动态蛋白质组学

动态蛋白质组学（精选7篇）

动态蛋白质组学 第1篇

1 蛋白质组学发展的趋势与技术需求

从1995年蛋白质组学的概念提出以来,蛋白质组学研究得到迅速的发展,其中蛋白质组学支撑技术的发展无疑起到重大的推动作用。首先生物质谱技术的发展,使得对数量巨大的蛋白质的鉴定日益迅速和精确,成为整个蛋白质组学技术的基础。同时,为有效鉴定所需的蛋白质分离技术也获得快速发展。尤其是双向电泳中IPG固相胶条的商品化,使得双向电泳的重复性问题在很大程度上得到解决。在20世纪末和21世纪初的几年里,有关蛋白质组学研究的论文和成果迅猛增长。在这段时间里,多种细胞系、亚细胞结构或组织、器官的蛋白质数据迅速积累,大型数据库相继建立,为开展后续的蛋白质组学提供有价值的数据基础。

然而,紧接着面临一个新的问题:这些大批量的静态的蛋白质数据所蕴含的生物学意义是什么?这比当初基因组测序完成时所面临的类似的问题更加突出,因为在生物体及其每一个细胞内,各种蛋白质的表达、修饰、定位和代谢都在随时发生严格受控的改变。而且很少有蛋白质是单独发挥其作用,大多数情况是与其它蛋白质相互作用,调节其它蛋白或者被其它蛋白所调节。而同一种蛋白质在不同的时间空间上也可能具有相当不同甚至完全不同的生物学功能。因此,以研究不同种类或不同状态下的细胞、组织或器官差异表达的蛋白质组为主要内容的“差异蛋白质组学”,或者研究特定生命活动过程中不同时间点上蛋白表达差异的“动态蛋白质组学”,成为蛋白质组学研究的前沿[4]。在2007年10月人类蛋白质组学组织的第三次代表大会上,以大会主题的形式提出,把更多的关注从大规模的技术性研究转向生物标志物(Biomarker)的研究和应用,就是这种发展趋势的一个鲜明例证。当然,这还只是开始的一步。实际上,通过比较不同条件和不同时间下蛋白质表达模式的变化,能够进一步深化对细胞内生理或病理过程极其分子机制的理解,例如发现其中涉及的不同的调节网络或信号通路[5],并可能从而有效增强Biomarker的可靠性,对于获得或提示潜在的治疗性靶点更是一个有力的推动。

很显然,对于差异或动态蛋白质组学来说,检测蛋白质组表达变化的敏感度和时间分辨率是两个至关重要的瓶颈,基于35S体内脉冲标记的SiLAD蛋白质组动态分析技术提供在这两个方面都有所提高的新方法[[6]]。

2 SiLAD技术的原理及优势

2.1 SiLAD技术的原理

SiLAD技术首先利用35S标记的Met/Cys混合物(NEG-722 EASYTAGTM EXPRESS PROTEIN LABELING MIX)对细胞或实验动物进行短时间的脉冲标记,在此短时间内合成的蛋白因为含35S氨基酸的插入而被特异性标记。然后制备总蛋白样品通过双向电泳进行分离,所得到的双向电泳胶经考马斯亮蓝(CBB)染色扫描后制备干胶,干胶利用高灵敏度磷屏进行曝光,最后对干胶进行激光扫描得到曝光图像。因此,SiLAD技术可以同时提供考染和35S曝光的2种图像。相对于传统的蛋白质组学方法,对这2种图像进行综合和比较分析提供多种新信息。

2.2 SiLAD技术的优势

2.2.1 SiLAD技术可以排除已经存在的蛋白的干扰,大大提高表达差异筛选的敏感性。

大多数传统的差异蛋白质组学技术利用考马斯亮蓝或其他方法染色,检测的是该特定时刻细胞或组织内各种蛋白的累积总量的差异,这个累积量是细胞一系列代谢活动包括:蛋白合成,降解,蛋白修饰及蛋白胞内、胞外运输后的结果。而不是真正的蛋白在细胞中的表达水平的差异。在多数情况下,蛋白的累积量会大大高于考察的时间点上(如15min内)新合成的蛋白量。因而各个蛋白表达水平的变化常常被已经存在的大量蛋白所掩盖。运用SiLAD技术,在磷屏图像中,得以只对新合成的蛋白进行相互比较。由于已经存在的大量蛋白的干扰被排除,新合成部分即表达水平的差异被强烈突出(见图1)。此外,得益于35S放射性在磷屏曝光的灵敏度比普通的考马斯亮蓝等染色高很多倍,也进一步提高蛋白点及其差异显示的敏感性。

2.2.2 以“蛋白合成速度曲线”取代“蛋白量曲线”,更直接地反映相关细胞活性,并显著提高时间分辨率。

由于SiLAD技术进行的是短时间(15min)的脉冲标记,标记的是这极短时间内的蛋白合成量,也即细胞在这段时间内蛋白合成的平均速度。通过对细胞某一个动态过程中多个时间点的顺次脉冲标记,即可获得细胞在几个时间点该蛋白表达速度的动态变化曲线。同传统的差异蛋白质组技术获得的“蛋白质累积量变化曲线”相比,这显然可以更直接更有效地反映细胞生命活动状态及该蛋白在其中作用和调控的变化动态。这2种曲线的走势常常有明显或重大的差别。实验表明,很多“差异表达蛋白”只能从SiLAD技术获得,而更多的差异蛋白在经过SiLAD技术分析后,会被重新分类(见图2)。同时,SiLAD进行的只是瞬时脉冲标记,可检测到15min内合成的数量,相对于普通蛋白质组学方法(只能反映时间点之间的蛋白改变量),大大提高检测的时间分辨率。

如该蛋白累积量为100单位,在时间点1合成量为1,在时间点2合成量为5。在传统差异显示技术中(左),其差异为101:105。从而被认定为“稳定表达蛋白”。在SiLAD技术中(右),其差异为1:5,从而被认定为“明显差异表达蛋白”。

2.2.3 具有高通量能力,

可以同时检测大量差异表达的蛋白双向电泳技术由于能够同时对上千个蛋白进行分离及其后的鉴定而被广泛使用,这一技术的发展和改进也极大地促进蛋白质组学研究的发展。现在虽然有一些新的定量比较技术如ICAT等出现,但由于其必须在质谱鉴定时对各个蛋白逐一进行差异鉴定,从而在多样品广泛筛选差异表达蛋白的应用方面受到一定的限制。SiLAD技术充分发挥双向电泳技术的高通量优势。而且由于磷屏曝光的高灵敏度,所能够检测到的蛋白数量更多。对于实验中的同一组样品,普通的考马斯亮蓝染色在一张双向电泳胶(pH4～7)中能够检测到约1461±35点/胶,而同一批胶磷屏曝光图中可以检测到1929±40点/胶,提高约32.0%。SiLAD技术可以在进行质谱分析之前就从多数样品和大量蛋白中判断出差异表达蛋白,并且具有优越的“可视性”。考虑到质谱设备昂贵,使用成本和技术要求也较高,SiLAD在广泛筛选或建立时间曲线等应用中具有相当的优越性。

)同步化的A549细胞在血清刺激下从G0期进入G1期。蛋白点C在考染(CBB)中显示仅有轻微上升,而在磷屏(PH-I)显示在4h处(红色曲线有一过性表达升高。蛋白点G在磷屏显示有强烈下降,而考染完全检测不到该蛋白。

2.2.4 可以获得蛋白合成以外的代谢信息

利用SiLAD技术对同一生命活动过程进行研究,可以同时获得考染和曝光2种实验数据,提供细胞内蛋白累积总量和合成速度两个水平的信息。结合这两个水平的变化,还可以得到蛋白除合成之外,蛋白在其他代谢方式如降解、胞内外运输方面的信息。例如在实验中可以发现一些蛋白在两个时间点之间,蛋白的合成速度并没有明显的差异,而蛋白总量明显降低,这显示该蛋白在该时段内发生降解或输出,并显示这些改变的相对强度。同时,综合比较某一蛋白表达水平和双向电泳上对应的由于蛋白修饰而造成的不同蛋白点强度的变化,还有可能提供关于蛋白磷酸化动态等信息。

2.2.5 SiLAD与蛋白质质谱鉴定可良好兼容

蛋白质质谱鉴定对于多数蛋白质组学研究以及Biomarker的应用等来说,都是一个必要的环节。在SiLAD技术中,同位素硫的引入是否会影响后续的蛋白鉴定,是一个值得关注的问题。由于在整个蛋白中35S对含硫氨基酸残基的标记并不足以造成该蛋白点在双向电泳胶上可辨的位置改变,同时在脉冲标记时间段(15min)内新合成的蛋白通常只占该蛋白总量的很少一部分,所以对蛋白的后续质谱鉴定并不造成实际上的障碍。在实验中,对所找到的近200个差异蛋白的鉴定中,蛋白鉴定的成功率和普通考染样品的鉴定并没有明显的差别。

