干细胞分离范文

干细胞分离范文（精选11篇）

干细胞分离 第1篇

关键词：干细胞分离仪,手工分离,脐带血

在传统的脐带血分离方法中, 多选用羟乙基淀粉沉淀离心分离, 或采用密度梯度离心分离, 采用此些传统分离法均可分离出有核细胞, 但在实际的操作过程中, 此些技术的操作要求较高, 回收效率差异较大, 并且有可能出现污染。因此, 在本文研究中探讨了干细胞分离仪与传统的羟乙基淀粉沉淀离心分离脐带血效果对比报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年2~7月我库收集的40份脐带作为研究对象, 所有产妇均签署研究知情同意书。在本研究所选用的仪器有:干细胞分离仪Sepax S-100, Biosafe生产, 血细胞分析仪KX-21N, SYSMEX公司制造, 流式细胞仪BD, Caton公司制造。

1.2 方法

观察组采用干细胞分离仪分离脐带血, 将20份脐带血的质量称重, 并且通过运算得出体积。在未进行处理前20min, 加入60g/L、且相当于脐带血1/5的羟乙基淀粉, 加入摇匀后关闭干细胞分离仪工具包全部开关, 并将脐血袋连接好, 此时进行干细胞冷冻收集袋、血浆、红细胞收集袋的安装, 安装确认无误后打开开关进行分离, 分离30min, 时间结束后再次称重[1]。对照组采用手工分离法分离, 将20%脐血体积的60 g/L羟乙基淀粉加入到已手机的积血中, 在加入过程中要将两者充分混匀, 取50g混合后液体进行离心分离, 时间为5min。再采用无菌空袋收集压浆板压出的血浆, 离析分离13min, 取20ml样本保留, 将样本稀释为原体积的5倍, 继而对样本红细胞以及有核细胞进行计数[2]。

2 结果

从细胞回收率来看, 观察组有核细胞回收率90.1%±3.2%, CD34+细胞回收率98.2%±4.9%, 对照组有核细胞回收率为69.9%±14.8%, CD34+回收率为84.8%±10.2%, 观察组有核细胞回收率、CD34+回收率高于对照组 (P<0.05) ;从红细胞去除率来看, 观察组为56.1%±15.8%, 对照组为46.9%±15.6%, 观察组红细胞去除率高于对照组 (P<0.05) ;若从标准差来看, 观察组有核细胞回收标准差、CD34+回收标准差低于对照组 (P<0.05) 。详见附表。

3 讨论

通过上述研究结果清楚显示出观察组红细胞去除率高于对照组 (P<0.05) , 观察组有核细胞回收标准差、CD34+回收标准差低于对照组 (P<0.05) , 充分说明, 干细胞分离仪相对于传统羟乙基淀粉手工分离而言, 拥有更高的红细胞回收率和红细胞去除率。

脐带血中造血干/祖细胞含量非常丰富。有如下两个特性是造血干细胞的基本特性: (1) 高度的自我更新能力或自我复制能力, 这样可以保持干细胞数量恒定[3]。 (2) 进一步分化为各系祖细胞及成熟血细胞的能力。目前, 脐带血的主要临床应用是造血干细胞移植治疗各种疾病, 此外脐带血中的非造血干/祖细胞在未来细胞治疗和再生医学中具有广阔的应用前景。本科室曾对脐血体外扩增进行了初步的研究, 证实脐血中不同血细胞可以不同程度被扩增, 但能否用于临床移植, 尚不能肯定[4]。因此, 目前对脐血的处理过程最关键的一步就是要将脐血中所有的干细胞尽可能的回收, 使其体积缩小到统一的20ml标准, 这样可充分利用有限的脐血冷冻储存空间, 在整个脐血的分离、浓缩、冷冻储存和复苏等处理实现标准化和可重复化。规范的仪器操作比较容易满足上述要求, 有利于保证干细胞的高回收率和活性。传统的细胞分离在大容量离心机内进行, 然后用血浆夹分离转移血浆、单核细胞层血浆[5]。

参考文献

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细胞核的分离 第2篇

[实验目的]

1.为了研究细胞核及其组分。

2.定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。

[实验原理]

1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。

目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。

柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。细胞核纯度的鉴定，可以从两方面进行，用光学显微镜或电子显微镜进行形态观察和生物化学方法进行酶活力的测定，某些细胞质的酶（如过氧化氢酶、碱性磷酸酶、淀粉酶和脂酶等），在纯细胞核制品中活力应较低或检查不出来。

本实验以动物肝脏为材料用柠檬酸的方法分离细胞核，用光学显微镜观察细胞核的形态。

[实验用品]

一、材料：动物肝脏。

二、试剂：

1.0.9 %氯化钠。

2.1.5 %柠檬酸钠。

3.0.25mol/l蔗糖-1.5% 柠檬酸溶液。

4.0.88mol/l蔗糖-1.5% 柠檬酸溶液。

5.台盼蓝染液：取0.4g台盼蓝，0.81g氯化钠，0.06g磷酸二氢钾和0.05g羟基苯甲酸盐于95ml重蒸水中，加热溶解后用1mol/l氢氧化钠溶液调ph值至7.2～7.3之间，最后定容到100ml。

三、器材：

1.解剖器一套。

2.高速组织捣碎机或组织匀浆器。

3.离心机（能准确调速的）。

4.台秤。

5.光学显微镜。[实验内容及方法]

一、细胞核的分离

1.实验前24小时内动物须保持空腹，然后将动物断头杀死，取出肝脏，在生理盐水中充分漂洗除去血污，用滤纸吸去表面液体，将肝脏放入-20℃低温冰箱过夜待用。

2.取10g肝脏剪成小块，按1﹕10（重量﹕体积）加入1.5%柠檬酸溶液，用组织捣碎机或组织匀浆器破碎细胞（注意不要把细胞核破坏），如果用高速组织捣碎机，要捣3次，每次5～10秒钟（转速为10 000～20 000r/min）。

3.把捣碎液用4层纱布过滤，滤液以800～900r/min离心10分钟，弃上清液，沉淀再用1.5%柠檬酸液洗一次。

4.将沉淀再悬浮于100 ml 0.25mol/l蔗糖-1.5%柠檬酸溶液中制成悬液，将离心管内预先加好200 ml 0.88mol/l蔗糖-1.5%柠檬酸溶液，并将上述悬液置于0.88mol/l蔗糖-1.5%柠檬酸溶液之上以1 000r/min离心10分钟，即可得到较纯的细胞核沉淀。

二、细胞核纯度的鉴定

用玻璃棒碰一下细胞核的沉淀，放在载玻片上轻磨，然后加一滴台盼蓝（trypan blue）染色液，加上盖玻片，即可在光学显微镜下进行观察，高纯度的细胞核制品必须在计数400个核中不能有一个完整的细胞；在1 000个细胞中不能有一个带有细胞质的核。

[实验报告及思考题]

1.绘制细胞核形态图sssss

血细胞分离机治疗的护理 第3篇

【摘要】离心式血液细胞分离机是利用离心原理，根据细胞大小和密度的不同，在离心力的作用下，细胞的沉降速率不同，进而使各种血液成分得以分离。这种类型的血液细胞分离机在临床和血液中心应用广泛。利用血细胞分离机分离采集患者的血液成分，包括红细胞、血小板、中性白细胞、血浆等。

【关键词】离心式血细胞分离机 治疗 护理

治疗性细胞分离采集术，是通过细胞分离机去除或置换出患者体内病理性的血液有型成分，如红细胞、血小板、白细胞、血漿，同时将其他正常成分回输给患者。

红细胞去除是指由于原发和继发的原因，患者体内细胞大量增生，这种情况下利用血细胞分离机快速去除红细胞，用生理盐水替代。

白细胞去除：主要针对急 慢性白血病的辅助治疗手段。

血小板去除：主要是去除原发性血小板增多症患者过高的血小板，当血小板量大于，就可考虑用此方法。

血浆置换：是一种特殊的治疗手段，包括重症肌无力、古兰——巴雷综合征一线治疗方案。

1 治疗前护理：

1.1 环境要求：独立房间，大小满足常规工作以及能够进行心肺复苏和其它抢救工作。采集房间能够满足无菌条件或者相关管理的规定，每次治疗前用紫外线照射1小时。

1.2 药品和物品的准备。物品：治疗室中除血细胞分离机外、采集床外，还应配备的物品有給氧装置、紫外线消毒灯、血压计、听诊器、抢救车、治疗盘等。

药品：急救药品：主要包括肾上腺素、多巴胺、阿托品、地塞米松、氨茶碱、10%葡萄糖酸钙、生理盐水、抗凝剂等。

1.3 治疗前患者的准备：采集前应对患者进行身体检查，脉搏、血压、呼吸，过高或过低都不能进行治疗，必要时进行B超检查 。

1.4 实验室检查 ：（1）血液学检查；主要进行全血细胞计数、分类和出凝血时间方面的检查。血小板数量和功能、血细胞比容、凝血酶原时间。（2）反映肾功能指标，如尿素氮、 肌酐、尿酸。（3）电解质：包括钾、钠、钙、氯、磷等，如异常，及时纠正。（4）血浆蛋白；为保持一定的血浆胶体渗透压，白蛋白浓度是十分重要。

1.5 治疗目标。根据患者所患疾病确定治疗目标，选择血细胞分离机的操作程序。

1.6 患者的心里护理：多数患者是第一次接触血细胞分离机，或多或少都有恐惧感和顾虑。医生和护士一起向他们讲解治疗方法及其重要性、必要性、安全性和可能出现的问题，讲解治疗的过程，可能需要的时间，并请有过上机治疗的病友与之交谈，缓解患者紧张焦虑情绪。瞩其充分休息、正常饮食。

