PCR方法范文

PCR方法范文（精选12篇）

PCR方法 第1篇

目前, 沙门菌检测主要依靠生化反应和血清学鉴定这样的传统检测方法, 检验周期较长, 所需试剂繁多, 在快速、特异检测方面具有一定的局限性[4]。近些年, 分子生物学技术中的聚合酶链式反应 (PCR) 技术以其简便、可以定量以及特异等优点被越来越广泛的应用[5]。本实验针对沙门菌致病性抗原保守基因肠毒素 (STN) 基因设计引物, 建立沙门菌快速、特异的PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

沙门菌分离株由吉林省畜牧兽医科学研究院分离保存。

1.1.2 试剂

沙门菌显色培养基, 10PCR Buffer, d NTPs, Taq DNA聚合酶, DL2000 DNA Marker。

1.1.3 主要仪器

PCR仪 (Model MG25+) ;电泳仪 (DG-300C) ;高速离心机 (HC-2062) ;紫外凝胶呈像分析系统 (BINTA 2020D) ;数显恒温水浴锅 (HH-S2) , 电热恒温培养箱 (HHB11600-S-Ⅱ) 。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据NCBI公布的沙门菌肠毒素 (STN) 基因序中的保守序列, 利用Primer引物设计软件进行引物设计, 上游引物:5'-CCTTTCCCGCTATCG-GTAAC-3', 下游引物:5'-GGATGCCCAAAG-CAGAGAG-3', 片段长度为210 bp, 由大连宝生物公司合成。

1.2.2 沙门菌的初步鉴定

从实验室保存的沙门菌斜面培养基中环取菌落, 接种到沙门菌显色培养基中, 将培养基放入37℃恒温培养箱中培养24 h。

1.2.3 模版DNA的提取

取分离培养的菌体, 用灭菌双蒸水冲洗2次, 12 000 r/min离心10 min, 弃上清, 最后一次用1 m L双蒸水悬浮, 置100℃水浴锅中水浴10 min, 12 000 r/min离心10 min, 取上清, –20℃备用。

1.2.4 PCR扩增反应以及条件的优化

分别对引物浓度和退火温度 (设置49、49.3、50.2、51.4、52.8、54.3、55.7、57.2、58.6、59.8、60.7、61℃12个温度梯度) , 进行PCR扩增, 确定最佳的PCR反应条件, 用凝胶成像仪将扩增产物分析。

1.2.5 特异性试验

对沙门菌以及4株非沙门菌株:普通大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌, 进行PCR特异性对比。

1.2.6 敏感性试验

将沙门菌用灭菌生理盐水按10倍梯度稀释, 进行PCR扩增检测。

2 结果

2.1 培养及菌体形态学观察

接种到沙门菌显色培养基中, 培养24 h后, 形成中等大小、圆形、表面光滑、亮红色、边缘整齐的菌落, 如图1。在沙门菌显色培养基上涂板, 采用平板菌落计数法, 确定沙门菌细菌数量为6109CFU/m L。

2.2 PCR扩增反应以及条件的优化

通过反复试验, 确定最适引物浓度为20 pmol。退火温度在55.7~58.6℃期间, 所扩增出的目的条带最亮, 所以选取最适合的退火温度56℃, 如图2。

M:DNA marker (2000 bp) ;1:49℃;2:49.3℃;3:50.2℃;4:51.4℃;5:52.8℃;6:54.3℃;7:55.7℃;8:57.2℃;9:58.6℃;10:59.8℃;11:60.7℃;12:61℃

因此, 确立试验所需的最适的PCR反应体系:反应总体积为25 L, 其中10PCR Buffer 2.5 L, d NTPs (10 m M) 2 L, 上游引物和下游引物各加1 L, 模板2.5 L, Taq DNA聚合酶 (5U/L) 1 L, 加双蒸水至25 L。反应条件:95℃预变性10 min;95℃变性30 s, 56℃返火30 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环;72℃延伸5 min。图3显示了PCR扩增试验结果, STN扩增片段约为210 bp, 结果出现了与理论值大小相等的条带。

M:DNA marker (2 000 bp) ;1:阴性对照;2:沙门菌

2.3 特异性试验

将沙门菌以及4株非沙门菌株进行PCR扩增, 结果从图4中可以看出, 沙门菌能扩增出210 bp的特异性条带, 而另外4株非沙门菌株则不能扩增出来。

M:DNA marker (2 000 bp) ;1:阴性对照;2:沙门菌;3:普通大肠杆菌;4:金黄色葡萄球菌;5:副溶血性弧菌;6:单增李斯特菌

2.4 敏感性试验

取梯度稀释后的沙门菌DNA作为模板, 进行PCR扩增检测, 图5结果显示, 随着稀释梯度的递增, 所扩增出来的条带亮度随之变淡, 最小检出量为6107CFU/m L。

M:DNA marker (2 000 bp) ;1:阴性对照;2:6109 CFU/m L;3:6108 CFU/m L;4:6107 CFU/m L;5:6106CFU/m L;6:6105 CFU/m L;7:6104 CFU/m L

3 讨论

本试验应用PCR技术, 根据沙门菌的侵袭性抗原保守基因肠毒素 (STN) 基因上的靶序列设计一对引物, 建立适合的PCR反应体系, 通过琼脂糖凝胶电泳试验, 得到与预期片段210 bp大小一致的条带, 并且通过特异性与敏感性试验, 表明此检测方法比传统方法相比, 检验时间大大缩短、省时省力, 可以快速、特异、灵敏的检测出沙门菌, 具有广泛的社会价值, 在沙门菌检测领域具有广阔的应用前景。

摘要：本实验根据沙门菌的侵袭性抗原保守基因肠毒素 (STN) 基因上的靶序列设计一对引物, 对沙门菌基因组DNA进行PCR扩增, 建立了沙门菌的PCR检测方法, 与传统的细菌分离鉴定方法比较, 该方法具有快速、特异、灵敏的特点, 在沙门菌监测领域具有广阔的应用前景。

关键词：聚合酶链式反应,沙门菌,检测

参考文献

[1]陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社, 2001.

[2]黄文宇, 柳陈坚.食源性沙门氏菌检测方法的研究进展[J].生物技术, 2009, 19 (3) :95~98.

[3]王军, 郑增忍, 王晶钰.动物源性食品中沙门氏菌的风险评估[J].中国动物检疫, 2007, 24 (4) :23~25.

[4]赵玉玲, 张天生, 张巧艳.PCR法快速检测肉食品污染沙门菌的实验研究[J].微生物学杂志, 2010, 30 (3) :103~105.

羊流产衣原体的PCR检测方法研究 第2篇

羊流产衣原体的PCR检测方法研究

根据羊流产衣原体16S rRNA基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地扩增出预期的523bp片段,而沙眼农原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及健康鸡胚的`卵黄囊膜均未扩增出相应的片段.敏感性试验表明,该体系可检测到2 pg的衣原体DNA.

作 者：张莉 王英珍 鄢明华 李秀丽 ZHANG Li WANG Ying-zhen YAN Ming-hua LI Xiu-li  作者单位：天津市畜牧兽医研究所,天津,300112 刊 名：天津农业科学 英文刊名：TIANJIN AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)： 15(2) 分类号：S852.67 关键词：羊流产衣原体   PCR   检测  

PCR方法 第3篇

摘 要：为了建立鹿人五毛滴虫巢式PCR检测方法并进行验证，根据人五毛滴虫18S rRNA基因的特异性片段设计巢式PCR特异性引物，对两轮PCR反应的退火温度和反应体系中Mg2+浓度进行探索和优化，在此基础上，进一步通过灵敏性和特异性的检测。采用建立的巢式PCR检测方法对68份鹿粪便样品进行检测。结果表明，建立的巢式PCR方法，第一轮PCR最适退火温度为53 ℃，第二轮PCR最适退火温度为53 ℃；镁离子浓度为2.5 mmol·L-1。对鹿人五毛滴虫的检测精度可达每毫升10个虫体DNA；对犬贾第虫、阴道毛滴虫、弓形虫、柔嫩艾美尔球虫、大肠杆菌、旋毛虫基因组DNA的扩增的结果均为阴性；68份鹿粪便样品鹿人五毛滴虫的检出率为50%。由此可见，建立的巢式PCR检测方法具有较高的灵敏度和特异性，可用于鹿人五毛滴虫感染的临床检测。

关键词：鹿；肠道毛滴虫；巢式PCR

中图分类号：S852.72 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.002

毛滴虫是一种有鞭毛的单细胞真核生物，其滋养体经而分裂增殖，主要寄生在泌尿生殖系统以及胃肠道，宿主范围广泛[1]。目前，常见的毛滴虫有人五毛滴虫（Pentatrichomonas hominis）、阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）、口腔毛滴虫（Trichomonas tenax）、胚胎三毛滴虫（Trichomonas foetus）、鸟毛滴虫（Trichomonas gallinae）、猪三毛滴虫（Tritrichomonas suis）、巴特里四毛滴虫（Tetratrichomonas buttreyi）等，其中人五毛滴虫被认为是寄生在哺乳动物肠道内的一类共生类寄生虫[2]，近几年，在我国河南、湖北、广东、安徽等地均有关于人感染人五毛滴虫的临床病例报道[3-8]，而在犬、猫、非灵长类和啮齿类动物的粪便样品中，也检测到了人五毛滴虫的感染 [9-11]。由于尚未有关于鹿感染人五毛滴虫的报道，因而构建一个快速有效的检测方法来评估鹿感染人五毛滴虫的感染情况显得十分必要。