2.2.6 可以用于体内研究

SiLAD技术中所用的标记方法,不止在体外对细胞系进行标记,也可以通过腹腔注射、皮下包埋、尾静脉注射等方法对动物体进行体内的标记,以提供更真实的蛋白功能信息。已经将这一技术成功地应用于A549细胞系、SK卵巢癌细胞系和大鼠肝再生模型中,得到很好的实验结果。

3 结论

SiLAD技术是一种与传统双向电泳技术兼容,能够同时提供细胞或组织内蛋白累积总量和蛋白合成速度信息,具有高通量、高灵敏度、高时间分辨率的新的蛋白质组学方法。与传统蛋白质组学方法相比较,能够提供更多的细胞内蛋白代谢和调控变化的动态信息。运用SiLAD技术找到的差异蛋白和普通蛋白质组方法找到的差异蛋白有较大的差别,在于SiLAD技术检测的是蛋白表达的变化,而不是累计总量的改变,更能够直接和有效地反映细胞生理活性状态与蛋白质组动态变化之间的相互关系。SiLAD技术当然也有其局限性,如对不含有含硫氨基酸的蛋白质(在不同物种或细胞中可能占1%～4%)不能被检测到。

摘要：随着蛋白质组学的产生和发展,对蛋白质组表达水平的差异和变化进行体内的和动态的分析已势所必然地成为蛋白质组学研究的发展趋势。但是传统差异蛋白质组学方法只能提供细胞或组织内各种蛋白累积总量的信息,而不是真正意义上的蛋白质差异表达分析。 SiLAD(~(35)S in vivo Labeling Analysis for Dynamic Proteomics)技术正是基于这种需求而在本实验室创立的。SiLAD技术由于其在差异检出的灵敏度和时间分辨率方面的明显优势,以及除提供蛋白质组表达动态以外,可以提供蛋白质代谢等相关动态变化的更多信息,所以可适用于对多种生物过程进行的动态蛋白质组学研究。本文对SiLAD技术的原理及特点进行简要综述。

关键词：SiLAD技术,差异表达蛋白,动态蛋白质组学

参考文献

[1] Wasinger V C, Cordewell S J, Cerpa-Poljak A, et al. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium [J]. Electrophoresis, 1995,16 :1090 ～ 1094

[2] 李伯良.功能蛋白质组学,生命的化学,1998,18(6) :1

[3] 王志珍等.后基因组-蛋白质组研究,生物化学与生物物理学报,1998,30(6) :533

[4] 何大澄,肖雪媛.差异蛋白质组学及其应用,北京师范大 学学报(自然科学版),2002,38(4) :558

[5] Martin Ethier, Jean-Philippe Lambert, Julian Vasilescu, Daniel Figeys. Analysis of protein interaction networks using mass spectrometry compatible techniques. Analytica Chimica Acta 564(2006) 10～18

动态蛋白质组学 第2篇

关键词：代谢组学,蛋白质组学,缺血再灌注损伤,脊髓

脊髓缺血再灌注损伤是脊柱脊髓外科领域研究的热点,以往的研究主要集中在阐述机制、解释空间构造方面。我们建立蛋白组学和代谢组学联合研究平台,试图从新的角度阐释脊髓缺血再灌注损伤时间规律。

1 蛋白组学方法

1.1 仪器

Amersham公司IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT Twelve电泳系统、蛋白核酸分析仪、超声破碎仪。Beckman冷冻离心机,PROTEAN IEF cell型等电聚焦仪、PROTEAN-11(R)ⅪCell型垂直电泳槽、凝胶成像系统为Bio-Rad产品,Thermo冷凝水循环仪质谱仪,Applied Biosystems产品ABI-4800型反射式基质辅助激光解吸附飞行时间串联质谱,Typhoon9410扫描仪及图像分析软件De Cyder v.5.02(Amersham Bioscience)。

1.2 试剂

Cy2、Cy3、Cy5荧光染料购自Amersham公司;DMF购于SIGMA公司;裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS)、水化液(8 mol/L尿素、2%CHAPS)、平衡母液(6 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、2%SDS)、RCDC定量试剂盒、10×电泳缓冲液(250 mmol/L Tris、1.92 mol/L glycine、1%SDS)、Bradford定量试剂盒、30%丙烯酰胺(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=29∶1)、1.5 mol/L Tris-HCl(p H 8.8)、10%SDS均是Bio-Rad公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备和脊髓标本采集

清洁级健康成年新西兰大白兔由吉林大学实验动物中心提供,雌雄不限,体重2.5~3.0 kg。随机将实验动物分3组:假手术组(I0R0)、缺血30 min组(I30R0)、缺血再灌组(I30R6、12、24、48),每组6只。将其用10%的水合氯醛麻醉,开腹后用血管夹在左肾动脉分叉下阻断腹主动脉,使脊髓腰骶段缺血。假手术组和缺血30min组于术后麻醉下取脊髓L4~5节段,缺血再灌注组缺血30 min后去除血管夹闭创,模拟再灌注。再灌注6、12、24、48 h麻醉下活体取脊髓L4~5节段。液氮速冻-70℃冰箱保存。

1.3.2 样品制备

液氮研磨组织粉末,按1∶10(W/V)加入lysis buffer。加蛋白酶抑制剂(Cocktail)20μl/ml。先取一部分lysis溶解样品粉末,转入Dounce匀浆器中。用剩余buffer清洗容器,再转入Dounce匀浆器中匀浆。将样品放入冰水混合物烧杯里超声,21%振幅。累计超声60 s,超0.2 s,停1 s(pulse on 0.2,off 2),室温提取30 min。离心,40 000 g×1 h/s,4℃离心,取上清,测量出蛋白浓度后,分装保存在-80℃冰箱。

1.3.3 实验方法

标本提取、标记及电泳过程详见文献[1]。

1.3.4 图像扫描及分析

电泳结束后,扫描仪在488/520 nm,532/580 nm,633/670 nm波长分别对Cy2、Cy3、Cy5荧光染料标记的图像进行扫描。用De Cyder v.5.02图像分析软件观察各蛋白点在缺血和再灌注各时间点的变化,取正常组与缺血再灌注24 h组比较筛选差异点标记描述。

1.3.5 差异点的质谱鉴定

应用胶内酶切法切取差异点。质谱分析采用反射式扫描方式,扫描范围:700~4 000 Da;激光能量:一级质量分析器5000 v,二级质量分析器5 500 v。

1.3.6 数据库检索

数据库应用兔形目数据库和NCBI全库。兔形目数据库取蛋白质评分>52分,NCBI全库取蛋白质评分>67分,置信水平在95%以上。

1.4 结果

选取实验动物I30R24组相对于对照组I0R0组,2倍的差异结果作为入选对象,通过荧光标记比较结果,共选取了49个差异点,通过MALDI-TOF-TOF/MS分析酶解后肽碎片的一级和二级离子序列。最后基于MASCOT算法的检索平台,分别以NCBI的兔蛋白库和物种全蛋白库分别检索,最终获得了21个蛋白质。根据灌流过程中蛋白质表达量的变化,实验中所设定的取样组(0、6、12、24和48 h)绘制变化曲线,见图1。

1.5 Western-blot验证分析

选取了24 h下调蛋白质α-tubulin进行验证结果分析,电泳上样次序根据缺血后灌注的时间顺序,与蛋白质分析曲线序列完全一致。

2 代谢组学方法

2.1 材料与方法

2.1.1 主要仪器与装置试剂

气相色谱-飞行时间质谱仪(GC-TOF-MS):美国Waters公司产品;DB-5MS柱(30 mm×0.25 mm,0.25μm)安捷伦科技有限公司产品;离心机为德国Eppendorf公司产品;电子分析天平(BS124S)为德国Startorius公司产品,Masslynx 4.0数据处理系统,英国Micromass公司产品;Nist 02数据库。

2.1.2 主要试剂

核糖醇(内标):由中国药品生物制品检定所提供;甲醇、正己烷(色谱纯):Merck公司产品;其他标准试剂均为国产。分析纯实验用水为Milli-Q超纯水系统(美国Milipore公司)纯化的纯净水。

2.1.3 实验动物与处理

同蛋白质组学研究组实验新西兰兔,随机分为3组:第1组为正常假手术组(I0R0,K),第2组为脊髓缺血30 min(I30R0,M),第3组缺血30 min,再灌注24 h组(I30R24,H)。复制动物模型同前。分别于假手术后,缺血30 min及再灌注24 h采集门静脉血,用1%肝素钠抗凝,3 000×g离心10 min后,取血浆-20℃保存待测。