2 治疗中护理：

2.1 根据患者舒适度，可取仰卧位或头高脚低位。选择明显、粗大、便于穿刺和护理的静脉。首选肘部较大静脉，左右两条静脉通路，一条作为出血端，另一条作为返回端，禁止在同一侧肢体穿刺。穿刺针选择16G或18G单腔穿刺针，以保证足够的血液供应分离机保证治疗过程的顺利进行。

2.2 治疗过程中密切观察患者生命体征变化，认真听取患者的主诉，如有病情变化，立即配合医生治疗。

2.3 并发症的观察：观察有无明显的指、趾、舌尖麻木、恶心、呕吐根据情况每循环1500ml，静推10%葡萄糖酸钙10ml，以补充体内血钙浓度，降低抗凝剂的输注速度。穿刺部有无出血、疼痛，检查穿刺针是否在血管内，有无脱落。

3 治疗后的护理

3.1 注射部位的护理。拔针后使用无菌棉签 多个手指大面积压迫针眼处10---15分钟以上，嘱患者24小时不要沾水，避免感染。

3.2 密切观察生命体征并记录。密切观察患者的血压 脉搏 呼吸及有无其他不适感，认真填写采集护理记录单，待生命体征平稳，与病房医生护士交班。

3.3 预防并发症的发生。告知患者可能发生的并发症，因为使用枸橼酸纳抗凝剂，降低血清钙的水平，可能发生感觉异常和肌肉痉挛，针眼处可能有血肿和局部感染的可能。

3.4 进行电解质血常规的检查。根据患者情况，返回病房2小时后，可及查血常规或次日晨空腹检查血常规和电解质。根据检查结果，如异常情况及时纠正，调整用药，利于患者康复。

我科自开展此项治疗以来，红细胞去除5例、血浆置换8例、白细胞去除35例、血小板去除18例，血常规检测异常值均下降30-%左右。血浆置换比治疗前的症状均有明显改变，患者和家属对治疗效果满意，现在被临床科室广泛应用。

参考文献

[1] 《血细胞分离机——原理与临床应用》温柏平、杨跃煌；人民卫生出版社 2007.12

[2] 《护理学基础》郑修霞；北京医科大学出版社 1998.12

犬牙髓干细胞的分离培养与鉴定 第4篇

本实验将采用酶消法和组织块法尝试从犬年轻恒牙中分离培养出c DPSC,探索其生物学特性,以便为下一步c DPSCs体内移植提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 主要耗材和仪器

4 ~ 6 个月健康雄性比格犬3 只( 上海新冈实验动物场) ,α-MEM培养基( Hyclone公司) ,FBS( 北京全式金) ,胰蛋白酶( Gbico) ,I型胶原酶( Sigma-aldrich) ,中性蛋白酶( 北京索莱宝) ; Anti-Human CD90 ( Thy-1 ) FITC、Anti-Stro-1 Purified ( e Bioscience ) , FITC Mouse Anti-Human CD24、PE Mouse Anti-Human CD34( BD PharmingenTM) ,Nestin ( 北京中杉金桥) ; Vimentin antibody( 武汉博士德) ,Rabbit Anti-Alkaline Phosphatase ( 北京博奥森) ,DSP、goat anti-mouse Ig MFITC: sc-2082 ( Santa Cruz Biotechnology,Inc ) ; FITC Affini Pure Goat Anti-Mouse Ig G( H + L) 、FITC Affini Pure Goat Anti-Rabbit Ig G( H + L) ( 北京凯瑞力枫) ,成脂、成骨诱导分化试剂盒( 赛业) ,荧光显微镜( Leica) 。

1. 2 实验方法

1.2.1 c DPSCs分离培养

犬腹腔注射3%戊巴比妥钠按30 mg/kg剂量全麻。CBCT扫描选取根尖未发育完全、无牙髓病和根尖周病的健康牙齿,拔取实验牙,无菌获取牙髓并分为2份,分别剪成约1 mm3大小;3mg/ml I型胶原酶和4 mg/ml中性蛋白酶联合消化,37℃孵育1 h,消化液通过200目孔筛获取单细胞悬液,然后离心,弃上清,洗涤,细胞计数。按1×105/ml接种至含有20%FBS的α-MEM培养基(加三抗)的25cm2培养瓶,于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养;另一部分组织块用无血清培养基漂洗,再用含血清的培养基漂洗1~2次,最后将组织块均匀放入25cm2培养瓶中(一瓶中约10块组织块),培养条件同上,翻转培养瓶于培养箱常规培养。

1.2.2犬牙髓干细胞的生物学特性鉴定

1.2.2.1克隆形成率(colony-forming unit,CFU)的测定

取第2~4代对数期细胞,消化离心,按600个/皿的密度接种6孔培养皿,常规培养。8~10 d终止培养,4%多聚甲醛固定,0.1%甲苯胺蓝染色。显微镜下细胞克隆计数(大于50个细胞为1克隆),克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.2.2.2流式细胞仪检测细胞表面标记物

取第2~4代对数期细胞,消化离心,计数,105/管,加抗体,室温孵育30 min,上机并用软件分析。

1.2.2.3细胞免疫荧光检测

取第2~4代对数期细胞,消化离心,接种于24孔板,24 h后弃培养基,PBS漂洗,多聚甲醛固定,加0.5%Triton-X100透膜,漂洗后加5%BSA封闭,甩干,实验组加入1%BSA稀释的一抗(1∶100)(Nestin、Vimentin、ALP、DSP);对照组加入PBS,4℃孵育过夜,加二抗(1∶200),37℃孵育1h,漂洗,荧光显微镜下观察拍照记录。

1.2.2.4诱导分化实验

成骨诱导:取第2~4代对数期细胞,消化离心,接种至明胶包被的6孔板,待达80%~90%融合,随机等分为对照组和实验组;实验组成骨诱导分化液,对照加含20%FBS的α-MEM培养,2~3周后茜素红染色,细胞免疫荧光检测牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatas,ALP)表达。成脂诱导:取第2~4代对数期细胞,消化离心,接种6孔板,分组,待细胞达100%融合时,实验组加2 ml成脂诱导分化培养基A,3 d后换为2 ml成脂诱导分化培养基B,24 h又换回培养基A,如此循环3~5次后油红O染液染色;对照组用2 ml含20%FBS的α-MEM。

1.2.3统计学分析

以上各实验至少独立重复3次,数据结果以±s的形式表示。

2 结果

2. 1 形态学观察

2.1.1酶消化法

接种24 h后见少数细胞贴壁,多呈短梭形,见疑似细胞碎片的杂质悬浮或贴壁,48 h后短梭形细胞增多,呈集落样分布生长(图1A),原代细胞在3~5 d生长缓慢,7~10 d见集落细胞数逐渐增多、相互融合(图1B),生长状况活跃,待达80%融合时按1∶3传代。

2.1.2组织块法

镜下观察5 d后,组织块周围游出短梭形细胞,8~10 d细胞围绕组织块呈放射状、漩涡状生长增殖活跃(图1C)。个别组织块周围无细胞游出。约2周组织块周围细胞增殖达80%融合时按1∶3传代,传代后稳定增殖。

A:酶消化法,培养2 d;B:酶消化法,培养7 d;C:组织块法A:Enzyme digested cells cultured for 2 d;B:Enzyme digested cells cultured for 7 d;C:Explanted tissue culture

2. 2 克隆成型率( CFU) 测定

克隆成形实验示8 ~ 10 d镜下见细胞明显呈集落样克隆增殖,细胞排列紧密似鸟巢,界限不清。经0. 1% 甲苯胺蓝染色测得CFU = 15. 17% ± 2. 79% ( 图2) 。

2. 3 犬DPSC流式检测

流式细胞术测其表面标记物,结果显示CD90( 24. 43% ± 7. 10% ) 、STRO-1( 20. 67% ± 1. 42% ) 、弱表达CD24( 2. 03% ± 0. 06% ) ,而不表达CD34( 图3) 。

2. 4 免疫荧光检测

荧光显微镜下犬牙髓细胞Vimentin、Nestin阳性表达、ALP弱阳性表达,DSP阴性或非常弱的表达,对照组上述标记物均为阴性表达( 图4) 。

2. 5 c DPSCs成骨诱导( 图6)

成骨诱导2 周,细胞逐渐呈复层生长,6 孔板底部黏附灰白色颗粒状物质,经茜素红染色,镜下见橘黄色矿化结节,对照组茜素红染色阴性(图5)。免疫荧光检测结果:实验组ALP及DSP呈阳性表达;对照组为阴性表达,可见经成骨诱导分化后ALP与DSP表达呈现明显正调节(图6)。

A:Vimentin;B:Nestin;C:ALP;D:DSP

2. 6 成脂诱导

c DPSCs成脂诱导3 周后,镜下见胞质中大量脂滴。油红O染色示细胞质中大量的红色脂滴,对照组油红O染色阴性( 图7) 。

A: 实验组; B: 对照组 A:Induction group;B:Control group

A: ALP; B: DSP

A:CDPSCs(×200);B:经油红O染色(×100);C:对照组(×100)A:c DPSCs(×200);B:Oil red O staining(×100);C:Control cells(×100)