人五毛滴虫主要通过污染饮用水或者食物而被动物或者人误食而感染，在传播过程中苍蝇等也发挥着一定作用，其感染后主要症状表现为腹泻[12]。诊断肠道毛滴虫的主要方法包括直接涂片镜检法、虫体培养法、染色镜检法、普通PCR 检测法、巢氏PCR检测法、原位杂交检测法等[13]，其中直接涂片镜检法、虫体培养法、普通PCR 检测法和染色镜检法精确度不高，原位杂交检测法实验条件要求高且步骤复杂，而巢式PCR检测法常被视为一种快速、便捷、有效的检测方法。本试验通过18S rRNA基因设计了特异性的巢式PCR引物，对镁离子浓度及退火温度进行了优化，并进一步进行了特异性和灵敏性验证，成功构建了鹿人五毛滴虫巢式PCR检测方法。采用构建的巢式PCR检测方法对长春地区68份鹿粪便样品进行了检测，以期为临床检测鹿人五毛滴虫的感染提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 基因组DNA

试验中涉及的人五毛滴虫、柔嫩艾美尔球虫、伊氏锥虫、弓形虫、阴道毛滴虫、贾第虫均来自于吉林大学寄生虫实验室保存或者培养的，分别提取对应的基因组DNA并保存在-20 ℃冰箱中。试验中用于临床检测的68份鹿粪便样品，均来自于吉林省长春市某养殖场，分别提取对应的基因组DNA并保存在-20 ℃冰箱中备用。

1.2 主要试剂

rTaq DNA聚合酶、dNTP，MgCl2等用于PCR反应的试剂均购自TaKaRa公司（日本）；DL2000 DNA marker购自TaKaRa公司（日本）；琼脂糖购自法国Biowest公司。

1.3 引物设计与合成

从Genbank中查找到人五毛滴虫18S rRNA基因序列（AY758392），根据此特异性序列，采用Primer Premier 5软件设计内外两套特意性的巢式PCR引物，外侧引物： F1为5′- AGACACGGAGGCGAAGG-3′，R1为5′- AGCCCAGAGCATCTAA AGGA-3′；内侧引物：F2为5′- AGTTCTTGGGCTC TGGG-3′，R2为5′- CCTCTTCCGCCTGCTA -3′。经两轮PCR反应后，扩增的目的片段为大小为322bp的特异性序列。PCR反应中使用的引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.4 反应体系中Mg2+浓度的优化

以人五毛滴虫基因组DNA作为模板，F1/ R1引物对作为引物进行PCR反应， MgCl2 0.5～5.5 mmol·L-1，5 μL dNTPs，0.5 μL rTaq酶，引物F1和 R1各1 μL，以双蒸水补足体积至50 μL。退火温度为53 ℃，延伸时间为35 s。在PCR反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，对比目的条带的亮度。

1.5 退火温度的优化

分别对巢式PCR的两轮PCR反应的退火温度进行优化，第1轮PCR反应（引物对为F1/ R1）以人五毛滴虫基因组DNA作为模板，MgCl2的终浓度为2.5 mmol·L-1，其他试剂加入量参照上述PCR反应。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性3 min，退火（50，53，55，58 ℃）1 min，72 ℃延伸35 s，循环30次； 72 ℃延伸10 min。

第2轮PCR反应，取1 μL第一轮PCR反应的产物作为模板，以内侧引物对F2/R2作为此次PCR反应的引物，反应体系参照第一轮PCR反应，退火温度设置4个梯度，分别是50，53，55，58 ℃。在PCR反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，并送吉林省库美生物科技有限公司进行测序分析。

1.6 方法的验证

1.6.1 灵敏度测试 取人五毛滴虫，计数，分别将其稀释成1，1 × 101，1 × 102，1 × 103，1 × 104，1 × 105个·mL-1，提取对应的基因组DNA，采用构建好的巢式PCR检测方法进行检测，测试其灵敏度。

1.6.2 特异性验证 以人五毛滴虫基因组DNA作为阳性对照，双蒸水作为阴性对照，采用已经构建好的巢式PCR反应对柔嫩艾美尔球虫、伊氏锥虫、弓形虫、阴道毛滴虫、贾第虫、犬心丝虫的虫体基因组进行检测，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 样品的检测

以人五毛滴虫基因组DNA作为阳性对照，双蒸水作为阴性对照，采用已构建好的巢式PCR方法对采集到的68份鹿粪便临床样品进行检测，并送吉林省库美生物科技有限公司进行测序分析，将测序结果在GenBank中进行序列的比对分析。

2 结果与分析

2.1 反应体系中最佳Mg2+浓度

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，由电泳图可知，巢式PCR反应在MgCl2浓度为0.5～5.5 mmol·L-1区间均能扩增出较好的条带，不同MgCl2浓度其对应的PCR产物亮度有差异，当Mg2+浓度为2.5 mmol·L-1时，扩增出的目的片段最亮，见图1。因此选择2.5 mmol·L-1作为巢式PCR反应的最佳Mg2+浓度。

bp M 1 2 3 4 5 6

2.2 最佳退火温度

为了摸索适合于本巢式PCR反应的退火温度，本试验设计了50，53，55，58 ℃这4个温度梯度，以期探索出退火温度对巢式PCR反应的影响。琼脂糖凝胶电泳分析显示，第一轮和第二轮PCR反应50，53，55，58 ℃这4个退火温度均能扩增出目的片段，且第一轮PCR反应和第二轮PCR反应均在53 ℃退火温度条件下扩增出较为明亮的PCR产物，见图2。将测序结果经拼接后，BLAST比对，结果显示其均为人五毛滴虫18S rRNA基因的特异性片段。将PCR反应重复操作两次，电泳结果相一致，故可选择53℃作为两轮PCR反应的退火温度。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8

2.3 方法的验证结果

2.3.1 灵敏度 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，当虫体浓度为10个·mL-1及以上时，可见明亮的条带即PCR反应扩增出了目的条带。将PCR反应重复操作两次，电泳结果相一致，表明本试验构建的巢式PCR检测方法可检测的最低虫体量为10个·mL-1。

bp M 1 2 3 4 5 6

2.3.2 特异性 将已完成了两轮PCR反应的8个样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4。由图可知，只有模板为人五毛滴虫基因组DNA的样品才扩增出目的条带，以其他虫体基因组DNA为模板的样品未扩增出目的条带。由此表明构建的巢式PCR检测方法具有较强的特异性。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8

2.4 样品检测结果

分别对68份鹿粪便临床样品进行基因组提取，然后采用此巢式PCR反应进行检测，琼脂糖凝胶电泳结果显示，34份样品的PCR产物出现目的条带，通过对扩增出的目的片段进行测序、比对，证明其均为人五毛滴虫18S rRNA基因的特异性片段，鹿粪样品人五毛滴虫的检出率为50%。

3 讨 论

随着分子生物学技术的发展，其越来越广泛的运用于对毛滴虫的分类鉴定中，Gookin等[14]采用18S rRNA基因、ITS1， 5.8S rRNA， ITS2基因以及部分28S rRNA基因作为靶基因对毛滴虫进行了分子分类鉴定，通过对基因序列的比对确定了其所观察到的毛滴虫为人五毛滴虫。

核糖体RNA也就是rRNA是细胞内含量最多的一类RNA，其与蛋白质组合而成的核糖体参与了细胞内肽链的合成。对于真核生物，rRNA根据沉降系数可将其分为四类，即5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。由于18S rRNA含量较高，长度适宜，大约在1 900 bp，且其存在核糖体蛋白质复合物中[15]，能够为18S rRNA提供一个隔绝RNA酶和其他外界不利因素影响的安全环境，使18S rRNA能够保持很强的稳定性[16]。因此，18S rRNA常被用来对寄生虫进行种属鉴定、遗传多样性分析、系统发育与进化研究、分子分类乃至于抗药性等研究 [17-18]。

目前，对于毛滴虫最常用的检测方法是PCR技术。但是，普通的PCR技术的灵敏度不是很高，且容易出现假阳性。巢氏PCR通过使用内外两套引物对特异性基因进行不同大小片段的两次扩增，只需要极少量的模板，即可扩增出理想的PCR产物极大的提高了检测的灵敏度，并保证了检测结果的特异性[19]。

本试验通过选取人五毛滴虫18S rRNA基因片段，建立了鹿人五毛滴虫巢式PCR检测方法，在对巢式PCR反应中涉及到的退火温度、Mg2+浓度进行了优化后，此检测方法表现出了较高的灵敏度和特异性。通过对临床样品的检测结果的分析，证明了检测的巢式PCR检测方法可以用来对鹿人五毛滴虫的临床检测。同时，通过对鹿的粪便样品的检测，说明了人五毛滴虫可以感染鹿且具有较高的感染率，人五毛滴虫可能会由鹿传播给人，存在着人兽共患的风险。

参考文献：

[1] LI W， LI W， GONG P， et al. Molecular and morphologic identification of Pentatrichomonas hominis in swine [J]. Veterinary Parasitology， 2014， 202（3-4）： 241-247.

