病毒受体范文

病毒受体范文（精选6篇）

病毒受体 第1篇

近年来,很多鸡的疾病,如禽流感、新城疫、鸡传染性贫血病等的流行已经不再只是局限于主要的家禽,而是延伸到了一些其他的宿主,如火鸡、商品鸭、鸽、鹅、其他水禽和其他鸟类等。而对于IBV,最初认为鸡是它的唯一易感动物,但近年来的研究发现,IBV不但可以感染鸡,同时也可以感染包括鸟类等一些其他动物如孔雀、水鸭等[2]。特别是由于2002年SARS的暴发,导致冠状病毒跨种感染的现象更引人注意,也促使对冠状病毒受体与配体的作用机制有更多思考。

1 IBV的病毒粒子结构及功能

IBV是属于套病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的一个代表种[3],编码4种结构蛋白,即纤突蛋白S(Spike protein),与受体结合及细胞膜融合有关,可以诱导抗体中和作用、血凝作用以及特异性CTL反应,S蛋白在翻译后被宿主的蛋白酶切割成Sl和S2两个部分,通过非共价键相连。Sl由514~519个氨基酸残基组成,负责识别受体,而S2则负责与细胞膜融合[4];膜蛋白M(Membrane protein),控制并介导病毒粒子从粗面内质网膜或高尔基体膜出芽,在病毒装配时与核衣壳相互作用,而将其结合到囊膜上[5];核衣壳蛋白N(Nucleocapsid protein),约17%为碱性氨基酸,其功能主要是包裹核酸。它与RNA前导序列相互作用促进病毒m RNA合成,并与病毒RNA结合形成螺旋状核衣壳[6];还有一些小分子膜蛋白E(Small membrane protein)。这几种蛋白质在病毒粒子的侵入、组装与释放过程中起着重要作用。

2 IBV病毒侵入及合成机制

当p H值接近中性环境时,IBV的S蛋白可介导病毒和靶细胞膜上的特异性受体结合,并吸附到细胞的表面,然后细胞膜与病毒囊膜融合或通过内吞的方式使毒粒进人细胞浆。在细胞浆内病毒基因组RNA与细胞的核糖体结合,随后5′端翻译出病毒特异性的RNA依赖的RNA聚合酶,它使病毒基因组转录成全长的互补链。病毒特异性RNA聚合酶以不同基因间隔区的互补序列转录成正链RNA和一套约6个亚基因组m RNAs。这些m RNAs的5′端戴帽,3′端加聚A尾,即所谓3′同末端成套结构。这些m RNA的5′端还有同一先导RNA序列,约72个核苷酸。可通过先导RNA-引物转录模式在粗面内质网核糖体上合成结构蛋白和非结构蛋白。在结构蛋白M、S和N中,M蛋白在刚翻译出来时并未糖基化,它要转运到高尔基体中才被糖基化,S蛋白可在粗面内质网与高尔基体间聚集,S蛋白在翻译后被宿主细胞的蛋白酶切割为S1和S2两个亚单位[7]。N蛋白产生于细胞质的多核糖体上,经磷酸化后与新合成的基因组RNA相互形成螺旋状的核衣壳。

3 IBV病毒受体及其作用机制

一般而言,病毒感染细胞需经历吸附、穿入与脱壳、生物合成、组装与释放等步骤。特异性的吸附是病毒表面分子与细胞受体相互作用的结果,是病毒侵染易感动物细胞的第一站,也是影响病毒宿主特异性和组织亲嗜性的决定因素之一。病毒通常利用存在于细胞表面成分作为进入细胞时的受体,包括一些蛋白分子类、糖类或者糖脂类。还有一些其他的分子或者供受体有时也会参与到病毒囊膜与细胞膜的融合。那么,IBV是以何种生物为受体参与感染?目前学术界有3种看法,即氨基肽酶N、硫酸乙酰肝素和唾液酸。

氨基肽酶N(APN)是许多1群冠状病毒的细胞受体,如猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫冠状病毒、犬冠状病毒及人冠状病毒等的受体。然而,虽然禽类组织中可以分离到多种氨肽酶成分,禽类的APN成分至今仍然没有得到确定,认为最有可能的是日本人从鸡卵黄中分离到的一种氨肽酶成分,他们将之命名为氨肽酶Ey[8]。Miguel等发现IBV能轻微感染猫细胞,IBV Ark299株可在猫肾细胞系(FEK)上复制,将子代病毒转移到鸡胚后出现了IBV典型的鸡胚变化特点,之后将猫APN(f APN)转染至非易感的BHK-21细胞后发现病毒可在胞浆内复制,表明f APN似乎可以作为IBV的受体,不管这种成分在鸡组织分布情况如何,表明f APN在IBV的传播上发挥着一定的作用[9]。然而,在2007年,Chu等[10]用瞬时转染及组型表达表明f APN不可能是IBV的功能型受体,他们发现f APN的表达对改变IBV多种毒株(包括Ark299)对BHK-21细胞的易感性的作用是非常微弱的。鸡APN是否可以作为IBV的可能性受体?近年没有关于这方面的报道。

另外一种可能的受体是硫酸乙酰肝素(HS)。Madu等[11]分析表明,HS是Beau株的一种可能性黏附因子,他们用RT-PCR分析了Beau与其他IBV株S基因的差异,发现Beau株S2段686~691位存在着一个与其他株明显区别的恒定区SRRK(R)S。他们还运用可溶性肝素竞争试验表明,肝素的处理有效抑制了Beau株的感染,而对M41株无任何作用,从而得出了HS是Beau株的一种特异性黏附因子的结论。是否这种特异性黏附作用决定了Beau的特性,还是与S2上特定区域存在稳定关系,需要进一步研究。S2的作用是促进病毒与受体结合之后病毒与宿主细胞的融合,而特异黏附因子作用于受体结合之前,存在什么关系似乎需要更多的详细论证。

相对于IBV上述2种可能性受体(氨基肽酶N、硫酸乙酰肝素)而言,唾液酸在IBV病毒粒子与宿主细胞相互作用中的角色则更为明了。唾液酸可作为多种病毒的特异受体或黏附因子,目前已发现流感病毒、副黏病毒、马鼻炎A病毒等可利用相同或不同的唾液酸成分作为自身受体[12,13,14];多种冠状病毒成员也能与唾液酸发生相互作用,许多2群冠状病毒与细胞表面成分中的N-乙酰基-9-O-乙酰唾液酸的结合对于启动感染是必要的。一些IBV株能凝集红细胞,在预先处理神经氨酸酶之后才能凝集,这是因为IBV优先识别α-2,3唾液酸[15]。Winter等[16]分析发现唾液酸对于IBV感染是至关重要的。他们发现经神经氨酸酶(唾液酸糖苷键的消化酶)处理过的Vero、BHK-21、CK细胞对原先易感的IBV Beau株变得抵制,这种唾液酸依赖性在IBV M41株上也存在着同样的关系。与流感病毒C以及仙台病毒相比,IBV对神经氨酸酶的处理更为敏感,这表明IBV的感染比其他病毒更需要唾液酸以启动感染,进一步研究发现IBV的感染与唾液酸α-2,3糖苷键有关。之后,Winter等[17]又证实了唾液酸在IBV感染气管环培养(TOC)中的作用,体外试验均证实了α-2,3唾液酸在IBV感染细胞中作为初始黏附因子的重要作用。