3 讨论

目前对DPSCs的分离培养基本采用酶消化法,组织块法鲜有报道。本研究同时采取2 种方法完成犬牙髓原代细胞的分离培养,发现均培养出短梭形的成纤维样贴壁细胞,具有高度克隆性增殖,传代后稳定增殖。2 种方法各显优劣,酶消化法快( 7 ~ 10 d) 但操作繁琐,消化的温度、时间较难掌握,消化酶可能损伤细胞,所以本实验酶消化法失败较多。组织块法稳定性好、可重复性强,但时间长( 2 周) 且培养过程中的剪切可造成组织块损伤而影响细胞游出。犬牙由于解剖结构的限制,牙髓组织本身就不丰富,2 种方法的耗费组织量少,而组织块法可避免消化酶的损害,组织块培养法更显优势。Spath等[7]利用组织块法分离培养DPSCs,认为组织块法能模拟体内DPSCs生长的血管周微环境,促进了DPSC增殖和多系分化潜能,提示组织块法对DPSC的分离培养具有一定的前景,值得考究。

牙髓细胞包含成牙本质细胞、成纤维细胞和未分化间充质细胞等多种细胞成分,所以牙髓原代细胞为异质性的多种细胞群体,本实验通过传代的方式,差速贴壁法对原代细胞进行提纯有一定作用,但不完善。

干细胞具备我更新的能力,克隆形成率是其一[2,8],在本研究中用来检测c DPSCs克隆增殖能力,细胞集落样增殖摆列紧密似鸟巢,界限不清。实验数据( 12. 38%~ 17. 95% ) 表明c DPSCs具有一定增殖能力

本实验通过流式细胞术鉴定细胞表面标记物,由于犬特异的抗体极少,本实验选用人抗体,曾有学者成功利用抗人抗体鉴定犬牙髓干细胞和牙周膜干细胞的免疫表型[9]。本实验流式结果显示c DPSCs表达间充质干细胞的标记物CD90,STRO-1,CD24,而造血干细胞的特异性表面标记物CD34 阴性表达。这些结果与以往文献c DPSCs结果一致,但DPSC的CD24 阴性表达[10],而Li等[11]学者研究得出DPSC的CD24 阳性表达,CD24 属一种神经细胞表面标记分子,这与牙髓的神经嵴来源是相符的,而此次c DPSCs的CD24+与Li等结果一致。DPSCs的CD24 表达仍是个有争议的内容,需进一步研究有助于全面理解DPSCs的生物学特性。国外学者检测到DPSCs胞质Vimentin、Nestin表达阳性[12],与本实验所得结果一致。Vimentin主要表达于非终末分化细胞,常作为间充质干细胞的表面标记分子; Nestin属于神经干细胞的表面标记物,这符合牙髓的神经嵴来源的事实,同时暗示其成神经的潜能。ALP是参与骨和牙齿等钙化组织代谢和再生的一种功能性标志酶,常作为鉴定干细胞或干细胞成骨分化与否的标志之一,DSP是成牙本质细胞特异性标志蛋白之一[3],本实验的犬牙髓细胞ALP的弱表达与DSP的极弱表达,排除细胞纯度的影响,表明细胞可能属未分化阶段的牙源性干细胞。

大量研究表明DPSCs具有多向分化潜能。本研究的成骨实验,结果显示诱导分化后茜素红染色阳性。成骨分化后的免疫荧光检测到ALP与DSP均阳性表达,ALP是成骨分化的早期标志,DSP是成牙本质细胞特异性标志蛋白之一。所以成骨诱导分化前后ALP与DSP表达的改变以及茜素红染色阳性结果提示c DPSCs经历了成骨/ 成牙本质分化。对DPSCs成骨分化研究基础大多建立在骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC) 之上,有文献提出牙源性干细胞与BMMSC具有相同的分化过程,但牙源性干细胞有否还经历独特分化过程、有否成骨与成牙本质的双向分化等,但无明确结论[12]。而本研究中成骨分化后免疫荧光检测到ALP与DSP均阳性表达,提示本次成骨诱导分化实验中DPSCs可能发生了成骨和成牙本质双向分化。但其中具体的机制不太确定,有待进一步研究。本实验对牙髓细胞的成脂分化进行了探讨,成脂诱导3 周后细胞胞质内出现大量的红色脂滴,而对照组油红O染色阴性,证实牙髓细胞发生了成脂分化,与国内外文献对DPSC成脂分化的报道是一致的,这里需要特别指出的是在本次研究中间充质干细胞的标记物CD90,STRO-1,CD24 的表达与同类型研究相比较均不高,分析可能与以下几种情况有关: ①培养基的问题使得犬DPSCs发生分化,影响上述指标的表达; ②所选细胞传代过多,可能有部分犬DPSCs发生分化,影响上述指标的表达; ③所选细胞未经筛选,可能含有其它杂质细胞影响数据的表达。我们将在今后的研究中重点针对上述问题进行改进。

4 结论

犬健康年轻恒牙牙髓组织中稳定分离培养出的牙髓细胞,从自我增殖程度、免疫表型、胞质蛋白表达以及多向分化潜能上均可证实属于一种牙源性外胚间充质干细胞,即c DPSCs,然而本实验探讨多向分化潜能进行的是定性研究,缺乏定量分析。对分化潜能的定量探讨,包括其衡量标准至今仍是DPSCs有效应用于牙组织工程的一大挑战。不论如何,本实验表明c DPSCs有望成为组织工程化牙髓牙本质研究与应用的种子细胞,并再次表明犬可作为牙源性干细胞等基础研究的良好动物模型。

参考文献

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干细胞分离 第5篇

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1 广.药学院东中医药研 究 / 广东省院代性谢病疾中医防治药重实点室验 ，家国中医药理 局管脂高血调肝降脂症重研点究室/ 国家中 药管理医局代谢脂级实三室验 ，东 广广 5州10006 ;.2中 大学山生 科命学院干学胞研究细室 ，广 广州东510 006) 培

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3期第

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 第6篇

【摘 要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果 获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。

【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定

0.引言

巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞， 具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1， 2] ， 被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象， 探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。

1.材料与方法

1.1实验对象

清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。

1.2实验方法

1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养

随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。

1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定

（1）台盼蓝染色计算存活率。

4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）； 胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀。（终浓度0.04%） ； 计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。

（2）瑞氏染色计算细胞纯度。

细胞涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。随后将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满涂片，大约1分钟后，滴加等量或稍多的II液，用吸耳球轻轻混匀。冲洗：染色5-10分钟用流水染液，待干。 结果观察，将干燥后的血涂片置显微镜下观察。先用低倍镜观察涂片，再用油镜。

2.结果

2.1小鼠巨噬细胞的分离培养

（1）巨噬细胞的观察与鉴定.

巨噬细胞体外培养24h观察结果。如图1

（2）台盼蓝染色结果。

从腹腔分离出来的巨噬细胞进行台盼蓝染色结果显示巨噬细胞的成活率>95%，如图2

（3）瑞氏染色结果。

从腹腔分离出来的巨噬细胞进行瑞氏染色结果显示巨噬细胞的纯度>98%，如图3

图1巨噬细胞体外培养24h观察 图2台盼蓝染色结果

图3 瑞氏染色结果

3.讨论及结论

巨噬细胞广泛分布于体内，它不仅参与非特异性免疫，而且是特异性免疫中一类关键的细胞，参与集体众多的生理和病理反应过程，如巨噬细胞的吞噬和消除病原微生物[5]，通过加工处理提成抗原，启动特异性免疫应答[6]，以及巨噬细胞通过细胞凋亡清除吞噬的致病病原体等。由于腹腔巨噬细胞多游离存在于腹腔的腹水中，易于获得，因此许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛选免疫增强药物和探讨其作用机制时，往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象。

虽然腹腔巨噬细胞的提取方法都是灌胃洗腹腔后，吸出含有巨噬细胞的灌洗液了，但具体操作略有差异[7]。预先注入的巨噬细胞刺激剂有淀粉溶液、肉汤、糖原等，以产生大量的巨噬细胞计入腹腔。虽然这些刺激剂能分离收集到大量的巨噬细胞，但注入的大分子抗原物质对巨噬细胞吞噬功能有一定的影响，获得的巨噬细胞已不再是原体内巨噬细胞的基础功能。本实验提取巨噬细胞的方法是对文献中方法的改进，关键在于活体腹腔注射不含血清的培养液，轻揉腹部后静置几分钟，然后颈椎脱臼致死小鼠，无菌打开腹腔吸取腹腔液[4]。此方法相对处死小数后进行系列操作而言，洗出的灌洗液中混杂的白细胞少，提取局势细胞的纯度高，是一种简便的小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法，为巨噬细胞的相关研究奠定了基础。

【参考文献】

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[4]李海涛，肖丹，等.小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养[J].现代生物医学进展杂志，2008，8（4）：638-639.