[2] Gookin J L， Stauffer S H， Coccaro M R， et al. Optimization of a species-specific polymerase chain reaction assay for identification of Pentatrichomonas hominis in canine fecal specimens[J]. Am J Vet Res， 2007， 68（7）： 783-787.

[3] 徐丕林，舒军. 对人毛滴虫感染致腹泻误诊病例的分析[J].当代医药论丛，2014，12（7）：267-268.

[4] 郭鄂平，宋明华，郭冀萍.人毛滴虫病36例临床分析[J].临床医学，2003，23（5）：18-19.

[5] Meloni D， Mantini C， Goustille J， et al. Molecular identification of Pentatrichomonas hominis in two patients with gastrointestinal symptoms[J]. J Clin Pathol， 2011， 64 （10）： 933-935.

[6] Gookin J L， Birkenheuer A J， St J V， et al. Molecular characterization of Trichomonads from feces of dogs with diarrhea[J]. J Parasitol， 2005， 91 （4）： 939-943.

[7] Gookin J L， Stauffer S H， Levy M G. Identification of Pentatrichomonas hominis in feline fecal samples by polymerase chain reaction assay[J]. Vet Parasitol， 2007， 145 （1-2）： 11-15.

[8] Kondova I， Simon MA， Klumpp SA， et al. Trichomonad gastritis in rhesus macaques （Macaca mulatta） infected with simian immunodeficiency virus[J]. Vet Pathol， 2005， 42 （1）： 19-29.

[9] 王彦平，李志满，刘兆铭. 实验小动物肠道内鞭毛虫的观察[J]. 中国比较医学杂志， 2003（6）： 40-42.

[10] 郑多魁.犬毛滴虫病的诊治一例[J].中国工作犬业， 2009（10）： 21.

[11] 孟莹. 犬源毛滴虫的分离鉴定及其生物学特性研究[D].长春：吉林大学，2013.

[12] Sabucedo A J， Furton K G. Estimation of postmortem interval using the protein marker cardiac Troponin I [J]. Forensic science international， 2003， 134（1）： 11-6.

[13] 李文灿.大鼠心肌组织中microRNA和18S rRNA的含量变化与死亡时间的相关性研究[D].上海：复旦大学，2011.

[14] Capowski E E， Tracy J W. Ribosomal RNA processing and the role of SmMAK16 in ribosome biogenesis in Schistosoma mansoni [J]. Molecular and biochemical parasitology， 2003， 132（2）： 67-74.

[15] Pechmann S， Willmund F， Frydman J. The Ribosome as a Hub for Protein Quality Control [J]. Mol Cell， 2013， 49（3）： 411-21.

[16] Hoelzle L E， Adelt D， Hoelzle K， et al. Development of a diagnostic PCR assay based on novel DNA sequences for the detection of Mycoplasma suis （Eperythrozoon suis） in porcine blood [J]. Veterinary microbiology， 2003， 93（3）： 185-96.

[17] Capowski E E， Tracy J W. Ribosomal RNA processing and the role of SmMAK16 in ribosome biogenesis in Schistosoma mansoni [J]. Molecular and biochemical parasitology， 2003， 132（2）： 67-74.

[18] Pechmann S， Willmund F， Frydman J. The Ribosome as a Hub for Protein Quality Control [J]. Mol Cell， 2013， 49（3）： 411-421.

犬细小病毒PCR检测方法的建立 第4篇

为了进一步解决CPV在临床上的快速诊断问题, 针对VP2基因设计特异引物[2], 预扩增片段大小990bp, 并通过条件优化试验确定合适退火温度、引物浓度、合适Mg2+浓度等, 建立一个特异性好、敏感度高、快速简便检测CPV核酸的PCR方法。

1 实验材料与设备

疑似犬细小病毒病的犬粪便、犬细小病毒CPV、犬流感病毒CIV、犬瘟热病毒CDV, 以及犬副流感病毒CPIV、缓冲液、Taq DNA聚合酶、d NTPs (each 10mmol/L) 、d NTPs (each 2.5mmol/L) 、DL2000 DNA Marker、实验仪器等。

2 实验方法

(1) 引物合成。根据Gen Bank中登录的犬细小病毒序列[DQ903936], 针对其VP2基因, 设计引物:CPV上游引物5-GTTCTGGGGGTGTGGGGATTT-3;下游引物5-CTCCCCCCCGTCCTGCTGCAA-3, 预扩增片段大小990bp。用dd H2O将引物稀释为20μmol/L, -20℃保存备用。

(2) 目的基因产物的PCR扩增。将以上成分混匀后, 在UNO-II型核酸扩增仪运行。运行程序如下。

94℃3min, 1个循环。94℃1 min, 55℃1 min, 72℃90s;30个循环。72℃8min, 1个循环。

在PCR扩增程序运行时, 设立不加模板的阴性对照。反应结束后, 取3μL PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶 (含0.5μg/m L EB) 进行电泳检测。

(3) PCR产物电泳检测。取PCR产物5μL加入Loading Buffer 1μL混匀, 加到1%琼脂糖凝胶的点样孔中, 并设置分子量参照标准DNA Marker DL2000。先用100V电压, 50m A电流进行电泳, 待PCR产物进入凝胶后, 再以80V电压, 40m A电流继续电泳, 直到PCR产物进入凝胶一定距离后 (约30min) , 再进行凝胶成像拍照分析。

(4) 特异性实验。根据建立的犬细小病毒PCR检测方法, 抽提犬流感病毒RNA、犬瘟热病毒DNA, 以及犬副流感病毒RNA, 并进行反转录制备模板加入到犬瘟热病毒RT-PCR反应体系中进行扩增, 同时设阳性对照, 对PCR产物进行电泳, 检测该方法的特异性。

(5) 敏感性实验。抽提病毒DNA, 运用核酸蛋白测定仪进行DNA含量测定, 定量的DNA依10倍梯度依次进行稀释, 将稀释后的DNA进行PCR反应, 对PCR产物进行电泳, 检测该方法的敏感性。

(6) 临床样品检测。对疑似犬细小病毒病的15例犬粪便进行临床检测。

3 结果

(1) 特异性实验结果。分别以犬瘟热病毒 (CDV) 、犬流感病毒 (CIV) 、犬细小病毒 (CPV) 和犬副流感病毒 (CPIV) 作为样品, 同时设立阴性对照作PCR特异性检测, 结果以CPV阳性样品为模板的泳道出现明显的大小约为990bp的扩增产物, 其他样品呈阴性。结果表明, 引物对CPV具有专一性, 可区分与犬细小病毒症状相似的一些疾病。

(2) 敏感性检测结果。运用建立的犬细小病毒PCR方法对犬细小病毒进行敏感性检测。结果该引物对犬细小病毒DNA的最低检出量达到10pg, 表明该检测方法对病毒目的基因扩真具有很高的敏感性。

(3) 临床样品检测。在15例疑似犬细小病毒的临床病料检测中, 能够检测出特异性病毒的结果显示, 有13例出现大小约为990bp扩增片段, 阳性检出率约为86.66%。

通过针对VP2基因设计特异引物, 成功建立了特异性好、敏感度高、快速简便检测CPV核酸的PCR方法。

参考文献

[1]刘忠华, 钟翎, 贺星亮, 等.用PCR技术鉴定犬细小病毒弱毒疫苗株[J].中国兽医学报, 2003, 23 (5) :444-446.

PCR方法 第5篇

目的:建立一种快速、定量、特异、灵敏的PCR方法用于对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的`早期诊断和疫情监测.方法:根据GenBank登录的IHHNV毒株序列,使用生物学软件进行序列比对,在IHHNV保守区序列设计特异性引物与Taqman探针.对实时荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性、灵敏度、重复性,并与普通PCR进行盲样测试的比对.结果:本法线性范围5102～5107拷贝/ml,检出限5101拷贝/ml,灵敏度超过普通PCR100倍,特异性高于普通PCR,重复性极好(S=0.035～0.39,CV=0.13%～1.05%),检测时间为普通PCR的1/5,现场盲样IHHNV检出阳性率高于普通PCR 26.00%.结论:本研究建立Taqman实时荧光定量PCR用于对虾IHHNV检测具有特异、灵敏、快速、定量、重复性好等优点.