2.1.4 实验条件

2.1.4.1 色谱条件:色谱柱:DB-5MS(30.00 mm×0.25 mm,0.25μm);升温程序:柱初温50℃,以30℃/min升温至160℃,保持1 min,以4℃/min升温至240℃,保持1 min;以30℃/min升温至280℃,保持3 min;进样温度260℃;载气为超纯氦(99.9996%),柱流量(恒流):1 ml/min;进样量0.3 ml。

2.1.4.2 质谱条件:电子轰击(EI)离子源,电子能量70 e V,传输线温度250℃,离子源温度220℃,电离方式EI+,检测质荷比范围:50~800 m/z。

2.1.4.3 多维统计分析结果:试验中采用非监督的主成分分析(PCA)对K、M和H组的血清代谢物进行分析,建立二维PCA数学模型OPLS-DA模型的载荷图。

2.2 结果

采用气相色谱联合质谱分析(GC-MS)的方法分析测定血清中代谢物并用PCA、OPLS-DA等多维统计方法区分假手术组和不同时段(30 min,24 h)缺血再灌注损伤组。结果发现了51种差异代谢物物质组成的代谢标志物组(其中一个为内标物)。代谢产物的成分及对比差异详见表1、2。

代谢产物主要分为糖类、氨基酸、脂类等。K组和H组对照,代谢产物偏高主要集中在半乳糖、未知糖、甘油、硬脂酸、6-脱氧吡喃甘露糖、软脂酸、尿素、肌醇;M和H组对照,代谢产物偏高主要集中在:葡萄糖、半乳糖、软脂酸、尿素、甲氧基丙二酸、甘氨酸、硬脂酸、5-氧基脯氨酸。

3 讨论

建立和完善蛋白质组学和代谢组学技术平台,可从蛋白组、代谢组两个水平检测目的样品的非期望效应,非选择性、无偏倚的方式筛选出被研究对象在细胞或组织水平的病理生理或代谢水平的潜在变化[2]。

DIGE在差异蛋白质分析方面稳定、可靠。在数据库检索上,借鉴Vissers等[3]的经验,采用兔形目数据库和NCBI全库进行互补分析的策略。分时段采样的蛋白质差异表达的结果上获得若干组动态的变化曲线,变化趋势显示,损伤的24 h是主要改变关键点,在此前后蛋白质的表达水平基本一致。

重点神经蛋白质如神经纤维蛋白M(neurofilament M,NFM),在上调和下调模式中均出现,其在应激后受雌二醇的诱导表达以恢复神经细胞的功能[4],损伤前期该蛋白质表达下降,而后保护性地上升以恢复神经元的功能,因此推测,保护性机制发生于再灌注24 h。另一个神经蛋白是span2,该蛋白参与神经元膜的稳定性的保持,Indraswari等以脑缺血小鼠为模型发现spna2的m RNA表达上调,参与缺血保护[5]。在结果中其蛋白质表达水平在24 h明显下调,表明该蛋白在缺血损伤前期发挥不同的作用。

胶质纤维酸性蛋白(GFAP)24 h表达量下降,之后表达水平恢复。胶质纤维酸性蛋白被认为是脊髓损伤的标志性蛋白。

根据实验结果构建的数学模型显示,蛋白表达量变化总体趋势呈现24 h“瀑布式”下降,而其余时间点变量很小的特征,Woolf等也通过免疫组化分析周围神经损伤时观察到,糖原磷酸化酶(PYGM)在24 h表达有一个瞬时降低[6],因此推测在脊髓损伤中,糖代谢的酶表达水平的降低可以在一定程度上降低葡萄糖的消耗,使体内的葡萄糖维持在较高水平,从而保护急性应激中受损的神经。

保守的热休克蛋白(HSP)是细胞对缺血、缺氧等应激反应敏感而可靠的标记,对应激细胞起保护作用[7]。最近有实验证实,脊髓损伤组大鼠在脊髓损伤后2 h即有HSP70开始表达,并随着时间增加,表达24 h达到峰值,维持至72 h后表达渐少,低于6 h水平[8],与HSP相关的辅助因子热激活蛋白70识别蛋白A(HSC70)在24 h下降达到低谷而后升高,此过程表明初期应激后机体内在损伤保护机制启动,与HSP70联动,其诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关[9]。

琥珀酸脱氢酶、烯醇酶等参与碳水化合物代谢和能量代谢的酶类在24 h时间点上也呈现下降的特征,但是目前仍缺少其在神经损伤研究中的作用机制证据。

代谢组学方面,由于所检测的许多内源性小分子化合物直接参与了体内各种代谢、循环,其水平高低在一定程度上反映了机体生化代谢的功能和状态,通过代谢网络分析还能了解体内生化代谢状态,沟通生化代谢与疾病关系[10]。气质联用(GC-TOF/MS)在扫描模式下不但具备了广谱测定、强大的分离和分析复杂混合物的能力,还拥有很高的灵敏度、良好的重现性和线性响应[11,12]可以同时测定定性几百个化学性质不同的化合物。其庞大的化合物谱图库也极大地方便了未知化合物的鉴定。

代谢产物分析方面,高能磷酸化合物,如磷酸肌酸(P2Cr)、三磷酸腺苷(ATP)的耗竭及葡萄糖、糖原的耗竭被认为是缺血性损伤最敏感和最可靠的代谢指标。葡萄糖在细胞内转换为丙酮酸后,缺氧时氧化磷酸酶活力下降,糖酵解产生的H+与丙酮酸结合形成乳酸,其作为疲劳物质,量的升高可以在某种程度上反映细胞缺血缺氧的状态。本试验中假手术组(K)、术后30 min组(M)、术后24 h组(H)比较:在假手术组与术后24 h组比较中(表1),出现明显高峰的产物,假手术组为葡萄糖,术后24 h组为乳酸,说明葡萄糖消耗明显。而术后30 min组与术后24 h组比较(表2),术后24 h出现半乳糖与未知名称的糖明显较术后30 min组高。半乳糖也可以通过半乳糖激酶等作用下进入酵解途径。其他糖类如6-脱氧吡喃甘露糖也可通过变位酶转变成磷酸己糖而半乳糖激酶等作用下进入酵解途径。其他糖类如6-脱氧吡喃甘露糖也可通过变位酶转变成磷酸己糖而进入酵解途径,由此可推断在术后24 h中,糖代谢已经达到峰值,趋向于向正常方向回归正常代谢变化。此外甘油是细胞膜的组成部分,研究表明甘油的浓度变化可能反映细胞膜损伤的程度[13]。

蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 第3篇

蛋白质组 (Proteome) 是1994年澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams提出的[3]。蛋白质组是指一个组织、细胞或者基因组在一个时期内所表达出的所有蛋白质, 蛋白质组学就是对这些蛋白质进行研究的学科[4]。其可以进行高通量的研究和比较正常细胞与癌细胞之间的差异蛋白质, 并对不同时期的癌细胞中所表达蛋白质的种类进行定性和定量分析, 不仅有助于阐释肿瘤的发病机制, 还能筛选和鉴定药物作用靶点, 在疾病的诊断、治疗和新药开发等方面, 都有着广阔的应用前景[5]。

1 蛋白质组学研究的主要技术

1.1 2-DE双向凝胶电泳技术 (two-dimensional gelelectrophoresis, 2-DE)

2-DE双向凝胶电泳技术是现在蛋白质分离研究最经典、最成熟的技术, 该技术是上世纪80年代发展起来的, 主要利用蛋白质的等电点和分子量对蛋白质进行高通量的分离。2-DE双向电泳主要包括:样品制备、等电聚焦、SDS凝胶电泳和染色, 图像的扫描和分析, 以此可以对不同样本的蛋白质进行分析。但是该技术也有一定的缺点, 如对不可溶性蛋白质、极酸极碱性蛋白质和高分子量的蛋白质不易分离。现在可以运用高效液相色谱技术来弥补这些缺点, 并对低丰度蛋白进行检测[6,7,8]。

1.2 蛋白质鉴定技术

蛋白质传统的检测方法有Edman降解测序和氨基酸测序, 随着技术的发展, 质谱技术已经大规模地应用在蛋白质的检测之中, 现在常用的技术有: (1) 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALD I-TOF-MS) 技术; (2) 电喷雾串联质谱 (ESI/MS/MS) 技术等。现在运用较多是MALDI-TOF-MS, 该技术可以在不破坏蛋白质样品结构的情况下对样品进行大量、精确的分析[9]。