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家兔精原干细胞的分离培养与鉴定 第7篇

关键词：精原干细胞 (SSCs) ,细胞培养,鉴定,家兔

精子发生是雄性动物终身产生大量精子的复杂过程, 包括增殖、分化及生殖细胞的形成[1,2,3]。精原干细胞 (SSCs) 是精子发生的基础, 而且SSCs是雄性个体中唯一能进行有丝分裂并将遗传信息传递给子代的干细胞[4], 而睾丸内的生殖细胞中仅有0.03%是生殖干细胞[5]。2003年, M.Kanatsu-shinohara等[4]首次建立小鼠生殖干细胞体外长期培养体系, 从初生小鼠的睾丸中分离出生殖干细胞, 并通过在体外长期培养获得了多能性生殖干细胞。然而同为啮齿类动物的家兔, 其生殖干细胞体外长期培养体系的建立却未见报道。研究为建立家兔SSCs体外培养体系和转基因兔的生产奠定了基础, 有利于对干细胞的培养及其生长条件进行深入研究。

1 材料

1.1 试验动物

15~20日龄雄性幼家兔2只, 由西北农林科技大学种兔场提供。耳缘静脉注射致死, 收集睾丸。

1.2 主要仪器及试剂

显微镜, Nikon公司生产;PCR仪, Bio-Rad公司生产;Ⅳ型胶原酶, Sigma公司生产;0.25%乙二氨四乙酸 (EDTA) -胰酶、Rabbit Anti-Mouse Oct4 Polyclonal Antibody、Cy3 Affini Pure Goat Anti-Rabbit Ig G (H+L) , Invitrogen公司生产;DMEM/F12, Gibco公司生产;胎牛血清, Hyclone公司生产;青霉素、链霉素, 奥普公司生产;Rabbit Anti-CD9 antibody, Cambridge公司生产;NBT/BCIP AKP显色试剂盒、RNA simple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒, 天根生化科技 (北京) 有限公司生产;LA Taq酶, Ta KaRa公司生产。

2 方法

2.1 SSCs的分离培养

将收集的睾丸用磷酸盐缓冲液 (PBS) 冲洗3次, 去除白膜和其他可见组织, 充分暴露曲细精管。用剪刀将曲细精管剪碎, 添加0.1%Ⅳ型胶原酶和10μg/m L DNaseⅠ, 37℃、5%CO2孵育15 min;PBS清洗1次, 1 000 r/min离心5 min;加入EDTA-胰酶37℃、5%CO2消化10 min。使用含10%FBS的DMEM培养基终止反应, 1 000 r/min离心5 min;使用DMEM/F12培养基 (含10%FBS, 100μg/m L青霉素、链霉素) 重悬细胞, 用400目细胞筛过滤;此时细胞已经基本消化成单细胞, 将单细胞悬液接种到25 cm3卡氏培养瓶中, 37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2 SSCs细胞的鉴定

2.2.1 碱性磷酸酶 (AKP) 染色

将由4%多聚甲醛固定的SSCs用PBS冲洗3次, 每次3~5 min;使用NBT/BCIP AKP显色试剂盒染色, 室温避光孵化15~20 min;待细胞染至深蓝色或深紫色时, 去除染色液, 纯化水冲洗以终止反应, 显微镜下观察并拍照记录。

2.2.2 RT-PCR检测

提取SSCs总RNA, 采用反转录试剂盒反转录合成c DNA。以c DNA为模板, 利用PCR扩增Ngn3、Oct4和β-actin基因。根据GenBank中报道的家兔Oct4基因序列 (登录号为NM_001099957) 、β-actin基因序列 (登录号为XM_002714047.1) 与ENSEMBL数据库报道的Ngn3基因序列 (登录号为ENSOCUG00000027045) , 利用Primer Premier 5.0软件设计引物, 引物序列见表1。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.2.3 免疫细胞化学染色

采用4%甲醛将培养7 d的SSCs室温固定15 min;用含0.1%Tween-20的PBS冲洗3次, 再使用含牛血清白蛋白 (BSA) 的PBS室温下封闭1 h以上, 使细胞重悬;Rabbit AntiMouse Oct4 Polyclonal Antibody室温稀释12 h, PBS冲洗3次;Cy3 Affini Pure Goat Anti-Rabbit Ig G (H+L) 稀释后室温孵育1 h, PBS冲洗3次;最后将该悬浮液用Hoechst 33258 (1∶800) 孵育8 min, 进行单倍体雄性生殖细胞的细胞核染色;PBS冲洗3次, 再取PBS-BSA 0.5 m L重悬细胞。荧光显微镜观察染色结果, 激发光吸收峰为580 nm, 发射峰为644 nm。

3 结果与分析

3.1 家兔SSCs的分离、纯化

研究采用多次差异贴壁法分离、纯化SSCs, 获得的纯化SSCs为圆形, 见图1。原代分离24 h后大部分细胞开始分裂增殖, 培养5~6 d细胞开始出现不规则形状, 即细胞成团生长成为细胞克隆, 见图2。

3.2 家兔SSCs的鉴定

3.2.1 AKP染色

细胞克隆团被染成蓝紫色, 即AKP染色呈阳性, 支持细胞几乎未被染色。AKP是一种细胞多能性标记, 通常用于评价细胞多能性及干细胞特性[6,7,8]。干细胞能被AKP染成蓝紫色或棕色[9,10,11], 见图3。

3.2.2 RT-PCR结果分析

某些生殖细胞的特性基因被认为是识别SSCs的标志, Ngn3基因即为SSCs的典型基因[12], 而Oct4基因是保持细胞多能性及自我更新的重要基因[13], β-actin基因为SSCs和支持细胞的管家基因。SSCs和支持细胞均有β-actin基因的表达, SSCs有Ngn3基因和Oct4基因的表达, 而支持细胞不存在这2个基因的表达, 见图4。因此, 试验所培养的细胞克隆即为目标细胞SSCs。

3.2.3 免疫细胞化学染色结果分析

培养5~6 d后, 细胞克隆表面有CD9细胞表面标记的表达, 可初步鉴定所培养的细胞即为家兔SSCs, 见190页彩图5。A.Mclaren[14]研究表明, SSCs与其他干细胞同样对细胞表面标记呈阳性反应, 例如CD9、胶质源性神经营养因子 (GDNF) 等。因此, 试验所培养细胞克隆为家兔SSCs。

1.Oct4基因;2.Ngn3基因;3.β-actin基因;M.DL-2 000 Marker。

4 讨论

在许多动物类群 (昆虫、蛔虫和脊椎动物) 中, 胚胎发育早期阶段体细胞与生殖细胞不同。雄性生殖细胞起源于原始生殖细胞 (PGCs) , 即起源于外胚层的雄性生殖细胞系的胚胎前体[15]。随着胚胎的不断发育, PGCs演化为生殖母细胞, 即SSCs的前体细胞[16]。因此, 试验选用15~20日龄雄性幼家兔睾丸, 通过两步酶消化法分离、纯化家兔SSCs并进行后续培养与鉴定。

目前, 科学家们根据形态不同将SSCs分为不同亚型的精原细胞。在成熟的小鼠睾丸中, 单一的A型精原细胞被表示为A-single型 (As型) , 最原始的细胞直接位于曲细精管基底膜[17]。As型SSCs对称分裂, 子细胞互相分离或细胞质分裂不完全, 成为A-paried型 (Apr型) , Apr型SSCs与细胞间质桥连接。Apr型SSCs继续分裂产生最多32细胞共同连接的精原细胞亚型A-aligned型 (Aal型, 4, 8或16细胞集落) 。Aal型SSCs继续分化成A1、A2、A3、A4及B中间型SSCs, 其中B中间型干细胞通过减数分裂最终形成精子[15]。试验观察到不同时期家兔SSCs各阶段细胞形态, 对家兔SSCs进行稳定培养, 初步建立了家兔SSCs体外培养体系。

AKP染色通常用于评价细胞多能性及其干细胞活性, 试验所培养的细胞染色结果呈阳性, 即具有干细胞特性。在啮齿类动物中, 已经广泛检测到SSCs标记基因和细胞表面因子的表达, 试验选用CD9作为检测SSCs的表面细胞因子[4]。通过免疫细胞化学染色法鉴定所培养细胞即为家兔SSCs, 是试验所需目的细胞。

5 结论

干细胞分离 第8篇

1 材料与方法

1.1 实验动物

新生SD大鼠 (清洁级) 0~3 d, 由本校动物实验中心提供。

1.2 实验试剂

DMEM/F12 (1∶1) 培养基、B27 Supplement为Gibco BRL公司产品;b FGF、EGF为Pepro Tech公司产品;小鼠抗大鼠巢蛋白 (Nestin) 单克隆抗体、神经元特异性核抗原 (Neu N) 抗体为Chemicon公司产品;2、3-环核苷酸磷酸二脂酶 (CNPase) 抗体为Neomarker公司产品;谷氨酰胺 (L-Glutamine) 、Cy3标记山羊抗小鼠Ig G和5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brd U) 购自Sigma公司;胎牛血清为Hyclone公司产品;兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体、水溶性封片剂、多聚赖氨酸 (Poly-L-Lysine) 为武汉博士德公司产品;青霉素、链霉素为华北制药股份有限公司产品;其余生化制剂均为进口分装或国产分析纯。

1.3 新生大鼠神经干细胞的分离培养方法

无菌条件下取新生大鼠全脑, 去除小脑, 用D-Hank’s液冲洗3次后除去硬膜和血块, 在显微镜下分离出皮层脑组织、室管膜下区和海马组织, 剔除脑组织内血管、纤维, 用眼科剪剪成约1 mm3组织小块, 加入0.125%的胰酶37℃消化15~20 min, 巴斯德吸管反复轻柔吹打成单细胞悬液, 将单细胞悬液过200目不锈钢滤网, 离心沉淀 (800 r/min) 去上清液, 加DMEM/F12完全培养基 (DMEM/F12, L-Glutamine 2 mmol/L, B27 supplement 2, b FGF 10 mg/L, EGF 10 mg/L) 2 m L重悬细胞, 计数后接种到50 m L培养瓶中 (5105个细胞/瓶) , 置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。

1.4 神经干细胞的传代培养

神经干细胞在培养3~4 d后, 可形成神经球, 神经球在培养基中呈悬浮生长, 予以更换半量培基, 1周后用吸管轻柔吹打球形克隆成为小的神经球和单细胞悬液, 将部分细胞接种到新的培养瓶中, 2105个细胞/瓶, 每7~10 d传代1次, 每隔3 d离心更换半量培养基1次, 培养条件不变。

1.5 神经干细胞的鉴定

1.5.1 神经干细胞特异性标志物巢蛋白 (Nestin) 的免疫荧光鉴定

选取培养的神经干细胞悬液滴加于有多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔培养板中。4 h后取盖玻片免疫荧光染色, 取出盖玻片用PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定30 min。用0.1%的Triton-X100处理细胞30 min, PBS洗3次。正常山羊血清封闭, 30 min后弃山羊血清, 加入Nestin一抗 (1∶100) , 4℃冰箱过夜, 再用PBS洗3次, 加入Cy3标记的二抗 (1∶64) 37℃温育30 min。水溶性封片剂封片后, 免疫荧光显微镜观察并照相。