4 展望

抗病毒天然免疫识别受体的研究进展 第2篇

TOLL样受体(Toll-like receptors,TLRs)被认为是最重要的模式识别受体[5],其在天然免疫细胞的表达使机体能够及时感知感染等危险信号。TLRs属于I型跨膜蛋白,表达于细胞表面或细胞内的内体,结构分为胞外区、跨膜段和胞内区三部分,不同的TLRs通过胞外区的亮氨酸重复序列(leucine-richrepeat,LRR)特异性地识别一系列的病毒的PAMP,并将信号传递到胞质内与白细胞介素1胞内区结构高度同源的胞内区,启动细胞内信号转导通路,诱导特异性基因表达,分泌细胞因子或趋化因子,发挥抗病毒作用[6～8]。

核苷酸寡聚化域样受体(NOD-like receptor,NLR)属于胞质内识别受体,主要通过自身C端的L R R和核内结和域,识别细胞质中非己物质,从而诱导抗病毒天然免疫反应分子活化和促炎症细胞因子的产生[9]。NLR主要由3个不同的结构域组成:C端LRR,这是一个与Toll样受体胞外段相同的结构域,专门负责识别和探测病毒的P A M P;N A C H T(n e u r o n a l apoptosis inhibitory protein、CⅡTA、HET-E and TP-1,N A C H T)为N L R各成员共有的特征性结构域,位于N L R的中央,也称为核苷酸结合位点(nucleotide-binding site,NBS),对于N L R的寡聚体化和活化非常重要;N端为效应结构域。主要由两种成分组成:胱天蛋白酶招募结构域(caspase activation and recruitment domain,CARD)或热蛋白结构域(pyrin d o m a i n,P Y D),主要连接N L R受体分子与下游的衔接蛋白及效应分子,通过激活NF-KB、MAPK与caspase-l等不同途径介导抗病毒免疫应答[10]。

维A酸诱导基因I样受体(RIG-I-like receptor,RLR)是细胞质内最重要的抗病毒识别受体,大多数细胞系均通过此受体识别病毒RNA的中间产物,对抗病毒天然免疫的建立起着至关重要的作用[11]。RLR主要包括维A酸诱导基因-I(RIG-I)、黑色素瘤相关基因-5(M D A-5)及L G P 2。尽管它们属于同一家族,在结构上具有一定的同源性,3者的C端都有一个类DExD/H盒的R N A解旋酶结构域,能够识别并结合病毒R N A,R I G-I和MDA 5类似之处在于都有一个CARD结构域,通过其激活宿主的天然免疫反应,诱导干扰素、促炎症细胞因子等一系列抗病毒因子的产生[12]。但与RIG-I和MDA5不同之处在于,LGP2缺乏CARD结构域,因而人们普遍认为LPG2只能够识别病毒相关的R N A组分,却不能直接将信号向下游传递[13]。最近研究发现:它很可能通过与R I G-I和M D A 5竞争性地结合R N A,选择性的抑制RIG—I和MDA5所引起的固有免疫应答,从而起到免疫调节的作用[14～15]。

天然免疫系统另一种重要的识别受体为N K细胞识别受体(NKR),NKR有以下几种分类:(1)根据其所识别的靶分子是否有MHC参与,可分为MHC特异性和非MHC特异性;(2)根据其分子结构可分为免疫球蛋白超家族(Ig-SF)和C型凝集素超家族(CL-SF);(3)根据其功能可分为活化性受体和抑制性受体。包括活化受体和抑制性受体,通过识别主要组织相容性复合体(MHC)或非MHC类配体结合,传递激活信号,调节NK细胞活性,杀伤被病毒感染的细胞、发挥其抗病毒的作用。杀伤被病毒感染的细胞、发挥其抗病毒作用[16～18]。

载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽家族(apolipoprotein B mRNA editing enzyme-catalytic polypeptide family,APOBEC家族)作为一种具有独特抗病毒机制的蛋白质分子,越来越受到人们关注,已成为生命科学研究的热点,其家族成员包括:活化诱导的脱氨酶(activation-induced deaminase,AID)、A P O B E C 1、A P O B E C 2、A P O B E C 3 A～G等十余种[19～21],其抗病毒作用的发挥是通过脱氨基反应来实现的,它们能够在DNA或RNA水平上改变病毒的遗传信息,这一称为编辑的修饰和加工过程,可以在多种病毒的基因组或其逆转录产物中引入高频突变,进而诱导其降解、干扰其复制或者严重影响病毒蛋白的生物学功能[22]。

病毒受体 第3篇

1 材料与方法

1.1 材料

pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR质粒载体、阴性对照pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRNC(Invitrogen);pLenti6.3-MCS/V5 DEST慢病毒表达载体(Invitrogen);大肠杆菌DH5α、293细胞株(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库);LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT(Invitrogen);AXYGEN胶回收试剂盒;AXYGEN质粒抽提试剂盒;基因测序由上海Invitrogen公司完成。慢病毒包装质粒Packaging Mix、POLOdelivererTM 3000 Transfection Reagent(Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 miRNA干扰表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-EGFR的构建

根据GenBank人EGFR基因序列(基因编号:NM_201283.1),通过Invitrogen公司的在线设计软件BLOCK-iTTMRNAi Designer设计并合成4对miRNA oligo序列(见表1),每对退火后与线性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,转化后接种于壮观霉素(Spe+)的LB培养基中,37℃摇菌过夜。次日用AXYGEN质粒抽提试剂盒提取纯化质粒,送测序。

1.2.2 EGFR基因4个干扰片段在293细胞中的干扰评价

根据目的基因EGFR序列信息设计并合成PCR引物(见表2)。质粒转染操作按LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT转染操作说明进行。转染48h后抽提RNA,反转录获得cDNA模板,用上述引物在Eppendorf Realplex4上进行SYBR Green法荧光定量PCR以分析各基因的表达。数据分析用△△Ct法进行各基因表达的相对定量。

1.2.3 慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFR-miRNA的构建

设计引物(见表3),在目的片段上下游分别添加酶切位点Asc1和Pme1,以干扰效应显著的EGFR片段的干扰载体pcDNA6.2-EGFR-2为模板,PCR扩增。用Asc1和Pme1双酶切PCR扩增产物及载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST。回收酶切后的载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST及目的基因片段,用T4连接酶将目的片段与pLenti6.3-MCS/V5 DEST酶切产物连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,将转化菌液涂布于含Amp(氨苄西林)抗性的LB培养基,挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。将鉴定阳性的克隆在含Amp抗性的LB培养基中培养,提取质粒进行酶切鉴定。最终将菌落PCR和酶切鉴定均呈阳性的克隆送测序,并进行序列比对,保留测序验证正确的质粒。