作 者：王忠发 王建跃 卢亦愚 何伟贤 王学海 Wang Zhong-fa Wang Jian-yue Lu Yi-yu He Wei-xian Wang Xue-hai 作者单位：王忠发,王建跃,何伟贤,Wang Zhong-fa,Wang Jian-yue,He Wei-xian(浙江省舟山市疾病预防控制中心,浙江舟山,316000)

卢亦愚,Lu Yi-yu(浙江省疾病预防控制中心,杭州,310009)

王学海,Wang Xue-hai(浙江大学医学院病原生物研究所,杭州,310031)

PCR方法 第6篇

关键词：小鹅瘟病毒;PCR;检测

中图分类号：Q789 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2015）03-0031-04

小鹅瘟（Gosling plague，GP）是由小鹅瘟病毒（Gosling plague virus，GPV）所引起的雏鹅的一种急性或亚急性败血性传染病。病鹅临床表现为下痢、腿瘫痪、精神萎靡、食欲废绝，主要病理学特征为小肠中后段黏膜坏死、脱落，有纤维素性渗出物凝固形成腊肠状栓子[1]。该病主要危害3～20日龄小鹅，特别是10日龄之内的雏鹅更易感染，发病率和死亡率高达100%，且传播速度快，是对养鹅业产生严重危害的一种重要传染病[2]。1956年我国科研工作者首先报道了小鹅瘟这种疾病[3]，此后世界上许多国家都有该病的报道。目前，GPV诊断方法有病毒的分离和鉴定、酶联免疫吸附试验[4]、反向间接血凝试验[5]、免疫酶琼脂扩散试验[6]和PCR方法[7]等，但是上述方法均存在不同的缺点，或检测灵敏度低，或检测时间长，或操作复杂。近年来，发展PCR检测方法具有检测速度快、特异性好、灵敏度高等优点，已经广泛应用于动物疾病的检测。笔者通过不断优化反应条件，建立了检测小鹅瘟病毒PCR方法，为小鹅瘟的临床诊断和流行病学调查提供了一种简便、快速、有效的方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株与病料 小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒、鹅病毒性肝炎病毒、鹅源鸭瘟病毒、鹅圆环病毒、鹅H9亚型禽流感病毒和鹅呼肠孤病毒由本实验室保存，临床检测病料为2014年采自山东省各地小鹅场临床诊断为GPV感染的小鹅的肝脏、脾脏等。

1.2 工具酶及试剂盒 pMD18-T载体、Premix Tag、DL2000 MarKer购自大连宝生物公司，AxyPrep体液病毒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司，DNA凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 PCR引物设计与合成 根据GenBank中登录的GPV基因序列（AY382889），应用Primer Premier5.0软件，设计1对特异性引物，扩增GPV的VP1基因507bp部分片段。引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′-ATGTGAGAAAGCAAACTT-3′，下游引物：5′-CTATCTATAAAGTCCTGG-3′。

1.4 GPV基因组DNA的提取 按AxyPrep体液病毒DNA小量试剂盒使用说明书提取GPV的DNA，并提取其它几种病毒的核酸。

1.5 GPV VP1基因的PCR反应条件的确立 以提取的GPV DNA作为模板，进行PCR反应，扩增VP1基因。在其它条件不变的情况下，对反应的退火温度进行优化，分别采用42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃等6种不同的退火温度进行扩增;在其它条件不变的情况下，对反应的引物浓度进行优化，分别采用0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L等6种不同引物浓度进行扩增。反应体系保持为25μl，PCR反应的条件保持不变，为95℃预变性5min，95℃ 30S、46℃ 30S，72℃ 30S ，共30个循环，最后72℃延伸10min。

1.6 PCR扩增产物的检测及鉴定 取5μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，紫外灯下观察扩增结果。如果有目的条带，则切下目的条带，按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收目的片段VP1。将回收后的VP1与pMD18-T连接。将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，37℃过夜培养后，挑取单菌落摇菌过夜，按质粒提取试剂盒的说明书抽提培养菌液的质粒，用建立的PCR方法检测质粒是否含有VP1基因。如果含有VP1基因，将提取的质粒发送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果与参照的GPV基因序列进行基因相似性分析。

1.7 特异性试验 分别提取小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒、鹅病毒性肝炎病毒、鹅源鸭瘟病毒、鹅圆环病毒、鹅H9亚型禽流感病毒和鹅呼肠孤病毒等7种不同的病毒核酸作为模板，用已建立的PCR检测方法进行扩增。

1.8 敏感性试验 提取GPV基因组DNA，用仪器测定含量，然后10倍系列稀释，使GPV基因组DNA的含量分别为10ng DNA、1ng DNA、100pg DNA、10pg DNA、1pg DNA、0.1pg DNA。分别将其作为模板，用建立的方法分别进行PCR检测扩增，确定PCR检测方法的敏感性。

1.9 重复性试验 为了验证所建立PCR检测方法的重复性，分别提取3批小鹅瘟阳性病料、阴性病料以及6种阴性对照病毒如鹅副粘病毒、鹅病毒性肝炎病毒、鹅源鸭瘟病毒、鹅圆环病毒、鹅H9亚型禽流感病毒和鹅呼肠孤病毒的核酸作为模板，进行PCR扩增反应。

PCR分析仪的温度检测方法探讨 第7篇

PCR分析仪温度测量和控制的不确定性主要来源于以下几个方面: (1) 显示仪表的不准确, 导致温度设定值 (或温度指示值) 与实际温度值有偏差; (2) 温度控制性能不足, 造成各孔间温度值不一致; (3) 目前大多数PCR分析仪都是由生产厂家自行检检, 且仅对一个温度点进行检测, 不能完全反映出仪器的技术性能指标。

测试仪器和测试项目

测试系统由多个精密温度传感器和数据采集分析仪器组成, 精密温度传感器的测量范围一般为 (0~100) ℃, 测量误差经修正后应小于0.01℃。

测试项目主要包括温度偏差、温度均匀度、温度稳定度和温度设定点偏差等4项。

测试点一般为30℃、50℃、70℃和90℃4个点 (还可根据仪器的使用情况进行增加) , 每个点进行6次测量。

测试方法和结果计算

1.测试前的准备

测试前应检查测试系统各部件线路连接是否正确, 将精密温度传感器合理地布置在被测仪器的模块中, PCR分析仪应预热30 min后再进行测量。

2.温度偏差的测试

温度偏差是指在热稳定状态下, 仪器的显示温度平均值与所有温度传感器测量值的平均值之间的差值。按下式 (式1) 计算温度偏差。

式中:Δtd———温度偏差, ℃;

td———所有温度传感器测量值的平均值, ℃;

to———显示温度平均值, ℃。

3.温度均匀度的测试

温度均匀度是指在工作区域内的温度均匀程度。以每次测量中最高温度与最低温度之差的平均值作为被测仪器的温度均匀度, 按下式 (式2) 进行计算。

式中:Δtu———温度均匀度, ℃;

n———测量次数;

timax———各测试点在第i次测得的最高温度, ℃;

timin———各测试点在第i次测得的最低温度, ℃。

4.温度稳定度的测试

温度稳定度是指在试验温度下的热稳定状态时控温点温度的稳定程度。以各测量点的最高温度与最低温度之差的一半作为被测仪器的温度稳定度, 冠以“±”号, 按下式 (式3) 进行计算。

式中:Δtf———温度稳定度, ℃;

tomax———测量中的最高温度, ℃;

tomin———测量中的最低温度, ℃。

5.温度设定点偏差的测试

温度设定点偏差是指在热稳定状态下, 仪器的设定点温度值与所有温度传感器测量值的平均值之间的差值。按下式 (式4) 计算温度设定点偏差。

式中:Δts———温度设定点偏差, ℃;

td———所有温度传感器测量值的平均值, ℃;

ts———设定点温度值, ℃。

结束语

PCR方法 第8篇

1 材料与方法

1. 1 弓形虫虫株及菌株

弓形虫国际标准强毒株RH速殖子, 由南方医科大学免疫抗体工程研究所惠赠, 小白鼠传代保种; 大肠杆菌O157∶ H7、沙门氏菌, 由东莞市动物疫病预防控制中心实验室分离、鉴定、保存。

1. 2 样品来源

野生老鼠共32 只, 分别采自东莞市常平镇三鸟批发市场和东莞市厚街屠宰场; 猪淋巴结, 采自东莞市万江区屠宰场, 共50 份。

1. 3 检测试剂

弓形虫荧光PCR试剂盒 ( 批号为2014002) , 中山大学达安基因股份有限公司生产; DNA试剂盒, 美国Promega公司生产; 蛋白酶K, Ta Ka Ta公司生产; 吉姆萨染色液, 北京鼎国生物技术有限公司生产。

1. 4 试验动物

试验小白鼠 ( 合格证明编号为44002100002586) , 由南方医科大学实验室动物中心提供。

1. 5 弓形虫RH株和阳性样品人工感染

弓形虫的复苏、传代、收集和计数参照参考文献[4,5]进行。弓形虫RH株攻虫为小白鼠, 分成2组, 每组10 只, 接种量为100 个/只, 腹腔接种, 对照组不接种, 小白鼠攻虫前后自由给水、采食。阳性样品研磨后加双抗, 3 000 r/min离心去上清液, 腹腔接种小白鼠。