2 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用

2.1 在药物靶点找寻方面的应用

通过研究癌细胞在用药前后蛋白质的表达情况, 分析药物作用的靶点, 探究细胞内的信号传导, 大致分析其药物作用机制。

卵巢癌 (ovarian cancer) 是一种常见的妇科癌症。赵群等[10]用二维差异凝胶电泳和MALDI-TOF/TOF串联质谱差异蛋白质组学研究103例卵巢上皮癌, 63例卵巢良性肿瘤, 3例盆腔良性病变和60例健康对照血清, 发现41个有显著性差异的蛋白质点, 成功鉴定其中的28个。上调和下调最显著的分别为结合珠蛋白和转铁蛋白, 成为卵巢上皮癌的血清标志物;CA125+结合珠蛋白+转铁蛋白联合诊断卵巢上皮癌的敏感度和特异度高于三者的单独检测, 提高了CA125阴性卵巢上皮癌的检出率, 有助于卵巢上皮癌的诊断。结直肠癌是消化道常见癌症, Akiko[11]等用差异蛋白组学研究了结直肠癌细胞DLD-1和用5-氟尿嘧啶处理过的DLD-1细胞, 结果发现有17个蛋白点上调, 19个下调, 有7种抗凋亡的蛋白, 如HSPB1、内质网过渡三磷酸腺苷 (ATP) 酶等上调, 4种凋亡蛋白如丝切蛋白1、丙酮酯酶激酶M2等下调。其中HSPB1和其磷酸化结构增强表达, 这个蛋白有成为今后药物研发靶点的可能。Victoria[12]等运用差异蛋白组学研究了新辅助化疗用于治疗雌激素受体阳性乳腺癌, 发生抗药性的原因。化疗有效的细胞蛋白组与有抗药性的细胞蛋白组进行对比发现, 有132个蛋白点有显著的变化, 57个蛋白点可以重复。经过实验证明, 14-3-3蛋白家族及其亚型与耐药性有密切的相关性, 现在仍需临床试验证明, 但该蛋白可以作为抗乳腺癌药物潜在靶点。

2.2 在癌症早期诊断中的应用

癌症早期诊断的意义超过了任何一种癌症的治疗方法, 它对延长患者生命和癌症的治疗都有着很大的帮助, 蛋白质组学为癌症的早期诊断提供了可靠的方法。对正常细胞和肿瘤细胞的蛋白组进行比较, 从中发现特异性的肿瘤标记蛋白, 可以作为肿瘤早期诊断的标准。

世界范围内, 男性患膀胱癌在有实体肿瘤的癌症中排第4位。Lei[13]等运用2D电泳技术对正常膀胱癌细胞和膀胱癌细胞进行比较, 发现有14中蛋白发生表达差异, 如β2微球蛋白、apoA1、前列腺素合成酶D2、Ⅱ型细胞骨架1等。其中apoA1由于其被证实膀胱癌患者的尿液中也有发现, 故可以作为膀胱癌早期诊断的蛋白质。

我国是胃癌高发的国家, 每年有约有35万人死于胃癌。Megan A[14]对胃癌小鼠模型中正常型与肿瘤型进行了2D-DIGE分析, 其中有28个基因与人类同源, 8个蛋白被用于患者血清对照组。显著增加的有载脂蛋白E和结合珠蛋白, 而afamin和从生蛋白显著减少, 用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 进行检验后发现, 这4种蛋白对于胃癌早期诊断的敏感性要远远好于现有临床检测胃癌标志物CA72-4。

根据一些组织的调查, 肺癌的发病率居于所有癌症的首位, 病死率也很高。Yao[15]对非小细胞肺癌细胞进行了差异蛋白组学研究, 发现了35种蛋白发生变化, 其中4个蛋白质可以进一步实验, SMOX、NOLC1、HMMR、MALAT1这4种蛋白质参与了多种细胞活动, 如细胞的增殖、凋亡。NOLC1、MALAT1已在诊断疾病中有着相当的灵敏度, 对于今后肺癌的早期诊断有很大帮助。

3 展望

蛋白质组学技术在高血压领域的应用 第4篇

1 蛋白质组以及蛋白质组学的概念

蛋白质组的概念由澳大利亚Wilkins和Willians于1994年提出, 指的是由一个基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质广泛参与细胞的功能及调节, 蛋白质组决定细胞乃至组织和器官的表型。不论是处于正常状态还是急慢性疾病状态下[2]。

2 蛋白质组学在高血压病中的研究

目前国内外的研究大多对其发病的机制感兴趣, 故研究多集中在高血压模型动物的组织蛋白质组学研究。

2.1 高血压模型动物心肌组织的研究

刘丽等[3]运用蛋白质组学技术探讨腹主动脉缩窄 (AAC) 高血压大鼠 (SHR) 左心室差异蛋白质表达, 及其在左室肥厚发生机制中的作用, 结果显示, 鉴定的21个蛋白质中, 相对于假手术组有14个蛋白质上调, 4个蛋白质下调, 3个蛋白为AAC组新出现。NCBI数据库检索后发现上调蛋白质包括:肌球蛋白轻链、心肌A肌动蛋白蛋白原、B肌球蛋白重链、3磷酸甘油醛脱氢酶、线粒体核糖体蛋白L15、G蛋白偶联受体34、酪氨酸蛋白激酶ZAP-70、RIKENcDNA 9030617003、天冬氨酸tRNA合成酶等, 下调蛋白为H 转运ATP合成酶、卜三脂酰辅酶A脱氢酶等, 两组蛋白表达差异有统计学意义。由此认为高血压大鼠心肌中参与糖酵解蛋白、信号转导通路蛋白、基因表达调控蛋白增加, 最终心肌细胞结构蛋白增加导致心肌肥厚。

Jin等[4]运用2-DE技术对SHR大鼠心肌蛋白表达进行了研究, 与Wistar大鼠相比有20个差异表达的蛋白质点, 其中13个点被证明与SHR大鼠早期与血压维持高水平及其进展有关, 而另外7个在后期高表达, 并且这些高表达的蛋白可以被血管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI) 类药物依那普利和氯沙坦逆转。

金贤等[5]取4周、20周龄雄性SHR和WKY大鼠, SHR在血压未升高时就已存在心肌肥厚。经二维凝胶图比较共找出27个差异蛋白点, 质谱分析鉴定出20个差异蛋白, 涉及能量代谢、线粒体氧化磷酸化和氧化应激反应等。

2.2 高血压模型动物肾脏组织的研究

Thongboonkerd[6]运用2-DE和MALDI-TOF-MS技术研究高血压大鼠肾脏蛋白质组表达的变化。结果发现肾脏蛋白表达谱在E-H诱导的高血压组和SH处理组不同, 血管舒缓素结合蛋白Kallistatin在各组中均有表达, 但仅在长期E-H30表达降低。Kallistatin的减少将导致血管中血管舒张因子总量的减少, 从而引起或加重高血压。α1-抗胰蛋白酶A1AT、肾舒血管素活化的抑制因子在E-H30组表达上调, 但在血压正常的SH30组下调。此外, 平滑肌收缩素 (SMCE, 包括肌球蛋白) 、房肽素和蛋白质二硫化物异构酶 (PDI) 在E-H30组上调, 但在SH30组下调。Kallistatin、A1AT、PDI的一致改变提示舒血管素通路在E-H诱导的高血压发病机制中起作用。

杜于茜等[7]研究氯沙坦干预SHR大鼠后蛋白表达的变化, 两组凝胶的平均蛋白点数分别为570±48、686±30。氯沙坦干预后有13个蛋白表达发生了显著变化, 表达增强4个, 表达降低4个, 蛋白点消失5个。对13个差异蛋白点进行质谱分析, 鉴定出的7个蛋白质为Heat shock protein (HSP) 、Tubulin alpha-1 chain、Transthyretinprecursor、Liver regeneration-related protein LRRG03等。

2.3 高血压模型动物主动脉的研究

Delbosc等[8]对两种不同种系的高血压大鼠的主动脉进行研究, Fischer 和Brown Norway (BN) 大鼠分别分为对照组和干预组[N (Omega) -nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) , 一种抗高血压药物], 结果显示BN大鼠干预组血管重构不明显。运用质谱技术对Fischer大鼠干预组表达有差异的蛋白进行研究, 差异蛋白是:ubiquitin, smooth muscle (SM) 22alpha, thymosin beta4, and C-terminal fragment of filamin A。

卞玉兰等[9]以SHR大鼠胸主动脉为研究对象, 结果在线性pH3～10范围内和分子量120 kDa以内, SHR的2DE图分离得到2 338±34个蛋白点, WKY得到2 102±48个蛋白点, 总共1 870个点匹配, 匹配率约为80%。用软件对凝胶图进行分析, 选择有2倍以上差异表达的蛋白点有50个, 其中有27个点在SHR中表达丰度比WKY高, 有23个点在WKY中表达丰度比SHR高。通过胶内酶解后进行一级质谱, 得到20个蛋白点的PMF图谱用 Mascot软件搜索NCBI非冗余库, 获得这些蛋白点的身份, 结果总共有10个点经鉴定后具有较可信的结果, 其功能主要有4大类:酶蛋白、信号通路蛋白、参与胞质分裂过程的蛋白和其他。