1.2.4 EGFR基因干扰慢病毒包装

用AXYGEN质粒抽提试剂盒进行质粒抽提,将质粒DNA、慢病毒表达质粒、包装质粒Packaging Mix、POLOdelivererTM 3000 Transfection Reagent混合后按照说明书共转染293T细胞。培养72h收集病毒上清液,用荧光显微镜观察法测定慢病毒滴度。

2 结果

2.1 miRNA干扰表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-EGFR测序结果(见图1),干扰表达载体构建成功。

2.2 4个干扰片段干扰结果见图2。目的基因EGFR的干扰效应评价见图3,干扰效应最显著地干扰载体是pcDNA6.2-EGFR-2。

注:A EGFR干扰片段-1,B EGFR干扰片段-2,C EGFR干扰片段-3,D EGFR干扰片段-4,E EGFR干扰评价阴性对照

2.3 慢病毒表达载体构建结果 pLenti6.3-EGFR-miR重组载体菌落PCR鉴定见图4,pLenti6.3-EGFR-miR重组载体酶切鉴定见图5。

2.4 共转染结果 慢病毒滴度计算结果:ifu/ml=1.8×106。

图4注:泳道1:Marker DL2000(条带大小:2000、1000、750、500、250、100bp);泳道2:阴性对照(水);泳道3～5:EGFR全长引物对重组子PCR扩增

图5注:泳道1:Asc I和Pme I酶对重组质粒进行双酶切(目的条带:911bp+7.7kb);泳道2:p Lenti6.3-EGFR-mi R重组质粒;泳道3:Marker 15000(条带大小:15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)

3 讨论

恶性胶质瘤是最常见的一种成人颅内原发肿瘤。其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤患者,即使经过积极的治疗(如手术、放疗、化疗),5年生存率仍低于5%,中位生存期只有12～15个月[1]。其中EGFR扩增是最常见的基因变异,约50%的恶性胶质瘤存在EGFR异常, EGFR是最早被发现的具有络氨酸激酶活性的受体[2]。在许多的上皮肿瘤中EGFR往往有过表达[3]。过度激活的EGFR可以通过Ras-MAP激酶途径、PI3/Akt途径及STAT-3等信号传导途径把细胞外信号传到细胞内,并激活多种基因异常表达而导致细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进细胞迁移侵袭和促进管生成等改变。EGFR变异的肺癌患者应用抗EGFR治疗已被证实有效[4,5,6,7]。 EGFR特异性抑制剂也已被批准应用于治疗非小细胞肺癌。虽然EGFR抑制剂也进入胶质母细胞瘤治疗的临床试验[8,9,10],但是很多胶质母细胞瘤患者对EGFR抑制剂治疗效果不佳[3]。

microRNA(miRNA)是近几年发现和发展起来的新兴基因阻断技术,是继siRNA(small interfering RNA)之后发现的又一调节mRNA稳定和翻译的一类非编码RNA,可与互补mRNA全配对,降解靶mRNA或抑制其转录后翻译,从而达到沉默该基因的表达。本实验采用真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR,具有以下特点:方便表达追踪;可同时表达多个miRNAs;组织特异性表达广泛;可转入包括慢病毒在内的各种目标载体,且在任何细胞中稳定干扰。

基因治疗需要优化载体系统、提高转染效率。以质粒为载体介导干扰的转染率低,靶基因抑制作用弱,维持时间短,只是瞬时地表达干扰RNA不容易得到稳定的转染,不适合体内实验。慢病毒载体是一种复制缺陷型反转录病毒载体,是在HIV-I病毒基础上改造成的病毒载体系统,具有可感染分裂期与非分裂期细胞、转移基因片段较大、表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点。与其他病毒载体,如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统反转录病毒载体相比,慢病毒可将目的基因整合至靶细胞基因组长期表达,同时扩大了载体感染细胞的范围,适于体内基因治疗。因此成为转染的理想工具[11,12]。尤其在神经细胞这种长期处于非分裂期的细胞中具有优势,实现稳定的RNAI。本实验慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST便具有高效、稳定、特异性强的特点。

在本研究中,我们成功构建了EGFR基因RNAi慢病毒载体,并包装成为慢病毒颗粒,可以很有效地感染胶质瘤细胞系。这为更深入地研究EGFR沉默后对其在胶质瘤相关信号通路中的作用奠定了基础,同时也为寻找胶质瘤基因治疗方法提供技术支持。

摘要：目的 构建表皮生长因子受体(EGFR)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法 合成EGFR基因的miRNA干扰序列,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-EGFR质粒,测序验证插入序列正确,连接到慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST中,获得pLenti6.3-EGFR-miRNA质粒,与慢病毒包装质粒Packaging MIX、POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent共转染293T细胞株,细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果 PCR和测序结果证实,EGFR miRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液滴度为1.8×106ifu/ml。结论 成功构建EGFR基因RNAi慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定基础。

病毒受体 第4篇

关键词：日本脑炎病毒(JEV),受体,二维电泳(2-DE),质谱(MS)

日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV),我国又称乙脑病毒,属于黄病毒科黄病毒属,是有囊膜的正链RNA病毒。JEV引起的流行性乙型脑炎(乙脑),是一种严重的急性中枢神经系统传染病。病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒感染复制过程中的始动环节,也是影响病毒宿主特异性、组织亲嗜性和致病性的决定因素之一。目前,JEV在易感细胞上的受体分子及其特性与功能仍然不清楚。

建立并筛选病毒特异性受体缺陷细胞系,或对病毒感染有抗性的细胞系,将为鉴定病毒受体分子提供有力的工具[1]。本课题组应用化学方法诱变JEV易感细胞BHK-21,经JEV攻击,筛选建立了一株JEV受体功能缺陷细胞系3A 10-3F[2]。3A 10-3F细胞与JEV的结合率显著下降,仅为2.1%;其对JEV的感染有相当程度的特异性抵抗,在JEV感染复数为MOI 1时,3A 10-3F细胞培养上清中JEV最高滴度比BHK-21细胞中JEV最高滴度下降两个数量级。由此推测3A 10-3F细胞的某些膜分子表达发生了变化,进一步鉴定这些膜分子可能发现某些具有病毒受体功能的新的未知宿主蛋白。本研究应用蛋白质组学的方法,即二维电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)组合液质联用质谱(LC-MS/MS)技术,重点观察了3A 10-3F细胞与BHK-21细胞膜分子的表达差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