1. 6 人工小白鼠腹水和内脏组织的镜检

取感染弓形虫小白鼠的腹水和组织涂片用吉姆萨染色后镜检。涂适量大小 ( 约1 cm) 的组织涂片, 等其干燥; 用滴管将2 ~ 3 滴甲醇滴于涂片上; 甲醇挥发后将5 ~ 8 滴吉姆萨染色工作液加于涂片上, 轻轻用手摇匀染色液使其覆盖整个涂片, 静置30 min;30 min后用水冲洗2 min, 晾干, 镜检。

1. 7 样品DNA的提取

1.7.1腹水的消化裂解

弓形虫RH株经小鼠传代, 从其腹水收取弓形虫速殖子, 计数后按Promega试剂盒Wizard SV Genomic DNA Purification System使用说明书, 将含有弓形虫虫株的小鼠腹水样品12 000 r / min离心1 min, 弃上清液, 保存在1. 5 m L EP管底部的沉淀, 加入275 μL消化反应体系, 结果见表1。混匀后置于37 ℃水浴锅中消化过夜。

1.7.2组织的消化裂解

分别取人工感染组小白鼠、对照组小白鼠、野生老鼠的内脏组织 ( 心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏) 、猪淋巴结组织约50 mg, 剪碎, 加入1. 5 m L PBS液, 在- 80 ℃ 和37 ℃ 水浴中反复冻融3 ~ 5 次, 每次3 ~ 5 min, 加玻璃珠约占体积的1 /3, 漩涡振荡30 min。加入275 μL消化反应体系, 结果见表2。混匀后置于37 ℃水浴锅中消化过夜。

μL

μL

1.7.3 DNA的提取

消化好的虫体悬液、样品和菌株按Promega试剂盒Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System使用说明书提取DNA。 取250 μL Wizard SV Lysis Buffer加入水浴消化后的离心管中 ( 组织消化样品, 可将液体换到新的离心管中, 然后再加Wizard SV Lysis Buffer) 漩涡振荡, 混匀。取微型柱 ( Sv. minicolumns) 置于收集管中, 将样品移入柱中, 13 000 r/min离心4 min。离心后弃收集管中的液体, 向微型柱中加入650 μL Wizard SV Wash Solution, 13 000 r / min离心2 min。离心后弃收集管中的液体, 将微型柱放回收集管中, 重复上一步骤清洗4 次。最后一次离心后, 弃收集管中的液体放回微型柱, 13 000 r/min空离心3 min, 甩干管壁。将微型柱放到新的1. 5 m L离心管中, 加入30 μL Nuclease - Free Water, 室温放置2 min, 然后13 000 r / min离心2 min。 再加入30 μL Nuclease -Free Water, 室温放置2 min, 然后13 000 r / min离心2min。弃微型柱, 用封口膜封好离心管, 将所提DNA样品置于-20 ℃ 冰箱中保存, 备用。弓形虫RH株经小鼠传代后腹水提取的DNA供特异性和敏感性试验。

1. 8 荧光PCR方法

按照弓形虫PCR反应液40 μL、Taq酶3 μL配制反应体系, 分别加入2 μL DNA提取液、阴性对照、临界质控样品和强阳性质控样品。PCR反应条件:93 ℃ 2 min; 93 ℃ 45 s, 55 ℃ 60 s, 共10 个循环;93 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s, 共30 个循环。结果判定, 阴性质控无扩增曲线或Ct值等于30, 阳性质控Ct值小于27, 结果成立。

1. 9 敏感性试验

用上述DNA制备法提取的弓形虫DNA, 以10倍递减稀释成含1 000, 100, 10, 1 个速殖子的DNA后, 用上述荧光PCR方法检测其敏感性。

2 结果与分析

2. 1 弓形虫RH株和阳性样品人工感染情况

试验将小白鼠分成两组, 每组10 只, 一组为攻虫组 ( 5 只接种RH株、5 只接种阳性样品) , 另一组为健康对照组, 感染后小白鼠的精神状态记录, 结果见表3。感染后第5 天, 攻虫小白鼠被毛散乱无光泽、精神萎靡、弓背、腹部膨大、颤动等症状, 健康小白鼠喜食、活泼面。说明小白鼠易感染弓形虫, 这次人工感染试验成功。

2. 2 人工感染小白鼠腹水和内脏组织的镜检结果

人工感染的小白鼠5 d后处死取腹水和内脏组织涂片经过吉姆萨染色后, 在显微镜下观察涂片, 用40 倍目镜, 100 倍油镜, 可看见一端较尖, 一端较钝圆呈新月型弓形虫速殖子 ( 见266 页彩图1) , 说明人工感染试验成功。

2. 3 弓形虫荧光PCR特异性试验检测结果

试验中检测弓形虫RH株样品DNA、大肠杆菌样品DAN、沙门氏菌样品DNA, 强阳性质控、临界阳性质控和阴性质控成立, 弓形虫RH株检测结果为阳性, Ct值为15. 34, 大肠杆菌和沙门氏菌均无扩增曲线, 检测结果均为阴性, 检测结果见表4。说明荧光PCR方法具有较高的特异性。

2. 4 弓形虫荧光PCR敏感性试验

试验将提取的弓形虫DNA以10 倍递减稀释成含1 000, 100, 10, 1 个速殖子的DNA后, 用弓形虫荧光PCR方法最低能检测到10 个弓形虫速殖子 ( 见表5) 。说明荧光PCR方法具有高度的敏感性。

2. 5 动物试验检测结果

随机抽取5 份人工感染的小白鼠不同组织样品, 分别为心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏, 采用荧光PCR方法检测, 结果均为阳性 ( 见表6) , 扩增曲线见图2。其中心脏Ct值为6. 78, 肝脏Ct值为3. 21, 脾脏Ct值为2. 41, 肺脏Ct值为3. 38, 肾脏Ct值为7. 12。随机抽取5 份健康组的小白鼠不同组织样品, 分别为心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏, 用荧光PCR方法检测, 结果均为阴性。表明小白鼠内脏组织均能感染弓形虫, 脾脏的Ct值最低, 说明弓形虫在脾脏中的含量最高, 依次为肝脏、肺脏、心脏、肾脏。

1.脾脏;2.肝脏;3.肺脏;4.心脏;5.肾脏;6.强阳性质控;7.临界阳性质控。

2. 6 弓形虫荧光PCR方法临床样品检测结果

2.6.1东莞市野生老鼠组织弓形虫荧光PCR检测结果

试验检测的野生老鼠样品来源东莞市常平镇三鸟批发市场和东莞市厚街屠宰场, 不同野生老鼠组织样品共32 份, 荧光PCR检测阳性样品1 份, 阳性检出率为3. 12% ( 见表7) 。取阳性病料制成悬液后腹腔接种小白鼠, 小白鼠出现感染症状, 处死后取腹水涂片后镜检可见一端较尖, 一端较钝圆呈新月型弓形虫速殖子 ( 见266 页彩图3) 。

2.6.2东莞市万江区屠宰场猪弓形虫荧光PCR检测结果

试验检测的猪来源于东莞市万江区屠宰场, 随机抽取猪肺门淋巴结样品共50 份, 荧光PCR检测阳性样品0 份, 阳性检测率为0。

3 讨论

根据试验结果, 应用建立的弓形虫荧光PCR方法最低能检测到10 个弓形虫速殖子, 1 个弓形虫速殖子的检测结果为可疑, 而对大肠杆菌O157∶ H7、沙门氏菌和对照组小白鼠内脏检测结果均为阴性, 与谢德华等[6]建立的PCR方法的敏感性差异不大。在检测感染的弓形虫小白鼠的内脏中, 脾脏的Ct值最低, 为2. 41, 说明弓形虫在脾脏中的含量最高, 依次为肝脏、肺脏、心脏、肾脏。结果表明, 试验建立的弓形虫荧光PCR方法具有特异、敏感、快速、操作简便等特点, 适合动物组织弓形虫的大规模监测。

根据临床样品的检测结果, 在野生老鼠中检出1 份阳性样品, 经过动物回归试验后, 镜检观察到弓形虫的速殖子, 说明东莞市野生老鼠存在感染的情况。张端秀等[7]应该正向间接血凝试验, 在2005—2006 年对东莞市犬、猫血清学调查中, 犬的抗体阳性率为0. 66% , 猫为0。徐斌等[8]应用ELISA对重庆地区猪弓形虫抗体进行检测, 检测结果为75. 95% 。陈淑芳[9]应用ELISA宁波某地猪弓形虫血清阳性率进行检测, 平均达到28. 40% 。肖芳萍等[10]应用正向间接血凝试验对贵阳地区猪弓形虫进行检测, 抗体阳性率为16. 06% 。于迪等[11]应用正向间接血凝试验对辽西地区宠物弓形虫抗体进行检测, 阳性率为14. 2% 。翟佳等[12]应用正向间接血凝试验对武汉家犬弓形虫抗体进行检测, 阳性率为13. 4% 。各地对弓形虫抗体的血清学调查结果不同, 差异较大, 但均反映了动物不同程度感染弓形虫的情况。李亚丽等[13]用建立的PCR方法检测漯河市菜市场的猪肉, 检测弓形虫阳性8 份, 阳性率为4% 。邵晓冬等[14]应用PCR方法对洛阳地区病死猪的检测阳性率为18.5% , 屠宰猪阳性率6. 7% 。本试验应用建立的荧光PCR方法对屠宰场采集的50 份猪淋巴结进行检测, 检测结果为阴性, 未检出猪淋巴结阳性样品可能与采集的样品数量少和场点少有关, 将在以后的监测中加大样品的监测数量和监测范围。

