斯做了关于先有技术的文献检索，没找到任何有价值的、有助于确定他所需要的实验参数的技术文献，但他坚信自己所走的是一条创新的道路，于是坚持不懈地对此设想进行了大量实验。开始时，他使用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段扩增目的基因，因该酶不耐热，每次加热变性DNA后需重新补加，而多份标本的操作更是耗时、费力且易出错，所以使得PCR技术在当时成了一种笨拙且中看不中用的实验室方法。

穆里斯苦苦思索，他曾写道：“我当然不知道什么是‘适当条件，也不知道自己所选择的条件是不是发生PCR所必需的。我能做的只是不断改进实验方法和程序，直到扩增反应能够顺利进行。在没有获得确切的DNA扩增结果前，我完全是在黑暗中摸索。只要有哪怕一丁点儿的扩增，我就能够通过改变部分实验参数的方法迅速优化反应体系。”正是穆里斯的执著和敏锐，努力不懈探索未知，使得耐热的TaqDNA聚合酶应用于PCR反应，实验条件逐步成熟完善，继而第一台PCR热循环仪实现了该技术的自动化，促成PCR技术迅速发展和广泛应用。