BHK-21细胞为本室保存,3A 10-3F细胞为本课题组建立。

1.1.2 试剂

蛋白酶抑制剂(MiniComplete)购自Roche公司。苯甲基磺酰氟(PMSF)、TritonX-100、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、尿素(urea)、硫脲(thiourea)、3-(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、iodoacetamide(IAA)购自Sigma公司。85%tributylphosphine(TBP)购自Fluka公司甘露醇(mannitol)、蔗糖(sucrose)、HEPES购自Merck公司。13cm pH 3-10线性IPG预制胶条、IPG缓冲液pH 3-10、低分子量蛋白标准均购自Amersham-PharmaciaBiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 氯仿去脂法提取细胞膜蛋白

参考文献[3],分别提取3A 10-3F细胞与BHK-21细胞的膜蛋白。长满单层的1×108个细胞,用PBS(含100mg/LPMSF)洗三次,用含蛋白酶抑制剂的冷分离缓冲液(200mmol/Lmannitol,70mmol/Lsucrose,10mmol/LHEPES,1mmol/LEDTA,pH7.4)1mL重悬细胞,冰浴超声3次。细胞沉淀重悬于含0.1%BSA的冷分离缓冲液中,离心(4°C、1 000g/min、15min),弃上清。细胞蛋白沉淀中加1mL氯仿室温振荡孵育1h,再加入1∶1的甲醇/去离子水1mL剧烈振荡10min。离心(2 000g/min、1min),吸弃氯仿层。重复氯仿去脂一次。冷丙酮沉淀膜蛋白后,Bradford法蛋白定量,分装-70℃保存备用。

1.2.2 二维电泳(2-DE)

突变细胞与BHK-21细胞的膜蛋白样品送西安交通大学生命科学院生物信息研究中心做二维电泳,分析差异点。用13cm线性pH 3—10预制胶条,上样量50μg膜蛋白。参照IPG phor等电聚焦系统指南,程序设置如下:1)60V,12h,Stepand Holdmode;2)200V,2h,StepandHoldmode;3)500V,2h,Gradientmode;4)1 000V,1h,Gradient mode;5)8 000V,1h,Gradientmode;6)8 000V,StepandHoldmode。总电压时间为30kVhT。将胶条在10mL含有1%DTT的平衡缓冲液中(6mol/L urea,30%glycerin,4%SDS,50mmol/LTris-HCl pH 8.8)室温平衡15min后,再用含2.5%IAA的平衡缓冲液室温平衡15min。在SDS-PAGE SE 600电泳系统进行第二相电泳。电流条件为:先10mA30min,再20mA直到溴酚蓝跑至距胶底0.5～1cm,停止电泳。按蛋白质银染试剂盒的操作手册进行银染。在相同条件下,对突变细胞与BHK-21细胞的膜蛋白样品分别进行了三次2-DE检测。

1.2.3 凝胶图像分析

银染的凝胶经ScanMaker 8700扫描仪扫描后,图像保存为TIF格式,输入分析软件ImageMaster 2D Platinum Software 5.0(Amersham-Pharmacia,Sweden),进行背景消减、点检测、匹配、获取斑点位置坐标等分析。选取表达量差异2倍以上的点作为后续质谱分析的候选蛋白质点。

1.2.4 LC-MS/MS分析及数据库查询

将需要进行鉴定分析的差异蛋白点从2-DE凝胶中切下,送中科院动物所生物膜与膜生物工程国家重点实验室,进行LC-MS/MS分析。经过冲洗,脱色,胶内酶切,萃取及冻干,将制备好的样品置于HPLCSurveyor系统及LCQ DecaXPPlusSystem质谱仪上进行分析。将肽指纹图谱的数据输入NCBI蛋白质网站数据库的子库(物种名称为mouse),用检索软件(Bioworks 3.1中的SEQUEST)对蛋白质点的分子量、等电点、匹配肽段的多少和覆盖率等进行综合分析、鉴定。

2 结果

2.1 2-DE检测3A 10-3F细胞与BHK-21细胞膜蛋白的差异

3A 10-3F细胞与BHK-21细胞膜蛋白2-DE银染图谱如图1所示。经图像扫描后,应用ImageMaster 2D Platinum Software 5.0软件对图像进行分析,结果显示3A 10-3F细胞样本三次重复凝胶图谱之间点偏差(variationcoefficientsonthespotnumbers)为9.2,平均检测到的蛋白质点数为690点;BHK-21细胞样本三次重复凝胶图谱之间点偏差为8.7,平均检测到的蛋白质点数为710点。以BHK-21细胞为对照,定量差异表达分析(表达量相差2倍以上)发现有23个蛋白质斑点在两组凝胶中有显著差异表达(图1与表1)。差异点分为三类,第一类是与对照组相比,3A 10-3F细胞样本中有蛋白质表达上调(六个点,即spots 11-12,14,17,19,21)或下调(六个点,即spots 1,4-7,9)。第二类是对照组为空白,仅仅表达在3A 10-3F细胞样本中的蛋白质(七个点,spots 13,15-16,18,20,22-23)。第三类是3A 10-3F细胞为空白,仅仅表达在BHK-21细胞样本中的蛋白质(四个点,spots 2—3,8,10)。

*:+100代表仅仅表达在参考胶(referencegel)BHK-21上的点;-100代表仅仅表达在样品胶(samplegel)3A 10-3F上的点

2.2 LC-MS/MS分析及数据库查询

将以上23个差异蛋白质点从2-DE凝胶中切下,进行胶内酶切和LC-MS/MS分析。结合数据库检索,鉴定了14个蛋白质(表2,spots 1,3-5,7,10-12,14-16,20and 22-23),均有较多的匹配肽段数及较高的氨基酸序列覆盖率。根据NCBInr网站蛋白质数据库提供的蛋白质功能信息,被鉴定的14个蛋白质按功能不同可分为六种:钙离子结合(Calcium-binding)蛋白,离子通道(Iontransportation)蛋白,蛋白结合(Proteinbinding)分子,信号转导(Signaltransduction)分子,核糖体(Ribosomal)蛋白以及代谢酶(Metabolism)。其中有四种膜蛋白,即钙结合蛋白annexin 1,annexin 2;电压依赖的离子通道(VDACs)蛋白VDAC 1,VDAC 2。