我国人口的弓形虫感染率低于欧美等国家, 可能与中国人肉类食品消费量低, 且多为熟食方式有关[15]。我国今后的弓形虫感染方式可能会逐渐变化, 与进食感染肉类的关系将逐渐加重, 因此试验使用近年发展起来的荧光PCR技术应用于动物组织的弓形虫检测, 为弓形虫病的防控提供依据。

PCR方法 第9篇

1 材料与方法

1.1 参考菌株

牛结核分枝杆菌参考菌株 (GIMI-267) 购自上海研生生化有限公司。大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌菌株均为贵州大学动物疫病研究所实验室保存。

1.2 主要试剂

SDL2000 Marker、2×Taq PCRMaster Mix、细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖等, 均购自天根生化科技有限公司;改良罗氏培养基, 购自上海研生生化有限公司。

1.3 引物设计与合成

参考Gen Bank数据库牛结核分枝杆菌基因序列, 设计合成1对牛结核杆菌特异性引物, 引物序列为TB-P1:5’-CCTGCGAGCGTAG-GCGTCGG-3’;TB-P2:5’-TCAGCCTCCACGC-CCGCCA-3’;预期扩增片段大小为317 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 牛结核分枝杆菌核酸获取

1.4.1 细菌的培养:

按照说明书配制改良罗氏培养基, 取菌液以划线方式接种于培养基上, 放置于37℃恒温箱中培养5~7 d, 待培养基逐渐由浅蓝色变为深蓝色, 收集细菌培养物, 供后续实验用。

1.4.2 细菌DNA的提取:

将1 000μL灭菌双蒸水加入固体培养基表面, 洗脱菌落, 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌核酸 (操作步骤按试剂盒说明书进行) , 将提取的DNA进行10倍倍比稀释后置于紫外分光光度计测定其纯度和浓度。

1.5 PCR基本反应体系建立

根据PCR技术原理, 结合特异性引物Tm值, 建立PCR反应体系: (1) 25μL反应体系包括:2×Taq PCR Master Mix为12.5μL, TB-P1 (10μm/L) 和TB-P2 (10μm/L) 分别为1μL, DNA模板为2μL, 灭菌去离子水补足25μL体系。 (2) 反应条件:94℃3 min;94℃30 s, 55℃30 s, 72℃1 min, 35个循环;72℃5 min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 观察扩增效果。

1.6 PCR最佳反应体系确定

1.6.1 模板浓度优化:

按照1.5所述基本反应体系和反应条件, 其中DNA模板1、2、3、4、5μL梯度进行PCR扩增, 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 综合考虑引物二聚体、目的条带效果等因素, 筛选DNA模板最佳反应浓度。

1.6.2 引物浓度优化:

按照1.5所述基本反应体系和反应条件, DNA模板使用1.6.1最佳反应浓度, 而引物使用0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75μL梯度进行PCR扩增, 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 综合考虑引物二聚体、目的条带效果等因素, 筛选最佳引物反应浓度。

1.6.3 退火温度优化:

在保证其他反应条件最佳的前提下, 通过调节退火温度, 在50~58℃之间浮动, 梯度为2℃, 得出其反应的最佳退火温度为52℃。

1.7 PCR方法性能评价

1.7.1 敏感性检测:

将提取的牛结核分枝杆菌基因组DNA (初始浓度为1.1×101μg/μL) , 按10倍倍比稀释, 各取2μL按最优PCR最优反应条件进行PCR扩增, 检测PCR方法的敏感性。

1.7.2 特异性检测:

分别提取牛结核分枝杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、链球菌培养物DNA, 按本实验确定的最佳反应条件进行PCR扩增, 检测PCR方法的特异性。

1.7.3 应用性检测:

用已建立的PCR检测方法, 对5份已知牛结核分枝杆菌阳性奶样进行基因提取, 并进行PCR扩增, 检测PCR方法的临床应用性。

2 结果与分析

2.1 牛分枝杆菌核酸获取

用核酸测定仪对DNA样本进行纯度和浓度测定, 结果显示:D260 nm/D280 nm=1.803 2, 说明样本纯度较好, 样本DNA浓度为0.011μg/μL。

2.2 PCR基本反应体系建立

对已知样本进行检测, 结果见图1, 所建立的PCR方法25μL反应体系可扩增出已知样本317 bp DNA条带, 与预期扩增大小相符。

注:M:DL 2 000 Marker;1~3:待检样本;-:阴性对照

2.3 最佳反应条件确定

2.3.1 最佳模板反应浓度检测:

分别取1、2、3、4、5μL DNA样本按基本反应体系与条件进行PCR扩增, 结果见图2。

注:M:DL 2 000 Marker;1~5:1、2、3、4、5μL DNA待检样本;-:阴性对照

由图2可见, 当反应体系中加入3μL DNA样本时, PCR扩增效果最佳, 即DNA模板终浓度为3μL×0.011μg/μL/25μL=1.32μg/m L时PCR反应效果最佳。

2.3.2 最佳引物反应浓度检测:

分别取0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75μL引物按最佳反应体系与条件进行PCR扩增, 结果见图3。

由图3可见, 当体系中TB-P1 (10μm/L) 和TB-P2 (10μm/L) 引物分别加入1.25μL时, PCR扩增效果最佳, 即PCR引物浓度为0.5μm/L时PCR反应效果最佳。

注:M:DL 2 000 Marker;1~6:0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75μL引物;-:阴性对照

2.3.3 最佳退火温度检测:

分别在50、52、54、56、58℃退火条件下按基本反应体系与条件进行PCR扩增, 结果见图4。

注:M:DL 2 000 Marker;1~6:1、2、3、4、5μL DNA待检样本。

由图4可见, 当反应条件中退火温度为54℃时PCR扩增效果最佳, 即最佳退火温度为54℃。

2.4 PCR方法特性检测

2.4.1 敏感性检测结果:

对DNA模板进行10倍倍比稀释, 分别取2μL模板按最佳反应条件进行PCR扩增, 结果见图5。由图5可见, 所建立的牛结核分枝杆菌PCR检测方法最小DNA检测浓度为8.8 pg/μL, 结果表明所建立的PCR方法均有较好的敏感性。

注:M:DL 2 000 Marker;1~6:10倍倍比稀释的DNA待检样本;-:阴性对照

2.4.2 特异性检测结果:

分别提取常见细菌大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、链球菌培养物的DNA样本, 按最佳反应条件进行PCR扩增, 结果见图6。

注:M:DL 2 000 Marker;1~5:牛结核分枝杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、链球菌DNA待检样本;-:阴性对照

由图6可见, 大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、链球菌培养物的DNA样本均为扩增出任何条带, 而牛结核分枝杆菌DNA样本扩增出317 bp目的条带, 结果表明所建立的PCR方法具有良好的特异性。

2.4.3 临床应用性检测结果:

提取已知5份牛结核分枝杆菌阳性乳样DNA样本, 应用所建立的PCR方法进行扩增, 结果均扩增出317 bp目的条带, 结果说明所建PCR方法具有良好的临床应用性。

3 结论与讨论

3.1 牛结核病 (Bovine Tuberculosis) 是由牛结核分枝杆菌引起的人畜共患传染病, 以奶牛最易被传染[1]。结核分枝杆菌可随鼻汁、痰液、粪便和乳汁等排出体外, 污染饲料、饮水、空气等周围环境, 使其在人畜之间相互传播[2]。人结核病可以传染给牛, 牛结核病也能传染给人, 人们饮用未经消毒或消毒不完全的患病牛的牛奶就可能被传染[3]。1996年, 张高迪等[4]通过试验发现牛结核病中有7%系人分枝杆菌感染, 而结核病人中10.6%为牛分枝杆菌感染, 世界上结核病人中约有15%是因饮用结核病牛的奶而致病。因此, 牛结核病的及时诊断、发现并采取净化措施, 是防控人、牛结核病的关键。

3.2 目前, 奶牛结核病的检测依然依赖提纯结核菌素皮内变态反应试验[5], 但随着养殖规模的扩大, 发展高通量、快速、准确、简便的新型检测技术显得十分迫切。不同地区结核分枝杆菌流行株在基因型上存在较大差异, 其预防与控制措施也需随机应变。国内外最早采用生化分析、血清学技术和噬菌体分型等技术[6~8]进行分析, 但由于这些方法的局限性而未得到广泛应用。基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等感染性疾病进行检测的一个强有力的手段[9,10], 可以进行结核分枝杆菌传播途径追踪和综合防制技术研究。