2.4 高血压模型动物脑血管的研究

李书林等[10]用自发性高血压卒中型大鼠 (SHR/SP) 试验, 结果表明, 青年组Wistar大鼠脑血管壁明胶酶A (MMP-2) 和明胶酶B (MMP-9) 的表达很少, 而在SHR/SP组大鼠的血管壁表达较多。自发性高血压大鼠Ⅳ型胶原酶在血管壁表达的增强, 可能是长期高血压致使血管内皮受到应力的损伤, 来自血流的切应力和血液的压力 (法向应力) 作用于血管壁, 激发炎性介质的瀑布反应有关。这些因子促进平滑肌细胞、内皮细胞等的基质金属蛋白酶表达。基质金属蛋白酶分解ECM而破坏基底层, 并开放血-脑屏障是脑卒中病情加重的重要因素。老年组大鼠MMP-2、MMP-9的表达也明显高于青年组, 与高血压大鼠差异无统计学意义。这可能是老年鼠由于动脉内膜的增厚, 引起小动脉中层的慢性缺血缺氧, 导致炎症介质、自由基等的产生增加, 从而激活明胶酶, 引起一系列病理生理变化。

2.5 高血压模型动物血清、尿蛋白的研究

Sironi等[11]将三种品系的大鼠[SHR, 自发性高血压易中风大鼠 (SHR/SP) 、Wistar大鼠]应用盐负荷处理一段时间后, 用双向凝胶电泳等测定血清和尿中的蛋白改变, 结果发现, 在中风前至少4周SHR/SP血清中就检测到炎症反应的标志蛋白, 包括高水平的硫抑素 (thiostatin) , 在中风前和盐负荷处理数周后, SHR/SP尿中就出现一些分泌蛋白 (转铁蛋白、血红素结合蛋白、清蛋白、α2-HS糖蛋白、血管舒缓素结合蛋白、α1-抗胰蛋白酶、Gc-球蛋白和转甲状腺蛋白) , 此结果提示, 在磁共振成像检测到脑的异常体征前, 不典型的炎症反应和广泛的血管渗透性改变就已经发生。

3 蛋白质组学在高血压中医证型的研究

“证”是中医对疾病某一阶段的特定病理生理过程的认识, 是中医理论中的基本概念, 也是辨证论治体系的基础。将蛋白质组学方法引入中医“证”的研究, 对中医证相关蛋白质进行筛选和鉴定, 为中医“证”本质的研究提供新的思路与方法。证的特征与蛋白质组有相似之处, 且证候的形成及不同治疗方法的治疗效果必然有其物质基础, 而这种物质基础就有可能反映在蛋白质变化水平上。

萧梅芳等[12]研究15例高血压病肝阳上亢证患者及15例高血压脑出血肝阳化风证蛋白表达的差异。结果提示:肝阳上亢证与肝阳化风证有6个相同表达的蛋白质, 18个差异表达的蛋白质。鉴定出的蛋白质涉及细胞骨架蛋白、代谢酶类、细胞信号转导蛋白、抗氧化蛋白、血液蛋白等。电压依赖性阴离子通道蛋白 (VDAC) 在肝阳化风组及肝阳上亢组表达下调, 提示两证与氧化应激条件下VDAC下调, 启动细胞凋亡有关。

熊新贵等[13]研究17例高血压脑出血肝阳化风证患者、10名健康对照、23例高血压肝阳上亢证患者的血清蛋白质表达谱。3组血清中共有8个蛋白质点呈现差异表达, 鉴定出5个蛋白质为:血清淀粉样前体蛋白, 铜蓝蛋白, 维生素D结合蛋白, 载脂蛋白C-Ⅲ和转铁蛋白。推测其可能与高血压脑出血肝阳化风证存在一定相关性, 其具体机制还有待进一步研究。

4 蛋白质组学在高血压中药治疗中的研究

以蛋白质表达为指标, 采用蛋白质组相关分析技术及生物信息学等方法, 通过比较分析中药作用前后组织、细胞的蛋白质组, 能在分子水平了解中药的作用靶点及方式、代谢途径[14]。

张莺等[15]用平肝潜阳方治疗高血压病肝阳上亢证大鼠, 有12个表达差异的蛋白质斑点, 鉴定确认的8个。其中异柠檬酸脱氢酶、类固醇合成急性调节蛋白在模型组表达较正常组上调, 在治疗组重新下调至前水平, 实验发现模型组大鼠肾上腺铁蛋白轻链较正常组明显下调, 经治疗后又重新上调至高水平。由此推测平肝潜阳法可以作用于铁蛋白轻链, 使其水平提高, 从而发挥其抗氧化应激损伤的作用。

赵艳[16]用镇肝熄风汤治疗高血压脑出血患者20例, 选取高血压脑出血肝阳化风证20例随机分为两组, 分别予以镇肝熄风汤对证治疗及大定风珠非对证治疗, 结果显示, 研究共筛选出22个差异表达蛋白质点。高血压脑出血肝阳化风证, 经镇肝熄风汤对证治疗后与健康对照组比较2个蛋白表达下调, 1个蛋白缺失, 5个蛋白表达与健康人无明显差异。经质谱鉴定有8个蛋白。由此考虑镇肝熄风汤通过作用于ApoAI, 肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶A (cyPA) , 使其水平提高, 有效地介导胆固醇和磷脂从人主动脉平滑肌细胞的流出从而发挥降压降脂作用。

5 展 望

蛋白质组学在胰腺炎研究中的应用 第5篇

1 蛋白质组学研究技术简介

蛋白质组学研究技术主要由3大部分组成:双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE),质谱(mass spectrometry,MS)和生物信息学(bioinformatics)。其中,2-DE主要应用于蛋白质的分离,质谱和生物信息学主要应用于蛋白质的鉴定和分析。用于蛋白质鉴定的质谱主要有基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)、电喷雾离子化质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)、表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)等。这3种质谱技术各有特点,MALDI质谱是利用过量的低分子有机酸作为基质吸收激光能量,再将能量传给蛋白质或多肽样本,使样本气化、离子化;ESI-MS是在样品喷射过程中利用电场使液相的多 肽或蛋白质样品离子化;SELDI-TOF-MS则是将蛋白质芯片与质谱技术结合,不需要双向凝胶电泳分离蛋白质或多肽,直接从样本中检测蛋白质,具有快速、简便、易行高通量平行分析等特点,极大地提高了对蛋白质的鉴定能力,因而更适合于临床应用[1]。

2 蛋白质组学在胰腺炎性疾病中的应用

既往蛋白质组学多用于肿瘤方面的研究,如胰腺癌[2],在寻找肿瘤的早期诊断标志物,了解肿瘤的发病机制等方面具有重要意义。近些年来,该技术也用于炎性疾病的研究。胰腺炎,一种常见的急腹症,发病率随着人们饮食习惯和生活方式的改变有所升高。一些学者也将蛋白质组学技术应用于胰腺炎的研究。

2.1 正常胰腺组织

建立正常胰腺组织蛋白质数据库是胰腺疾病蛋白质组学研究的基础。正常小鼠胰岛组织的二维电泳图谱已被SWISS-2D-PAGE数据库收录[3]。正常人体胰岛蛋白质表达图谱是由Ahmed等建立的。他们提取5个志愿者的部分正常胰腺组织,根据组织内密度梯度的不同离心分离出胰岛制备胰岛样本,利用2-DE和MALDI质谱技术成功鉴定出与胰岛生理功能相关的66种不同的蛋白质,其中具有特定功能的有酶类、分子伴侣、细胞结构蛋白质、细胞防御蛋白、信号分子和转运蛋白等。对比小鼠胰岛组织蛋白质表达图谱,许多蛋白质是新发现的,如膜联蛋白A2、延长因子1-а2、组蛋白H2B和热休克蛋白等[4]。这说明胰岛蛋白质表达谱存在物种差异。结合动物实验研究结果,Ahmed的研究小组推测分子伴侣GRP78、GRP94、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、钙网蛋白、膜联蛋白、细胞角蛋白、前纤维蛋白和ORP150可能与糖尿病发生相关[5,6]。该研究结果为胰岛相关疾病(如糖尿病)的蛋白质组学研究奠定了基础。