3 讨论

通过鉴定病毒的受体可以促进对病毒致病机理的认识。一旦病毒受体的特性与功能被确定,将对研制有效的抗病毒药物和疫苗提供依据。

目前还未见报道筛选鉴定BHK-21细胞上JEV受体。本研究应用2-DE组合LC-MS/MS技术,首次鉴定了JEV受体功能缺陷的细胞系3A 10-3F与亲代BHK-21细胞上有明显差异表达的四种膜蛋白,即钙结合蛋白annexin 1,annexin 2;电压依赖的离子通道(VDACs)蛋白VDAC 1,VDAC 2。这些膜蛋白介导JEV吸附穿入细胞的特异性作用是未知的。

annexins分子是一类结构相似的蛋白家族,它们的共同特性是都能以钙离子依赖的方式结合磷脂膜和细胞膜。annexin 1参与多种细胞功能,包括膜融合、胞外分泌、分化、凋亡、钙离子通道以及与细胞骨架蛋白相互作用[4]。目前仅有一篇文献报道涉及annexin 1在病毒感染细胞中的作用。研究发现[5],感染性胰腺坏死病毒(IPNV)对鱼细胞的感染,使annexin 1在细胞膜上表达升高,从而抑制IPNV感染细胞的凋亡,促进IPNV在细胞中的增殖。另有几篇文献报道涉及annexin 2在病毒感染中的作用。如最近annexin 2被鉴定为巨细胞病毒(CMV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的受体[6,7]。annexin 2能够促进HIV—1穿入细胞,在病毒装配中起关键的作用[8]。本研究发现3A 10-3F细胞上annexin 1和annexin 2的表达明显地下降。根据上述annexin 1与annexin 2的功能,这两个分子有可能通过与脂膜的相互作用与JEV的结合相关。所以annexin 1与annexin 2在3A 10-3F细胞上表达的下调,导致JEV与3A 10-3F细胞膜的结合能力也明显下降了。

VDACs蛋白是一个进化保守的多基因家族,是存在于真核细胞线粒体外膜的多孔疏松性蛋白质,控制ATP与ADP转运的动态平衡。然而,多个研究小组报道[9,10,11]VDACs蛋白也存在于多种类型的细胞膜上,参与细胞膜电压调节及细胞的凋亡。VDAC 1通过一种鼠细胞的细胞膜调节ATP的转运[12]。Baker等[13]观察到在细胞膜上,VDAC 1以NADH依赖的铁氰化物还原酶的形式抑制ATP合成酶的释放,并大大降低了完整的线粒体内生性NADH/细胞色素酶系统的活性。除了可以作为盐类及离子通道,哺乳动物的VDAC 2还有其它功能,比如与Bcl-2家族的蛋白相互作用,严格调节细胞凋亡[14]。本研究发现VDAC 1仅仅表达在3A 10-3F细胞上,VDAC 2在3A 10-3F细胞上的表达升高。可能这两个VDAC分子在JEV穿入3A 10-3F细胞过程中起着离子通道的作用,同时也参与其它包括信号转导的细胞功能。

膜蛋白蛋白质组学研究具有相当的挑战性,主要是因为膜蛋白的特性,如两性分子、低丰度、高疏水性、碱性等电点等。膜蛋白既含有亲水性区域,也含有疏水性区域。在水中的低溶解度限制了它们的富集、定量和鉴定。因此需要一种简单有效的方法提取膜蛋白。最主要的障碍是膜蛋白镶嵌在脂双层中。用有机溶剂使膜蛋白去脂可以改善膜蛋白在二维电泳中的分离[15,16]。Mirza等[3]用氯仿抽提法建立了一种简单有效的膜蛋白去脂新方法,使膜蛋白能更好地溶解在尿素缓冲液中,适合于后续的胰酶消化及质谱分析。经鉴定证实,提取的细胞蛋白中,大约43%是膜相关蛋白。在本研究中,应用上述方法提取了3A 10-3F和BHK-21细胞膜相关蛋白,因而在LC-MS/MS鉴定的结果中,除了膜蛋白,也发现了胞浆蛋白,核糖体蛋白和一些代谢酶。另外,由于蛋白质组学方法的复杂性,差异点选择的严格性,很有可能并不是所有表达量改变的点都能被检测和被鉴定。这样,只有那些在电泳中得到很好的分离而差异也很明显的蛋白,才能被挑选出来进一步鉴定。

病毒受体 第5篇

谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，参与神经系统发育及其突触传递等重要生理功能，但是谷氨酸能神经传递的异常则会诱发癫痫、中风、老年痴呆等神经退行性疾病。海人藻酸(kainate,KA)受体为离子型谷氨酸受体，在神经系统广泛表达。KA受体在神经递质释放、突触功能以及神经兴奋性传递等神经功能中发挥重要作用[1,2,3,4]。其中，突触后的KA受体主要参与兴奋性神经传递，而突触前KA受体通过调节抑制性神经递质GABA的释放而参与调控抑制性神经传递[5]。

KA受体为四聚体，主要包含五个亚基，即GluR5、GluR6、GluR7、KA1及KA2，目前根据其亚基的基因名称依次命名为Glu K1-5[6,7]。其中，Glu K1-3亚基可构成同源通道而被KA调节，而Glu K4和Glu K5本身不能形成功能性的受体，只有和Glu K1-3共同表达构成异源通道才具有功能。Glu K2亚基在大脑广泛表达，尤其在海马中高度富集，在神经元突触前和突触后均有表达，参与突触传递、兴奋性神经元损伤等生理病理性调控[4,5,8,9]。因此，对Glu K2调节机制的阐明，可为兴奋性神经元的损伤提供一定的理论基础，有着非常重要的实验价值。

复制缺陷型腺病毒载体是目前在科学研究中应用较广泛的具有较高转染效率的载体。本研究通过分子生物学手段成功构建了Glu K2复制缺陷型腺病毒载体，有望通过其感染脑组织、体外培养的原代神经元或是神经元细胞系，为进一步研究Glu K2在神经元生理病理性活动中的作用提供高效的转染工具。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株及细胞株

海人藻酸受体亚基Glu K2-pc DNA3.1真核表达载体为本课题组构建保存[10];腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV、骨架载体p Ad Easy-1、BJ5183菌株及HEK293细胞均为作者实验室保存。

1.1.2 试剂

PCR master Mix和Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System购自Promega公司;限制性内切酶KpnⅠ、NotⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、T4DNA ligase、1 kb DNA Ladder购自New England Biolabs公司;Lipofectamine 2000、1 kb Plus DNA Ladder及Puri Link Hipure Plasmid Midiprep Kit购自Invitrogen公司;λ-HindⅢ-digest marker为Takara公司产品;腺病毒纯化试剂盒Adeno-XTMVirus Purification Mega Kit为Clontech公司产品。细胞培养基DMEM、Opti-MEM I均为GIBCO公司产品;肽牛血清为杭州四季青产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及目的基因扩增

根据Gene Bank中的大鼠Glu K2基因编码序列(Z11548)，设计上下游引物，在上游引物中加入KpnⅠ酶切位点(下划线)，下游引物中加入NotⅠ酶切位点(下划线)，上游引物:5’-GGTACCATGAAGATTATTTCCCCAG-3’，下游引物:5’-GCGGCCGCTCATGCCATGGTTTCTTTACCTG-3’，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以Glu K2-pc DNA3.1为模板，利用特异性合成的上下游引物进行PCR，扩增Glu K2目的基因，后进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2 Glu K2亚克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV

琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段，目的基因和腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV经限制性内切酶KpnⅠ和NotⅠ进行双酶切，回收酶切产物，然后将目的基因亚克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV(Kan+)，筛选阳性重组质粒及酶切鉴定。阳性重组质粒送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序分析。

