人心肌细胞范文

人心肌细胞范文（精选7篇）

人心肌细胞 第1篇

1 材料与方法

本实验于2011年6月-2012年1月在中南大学湘雅医院医学实验研究中心和中南大学实验动物学部完成。

1.1 实验动物

健康纯种中国家兔60只, 雌雄不拘, 兔龄4~5个月, 体重1.5~2.0 kg, 购自中南大学实验动物学部, 动物许可证号:SYXK (湘) 2011-00041。饲养环境:室内25℃常温、12 h灯光照明、单笼常规饲养。

1.2 主要药物、试剂和仪器

阿托伐他汀 (美国Pfizer Ireland Pharmaceuticals) , XDS-100倒置显微镜 (上海蔡康光学仪器有限公司) , JX0197097细胞培养箱 (博士德公司) , 淋巴细胞分离液 (美国GICBO公司) , DMEM (美国GICBO公司) , RPMI1640液 (美国GICBO公司) , 绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 慢病毒 (上海英为信生物科技有限公司) , KIT-5020通用型二抗羊抗鼠免疫组织化学广谱试剂盒 (福州迈新公司) , 鼠抗兔VEGF单克隆抗体、鼠抗兔v WF单克隆抗体 (一抗) (博士德公司) , Vevo770型高分辨率小动物超声仪 (加拿大VISUALSONICS公司) 。

1.3 人脐血单个核细胞提取、制备与GPF标记

HUMNCs的体外分离、纯化和培养参照6%HES法[6]。脐血来自中南大学湘雅医院产科、身体健康、足月分娩 (37~42周) 产妇, 取传2代细胞为移植细胞。将HUMNCs按5×104个每孔接入24孔板, 加入含10%胎牛血清的RPMI 1640液为培养液培养12 h。将GFP慢病毒载体与无血清的RPMI 1640液混合后分别加入每孔细胞中培养24 h, 再在每孔中加入1 m L含10%胎牛血清的RPMI 1640液, 继续培养48 h。在荧光显微镜下计数绿色荧光细胞, 计算转染效率, 移植前调终浓度至3×107细胞/500μL备用。

1.4 动物模型制作与实验分组

对60只家兔结扎冠状动脉左前降支, 制备AMI模型[6]。建模成功者60只随机分为4组, 每组15只。对照组:生理盐水2 m L灌胃, 建模术后24 h生理盐水0.5 m L耳缘静脉注射;阿托伐他汀组:阿托伐他汀5 mg/ (kg·d) 溶入生理盐水2 m L灌胃4周, 同时间点、同途径注射生理盐水0.5 m L;细胞移植组:生理盐水2 m L灌胃4周, 同时间点、同途径注入含3×107GFP标记人脐血单个核细胞生理盐水0.5 m L;联合治疗组:同时间点、同途径注入含3×107GFP标记人脐血单个核细胞生理盐水0.5 m L, 阿托伐他汀5 mg/ (kg·d) 溶入生理盐水2 m L灌胃4周。

1.5 超声心动图检测

分别于移植后1、2和4周用配备7.5 MHz心脏超声探头Ve Vo770型高分辨率小动物超声仪测心功能。在大鼠胸骨旁以二维超声和M型超声行功能检测。测量指标为左室短轴缩短率 (LVFS) 、左室射血分数 (LVEF) , 取3次测量平均值。

1.6 病理学与免疫组织化学检测

移植后1、2和4周每组随机处死5只家兔。取左室心肌梗死部位及其周边区域沿长轴切成4段, 10%甲醛溶液固定, 脱水, 石蜡包埋, 5μm连续切片, 每3连续切片分别取一张, 进行免疫组织化学和荧光显微镜检测。抗VEGF免疫组织化学阳性细胞胞质呈红褐色, 每组每个时间点取6张片, 每切片随机选取10个高倍视野 (×400) , Image Pro Plus图像分析系统测VEGF免疫组织化学染色的平均吸光度值。抗VⅢ因子免疫组织化学血管内皮阳性细胞胞浆呈红色, 每切片随机取5个400倍视野, 计算每个视野内毛细血管的数目, 取平均值即为毛细血管密度。

取上述制备第1、2和4周石蜡切片脱蜡、蒸馏水冲洗后, 荧光显微镜高倍视野 (×400) 观察GFP阳性细胞。每切片随机选取10个高倍视野, 取其均数为GFP阳性细胞数量。

1.7 统计学方法

所有数据采用SPSS 17.0统计软件包处理, 数据用均数±标准差 (±s) 表示, 多样本均数比较采用方差分析, 两组比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析