除了胰岛之外,胰腺组织还包括大量的腺泡细胞;胰岛蛋白质表达谱仅代表胰腺组织蛋白质组的一部分。Hu等[7]选取12例志愿者部分正常胰腺组织,未进行胰岛分离,采用2-DE和MALDI质谱分析胰腺组织样本,共发现了302种蛋白质,其中约27%属于酶、包括胰淀粉酶、胰弹性蛋白酶、胰腺炎相关蛋白,胰脂肪酶等胰腺特异蛋白质;同时鉴定出结构和细胞骨架蛋白。认为胰腺组织蛋白质表达谱可以反映胰腺的功能。另一位学者采用同样的方法,发现凝胶上有18个蛋白点的分子质与Hu的研究结果相比减小10 ka以上。这可能仍是同一类蛋白质,只是被蛋白酶降解而造成的差异[8],不是新的蛋白质。

2.2 急性胰腺炎

2.2.1 寻找重型急性胰腺炎的蛋白标志物

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)已成为常见病多发病,20%左右的患者病程呈进展性,导致重型AP,甚至多器官功能衰竭[9],死亡率可高达20.8%～36%[10],因此早期鉴别重症AP并对其行及时有效的干预显得尤为重要。Papachristou等[11]选取21例轻型AP和7例重型AP患者,在诊断后24 h内运用SELDI质谱法检测两组患者血清蛋白质组,发现两组间有18个差异表达的蛋白点,其中一个相对分子质量在11 720的蛋白质对这两种AP鉴别的灵敏度近100%,特异度81%,另外一个相对分子质量在4 283的蛋白质鉴别的灵敏度为95%,特异度80%。据此他们认为血清蛋白质表达图谱的差异对鉴别重型AP和轻型AP具有重要的意义。Flint等[12]利用反相高性能液相色谱(RP-HPLC)技术检测AP患者发病24 h的尿液,对比轻型AP患者和正常人,重型AP患者尿液中有17个异常表达的蛋白点,包含21种蛋白质以及纤维蛋白原、胰岛素和降钙素基因相关肽等。当然,无论是血清还是尿液的中发现的多种蛋白质,都还有待于进一步鉴定,能否在临床上作为重型AP特征性的蛋白标记物,还有待更大样本的研究进行验证。

2.2.2 研究AP发病机制

AP的发病机制比较复杂,至今尚未被完全阐述清楚。应用蛋白质组学技术对AP进行研究,试图在蛋白质水平进一步了解其发病机制。Lee等[13]用雨蛙肽作用于大鼠胰腺腺泡AR42J细胞制备AP体外模型,采用2-DE和MALDI质谱技术检测腺泡AR42J细胞膜蛋白,与正常对照组相比,发现有2种蛋白质表达上调(甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2,热休克蛋白-60),4种蛋白质表达下调(蛋白二硫键异构酶,γ-肌动蛋白,异柠檬酸脱氢酶-3和Seven in absentia homolog 1A),这些蛋白质与细胞信号转导、氧化应激、细胞骨架排列相关。Yu等[14]采用同种办法制作模型并检测AR42J细胞株,经MALDI质谱分析发现5种差异表达蛋白质,分别为热休克蛋白-90,线粒体ATP合成酶β链,微管蛋白β链,3-巯基丙酮酸转硫酶和线粒体ATP合成酶D亚基。这些蛋白质虽同Lee等的研究结果有差别,但同样参与氧自由基反应、细胞骨架排列和细胞信号转导。因此,可推测氧化应激可能参与雨蛙肽诱导AP模型的胰腺腺泡细胞损伤和防御机制障碍。Chen等[15]制作了精氨酸诱导和雨蛙肽诱导的两种不同的大鼠AP模型。利用液相色谱串联MALDI质谱分别检测同位素相对标记和绝对定量技术(iTRAQ)标记过的两种模型的含粗面内质网样本液,定量鉴定出大量属于许多功能类别的蛋白质,如核糖体蛋白、易位子亚基和分子伴侣等等。与正常对照组相比,发现的37种差异表达的粗面内质网蛋白质,说明了粗面内质网功能受到了严重的影响。粗面内质网功能异常又影响到消化酶的合成和加工,导致消化酶的表达异常,是AP发病的始动因素。比较AP和正常胰腺组织的蛋白质组,更有助于全面深入地了解AP发病机制。Fetaud等[16]采用比较蛋白质组学的方法,成功鉴定出42种与AP病理过程相关的蛋白质。这些蛋白质与消化蛋白酶的激活,多种炎性因子的表达,氧化应激和细胞应激反应有关;并首次提出与细胞凋亡有关的14-3-3蛋白质可能参与AP的病理生理过程。

2.2.3 研究AP胰外器官功能障碍机制

重症AP引起多器官功能障碍机制至今尚未阐述清楚。Mole等[17]利用SELDI质谱分析法检测AP大鼠肠系膜淋巴液,发现淋巴液中具有免疫调节活性的色氨酸代谢产物,3-高氧犬尿酸的表达水平升高。而AP患者中血浆犬尿酸的表达水平与多器官功能障碍评分及需要提前进行机械通气和血液透析呈正相关[18]。肠系膜淋巴液中的3-高氧犬尿酸进入血液循环导致AP的胰外器官功能障碍,其原因是3-高氧犬尿酸在胰外器官通过氧化作用造成细胞损害[19],进而逐渐出现器官功能障碍。Mittal等[20]采用iTRAQ标记技术和液相色谱串联MALDI质谱法检测AP大鼠模型肠系膜淋巴液,定量鉴定出245种差异表达的蛋白质。这245种蛋白质中有8种急剧增加,其中7种是胰腺代谢的酶类,分别是胰淀粉酶2、胰脂肪酶、羧肽酶A2、糜蛋白酶原B、羧肽酶B1、阳性胰蛋白酶原和核糖核酸酶1。这些酶进入血液循环通过其特有功能损伤胰外组织器官,从而参与胰外器官功能障碍发生过程。同时,这7种胰腺代谢酶类为使用肠内蛋白抑制剂治疗AP提供效果判断指标。

2.3 慢性胰腺炎

慢性胰腺炎是各种原因导致的胰实质和胰管的不可逆慢性炎症损害,它与胰腺癌的关系也较密切。Chen等[21]运用同位素代码标记技术(ICAT)标记,串联质谱分析法检测10例慢性胰腺炎患者和10例正常人的胰腺组织标本。发现慢性胰腺炎的胰腺组织中116种差异表达的蛋白质,大部分与胰腺的炎性损伤和组织恢复有关。这些与胰腺炎性损伤和组织恢复有关的蛋白,并不是慢性胰腺炎特有的,其中40%在胰腺癌中也存在[22]。这进一步这说明慢性胰腺炎与胰腺癌关系密切。蛋白质印迹和免疫组织化学分析发现,膜联蛋白A2、胰岛素样生长因子结合蛋白-2在胰腺癌中过度表达而未在慢性胰腺炎中过度表达,有望成为鉴别胰腺癌与慢性胰腺炎的蛋白标志物。

3 结语

随着蛋白质组学的迅猛发展,蛋白质组学在生命科学研究中的作用越来越重要。蛋白质组学技术在寻找重型AP的特异蛋白标志物,了解AP发病机制,鉴别慢性胰腺炎与胰腺癌等胰腺炎研究中,显示出越来越重要的作用。随着蛋白质组学研究技术的提高和发展,结合相关有效技术,将为胰腺炎性疾病的研究拓展更为广阔的空间。

摘要：蛋白质组学是以双向凝胶电泳、质谱鉴定和生物信息分析三大技术为支撑,从整体生物机体的角度研究生命活动的主要执行者——蛋白质。作为研究胰腺炎的新方法,蛋白质组学在寻找和发现这类疾病新的标志物、进一步了解其发病机制、开发新的药物治疗靶点、预测疾病的转归等方面具有重要意义,也具有广阔的应用前景。

动态蛋白质组学 第6篇

关键词：冠心病,血清蛋白质组学,视黄醇结合蛋白4

蛋白质组学最主要的应用之一就是生物标志物的发现,蛋白质在丰度或是形态上的改变往往与某一个特殊的生物学过程或疾病相关,这就为我们寻求冠心病的蛋白质组学生物标记物、寻找药物治疗靶点以及反映治疗效果提供了重要依据。本研究采用双向凝胶电泳联合质谱的技术方法,分别对正常人、冠心病中高危人群(但尚未发生冠心病)、冠心病急性期患者及冠心病稳定期患者四个不同阶段的血清进行了差异蛋白质组学的研究,以期寻找到与冠心病发生发展相关的蛋白质,从而为进一步阐明冠心病发病机制、寻找临床诊断和治疗的预警蛋白提供有价值的依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