1.2.3 Glu K2-p Ad Track-CMV与骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组

将测序正确的Glu K2-p Ad Track-CMV用PmeⅠ进行酶切使之线性化，然后将酶切产物进行酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，后将线性化产物溶解于灭菌无核酶水中待用。然后进行含骨架载体p Ad Easy-1的BJ5183电感受态细胞的制备，即将p Ad Easy-1与感受态细胞BJ5183混匀，加入电转杯中进行电穿孔实验(2.5 k V,2.5 ms)，将转化后的菌液用LB培养基悬浮，于LB平板(Amp+)进行阳性克隆筛选，将经鉴定含有p Ad Easy-1的菌株做成电转感受态细胞待用。将纯化的Glu K2-p Ad Track-CMV线性化产物与含p Ad Easy-1的菌株进行电转染，转化产物涂布于LB平板(Kan+)进行筛选，阳性同源重组子经PacⅠ酶切后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 Glu K2重组腺病毒的包装、扩增及纯化

将鉴定正确的Glu K2同源重组体，用PacⅠ酶切，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后溶解于灭菌无核酶水。将线性化产物和脂质体Lipofectamine 2000分别溶解于Opti-MEM I中，混匀室温放置20 min后，加入到密度为90%的HEK293细胞中(25cm2培养瓶)，4 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基。培养至8d后细胞均可观察到绿色荧光，收集细胞，离心收集细胞胞体，重新悬浮于无菌Hanks液中，反复冻融3次，离心，收集上清液(一代病毒)。用该上清液继续感染HEK293细胞(75 cm2培养瓶，2瓶)，2 d后收集细胞，重复上述操作收集病毒(二代病毒)。将收集的二代病毒继续感染HEK293细胞(75 cm2培养瓶，15瓶)，收集细胞，参照腺病毒纯化试剂盒Adeno-XTMVirus Purification Mega Kit操作方法大量提取纯化病毒，分装于预冷的EP管，-80℃冻存待用。

1.2.5 病毒滴度测定

将HEK293细胞以5×105细胞/孔接种于12孔细胞培养板中，每孔加入100μl梯度稀释的Glu K2腺病毒(10-2～10-6)，每个梯度各做两组，混匀，48 h后于荧光显微镜20×物镜下计数，12孔板于20×物镜下观察每孔视野数为573个。选取平均每个视野荧光细胞数为5～50的孔进行计数，每个梯度2孔，每孔至少计数5个视野，然后按照公式进行病毒滴度(感染单位/ml,ifu/ml)计算。

2 结果与分析

2.1 Glu K2目的基因的扩增

利用设计合成的特异性引物，以Glu K2-pc DNA3.1为模板进行PCR，扩增出Glu K2目的基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)，发现一分子量约2 700 bp的DNA条带，与目的基因分子量(2 727 bp)大小相一致。结果表明，Glu K2目的基因成功扩增。

2.2 Glu K2-p Ad Track-CMV重组穿梭质粒的构建

将上述扩增的Glu K2目的基因亚克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV，筛选的阳性重组质粒经限制性内切酶KpnⅠ和NotⅠ进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离后显示两条明亮条带(图2)，一条约9 000 bp的条带，另外一条约2 700 bp的条带，分别与p Ad Track-CMV分子量(9 220 bp)和目的基因分子量(2 727 bp)大小相符。经测序分析，目的基因序列与Gene Bank中序列相一致。结果表明，Glu K2-p Ad Track-CMV重组穿梭质粒成功构建。

M.1 kb DNA Ladder;1.Glu K2 PCR产物。

M.1 kb DNA Ladder;1.GluK2 PCR product.

M.1 kb Plus DNA Ladder;1.GluK2-p Ad Track经KpnⅠ和NotⅠ双酶切产物。

M.1 kb Plus DNA Ladder;1.Digestion of Glu K2-pAdTrack with KpnⅠand NotⅠ.

2.3 Glu K2同源重组体的构建

将构建好的Glu K2重组穿梭质粒经PmeⅠ酶切，使之线性化，经电泳鉴定(图3)，发现一条长约12 000 bp的DNA片段。然后将线性化穿梭质粒电转染入含骨架载体p Ad Easy-1的BJ5183感受态细胞，筛选穿梭质粒与骨架载体的同源重组质粒。将筛选的阳性同源重组质粒经限制性内切酶PacⅠ消化后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果显示(图4)，分别出现长约30kb和4.5 kb的两个DNA片段，与预期结果相一致。并且重组质粒经测序分析，测序结果与目的基因序列一致。结果表明，Glu K2腺病毒重组质粒成功构建。

M.1 kb DNA Ladder;1.Glu K2-pAdTrack经PmeⅠ酶切后线性化产物。

M.1 kb DNA Ladder;1.Glu K2-pAdTrack linearized product digested by PmeⅠ.

M.λ-HindⅢ-digest marker;1.Glu K2同源重组体经PacⅠ酶切产物。

M.λ-HindⅢ-digest marker;1.Digestion of Glu K2 homologous recombinant by PacⅠ.

2.4 Glu K2腺病毒的包装与滴度测定

将筛选的Glu K2腺病毒重组体用PacⅠ酶切纯化后，经脂质体法转染入HEK293细胞进行包装重组。在转染次日即可观察到绿色荧光，当绝大部分细胞呈现绿色荧光并出现细胞病变效应(CPE)后，收集细胞，粗提病毒，此时的病毒已具有感染能力并能表达目的蛋白。将此病毒进一步扩增，然后用腺病毒纯化试剂盒进行大量提取纯化。如图5所示，将纯化的Glu K2缺陷型腺病毒梯度稀释(10-2～10-6)，进行滴度测定。选取稀释度为10-5的孔进行计数，根据公式，纯化后的Glu K2滴度为6.75×109ifu/ml。结果表明，Glu K2腺病毒具有较高的细胞感染能力。

3 讨论

谷氨酸受体主要包括离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体，其中离子型谷氨酸受体包括NMDA受体、AMPA受体和KA受体[6]。AMPA受体和KA受体合称为非NMDA受体，主要参与中枢神经系统的兴奋性突触传递[11]。当Glu K2丝氨酸846位磷酸化后可上调其SUMO化水平，继而诱导Glu K2亚基发生内吞，此外，棕榈酰化修饰也调节Glu K2在细胞膜的表达。由此可知，蛋白质翻译后修饰参与Glu K2自身功能的调控，从而参与突触可塑性的调节[8,9,12,13]。KA受体亚基Glu K2不仅参与在突触可塑性等神经功能调控[8,9,14,15,16]，而且在兴奋性神经元损伤中也发挥重要作用[17,18,19,20,21,22]。我室首次证明KA受体活化后参与缺血性脑损伤，活化的KA受体通过Glu K2-PSD-95-MLK3信号模块，激活下游信号通路及凋亡通路，最终诱导神经元的凋亡和脑损伤[19,20].含Glu K2亚基的KA受体还参与癫痫发病导致的病理性损伤，参与脑组织神经元的损伤[21]。Glu K2亚基可发生SUMO化，通过MLK3-JNK3信号通路诱导缺血后神经元的损伤[22]。由此可知，Glu K2亚基在谷氨酸兴奋毒分子机制中处于上游信号，是一重要的离子通道蛋白，但是目前关于Glu K2亚基在其他病理机制中的作用仍有待深入阐明。