1.5.2 神经干细胞的增殖能力鉴定

向培养基中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (5-bromodeoxyuridine, Brd U) , 浓度为10μmo1/L, 培养2 d后, 滴加标记的神经干细胞悬液于有多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔培养板中。4 h取盖玻片免疫荧光染色, 取出盖玻片用PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定30 min。置于2 mol/L的盐酸中, 37℃反应30 min;同时加0.04%胃蛋白酶室温作用5 min;用PBS洗3次。用0.1%的Triton-X 100处理细胞30 min, PBS洗3次。正常山羊血清封闭, 30 min后弃山羊血清, 加入Brd U一抗 (1∶100) , 4℃过夜, 再用PBS洗3次, 加入Cy3标记的二抗 (1∶64) 37℃温育30 min。水溶性封片剂封片后, 免疫荧光显微镜观察并照相。

1.5.3 神经干细胞的诱导分化

选取上述部分培养的球形克隆悬液种植于有多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔培养板中, 更换为去除生长因子和血清浓度为10%的DMEM/F12培养液, 置37℃、5%二氧化碳培养箱中继续培养, 7 d后做免疫荧光鉴定。

1.5.4 神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞的特异性标志物

Neu N、GFAP、CNPase免疫荧光染色取出上述细胞爬片, 将盖玻片用PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定30 min。用0.1%的Triton-X 100处理细胞30 min, PBS洗3次。山羊血清封闭30 min, 弃去山羊血清后分别加入一抗 (Neu N 1∶100, GFAP1∶100, CNPase 1∶100) , 4℃过夜, 再用PBS洗3次, 加入Cy3标记的二抗 (1∶64) 湿盒内37℃温育30 min。水溶性封片剂封片后, 免疫荧光显微镜观察并照相。分别将原代、3代、10代和20代的神经干细胞诱导分化后, 重复以上过程。

2 结果

2.1 神经干细胞的原代分离培养与传代培养及增殖能力鉴定

在原代培养的第3天能够清楚地观察到神经干细胞以漂浮的细胞团的方式生长, 即形成神经球 (见附图A) , 培养7 d后, 神经球的直径可增加到几百微米, 由数百个细胞构成 (见附图B) 。几乎整个神经球都由Nestin阳性细胞构成 (见附图C) 。Brd U掺入实验表明, 神经球Brd U免疫荧光染色呈阳性 (见附图D) 。

2.2 神经干细胞诱导分化

在去除生长因子并加入10%胎牛血清的培养基中, 神经球及单个干细胞开始贴壁分化 (见附图E) 。细胞从神经球内迁出, 发出很多神经突起, 并形成细胞间的突触连接。单个神经干细胞形态从球形转变为各种形态 (见附图F) , 进而分化为表达Neu N (神经元) 、GFAP (星形胶质细胞) 、CNPase (少突胶质细胞) 阳性的神经细胞 (见附图G~I) 。结果表明, 神经干细胞可以分化为3种神经系的成熟细胞, 经过长期培养的细胞表现出了同样的特性, 神经干细胞的分化能力在历经多次传代后仍保持稳定, 在原代、3次、10次、20次传代后分化成的细胞中, 均可检测到有3种不同类型的神经细胞。

A:原代培养3 d的神经干细胞球 (100) ;B:培养7 d的神经球 (100) ;C:神经球Nestin阳性, Cy3免疫荧光染色 (150) ;D:神经球Brd U阳性, Cy3免疫荧光染色 (150) ;E:神经干细胞球贴壁分化, 细胞向外生长并形成突起 (100) ;F:神经干细胞贴壁分化生长, 并形成细胞间的突触连接 (100) ;G:神经干细胞诱导分化7 d后, Neu N阳性细胞 (神经元细胞) , Cy3免疫荧光染色 (150) ;H:神经干细胞诱导分化7 d后, GFAP阳性细胞 (星形胶质细胞) , Cy3免疫荧光染色 (150) ;I:神经干细胞诱导分化7 d后, CNPase阳性细胞 (少突胶质细胞) , Cy3免疫荧光染色 (150)

3 讨论

在哺乳类动物胚胎期的纹状体、海马、脑皮层、视网膜、脊髓、嗅球、侧脑室的脑室区、室下区均发现有NSCs存在。NSCs具有无限的增殖分裂能力, 它的体外培养成功为研究神经系统发育、分化及治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路。随着研究的深入, NSCs移植将有可能成为治疗神经变性疾病和脑损伤的有效手段[4]。NSCs可以分离、培养并用细胞因子进行分化之后将其移植;也可将体内的NSCs激活、分化为神经元或胶质细胞, 最理想的策略是从需要治疗的患者体内取出NSCs用于自身治疗[5]。

本研究采用无血清培养液, 加用含有能刺激神经干细胞增殖的生长因子b FGF和EGF, 利用神经干细胞具有自我更新和增殖能力的特性, 从胚胎大鼠的大脑皮层、室管膜下区和海马等部位成功地分离培养了神经干细胞, 分离培养的细胞呈悬浮球形生长, 并能在体外大量增殖, 连续传代, 长期培养。神经干细胞的增殖受到多种信号的调节, 其中丝裂原样的生长因子信号在增殖过程中起着相当重要的作用。已用于维系干细胞特性的丝裂原主要包括EGF和b FGF[6]。EGF主要作用是促进神经干细胞的长期存活, 而b FGF则可能对于神经干细胞向神经元和部分程度向胶质细胞分化起到一定的作用[7]。本实验从新生鼠脑分离培养得来的细胞团, 采用无血清培养液联合使用较高浓度的b FGF和EGF进行培养, 结果细胞具有很强的分裂、增殖及自我更新能力, 经传10代以上, 呈蛋白免疫反应阳性, 仍具神经干细胞的基本特性。

Brd U是一种碱基类似物, 在细胞增殖DNA合成时可取代胸腺嘧啶而掺入, 特异性结合在细胞有丝分裂S期的细胞, 作为一种细胞增殖标志。通过Brd U标记可显示新增殖的细胞, 从而检测细胞是否具有自我更新的能力。结果证实神经球内的绝大部分细胞是Brd U阳性细胞, 说明培养的细胞具有自我增殖能力。

巢蛋白 (Nestin) 是一种中间丝蛋白, 又称为细胞骨架蛋白, 该蛋白只在多潜能的神经外胚层细胞表达, 仅在胚胎早期神经上皮表达, 一旦神经前体细胞朝向终末方向分化成神经元和胶质细胞时, Nestin便停止表达, 成熟神经元和星形胶质细胞分别表达其特异性标志物:神经丝和GFAP[8]。因此Nestin被广泛用于神经干细胞的鉴定。但是Nestin并非只在NSC中表达, 它被发现在肌肉和胰岛细胞中表达, 因而其并不能作为高特异性的表面标志物来单独鉴定NSC。

神经干细胞的分化机制有自然分化和定向分化两种。自然分化是神经干细胞内由遗传因素所决定的分化, 定向分化是指在遗传因素的基础上, 接受环境中的特异性分化信号而有目的地分化。当去除生长因子, 置于含血清培养基中培养后, 神经球及单细胞开始贴细胞逐渐迁移出球体并分化为各种成熟的神经细胞, 包括神经元、胶质细胞和少突胶质细胞, 分化的细胞之间具有相互趋向生长的特性[9]。本文免疫荧光染色结果显示, 此种分离培养的细胞分化后可表达Neu N、GFAP和CNPase, 表明笔者获得的细胞是具有多向分化潜能的神经干细胞。

神经干细胞的成功分离和体外培养对通过细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究具有重要意义。除了直接移植替代受损神经细胞外, 神经干细胞还是非常理想的基因载体, 通过细胞培养技术及基因组的研究, 进一步认识神经干细胞的本质和控制分化基因, 通过调控靶基因, 可以从神经干细胞诱导产生特定的分化细胞来满足各种需要, 可能达到细胞替代和基因治疗的双重作用。

摘要：目的 探索新生SD大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及体外长期培养的方法。方法 分离新生SD大鼠海马组织, 用无血清培养技术培养神经干细胞, 免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白 (Nestin) 的表达;并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU) 掺入试验, 免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况。诱导神经干细胞分化, 分别用神经元特异性核抗原 (NeuN) 抗体、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 抗体、2, 3-环核苷酸磷酸二脂酶 (CNPase) 抗体进行免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞。结果 获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团, 并能分化为神经元和神经胶质细胞, 且经传代培养10代以上仍具干细胞特性。结论 成功培养出胚胎大鼠神经干细胞, 培养出的细胞具有增殖、自我更新及多潜能分化能力, 可分化为神经元及神经胶质细胞并可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞。

关键词：神经干细胞,细胞培养,免疫组织化学

参考文献

[1]DOETSCH F, SCHARF C.Challenges for brain repair:Insightsfrom adult neurogenesis in birds and mammals[J].Brain BehavEvol, 2001, 58 (5) :306-322.

[2]BJORKLUND A, LINDVALL O.Cell replacement therapies forcentral nervous system disorder[J].Nat Neurosci, 2000, 3 (6) :537-544.

[3]GAGE FH.Mammalian neural stem cells[J].Science, 2000, 287 (5457) :1433-1438.

[4]RENFRANZ PJ, CUNNINGHAM MG, MCKAY RD.Region 2specific differentiation of the hippocampal stem cell line HiB5upon implantation into the developing mammalian brain[J].Cell, 1991, 66:713-729.