冠心病中高危人群、急性期和稳定期患者均为2009年2月—2010年11月中日友好医院中西医结合心内科门诊及住院患者,其中冠心病中、高危人群组8例,男3例,女5例,年龄(53.0±10.1)岁;冠心病急性期患者组8例,男5例,女3例,年龄(67.7±8.1)岁;冠心病稳定期患者组8例,男4例,女4例,年龄(69.5±9.8)岁。正常健康者8名,均来自北京中医药大学体检正常的健康志愿者,男3名,女5名。

1.2 诊断标准及纳入标准

诊断符合WHO/ISEC于1979年制定的《缺血性心脏病的命名和诊断标准》。具体分组标准如下。

1.2.1 正常健康人群组(①组)

不具备心血管病的危险因素,无糖尿病、高血压、高脂血症、肾脏疾病及外周血管病变。

1.2.2 心脑血管疾病中、高危人群组(②组)

中危人群:1个～2个危险因素,收缩压和舒张压水平<2级高血压;高危人群:≥3个危险因素或靶器官损害或糖尿病或无其他危险因素仅3级高血压。

1.2.3 急性期冠心病患者组(③组)

即急性冠脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)患者,包括不稳定型心绞痛(UA)、急性心肌梗死(AMI);AMI又包括ST段抬高性心肌梗死和非ST段抬高性心肌梗死。

1.2.4 稳定期冠心病患者(④组)

即已发生心肌缺血而目前处于稳定期的患者,包括陈旧心肌梗死,或以前曾行冠脉介入术(PCI)或冠状动脉搭桥术后的患者。

1.3 实验试剂

固相pH梯度干胶条(pH3-10NL,24 cm),IPG buffer均购自GE Healthcare 公司;二硫苏糖醇(DTT),SDS,Tris等购自Amersham Bioscience公司;碘乙酰胺,考马斯里亮蓝G-250等购自Amresco公司。

1.4 实验仪器及软件

IPG phorTM等电聚焦仪(Amersham Pharmacia Biotech公司),Ettan DaltTwelve垂直电泳系统(美国Parafilm 公司),ImageScannerⅢ透射扫描仪、Labscan扫描控制和分析前处理软件(GE Healthcare公司),PD-Quest图像分析软件(Bio-Rad公司),MALDI-TOF-MS质谱仪(UltraFlexⅢTOF&TOF/TOF,Bruker Daltonics公司)等。

1.5 实验方法

1.5.1 血清样本的采集及处理

清晨采集各组人群外周静脉血3 mL,3 000 r/min离心10 min,分离血清,-80 ℃冰箱备用。Bradford法测定各血清样本的蛋白浓度。

1.5.2 双向凝胶电泳

第一向固相pH梯度等点聚焦(IEF):按IPG-phor等电聚焦系统指南操作。将含1 mg蛋白的血清样本中加入1%IPGbuffer,水合液稀释至450 μL混匀上样,水化合等点聚焦在20 ℃自动进行,总电压为90 000Vh。

第二向垂直SDS-PAGE电泳:平衡后的IPG胶条移至12%SDS-PAGE胶上端,加入SDS电泳缓冲液,电泳条件为25 ℃,2 W/gel电泳30 min,然后按每块胶17 W的恒功率电泳,直到溴酚蓝指示线到达凝胶底边为止。

1.5.3 染色

电泳所得的双向凝胶电泳技术(2-DE)凝胶固定后以考马斯亮蓝G-250染色。

1.5.4 扫描及分析

凝胶脱色后经LabScan和ImageScanner透射扫描,运用Imagemaster和PD-Quest软件对各组凝胶图谱进行蛋白点的检测、标准化、匹配、统计学处理,找到差异表达的蛋白质点。

1.5.5 质谱鉴定及数据库查询

质谱采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行分析,获得肽质量指纹谱(由军事医学科学院生物医学分析中心完成),运用Mascot软件搜索Swissprot和NCBInr数据库,得到差异蛋白质的相关信息。

2 结 果

2.1 各组双向凝胶电泳结果

4组血清分两次进行了电泳分离,第1次3例/组,第2次5例/组,图像分析时,均以正常人群组的凝胶为参考凝胶,其他3组均分别与参考胶进行匹配,4组凝胶上的蛋白质点个数分别为153.60±27.57、148.80±23.15、120.80±6.57、146.60±19.99。

2.2 图像分析及质谱鉴定结果

经匹配分析,两次实验共获得14个差异蛋白质点,经数据库查询共有13个点得到阳性鉴定,整合重复鉴定的蛋白点,共得到7个有意义的蛋白质点:视黄醇结合蛋白4(RBP4)、载脂蛋白E(ApoE)、载脂蛋白A1(ApoA1)、CD5抗原样蛋白(CD5L)、结合珠蛋白(Hp)、血清白蛋白(ALB)、簇连蛋白(CLU)。详见表1。

2.3 各差异点在4组中表达的差异

由于两次实验所用的分析软件不同,所得蛋白质点的差异表示也不同。从两次实验结果来看,所得7个蛋白质点在各组中的差异表达表现为:RBP4和Hp在③组、④组的表达明显高于①组、②组;CLU在②组、③组的表达高于其他两组;APOA1在①组表达高于其他3组,ALU在④组的表达最高;而CD5L和APOE在两次实验结果中的表达存在不一致的情况。详见表2、表3。

3 讨 论

近年来蛋白质组学技术已经有了很大的发展和进步,但是双向凝胶电泳技术仍然是蛋白质组学的基础和核心。而血清因其采集较为简便安全,因此是蛋白质组学的一个最理想的样本来源。

在本实验中,发现了7种差异蛋白质。目前对RBP4的大多数研究集中在其与肥胖[1]、代谢综合征[2]、胰岛素抵抗[3]及2型糖尿病[4]的关系方面,也有研究发现其与心脑血管疾病相关[5,6],血清RBP4的升高可能是动脉粥样硬化发生发展的标志[7,8],运用Western-blot和Elisa的方法进行血清检测发现RBP4在心血管病人(排除2型糖尿病)血清中的表达明显高于正常人[9],另外,发现血清RBP4在单纯冠心病患者中的表达高于非冠心病患者,而合并有2型糖尿病的冠心病患者血清RBP4的水平又明显高于单纯冠心病患者[10]。

ApoE可与脂质及其受体结合,参与载脂蛋白的清除过程,因此,ApoE缺乏会导致血浆中脂质清除障碍,脂质长期在血液循环中堆积导致动脉粥样硬化发生[11]。在颈动脉损伤2周～5周的大鼠血液中观察到ApoE显著减少[12],因此ApoE可以作为预测和诊断血管损伤的潜在生物标志。ApoA1是高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的主要结构蛋白,具有促进胆固醇的清除、抗炎症反应、抗氧化反应等作用[13,14],是防止动脉粥样硬化的保护性因子,与心血管疾病成负相关性。本实验发现,ApoE和ApoA1的表达随着疾病的进展呈现出①组>②组>③组>④组逐渐降低的趋势,说明脂质代谢在冠心病的发生发展过程中具有重要的作用,动态监测其变化,有可能为预测冠心病的发生起到一定的警示作用。

对CD5 antigen-like precursor功能的认识还较少,除了它能和单核细胞、淋巴细胞结合发挥免疫调节作用外,也发现它在抑制细胞凋亡的过程中发挥重要作用[15],而其在心血管疾病中的作用,可能和其与炎症之间关系从而导致动脉粥样硬化的发生有关。

Haptoglobin最主要的功能就是它能与游离的血红蛋白(Hb)结合,从而抑制Hb的氧化活性,减少溶血过程中自由Hb对组织的氧化损伤,Hp-Hb的结合还能对抗自由基和NO引起的细胞损伤,抑制前列腺素的合成而减少炎症反应[16]。同时,Hp也是一种急性期反映蛋白[17],其在急性反应(如创伤、炎症、感染等)中的血清水平升高时,往往伴有广泛的组织损伤或坏死。另外,Hp已被证实在血管再生过程中能够促进血管内皮细胞的增殖和分化,因此血清Hp浓度的增高对慢性炎症或缺血性病变的组织修复和侧支血管的生成有重要意义[18]。从实验结果看Hp在③组、④组的表达高于①组、②组,③组升高可能与急性期反应相关,④组升高可能与代偿性血管再生相关,是机体的自我保护机制。

Serum albumin是人体血清中含量最丰富的蛋白质,具有重要的生理功能和保护作用。研究表明[19],血清白蛋白与心血管疾病有着重要的联系,低血清白蛋白可能是心肌梗死的危险因素并影响其预后,在老年人群中,血清白蛋白降低,即使仍在正常范围内,也能增加发生心血管疾病的危险性,因此血清白蛋白的检测可以为早期发现和预防心血管疾病提供信息[20]。