KA受体亚基主要包含Glu K1、Glu K2、Glu K3、Glu K4和Glu K5五个功能亚基，其中Glu K1、Glu K2和Glu K3具有高度同源性[4]。由于目前尚缺乏特异性的亚基拮抗剂，因而对Glu K2在神经功能调控中的作用仍有待详细阐明。因此，应用高效的基因表达系统，于体内外高效表达Glu K2蛋白，可以更好的研究Glu K2在神经系统中的功能，有着重要的实验价值和应用前景。

Neg.阴性对照;10-2～10-6.病毒稀释倍数。

Neg.Negative control;10-2-10-6.virus dilution.

复制缺陷型腺病毒可高效率进行基因转移，插入的外源基因较稳定，其安全性也较高。脑组织、原代神经元以及一些神经元细胞系的低转染效率一直是困扰科研实验的一大难题。Glu K2缺陷型腺病毒重组体可以于体内外高效表达Glu K2蛋白，为Glu K2神经功能的研究奠定了坚实的基础。

4 结论

本研究通过分子生物学手段成功构建了Glu K2的缺陷型腺病毒重组体，并且通过滴度测定确定其具有较高的感染效率。KA受体亚基Glu K2在突触传递及神经元兴奋性损伤中发挥重要作用。Glu K2复制缺陷型腺病毒重组体对神经元细胞的高感染能力，为我们进一步研究Glu K2亚基在神经系统的生理功能和病理作用提供了一个有效的实验研究平台。

摘要：目的:构建海人藻酸(kainate,KA)受体GluK2亚基复制缺陷型腺病毒重组体。方法:以GluK2-pcDNA3.1真核表达载体为模板,经PCR扩增GluK2目的基因,然后将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,后将重组的穿梭质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共同电转入BJ5183电穿孔感受态细胞筛选阳性同源重组子。阳性重组体经限制性内切酶PacⅠ消化,经脂质体转染入HEK293细胞进行包装与扩增。接着腺病毒经大量提取纯化后进行滴度测定。结果:GluK2腺病毒具有较强的感染能力(6.75×109ifu/ml)并可表达目的蛋白。结论:GluK2复制缺陷型腺病毒成功构建。GluK2腺病毒可高效感染原代神经元及神经细胞系,为进一步研究其对神经元的调控作用奠定基础。

病毒受体 第6篇

1资料与方法

1.1一般资料

共研究66例乙型肝炎肝硬化患者,为2011年1月 -2013年12月无锡地区的患者,诊断符合2010年中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会联合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》失代偿乙型肝炎肝硬化的诊断标准[2]。HBV DNA阳性 (HBV DNA≥2-≤8 log10拷贝 /ml),肝功能有不同程度的异常,所有患者排除甲型、丙型、丁型、戊型肝炎病毒的感染,无自身免疫性疾病史,无嗜酒史,无肝毒性药物使用史,未用过核苷(酸)类似物和干扰素等抗病毒药物或免疫调节剂。66例中,C基因型感染者44例(66.67%),其中,男28例(63.64%),女16例(36.36%),平均(54.66±12.92)岁。B基因型感染者21例(31.82%),其中,男17例(80.95%),女4例(19.05%),平均(56.52±11.30)岁,两者性别和年龄比较差异无统计学意义(P >0.05),B和C混合型1例(1.52%),男性,43岁。

1.2检测方法

1.2.1肝功能的检测用日立7600全自动生化分析仪检测。

1.2.2 HBV检测HBV血清学标志物的检测用1235时间分辨荧光法,上海新波试剂检测,HBV DNA用PCR法,上海科华生物工程股份有限公司试剂检测。

1.2.3 HBV基因型的检测采用PCR微板核酸杂交 -ELISA技术,基因扩增仪PE9600型,美国PE公司生产,试剂为第一军医大学基础生物医学诊断研究中心提供。引物及探针:选择前C区的不同序列作为PCR引物和核酸杂交探针,6个基因型通用的序列作为PCR的引物和通用包被探针,而同一部位的不同序列作为各型的显色探针。显色探针5’标记生物素,由上海生物工程公司合成。引物序列为:引物W1:5'-CCCTTCTTCGTCTGCGGTTCC-3'(nt1490~ 1510);引物W2:5'-ACCAATTTAT-GCCTACAGCCTC-3'(nt1798~1777),按说明书操作。

1.2.4 HLA-A2等位型的鉴定取100μl肝素钠抗凝新鲜全血,加入检测管和对照管,分别加入HLAA2-PE及同型对照10μl,室温避光孵育30 min,经溶血处理后用流式细胞仪(Beckman-coulter 3XL)检测,试剂购自英国Proimmune公司。

1.2.5 HBV特异性CTL表面PD-1表达的检测采用密度梯度法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),细胞计数后悬于含体积分数2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer,PBS)中,调整浓度为1×107/ml。取上述PBMC悬液100μl,加入PE标记的四聚体 (HBV core 18-27抗原肽),CD3- 别藻红蛋白(allophycocyanin, APC)、CD8- 藻多甲素 - 叶绿素蛋白(peridinchlorophyll protein,Per CP),PD-1-FITC;同时做同型对照加入Ig G1-FITC、Ig G1-PE、CD3-APC和CD8-Per CP混匀后4℃避光20 min,用2 ml含体积分数2%胎牛血清PBS洗涤液洗涤2次,1 200 r/min离心5 min, 弃上清液,加入1%多聚甲醛300μl固定,2~8℃存放,避光待测(用流式细胞仪检测)。

1.2.6 HBV特异性CTL的检测试管中加入10μl藻红蛋白标记的HLA- 肽四聚体和CD8- 异硫氰酸荧光素、CD3-PC5和HBVcore18-27抗原肽1μl,再加入100μl的肝素抗凝血,同时做同型对照(不加抗原肽的非特异性抗体),混匀室温避光孵育20 min, 溶血洗涤后上流式细胞仪检测,以CD3+淋巴细胞设门计数50 000个CD8+细胞,同时计数CD8+和HLA- 肽四聚体双阳性细胞为特异性CD8+细胞,并以占总计数CD8+细胞的百分比表示,所用试剂购自Beckman coulter公司。

1.3统计学方法

用SPSS 12.0软件进行统计分析,计数资料用 χ2检验,计量资料用(±s)表示,用t检验,P <0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1HBV基因型分布特点

66例乙型肝炎肝硬化患者中,C基因型感染者44例(66.67%),B基因型感染者21例(31.81%),B和C混合型1例(1.52%)。表明无锡地区的乙型肝炎肝硬化患者以C基因型为主,其次为B基因型。