[5]DOETSCH F, CAILLE I, LIM DA, et al.Subventricular zoneastrocytes are neural stem cells in the adult mammalian[J].Cell, 1999, 97:703-716.

[6]KONDO T, RAFFM.Oligodendrocyte precursor cells rep ro-grammed to become multipotential CNS stem cells[J].Science, 2000, 289:1754-1757.

[7]KUHN HG, WINKLER J, KEMPERMANN G, et al.Epidemalgrowth factor and fibroblast growth factor-2 have different effectson neural progenitors in adult rat brain[J].J Neurosci, 1997, 17 (15) :5820-5829.

[8]LENDAHL U, ZIMMERMAN LB, MCKAY RDG.CNS stem cellsexpress a new class of intermediate filament protein[J].Cell, 1990, 60:585-595.

干细胞分离 第9篇

1材料与方法

1.1实验动物

100 g左右雄性SD大鼠,东南大学医学院动物实验中心提供。

1.2主要试剂和仪器

胎牛血清( GIBCO公司) ,流式抗体( Santa Cruz公司) ,脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞诱导液( CYAGEN公司) ,CO2培养箱( Thermo Fisher公司) ,25 cm2培养瓶、6孔和96孔培养板、青链霉素、0. 25% 胰酶、α-MEM( HYCLONE公司) ,CCK-8试剂盒 ( 碧云天生物技术研究所) ,水平离心机( 上海德洋意邦仪器有限公司) ,超净工作台 ( 广州瑞智科学仪器有限公 司) , ELX800酶标仪 ( BIOTIK公司 ) ,倒置相差 显微镜 ( Olympus公司) 。

1.3实验方法

1.3.1大鼠BMSCs的分离和培养

大鼠直接脱 颈处死,体积分数75% 乙醇浸泡15 min后剥离双下肢,无菌条件下分离出双下肢股骨。 PBS漂洗,剪断股骨骨垢端,用含体积分数10% 胎牛血清的 α-MEM培养液冲洗骨髓腔,收集单细胞悬液, 1 500 r·min- 1、25 ℃离心7 min,弃上清液,用上述 α-MEM培养液重悬,取约5 × 105个细胞接种在25 cm2培养瓶中,置于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养,首次48 h全量换液,以后每2 ~ 3 d换液,10 ~ 12 d后细胞融合70% ~ 80% ,0. 25% 胰酶消化后以1∶ 3传代培养。

1.3.2大鼠BMSCs形态学观察

倒置光学显微镜下动态观察原代和传代BMSCs形态结构变化,并拍照。

1.3.3大鼠BMSCs生长曲线测定

取生长状态良好的第3代BMSCs,0. 25% 胰酶消化,制成单细胞悬液,计数,取约5 × 103个·孔- 1接种在96孔板,每板6孔,共计8块板,96孔板移入37 ℃、 体积分数5% CO2的培养箱中,每日定时取1板按CCK-8试剂盒说明操作,37 ℃ 孵育30 min,ELX800酶标仪570 nm波长检测各孔光吸收值,记录各孔结果, 每孔平行测定3次,结果取平均数,以横轴为时间、纵轴为光吸收值绘制生长曲线。

1.3.4大鼠BMSCs流式细胞术鉴定表面抗原

取生长状态良好的第3代BMSCs,0. 25% 胰酶消化,1 500 r·min- 1、25 ℃ 离心7 min,弃上清,PBS制成单细胞悬液,计数细胞,以1 × 108个BMSCs分装流式管,各管依据说明书依次加入相应剂量CD45、 CD34 、CD29 、CD90单克隆抗体,同时设立同型阴性对照,振荡器充分混匀,4 ℃ 孵育1 h,流式细胞仪检测分析。

1. 3. 5大鼠BMSCs成骨细胞及成脂肪细胞分化鉴定

1. 3. 5. 1诱导分化成骨细胞取生长状态良好的第3代BMSCs,0. 25% 胰酶消化,制成单细胞悬液,计数, 约1 × 105个·cm- 2细胞接种在明胶预处理过的6孔板中,待细胞80% ~ 90% 融合后弃去完全培养液,依据说明书每孔加入2 ml的骨细胞诱导液( 含100 ml· L- 1胎牛血清、10 ml·L- 1青链霉素、10 ml·L- 1谷氨酸、10 ml·L- 1β-甘油磷酸钠、2 ml · L- 1抗坏血酸、 100 μl·L- 1地塞米松) ,每3 d更换诱导液,21 d后福尔马林固定,茜素红染色,PBS冲洗,光学显微镜下观察、拍照。

1. 3. 5. 2诱导分化成脂肪细胞取生长状态良好的第3代BMSCs,0. 25% 胰酶消化,制成单细胞悬液,计数,约1 × 105个·cm- 2细胞接种在6孔板中,待细胞80% ~ 90% 融合后弃去完全培养液,依据说明书每孔加入2 ml的脂肪细胞诱导液( 含100 ml·L- 1胎牛血清、10 ml·L- 1青链霉素、10 ml·L- 1谷氨酸、2 ml· L- 1胰岛素、1 ml·L- 13-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 ml· L- 1罗格列酮、1 ml·L- 1地塞米松) ,72 h后更换为脂肪细胞维持液( 含100 ml·L- 1胎牛血清、10 ml·L- 1青链霉素、10 ml·L- 1谷氨酸、2 ml·L- 1胰岛素) ,24 h后再更换成脂肪诱导液,如此4个循环后,加入脂肪细胞维持液培养7 d,福尔马林固定,油红O染色,PBS冲洗,光学显微镜下观察,拍照。

1.4主要观察指标

( 1) BMSCs形态学变化; ( 2) 细胞表面抗原标志物的表达; ( 3) 骨细胞、脂肪细胞的诱导分化情况。

2结果

2.1大鼠BMSCs的形态学改变

全骨髓单核细胞悬液接种于培养瓶,48 h后换液去除未贴壁细胞,贴壁细胞呈纺锤形或者多角形,散在分布( 图1A) ; 4 d后细胞核变大,有时可见2个核仁, 细胞以纺锤形细胞为主,开始出现集落( 图1B) ; 6 ~ 10 d大多数细胞可见2个核仁,集落较为密集,并开始融合,细胞开始成漩涡状生长( 图1C、D、E) ; 2 ~ 3次传代后,形成旋涡状、排列较为密集、形态相对均一的纺锤形细胞群( 图1F) 。

A ~ E. 依次为原代细胞 2、4、6、8、10 d × 100; F. 传代细胞 × 40

2.2大鼠BMSCs生长曲线

如图2,大鼠BMSCs接种后第1、2天生长曲线比较平缓,表明细胞处在潜伏期; 接种后第3 ~ 6天生长较快,曲线成线性,表明细胞处在对数生长期; 接种后第7、 8天细胞曲线变得平缓,表明细胞生长进入平台期。

2.3大鼠BMSCs表面抗原的流式细胞术鉴定

如图3,BMSCs表面抗原CD29阳性率为99. 74% ,CD90阳性率为98. 01% ,CD34阳性率为0. 16% ,CD45阳性率为14. 09% 。

2.4大鼠BMSCs的成骨细胞及成脂肪细胞分化鉴定

大鼠BMSCs经骨细胞诱导液培养21 d后,细胞形态由梭形变为多角形,茜素红染色呈红色( 图4A) 。 大鼠BMSCs加入成脂细胞诱导剂经4个循环后,胞质内可见折光性强的圆形小脂滴,部分可见融合成的大脂肪滴,经油红O染色呈暗红色( 图4B) 。

3讨论

BMSCs是骨髓内非造血干细胞,参与构成造血微环境,起造血支持作用,Friedenstein等[5]于1987年首次发现。随后的研究表明,BMSCs可以向3个胚层的细胞分化。Mattsson等[6]将GFP标记的BMSCs通过静脉输入到博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠体内,大鼠的肺纤维化程度减轻,通过激光共聚焦显示荧光细胞表面表达sp-c抗原; Nartprayut等[7]观察到BMSCs可以分化为心肌细胞; 王卫民等[8]的研究也产生相似的结果。这些研究结果为疾病的细胞治疗开启了新的篇章。然而骨髓中的BMSCs含量少,临床治疗中需要大量的BMSCs,必须通过体外扩增。现有的文献报道了4种体外用骨髓细胞分离培养BMSCs的方法: 利用细胞贴壁特性的全骨髓贴壁分离法、利用细胞密度差异的密度梯度离心法[9]、利用细胞表面表达不同抗原的流式细胞术分选法和免疫磁珠法[10]。密度梯度离心法由于对全骨髓细胞进行相对高速、长时间的离心而容易降低细胞活力,且操作技术难度大,所以难以推广,而流式细胞术分选法和免疫磁珠法虽然能够在短时间内培养出高纯度的BMSCs,但对实验条件要求高,花费高昂,且对细胞活力有一定的影响,一般实验室较少采用。