3.3 本实验在国内外研究者的工作基础之上, 筛选适合我市奶牛结核病检测的新技术, 使我省在结核病检测技术发展和应用上得到提高。通过设计合成特异性牛分枝杆菌引物, 建立PCR方法, 并对所建立方法的体系和条件进行优化, 评估方法的敏感性、特异性和临床应用性, 结果显示, 所建PCR方法模板浓度、引物浓度和退火温分别为1.32μg/m L、0.5μm/L、54℃时最佳。该方法具有良好的特异性和敏感性, 最小可检出结核分枝杆菌DNA浓度8.8 pg/μL。本快速检测方法的建立为我省奶牛场结核病综合防控提供关键技术。

摘要：随着牛结核病疫情日趋严重, 快速、高效的分子生物学检测方法建立显得十分必要。试验设计合成了牛结核分枝杆菌特异性引物, 优化反应条件, 建立了牛分枝杆菌PCR检测方法。结果显示, 所建立的牛结核分枝杆菌PCR检测方法可有效检测牛结核分枝杆菌, 在模板浓度、引物浓度和退火温度分别为1.32μg/mL、0.5μm/L、54℃时最佳;性能评估显示, 该方法具有较好的特异性、敏感性和临床应用性, 为我省牛结核病的综合防控提供关键技术。

关键词：牛结核分枝杆菌,PCR检测,方法建立

参考文献

[1]Stefano M, Marco M, Manuela D P, et al.A case-control study on bovine tuberculosis in the Veneto Region Italy[J].Preventive Veterinary Medicine, 2008, 34:87~95.

[2]王忠仁.牛结核病与人结核病的相互关系[J].中国防痨杂志, 2005, 27 (2) :123~125.

[3]朱建国, 华修国.牛结核病研究进展[J].中国预防兽医学报, 2005, 27 (5) :422~426.

[4]张高迪, 杨醉宇, 邢新华, 等.内蒙古哲里木盟人与牛结核相互传播关系的研究[J].内蒙古畜牧兽医, 1996, 2:47~49.

[5]张喜悦, 王君玮, 高云航, 等.3种方法检测结核污染牛场的比较[J].中国兽医学报, 2003, 23 (6) :555~558.

[6]杨玉英, 李士泽, 郭士玲, 等.BA-Dot-ELISA检测牛结核乳清抗体的研究[J].黑龙江八一农垦大学学报, 2000, 12 (4) :51~54.

[7]牛中伟.牛γ干扰素抗原捕获ELISA检测方法的建立及初步应用[D].扬州大学, 2009.

[8]余大海, 韦一然, 蔡宏, 等.牛结核病鉴别诊断的方法研究[J].中国人兽共患病学报, 2006, 20 (10) :935~936.

[9]张书环, 杨俊兴, 晁彦杰.牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用[J].动物医学进展, 2007, 28 (7) :17~24.

PCR方法 第10篇

1 材料

1.1 供试菌株

RA菌株, 分离自广西地区不同养鸭场, 主要流行株为1型 (见表1) ;RA分离菌株、大肠杆菌南宁株、沙门杆菌南宁株、多杀性巴氏杆菌南宁株, 均由广西壮族自治区兽医研究所细菌研究室鉴定并保存。

1.2 培养基及试剂

培养基, 购自杭州天和生化仪器公司;PCR Taqmix、100 bp DNA MarkerⅡ, 购自广州东盛生物科技有限公司。

2 方法

2.1 全菌体的预处理

参照参考文献[7]中的方法, 用生理盐水清洗菌泥, 加双蒸水沸水浴10 min 后离心, 取上清液作为模板使用。

2.2 引物的设计与合成

根据GenBank中发表的鸭疫里默杆菌CVL110/ 89 株编码42 ku 主要外膜蛋白的基因序列设计1对引物[由宝生物工程 (大连) 有限公司合成], 序列为上游引物5′-GAGCCAACTATTTGAGACACG- 3′, 下游引物5′–CCTTTAATGCTCCTGTTGCT- 3′, 预计扩增片段长度为660 bp。

2.3 PCR反应及产物的检测

PCR 反应条件:95 ℃预变性4 min ;94 ℃变性40 s, 51 ℃退火40 s , 72 ℃延伸1 min, 共35个循环;72 ℃再延伸10 min。分别以21株来自广西壮族自治区各鸭场的鸭疫里默杆菌全菌体为模板进行扩增。测定敏感度时, 将广西壮族自治区优势血清型1型RA菌株过夜纯菌培养液用无菌纯化水以10倍梯度稀释, 平板计数得到起始的细菌总数为11011 cfu/mL, 作10 倍连续稀释至10 cfu/mL。取各稀释度的全菌体作为模板进行扩增, 并按常规方法计数以检验本方法的敏感性。PCR反应结束后取20 μL产物用于1 %琼脂糖凝胶电泳分析。

3 结果

3.1 特异性检测结果

所有的21 株鸭疫里默杆菌均能扩增出660 bp 的DNA 片段, 与预期扩增片段大小相符, 而鸭源大肠杆菌、鸭源沙门菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌均为阴性。图1为3 种血清型RA、1株鸭源大肠杆菌、1株鸭源沙门菌和1 株鸭源禽多杀性巴氏杆菌的扩增结果。

M.100 bp DNA MarkerⅡ;1～21.分别代表RA0428、RA0531、RA0608、RA0701、RA0609、RA0702、RA0712、RA0703、RA0704、RA0705、RA0706、RA0707、RA0708、RA0709、 RA0710、RA0711、RA0901、RA0902、RA0903、RA0904、RA0905株; 22.鸭源大肠杆 菌; 23.鸭源沙门菌; 24.鸭源禽多杀性巴氏杆菌。

3.2 敏感性检验结果

以不同稀释度全菌体作为模板的PCR扩增结果见图2。全菌体模板稀释度从11011 cfu/mL到1102 cfu/mL均有目的条带出现, 证明该方法检测灵敏度达1102 cfu/mL。

M.100 bp DNA MarkerⅡ; 1～12.RA全菌体模板稀释度分别为11011, 11010, 1109, 1108, 1107, 1106, 1105, 1104, 1103, 1102, 1101, 1100 cfu/mL。

4 讨论

研究在国内首次建立以3型RA 的OmpA基因为靶序列进行快速检测的PCR方法并取得了较好的结果。以往鸭疫里默杆菌PCR检测多以提取基因组DNA为模板的方式进行[8], 提取程序繁琐, 耗时长且经济性差。试验采用全菌体作为模板进行PCR 扩增, 为鉴定RA提供了快速和实用的新方法。

根据GenBank中发表RA的OmpA基因序列, 在其高度保守区设计1对特异性引物, 对广西兽医研究所细菌研究室鉴定、保存的21 株鸭疫里默杆菌 (其中包括3 个血清型) 、1株鸭源大肠杆菌、1株鸭源沙门菌和1 株鸭源禽多杀性巴氏杆菌进行扩增, 结果所有的鸭疫里默杆菌均能扩增出660 bp 的DNA 片段, 而鸭源大肠杆菌、鸭源沙门菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌均为阴性, 表明建立的PCR方法特异性强。

CFU 是colony forming unit 的缩写, 由于在琼脂平板上生长出的菌落可能来源于单个细胞或几个细胞, 通常以单位体积或单位重量中菌落总数单位CFU 来表示样品中细菌数量。本试验首先检测每毫升菌液的CFU, 并进行梯度稀释制备PCR 模板, 在1102 cfu/ mL时仍然能扩增出660 bp 的目的条带, 检测方法敏感性高。

OmpA广泛存在于革兰阴性菌群中, 能维持细胞膜的完整性, 是一种在肠科杆菌中高度保守的外膜蛋白, 也是该菌的主要免疫原性蛋白之一[9]。本研究进一步证实OmpA基因是可用于鸭疫里默杆菌PCR快速检测的良好候选基因。

参考文献

[1]B W卡尔尼克.禽病学[M].10版.高福, 苏敬良, 译.北京:中国农业出版社, 1999:195-202.

[2]郭玉璞, 陈德威, 范国雄, 等.北京鸭传染性浆膜炎的调查研究[J].畜牧兽医学报, 1982, 13 (2) :107-112.

[3]黄瑜, 李文扬, 程龙飞, 等.福建省Ⅱ型鸭疫里默氏杆菌的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报, 1999, 21 (1) :71-72.

[4]李继祥, 徐刚, 王孝友, 等.重庆地区鸭传染性浆膜炎病原分离鉴定[J].中国预防兽医学报, 2000, 22 (6) :420-422.

[5]RYLL M, CHRISTENSEN H, BISGARRD M, et al.Studies on theprevalence ofRiemerella anatipestiferin the upper respiratory tract ofclinically healthy ducklings and characterization of untypable strains[J].Journal of Veterinary Medicine, 2001, 48:537-546.