Clusterin,又称载脂蛋白J、簇连蛋白,其对动脉粥样硬化是促进还是抑制作用目前还存在争议,有研究[21]发现在血管损伤后,簇连蛋白可以明显诱导新生内膜产生,并且减少簇连蛋白的表达可以抑制血管平滑肌细胞的增生(VSMCs),认为簇连蛋白是靶向性治疗动脉粥样硬化的候选者。

动态蛋白质组学 第7篇

1材料与方法

1.1 临床资料

所有病人的唾液样品均为南方医院或深圳市第二人民医院内科住院或门诊病人经胃镜和/或组织病理检查确诊为胃癌、慢性胃炎及消化性溃疡患者的标本。正常对照样品来自经健康体检正常的健康志愿者。

参考《中医诊断学》舌诊标准辨舌苔, 将病理舌苔分为病理薄苔、厚苔、剥苔3大类, 并设正常薄白苔组为对照。排除标准:排除口腔局部及唾液腺的炎症、肿瘤及先天性疾病;排除舍格伦综合征、囊性纤维病;排除其他系统严重并发疾病;同时排除正中菱形舌、舌裂、毛舌、游走性舌炎、舌淀粉样变性、舌扁平苔藓、舌念珠菌病等先天异常和舌局部特殊疾病引起的舌苔变化。其中正常舌苔组20例, 男13例, 女7例, 平均年龄 (45.40±10.39) 岁;病理薄苔组25例, 男11例, 女14例, 平均年龄 (48.44±14.39) 岁;厚苔组28例, 男15例, 女13例, 平均年龄 (46.74±10.14) ;剥苔组22例, 男13例, 女9例, 平均年龄 (48.68±11.34) 岁。各组年龄、性别构成相似。经统计学分析, 各组年龄分布比较差异无显著性 (P>0.05) 。

1.2 标本收集

唾液收集时间为6:00～8:00AM, 收集前一晚睡前不再进食及服用任何药物, 收集前2小时开始禁食水。用清水漱口后静坐于椅上。前5分钟内的唾液自然吞下后开始收集, 口腔唾液积聚至一定量后, 吐入置于冰浴预冷的50ml离心管内, 每个唾液样本采集2～5ml, 采集时间为20～30分钟。每个样本采集完立即放入冰盒内。唾液采集在15ml离心管中, 以10 000r/min离心10分钟, 4℃离心。取50μl唾液分装在0.5mlEP管中, 于-80℃冰箱保存。实验时由-80℃冰箱取出样本, 常温解冻。所有检测唾液均1次冻融。

1.3 试剂和仪器

WCX磁珠试剂盒:Bruker公司。α-氰基-4-羟基肉桂酸[α-Cyano-4-hvdroxycinnamic acid (HCCA) ]:Bruker公司, 质量浓度0.3g/L;乙醇 (色谱级) /丙酮 (色谱级) =2/1, 新鲜配制。AutoFlex III型MALDI-TOF质谱仪:Bruker公司。

1.4 WCX磁珠处理过程

4℃冰箱取出WCX磁珠试剂盒, 处理过程参照试剂盒说明书, 主要经混匀、清洗及洗脱等步骤。最后将洗脱的多肽样品溶液移入干净的0.5ml样品管中, 备质谱分析。

1.5 点样及质谱分析

将磁珠分选后的多肽样品溶液各取1μl分别点靶, 室温下干燥后, 再各点1μl浓度为3g/L的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液 (溶于50%乙腈, 2%三氟乙酸) 。然后将制备好的点样板置于MALDI-TOF质谱仪上进行分析。应用线性模式, 采集相对分子量范围为1000～10000Da, 激光能量为20%, 累计400shots。质谱信号单次扫描累加50次, 获得肽质量指纹图 (PMF) 。

1.6 数据处理及统计学分析

利用Bruker公司Flex Analysis 3.0和Clin Pro Tools软件2.1进行数据的分组指标及相关性进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

正常薄白苔与病理舌苔除算法选择问题被排除的样本共75例, 对所有的样本检测质谱图进行分析比较, 共得到蛋白质峰为187个, 其中通过遗传算法找到4个统计差异显著的蛋白质峰 (P<0.05) , 质荷比 (m/z) 为:6447.39Da、2938.47Da、1472.34Da、1451.77Da。通过分析差异蛋白质峰表达谱, 建立了分类预测模型, 识别率为85.31%, 预测能力39.91%。临床回代检验结果, 对正常组19例, 其中18例被准确检出, 56例病理组, 其中40例被准确检出, 该模型的准确率为85.33% (64/75) 。见表1～2。

3讨论

目前, 舌苔的研究已日益为国内外众多的学者瞩目, 迄今为止, 对于舌苔原理的研究已经从整体、器官、细胞、亚细胞乃至基因分子水平做了不少工作, 使得中医对舌苔原理的认识深入到亚细胞和基因分子水平[2,3,4,5]。但目前的研究是分散零碎的, 缺乏基因和蛋白质表达全貌的深入系统性研究;并且只是限于从已知生物学功能的指标去研究舌苔原理, 尚没有通过还原的方法去探索未知的东西, 具有较大的局限性。目前的研究尚难以从整体联系的观点对舌苔形成的本质及其变化规律进行全面深入的阐述。舌苔原理研究的进一步突破, 有赖于以分子整体观为基础的技术方法学的突破。近年来, 吴正治等将蛋白质组学技术运用于中医舌苔原理与微观辨证学的研究, 取得了有意义的研究结果, 发现不同病理舌苔具有不同的蛋白质组学特征, 说明蛋白质组学技术在中医药现代研究中的重要价值和广阔前景[6,7,8]。

根据中医学理论, 唾液是灌溉脏腑、滋润肌肤、流通百脉、补养后天之气的重要物质, 被称为“金津玉液”。研究发现唾液成分与血清相关[9], 随着高通量、高精度的蛋白质组学的应用, 使得唾液蛋白中生物标记用于疾病的早期诊断预防、生物蛋白靶向治疗、预后监测判断等均已成为可能[10,11,12,13,14]。近几十年来利用唾液作为检测人体疾病的手段, 用来诊断感染性疾病、免疫性疾病、内分泌疾病及肿瘤等众多疾病方面均已取得不少成果[15]。笔者对消化系疾病方面进行了首次研究, 并取得了有意义的结果。

胃主受纳, 腐熟水谷, 人体赖以生存的后天营养物质皆由其化生。故中医学历来非常重视胃的生理功能的具体体现。舌苔是由胃气熏蒸胃阴与浊气, 使之均匀地分布于舌面而生成, 正常舌苔的生成离不开胃气的熏蒸作用[16]。五脏六腑皆受气于胃, 五脏六腑的病变均能影响到胃气, 反映于舌苔上。舌苔的变化在消化系疾病辨证中常反映了脾气和胃气的强弱, 对临床消化系疾病的辨治具有指导意义, 为临床消化系疾病辨证、用药和判断疾病预后提供参考。鉴于此, 本研究首先选择消化系疾病进行舌苔与唾液蛋白质组的相关性研究。本研究通过对正常薄白苔与常见消化系疾病病理薄苔、病理厚苔、病理剥苔4组唾液样本的分析, 发现不同舌苔之间存在4个差异显著的蛋白峰, 并据此建立了不同舌苔的分类预测模型, 该模型的准确率为85.33% (64/75) 。说明察舌辨证有其分子水平的物质基础与现代科学内涵, 进一步的研究可望建立中医常见舌苔的唾液蛋白质组鉴别诊断模型。本研究有利于丰富和发展中医舌苔相关理论, 创新和发展中医特色的无创伤诊断技术, 因而具有重要的研究价值和广阔的应用前景。

摘要：目的:用蛋白质组学质谱技术筛选胃癌、慢性胃炎及消化性溃疡患者不同舌苔的唾液蛋白质差异表达谱, 寻找不同舌苔的唾液蛋白质组物质基础与生物标志物。方法:将病理舌苔分为病理薄苔、厚苔、剥苔3大类, 并设正常薄白苔组为对照, 采用MALDI-TOF-MS技术, 并运用弱阳离子磁珠 (WCX) 检测受试者唾液, 得到相应的肽质量指纹图谱, 建立分类预测模型。结果:正常组与消化系疾病薄苔、厚苔、剥苔3大类病理舌苔组共得到差异蛋白质峰187个, 其中4个蛋白质峰统计差异显著 (P<0.05) ;通过分析差异蛋白峰表达谱, 并建立了分类预测模型, 识别率为85.31%, 预测能力39.91%。临床回代检验结果, 模型的准确率为85.33% (64/75) 。结论:初步得到了消化系疾病患者不同舌苔的唾液蛋白指纹质谱, 并建立了以6447.39Da、2938.47Da、1472.3Da、1451.77Da4个蛋白质峰为模型区分正常舌苔与消化系疾病不同病理舌苔的唾液蛋白表达质谱诊断模型。