A. 成骨细胞的茜素红染色 × 200; B. 成脂肪细胞的油红 O 染色 × 200

全骨髓贴壁分离法[11,12]是根据BMSCs贴壁生长特性,去除了不能贴壁的造血细胞及造血干细胞,并且干细胞生长速度快,对胰酶消化的敏感性高,通过胰酶的消化可以去除成纤维细胞等不易被胰酶消化的非干细胞类杂细胞。此方法全程没有对细胞活性有损伤的操作,可以很好地保护细胞活力,而且最初的几代细胞培养过程中BMSCs生长较为缓慢,细胞群内含有其他的杂细胞,这些非BMSCs可以分泌一些细胞因子如PGF等[13],促进BMSCs的生长。国内吉佳佳等[14]利用全骨髓贴壁分离法培养出了高纯度并具有分化潜能的BMSCs。本实验通过3代的贴壁分离培养,显微镜下动态观察利用全骨髓分离法培养的BMSCs形态相对均一,更新速度较快,呈漩涡状、纺锤形。为进一步对培养的细胞进行鉴定,本实验采用流式细胞术分析检测了细胞表面CD45、CD34、CD29、CD90抗原表达情况[15],结果显示间质细胞的抗原特性CD29阳性率为99. 74% 、CD90阳性率为98. 01% ,而造血细胞表面抗原CD34、CD45为阴性,Harting等[16]无菌条件下分离出大鼠全骨髓,采用全骨髓贴壁法培养,流式细胞术检测BMSCs表面抗原的表达,结果显示为CD11b-、 CD45-、CD29+、CD73+、CD90+、CD105+及Stro-1+。 我们的实验结果与其相一致,表明我们利用全骨髓贴壁分离法获得了高纯度的BMSCs。

BMSCs输入患者体内治疗疾病最重要的一个机制是其具有的分化为目的细胞的潜能[17],那么通过全骨髓分离法培养获得的BMSCs是否能够保持良好的分化特性呢? Liu等[18]采用共培养模型,诱导全骨髓贴壁分离的BMSCs 10 d后,蛋白质印迹法证实细胞表达了细胞活性蛋白C; Du等[19]用脂肪细胞诱导剂对全骨髓贴壁分离法培养的BMSCs进行诱导,油红O染色鉴定诱导后的细胞内生成脂滴。本实验利用不同的诱导剂成功诱导BMSCs分化为骨细胞、脂肪细胞,说明我们利用全骨髓贴壁分离法培养获得的BMSCs具有良好的分化潜能。

总之,利用全骨髓分离培养法可以获得数量充足且形态相对均一、更新速度较快,呈漩涡状纺锤形并具有分化潜能的BMSCs,流式细胞术显示细胞的纯度较高。

摘要：目的:建立简单、经济、高效、快捷的扩增骨髓间充质干细胞的方法。方法:利用全骨髓贴壁分离法分离、纯化大鼠的间充质干细胞,观察细胞的形态,绘制生长曲线,并采用流式细胞术检测细胞表面CD29、CD90、CD45、CD34的表达情况。采用茜素红染色法检测间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的情况;采用油红O染色法检测间充质干细胞诱导分化为成脂肪细胞的情况。结果:间充质干细胞培养到第3代时形成漩涡状、纺锤形的形态相对均一的贴壁细胞。流式细胞术检测结果显示其表面抗原CD29、CD90阳性,CD45、CD34阴性。间充质干细胞经不同诱导剂诱导后,茜素红染色呈红色,油红O染色呈暗红色。结论:全骨髓贴壁分离法可以有效获得数量充足、生长状态良好并具有分化潜能的间充质干细胞。

干细胞分离 第10篇

体外成功分离培养BMSCs是实验研究和临床应用的重要前提。该实验应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs, 并观察其生物学特性及成骨和成脂的分化潜能, 为BMSCs的体内外研究应用奠定基础, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

4~6周龄SPF级SD大鼠, 雌雄不限, 体重100~150 g, 购自中山大学中山医学院实验动物中心。

1.2 实验试剂

L-DMEM培养基、H-DMEM培养基均购自美国GIBCO BRL公司;胎牛血清 (FCS) 、胰蛋白酶均购自Hyclone公司;Vitamin C、地塞米松、牛胰岛素均购自Sigma公司;β-甘油磷酸钠购自Calbiochem公司。兔抗大鼠单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5购自BD phamingen公司。

1.3 大鼠BMSCs的体外分离、培养与纯化

取SPF级3~4周龄SD大鼠, 断颈处死, 75%酒精浸泡5 min。无菌条件下分离大鼠双侧股骨, 并彻底清除附着其上的肌肉组织, 去除两端骨骺, 用含10%胎牛血清的L-DMEM间质干细胞培养液反复冲洗骨髓腔, 收集细胞, 1 100 r/min离心5 min, 弃去上清及脂肪层。以2×105 cells/cm2的密度接种于培养瓶中, 置于培养箱中培养。培养48 h后首次换液, 以后每3 d换液1次, 每天观察细胞的形态及生长情况。

1.4 流式细胞仪检测细胞表面标记

收集第3代细胞, 调整细胞密度为1.0×106个/m L, 装入1.5 m L的EP管中, 每管1 m L, 1100 r/min离心4 min, 弃上清。每管加入100μL PBS, 混匀, 分别加入CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5兔抗大鼠单克隆抗体1μL (0.5~1μg/106细胞) , 混匀。37℃避光孵育20 min后, 每管加入1 m L PBS, 1100 r/min离心4 min, 弃上清, 再重复洗2遍, 以除去未结合抗体。0.5 m L PBS重悬细胞, 流式细胞仪进行检测分析。同时每管样品设立同型阴性对照。

1.5 体外诱导大鼠BMSCs成骨和成脂分化

1.5.1 成脂分化及油红O染色鉴定

取第3代的大鼠BMSCs接种于六孔板, 加入含1 umol/L的地塞米松, 0.5 mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤, 10 mg/L的牛胰岛素, 100 mmol/L的消炎痛 (indomethncin) , 10%FCS的H-DMEM诱导3 d, 再用含10 mg/L的牛胰岛素, 10%FCS的H-DMEM处理1 d, 镜下观察细胞形态的变化和生长情况。成脂诱导后的细胞用PBS洗涤3次, 10%多聚甲醛固定10 min, 油红O染色5~10 min, 60%异丙醇稍洗去多余染液, 蒸馏水洗, Mayer氏苏木素浅染核, 1%盐酸水稍分化, 水漂洗10 min。于倒置相差显微镜下观察。

1.5.2 成骨分化及茜素红S染色

取第3代的大鼠BMSCs接种于六孔板, 加入成骨细胞诱导液 (含10~7 mol/L地塞米松, 10mmol/Lβ-甘油磷酸钠, 50 g/m LVitamin C) 2 m L, 置培养箱中培养。诱导分化18 d后, 吸去成骨细胞诱导液, 用PBS洗涤3次, 然后加入适量的茜素红-S染液染10~15 min, 显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 BMSCs的形态学观察

原代培养时, 骨髓细胞接种于培养瓶后, 细胞呈圆型, 悬浮于培养液中。培养24 h后即有细胞贴壁, 换液后可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长, 第4~5 d可形成分散的细胞集落, 细胞形态不一, 梭形细胞为主, 见图1A。第8~9 d细胞呈集落生长, 细胞间相互紧密贴附生长, 沿胞体长轴有序排列, 呈螺旋状或漩涡状, 可达80%~90%融合, 见图1B。消化传代后, 传代细胞12 h完全贴壁生长, 3~4 d可传代1次。传代至第3代的细胞形态均一, 呈梭形生长, 见图1C。

A:原代培养第5 d的细胞B:原代培养第9 d的细胞C:传代培养至第3代的细胞

2.2 BMSCs表面标记物的表达

流式细胞仪检测结果显示, 培养的第3代大鼠BMSCs CD29、CD44表达阳性, 而CD45呈阴性, 见图2。

A:CD29流式检测结果B:CD44流式检测结果C:CD45流式检测结果

2.3 BMSCs成脂成骨诱导分化及鉴定

BMSCs加入脂肪诱导液诱导2周后, 细胞中有大小不等的脂肪滴出现, 细胞逐渐由原来的梭形变为圆形或多角形, 经油红O染色, 苏木素复染核, 镜下观察可见脂滴为橙红色, 胞核为蓝色, 见图3A。BMSCs经成骨诱导液诱导2周后, 细胞转变为多角形细胞, 呈多层重叠生长, 可观察到较大的细胞结节, 有明显的钙沉积, 茜素红S染色后镜下可见散在大量橘红色的钙结节, 为茜素红与钙盐形成的橘红色的复合物, 见图3B。

A:成脂油红O染色 (×200) B:成骨茜素红S染色 (×100)

3 讨论

骨髓间质干细胞是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞, 是骨髓造血微环境的重要组成部分。BMSCs在全骨髓中比例很低, 只占骨髓有核细胞总数的0.001%~0.01%[9]。目前已经建立了多种体外分离培养BMSCs的方法, 主要有全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法, 不同的方法具有不同的优缺点[1,10]。全骨髓贴壁培养法基于BMSCs的粘附特性, 是获得这种细胞的最简单方法。本实验采用的是全骨髓贴壁培养法, 用L-DMEM+10%FBS作为基本培养基, 通过反复、多次换液去除未贴壁的造血干细胞, 获得贴壁生长的BM-SCs, 通过传代进行纯化和扩增培养。研究显示, 体外培养的BMSCs, 在形态上呈纺锤形成纤维细胞状, 能贴壁生长, 呈螺旋状或漩涡状[11]。该研究也证实了上述观察结果。

BMSCs的多向分化潜能受到多种因素的影响, 研究表明, Micro RNA-9-1可增加BMSCs向神经细胞的分化比率[12], 熟地含药血清能够促进BMSCs向神经细胞的分化[13]。王贞等[14]研究发现, 人血小板裂解液可以促进BMSCs成骨分化, 抑制其成脂分化, 朱小虎等[15]证实硝酸甘油也可促进BMSCs向成骨分化。BM-SCs的疾病治疗方面也得到广泛的研究, 并取得较好的实验结果, BMSCs经BMP-2预诱导后移植治疗大鼠再灌注后心肌梗死, 对心肌梗死再灌注损伤有一定治疗作用[16]。BMSCs联合脑源性神经营养因子用于大鼠脑出血的实验研究发现[17], 移植后可促进大鼠脑出血损伤部位结构和功能的修复。