2.2B和C基因型性别与年龄的比较

乙型肝炎肝硬化C基因型感染者44例中,男28例(63.64%),女16例(36.36%);B基因型感染者21例中,男17例(80.95%),女4例(19.05%),χ2= 2.00,P >0.05,C基因型感染者平均 (54.66±12.92) 岁,B基因型感染者平均(56.52±11.30)岁,t =0.57, P >0.05。

2.3B和C基因型感染者HBV特异性CTL表面PD-1表达水平比较

C基因型感染者HBV特异性CTL表面PD-1表达水平为(39.82±6.00)%,高于B基因型感染者 (26.33±3.01)%,t =12.07,P <0.01,见表1。HBV特异性CTL表面PD-1表达的流式细胞图见图1。

2.4B和C基因型感染者HBV特异性CTL水平的比较

C基因型感染者HBV特异性CTL水平(0.17±0.02)%,低于B基因型感染者 (0.37±0.07)%,t =13.54,P <0.01,见表1。HBV特异性CTL的流式细胞图见图2。

2.5B和C基因型感染者的血清HBVDNA水平比较

C基因型感染者HBV DNA水平(5.14±1.09) log10拷贝 /ml,高于B基因型感染者(3.10±0.89) log10拷贝 /ml,t =7.46,P <0.01。见表2。

2.6B和C基因型感染者肝功能的比较

C基因型感染者丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平(115.43±195.05)u/L和总胆红素(total bilirubin,TBil)水平(89.77±132.32)μmol/L, 均高于B基因型感染者[ALT水平(39.14±28.25)u/L和TBil水平(26.52±16.79)μmol/L],t =2.54和3.12, P <0.05和 <0.01。见表2。

3讨论

本研究用PCR微板核酸杂交 -ELISA技术对66例乙型肝炎肝硬化患者进行HBV基因分型的结果表明,C基因型44例 (66.67%),B基因型21例 (31.82%),B和C混合型1例(1.52%),表明无锡地区的乙型肝炎肝硬化患者以C基因型为主,其次为B基因型。B基因型感染者和C基因型感染者之间的性别、年龄比较差异无统计学意义(P >0.05)。

一般认为与HBV B基因型感染者相比较,C基因型感染者的血清HBV DNA水平较高,肝组织学活动度较高[1],本文研究结果与之类似:C基因型感染者HBV DNA水平高于B基因型感染者,ALT和TBil水平高于B基因型感染者。B和C基因型感染者为什么会出现这种差别不很清楚,是否与B、C基因型感染者之间的细胞免疫差别有关,本实验对此作了研究。目前已较一致地认为,乙型肝炎的发病机制主要是机体清除HBV而引发的细胞免疫病理改变,机体清除HBV的细胞免疫机制可分为特异性和非特异性两种形式[3],而对病毒所产生的特异性细胞免疫应答可能是清除机体内病毒的重要因素,病毒特异性CTL清除HBV主要是通过两条途径实现:即胞毒途径和非溶胞途径[4],而非溶胞途径特异性T淋巴细胞只是清除了靶细胞内的病毒,而对靶细胞本身并无损伤,实验研究表明:在特异性T细胞清除病毒的过程中,非溶胞途径可能扮演着更重要的作用[5]。而非特异性细胞免疫清除HBV的作用相对较弱,在清除HBV的过程中可引起肝细胞损伤[6]。 PD-1主要表达于活化的淋巴细胞和单核细胞,尤其是体内活化的T淋巴细胞表面[7],负性调节其活化, 增殖和细胞因子的产生[8,9],使HIV[10]、HCV[11]和HBV[12]等慢性感染过程中患者的病毒特异性CD8+CTL功能受到抑制,从而造成持续性感染状态。

本研究表明,C基因型感染者与B基因型感染者之间特异性细胞免疫功能存在差别,与乙型肝炎肝硬化B基因型感染者相比较,C基因型感染者的HBV特异性CTL表面PD-1表达水平较高,导致HBV特异性CTL水平较低,引起HBV DNA水平高于B基因型感染者,C基因型感染者肝功能损害比B基因型感染者重可能与此有关。并且,可能由于C基因型感染者的HBV特异性CTL水平较低,抗病毒治疗效果较差。C基因型感染者HBV特异性CTL表面PD-1表达水平高于B基因型感染者的机制不很清楚,HBV不同基因型存在不同的生物学特性, 可以影响病毒抗原的表达,从而可以影响免疫功能。 因此,不同基因型可能导致不同临床表现[13]。本研究表明,可能由于HBV B、C基因型存在不同的生物学特性,C基因型HBV的S蛋白氨基酸序列的T细胞表位发生变化的机率较B基因型HBV的S蛋白氨基酸序列的T细胞表位发生变化的机率高等因素[14],导致HBV C、B基因型诱导HBV特异性CTL表面PD-1的表达不同,C基因型HBV诱导HBV特异性CTL表面PD-1的表达高于B基因型HBV。 也可能由于C基因型HBV的S蛋白氨基酸序列的T细胞表位发生变化的机率较B基因型高,导致滤泡辅助性T淋巴细胞(T lymphocytes,Tfh)对B、C基因型HBV的设别和应答不同,C基因型HBV诱导Tfh的产生低于B基因型,导致C基因型感染者的HBV特异性CTL的增殖低于B基因型,C基因型感染者的HBV DNA水平高于B基因型[15],引起HBV特异性CTL表面PD-1的表达水平高于B基因型[16]。 乙型肝炎肝硬化患者不同HBV基因型之间的免疫功能差别和意义需要进一步研究。

摘要：目的 探讨乙型肝炎肝硬化患者不同乙型肝炎病毒(HBV)基因型与外周血HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表面程序性死亡受体-1(PD-1)表达的关系和意义。方法 66例人白细胞抗原(HLA)-A2阳性的乙型肝炎肝硬化患者作HBV基因型检测,比较B、C基因型感染者之间HBV特异性CTL表面PD-1表达水平、HBV特异性CTL水平、HBV DNA水平和肝功能的差别。结果 66例乙型肝炎肝硬化患者中,C基因型44例(66.67%),B基因型21例(31.82%),B、C混合型1例(1.52%),C基因型感染者的HBV特异性CTL表面PD-1表达水平高于B基因型感染者(t=12.07,P<0.01),HBV特异性CTL水平低于B基因型感染者(t=13.54,P<0.01),HBV DNA水平高于B基因型感染者(t=7.46,P<0.01),丙氨酸转氨酶(ALT)高于B基因型感染者(t=2.54,P<0.05),TBil高于B基因型感染者(t=3.12,P<0.01)。结论 与乙型肝炎肝硬化B基因型感染者相比较,C基因型感染者的HBV特异性CTL表面PD-1表达水平较高,导致HBV特异性CTL水平较低,引起HBV DNA水平较高,肝功能损害较重。