[6]TSAI HJ, LIUY, TSENG C S, et al.Genetic variation of the ompAand 16S rRNA genes ofRiemerella anatipestifer[J].Avian Patholo-gy, 2005, 34 (1) :55-64.

[7]POH RAMACHANDRAN C I V, TAPSALL J W.Genetic diversityof Neis seria gonorrhoeae IB-2 and IB-6 isolates revealed bywhole?cell repetitive element sequence?based PCR[J].J ClinMicrobiol, 1996, 34:292-295.

[8]胡清海, 刘晓文, 赵世华, 等.应用PCR技术检测鸭疫里默氏杆菌的研究[J].中国预防兽医学报, 2002, 24 (6) :471-473.

PCR方法 第11篇

【关键词】 EMA  PCR  微生物死活菌区分  微生物检测新技术

【课题项目】重庆三峡医药高等专科学校校级苗圃工程（2014mpxz4）。

【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2015）05-0233-01

分子生物学方法中基于PCR技术的检测方法被越来越多地应用于致病菌的检测，但是传统的PCR检测技术不仅能扩增活细胞DNA，同时自由状态的DNA或死细胞DNA也能被扩增，导致检测出现假阳性，因此一种能特异、快速、准确检测病原菌的方法极为迫切。

一、EMA-PCR检测技术原理

活菌和死菌的区别之一是细胞膜的完整性，EMA是一种DNA 结合染料，其光解后形成的氮宾化合物能够渗透进入细胞膜不完整的菌体内，与DNA分子发生不可逆的共价结合，从而抑制其PCR扩增，但不会影响活菌DNA的PCR扩增。EMA结合PCR的检测方法，仅以活菌的基因组DNA为检测靶标，能有效降低传统PCR检测的假阳性，同时能有效降低“活的但不可培养状态”（VBNC）菌在传统培养法带来的假阴性结果，使检测结果更加准确、可靠。

二、EMA-PCR检测技术应用

目前，EMA-PCR新型微生物活体检测技术已经广泛用于食品微生物、环境微生物和医学微生物的检测中。Guy等[1]用EMA结合常规PCR的方法检测屠宰场中有活性的沙门氏菌，这种EMA-qPCR方法成功地避免了检测过程中的假阳性，对食品安全评估更为准确。Pilar等[2]用v-PCR方法检测军团杆菌，结果发现，v-PCR方法与平板培养法结果比较相近或略高，但是相对于常规PCR的检测结果而言偏低或相近，表明此法能避免常规PCR检测带来的假阳性和平板培养计数法可能带来的假阴性结果，该法用于检测水体中的军团杆菌。新建立的v-PCR方法在缩短检测时间的同时保证了检测结果的准确性。Trivedi等[3]用较高的EMA浓度实时定量监测柑橘中脉中不可培养的柑橘黄龙病菌的含量，发现在感染的长春花中检测到的病原菌含量比感染的柑橘中高，对病害的流行规律研究有重要的意义。

金黄色葡萄球菌（SA）是一种常见的高致病性革兰氏阳性菌，对SA的准确检测十分重要，而检测的关键是食品中活菌是否存在和如何准确定量的问题。余以刚等[4]建立金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导条件模型，成功建立了DNA结合EMA与qPCR技术相结合检测VBNC金黄色葡萄球菌的方法。

EMA-PCR检测技术有效避免了传统PCR检测方法的假阳性结果和传统培养方法带来的假阴性结果，这种新型、方便、快捷、准确的微生物活体检测技术将取代传统的检测技术成为微生物检测的新思路。

参考文献：

[1]Guy RA， Kappor A， Holicka J， Shepherd D， Horgen PA. Arapidmolecular-based Assay for direct quantification of viable bacteriain slaughterhouses. Journal of Food Protection， 2006，69（6）：1265-1272.

[2]Pilar DV，Lydie S，Jean MD. Viability PCR，a Culture-Independent method for rapidand selective quantification of viable legionellapneumophilacellsin environmentalwatersamples.Applied and environmental microbiology，2009，75（11）：3502-3512

[3]Trivedi P， Sagaram US， Kim JS. et al. Quantification of viable Candidatus Liberibacter asiaticus in hosts using quantitative PCR with the aid of ethidium monoazide （EMA）.European Journal of Plant Pathology，2009，124： 553-563.

[4]余以刚，田聪，肖性龙等.金黄色葡萄球菌VBNc状态的诱导条件和EMA-qPCR检测.华南理工大学学报（自然科学版），2013，1（41）：127-129.

作者简介：

PCR方法 第12篇

关键词：甲肝病毒,PCR,TaqMan

甲肝是经粪口感染HAV病毒导致的急性肝脏炎症。传统的ELISA检测单抗-HAV不能区分感染是新近还是既往。因HAV抗原主要存在于病人的粪便中其检测一般只用于科研[1]。本法研究的TaqMan PCR是建立在RT-PCR的基础上, 针对放射性探针缺点进行改进的技术, 其对目标序列的高特异性克服了常规RT-PCR的不足, 还具引物设计简单、重复性较好等优点[2]。本研究利用TaqMan RT PCR技术建立了甲肝病毒核酸分子检测方法, 现将结果报道如下。

1 资料与方法

本研究利用反转录酶将病毒RNA反转录成cDNA, 再以cDNA为模板利用Taqman探针法进行扩增反应, 对病毒进行核酸定性检测。

1.1 病毒

HAV选择甲肝IgM阳性样本, 样本由艾迪康医学检验中心提供。

1.2 试剂与仪器

病毒RNA提取试剂采用艾康生物的病毒核酸纯化试剂盒, 反应系统为T A K A R AR T-P C R nk i t试剂盒, 定性P C R仪为TAKARA, 荧光定量PCR仪为ABI7300。

1.3 引物与探针的设计合成

从GenBank基因库上检索出中国人群的12株甲肝全基因序列, 利用clustalx生物软件进行保守性分析。根据TaqMan PCR引物探针的设计原则, 利用PrimerExpress 3.0进行引物和探针的设计。探针5`, 3`端分别标记FAM荧光报告基团和TAMRA荧光淬灭基团。引物和探针由上海英骏生物技术有限公司合成并标记。

1.4 反应体系与反应条件

配制RT反应液, 进行5uL体系反应, 上定性PCR仪, 进行RT-PCR:37℃15min (反转录反应) , 85℃5sec (反转录酶的失活反应) 。按照以下组分配制反应液:通用PCR反应混合液、PCR Forward Primer、PCR Reverse Primer、荧光探针溶液、模板、dH2O等试剂的使用量分别为25、1、1、1、5、17 (μL) , 前3个的终浓度为10.2、0.2、0.2 (μM) 。ABI 7300:95℃, 5min, 95℃, 30sec, 55℃, 35min, (40circles) , 55℃采集荧光。

1.5 TaqMan PCR检测体系的优化

为优化引物与探针的最佳浓度, 获得反应的最佳Ct值和最高荧光强度增加值△Rn, 提高扩增效率与敏感度, 在相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中, 对引物与探针利用矩阵法优选出最佳工作浓度;引物浓度为0.18μmol/L, 探针浓度为0.16μmol/L。在相同浓度阳性核酸为模板反应条件下对Tm值进行优化, 以获得最佳退火温度56℃时, 荧光强度最强, 反应的灵敏度最好。

1.6 TaqMan荧光定量RT-PCR检测体系评价

选取一HAV IgM (+) 样本株倍比稀释1:10、1:100、1:1000, 分别提取病毒RNA并检测, 考察检测下限, 评价敏感性。对每一个浓度的样本都作3个重复, 对实验结果Ct值的平均值和变异系数进行分析与评价。

2 结果

2.1 特异性的引物与探针

根据对12株病毒全基因序列生物信息学分析结果, 利用Primer Express 3.0设计得到的引物与探针, 经Blast分析验证证实为HAV各型共有序列, 并具有HAV的型特异性。扩增目标片段长度为73bp。

2.2 数据分析 (表1)

引物与探针浓度的筛选结果 (Ct值) 。

2.3 结果分析

对进行倍比稀释的4个不同浓度的同一HAV IgM (+) 样本重复3 次 (Ct1, Ct2, Ct3) 得到的Ct值, 通过计算Ct值的平均值和标准差, 进一步可以得到各项检测的变异系数 (CV) , CV值最大为1.66%, 均<5%。证实检测重复性很好。

3 结语

缩短病毒的检测窗口期对及甲肝早发现有重要作用。临床常用检测方法主要针对HAV抗原抗体及HAV-RNA。他们针对两个不同的水平。TaqMan RT-PCR针对病毒核酸直接证实病毒感染和复制活性, 而ELISA抗体方法针对病毒蛋白, 检测血清学指标, 不属同一个水平, 敏感性、特异性也不同。核酸检测是判断感染最灵敏、最特异的确诊性指标。阳性即可确认感染, 并表示病毒复制活跃和具有传染性[3]。

参考文献

[1]王季午.人类病毒性疾病[M].北京:人民卫生出版社, 2002.

[2]吴梓涛.病毒性肝炎研究近况[J].国外医学情报, 1993 (1) .