干细胞分离 第11篇

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

DMEM培养液、胎牛血清、胶原酶、胰蛋白酶(Gibco,美国),山羊抗人多克隆抗体Oct4(C20)购自Santa Cruz公司。透射电镜(JEOI,日本);超净工作台(苏州净安泰空气技术有限公司);二氧化碳孵箱(Heraeus,德国);倒置相差显微镜照相系统(Olympus,日本);流式细胞仪(FACSCalibur,美国);高速离心机(KUBOI,AKR/7OZJ,日本)。标本来源:8例羊水标本来自妊娠l8～22周自愿引产的孕妇,在B超引导下行羊膜腔穿刺抽取20～40 m L羊水。取标本前均征得孕妇本人同意,研究获得广东医学院附属医院道德伦理委员会批准。

1.2 AFMSCs的分离与培养

羊水标本在室温下1 100 r/min离心5 min,弃上清,加入20 m L L-DMEM培养液(含10%胎牛血清)、100μL羊水细胞培养添加剂,制成单细胞悬液,接种到培养皿中置饱和湿度、5%二氧化碳、37℃培养箱培养。接种第4天换液。倒置相差显微镜每日观察细胞形态,每日更换培养液,待细胞约达90%融合时进行1∶3传代培养。

1.3 AFMSCs的生长曲线测定

取90%融合的第3代AFMSCs,制备单细胞悬液,调整细胞浓度为2104个/m L,接种于24孔培养板,每孔0.5 m L,置培养箱培养,每2天更换培养液。从第2天起每隔24 h随机取3孔细胞计数,取其平均值作为当天的细胞数,绘制8 d的细胞生长曲线。计算细胞倍增时间[TD=tlg2/lg(N1/N0)](N1为t时间的细胞数,N0为初种细胞数)(见图1)。

1.4 透射电镜观察细胞的超微结构

收集第3代细胞,消化后收集在离心管内,经1 500 r/min离心10 min成团,将细胞团移至于EP管内,加入2.5%的戊二醛固定,用冷蔗糖缓冲液洗细胞团快1 h,锇酸固定1.5 h,50%、70%和90%的丙酮脱水各15 min,100%的丙酮脱水45 min,浸入1∶1丙酮包埋液中1 h,浸入37℃环氧树脂中24 h,60℃固化1 h,AO机做超薄切片,制备电镜标本。

1.5 AFMSCs表面抗原检测

取90%融合的不同时期AFMSCs,PBS洗涤后制备细胞爬片,分别加入小鼠抗人抗体:Oct4、CD34、CD44、CD45和HLA-DR,设立阴性对照,用免疫组织化学方法检测。

1.6 AFMSCS细胞周期测定

取不同时期生长良好的AFMSCs,制备单细胞悬液,用流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 AFMSCs集落形成能力测定

取第1代、第3代和第5代AFMSCs接种于6孔培养板,调整细胞浓度为10个/mm2,置培养箱培养,常规换液,76 h后弃培养液,PBS洗涤后用5 g/L结晶紫染色,计数孔内的集落数,计数标准为50个细胞以上者计为1个集落,每次培养6孔,取平均值。集落形成率=平均集落数/种入的细胞数100%。

2 结果

2.1 AFMSCs的分离和培养

接种第2天,即可见有散在的贴壁细胞,大多呈梭形或针尖状,部分呈多角型和圆形,5 d后,形成以散在的梭形细胞为主,类成纤维细胞的集落和多角型铺路石样的上皮细胞样集落,集落间不接触,界限清楚,利用成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,多次差别消化法进行纯化后,上皮样细胞明显减少,传代的间充质细胞仍然克隆化生长,随着细胞增殖,集落融合,之后成漩涡状生长。传至10代细胞仍保持短梭型,形态不变(见图2、3)。

2.2 AFMSCs生长曲线

AFMSCs生长曲线呈S形,接种后1～2 d为潜伏适应期,从第3天起进入对数生长期,第7天达到高峰,以后进入平台期群体伴倍增时间为28 h(图1)。

2.3 细胞超微结构观察

透射电镜见AFMSCs核浆比例大,胞浆中见丰富的粗面内质网、溶酶体和发达的高尔基体,细胞中有丰富的中间丝,具有干细胞的超微结构特征(图4)。

2.4 AFMSCs的表面抗原特性

5份样本重复测定,结果显示AFMSCs表达Oct4、CD44,而CD34、CD45和HL A-DR阴性,不同样本间差异无统计学意义,不同代细胞间表现相同(图5)。

2.5 AFMSCs细胞周期

流式细胞仪检测结果显示第3代细胞G1、S和G2期的细胞所占百分比分别为71.36%、5.49%和23.15%。

2.6 AFMSCs集落形成能力

低密度种植6 d后,可形成散在的细胞集落,6个标本第1代集落形成率平均为25%,第3代均为23%,5代平均为22%,随传代次数增加集落形成率有逐渐降低的趋势。

3 讨论

羊水中的细胞来源于胎儿和羊膜脱落细胞,这些细胞形成于胚胎发育早期,部分保存着胚胎原始细胞的特性。最近,在羊水细胞中检测到端粒酶和Oct4阳性细胞亚群,因此,认为羊水中可能含有干细胞[4]。羊水中的细胞主要有3类:上皮细胞、成纤维细胞、羊水细胞等。目前AFMSCs缺乏特异性表面标记,如何获得纯净的AFMSCs仍是困扰研究者的重要问题。GRONTHOS等[5]曾根据间充质干细胞表面表达的STRO-1和CD106对其进行分离,获得了较高纯度的细胞,但数量非常少,其增殖、分化能力有限,而且采用免疫磁珠分离和流式细胞仪分选价格昂贵。本研究在直接贴壁分离法的基础上,根据细胞形态,利用成纤维细胞与上皮细胞对胰酶的耐受性不同将间充质细胞纯化,对其进行单独培养。该方法操作简单,易于掌握,不需特殊试剂和器材,共8例标本培养成功6例,获得的细胞具有自我纯化特性,传至第3代接近融合时细胞形态呈纤维细胞群,与其他来源间充质干细胞相似。细胞接种后3 d,可见少量的贴壁细胞,形态以梭形或类上皮细胞样为主。传代培养的细胞形态逐渐均一,以梭形细胞为主。细胞生长迅速,平均倍增时间约为28 h,增殖速度明显快于骨髓间充质干细胞潜能干细胞。细胞周期检测结果表明,细胞的增殖能力强,大部分细胞处于G1期,符合干细胞的特点。超微结构观察发现,AFMSCs核浆比例大,胞浆中见丰富的粗面内质网、溶酶体、发达的高尔基体等细胞器,细胞中有丰富的中间丝,具有干细胞的超微结构特征。细胞化学染色结果显示:细胞表达CD44、Oct4,不表达CD34、CD45和HLA-DR,与文献报道间充质干细胞的染色和表面标记的特点一致[6,7,8,9,10]。这些结果表明用上述方法从妊娠中期羊水中得到的细胞具有独特的细胞化学特征和表型,可以确定为AFMSCs。PRUSA等[11]用RT-PCR和Western-Blot方法,对妊娠14周的人羊水细胞进行检测时发现有些细胞表达Oct4,免疫荧光显示0.1%～0.5%的细胞为Oct4阳性细胞。AFMSCs细胞的Oct4阳性的细胞已经达到了90%。Oct4是转录因子POU家族中的一员,可以与DNA中的启动子或增强子结合,通过启动或关闭FGF4、Sox-2、Hcg、Rex-1等基因的表达,控制干细胞是否维持未分化状态,是决定干细胞多能性和自我更新能力的关键物质[12],Oct4的存在是明确细胞为全能干细胞的重要标志之一。而羊水细胞中存在Oct4阳性细胞的事实则提示羊水中含有更原始、增殖和分化能力更强、更接近于胚胎干细胞的细胞存在。相对于成体干细胞取材不易、增殖能力较弱和分化方向局限的缺点,羊水来源Oct4阳性的干细胞具有更广阔的研究前景。对其的分离、进一步的纯化和建系将为多能干细胞开辟新的来源,并且不用破坏具有形成完整个体能力的早期胚胎,从而能够避开胚胎干细胞研究所面临的伦理学问题。

ZIMMERMANN等[13]发现间充质干细胞并不像人们想象的那样可以无限传代,细胞在传代的过程中活力会逐渐丧失,失去研究的应用价值。为此,本研究对AFMSCs进行了生长动力学观察。发现细胞生长曲线呈S形,第3代群体倍增时间为28 h,表明其符合正常细胞的生长特性。实验中发现,第3、5代细胞再生活跃,速度接近。采用流式细胞仪对第3代细胞周期进行测定的结果显示,细胞DNA合成的S期在细胞中所占有的比例较高。集落形成能力测定也显示同样的结果。

本研究发现AFMSCs表达CD44,这是间充质干细胞和神经干细胞的表面标志[14,15],而在胚胎干细胞中不表达。因此AFMSCs可能是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的一种过渡阶段的干细胞。

摘要：目的 分离培养羊水来源间充质干细胞(amniotic fluid mesenehymal stem cells,AFMSCs),观察其生物学特性。方法 通过羊膜腔穿刺取妊娠18～22周的羊水,差速贴壁法分离间充质干细胞,体外传代培养,通过倒置相差显微镜观察细胞的黏附、生长情况。取对数生长期的细胞在酶标仪450nm波长处检测吸光度值,绘制羊水干细胞生长曲线,透射电镜观察细胞超微结构,免疫细胞化学方法检测干细胞表面标志的表达。结果 羊水间充质干细胞在体外培养体系中增殖迅速。免疫细胞化学显示Oct4阳性,与间质细胞类似。结论 羊水间充质干细胞增殖能力强,表现间充质干细胞的特性。