急性心梗模型制备成功的健康纯种中国家兔60只, 全部完成整个实验过程。

2.2 观察GFP慢病毒转染HUCBMCs效应

普通光镜下HUCBMCs呈长梭形、无色透明, GFP慢病毒转染后荧光显微镜下GFP转染阳性细胞呈发绿色荧光的长梭形, GFP转染效率为 (90±3) %。见图1。

2.3 各组超声心功能比较

由表1可见, 与对照组比较, 阿托伐他汀组、细胞移植组及联合治疗组于移植后1、2和4周心功能均有改善, LVFS和LVEF均有增加。细胞移植组较阿托伐他汀组心功能改善明显, 联合治疗组较其他两组改善更加明显。各治疗组不同时间点比较, 心功能指标LVEF和LVFS有好转趋势, 但差异无统计学意义。

2.4 各组心肌免疫组织化学检测VEGF蛋白的表达比较

由图2和表2可见, 治疗后第1、2和4周对照组心肌组织可见少量表达VEGF蛋白表达;阿托伐他汀组、细胞移植组及联合治疗组心肌梗死区域与周边组织均有VEGF蛋白表达阳性细胞, 与对照组比较, VEGF蛋白表达阳性细胞数量均显著增多 (P<0.05) ;与阿托伐他汀组、细胞移植组相比, 联合治疗组VEGF蛋白表达阳性细胞数量增多更显著 (P<0.05) ;且细胞移植组VEGF蛋白表达阳性心肌细胞数量多于阿托伐他汀组 (P<0.05) 。治疗后第2和4周VEGF蛋白表达阳性心肌细胞数量有增多趋势, 但各治疗组不同时间点比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与阿托伐他汀组比较, P<0.05;3) 与移植组比较, P<0.05

注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与阿托伐他汀组比较, P<0.05;3) 与移植组比较, P<0.05

2.5 各组v WF免疫组织化学染色及心肌组织毛细血管密度

由图3和表3可见, 治疗后第1、2和4周, 对照组心肌组织均可见少量新生血管生成, 第4周血管数量多于第1和2周 (P<0.05) , 第2和4周间比较差异无统计学意义。与对照组比较, 阿托伐他汀组、细胞移植组及联合治疗组第1、2和4周心肌组织毛细血管密度均显著升高 (P<0.05) ;联合治疗组与阿托伐他汀组、细胞移植组比较心肌组织毛细血管密度更明显增加 (P<0.05) ;且细胞移植组毛细血管密度多于阿托伐他汀组 (P<0.05) 。治疗后第2和4周毛细血管密度数量有增多趋势, 但各治疗组不同时间点比较差异无统计学意义。

2.6 各组心肌组织内GFP阳性细胞比较

对照组与阿托伐他汀组各时间点均未见GFP阳性细胞。细胞移植组及联合治疗组治疗后第1、2和4周荧光显微镜下心肌梗死区域与周边组织无数可观察散在分布的GFP阳性细胞。由图4和表4可见, 与细胞移植组比较, 联合治疗组GFP阳性细胞数量明显增多 (P<0.05) , 两组不同时间点组内比较差异无统计学意义。

注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与阿托伐他汀组比较, P<0.05;3) 与移植组比较, P<0.05

注:覮与细胞移植组比较, P<0.05

3 讨论

包括笔者在内的国内外研究[6,7,8]显示, 移植细胞在急性梗死心肌内存活率低、增殖分化能力有限是目前干细胞移植治疗急性心肌梗死疗效有限的主要原因。大多数细胞移植后4 d内在急性心肌梗死心肌组织内发生细胞凋亡[9];还有研究证实, 即使心肌内注射自身同基因的骨髓干细胞, 72 h后心肌组织内仅有5.0%移植细胞存活[10]。分析其原因主要是心肌梗死后继发炎症反应、低氧状态和营养物质的缺乏等恶劣微环境下导致的细胞凋亡[7,8,9,10], 从而严重制约干细胞移植治疗心肌梗死近、远期疗效。

近年来, 他汀类药物已公认为是治疗冠心病心肌梗死基础药物之一, 除了他汀类药物有调脂作用、稳定冠状动脉斑块外, 还通过其他多效性机制改善梗死区心肌微环境, 其多效性主要机制如下: (1) 降低促炎症因子和炎症趋化因子表达, 拮抗局部炎症反应[5]; (2) 上调VEGF表达, 促进毛细血管再生[11]; (3) 降低梗死区局灶组织氧化应激反应[5]; (4) 改善内皮功能[5,11]; (5) 调节内皮祖细胞迀移和分化能力[11]。

近期国内杨跃进等[5]研究证实阿托伐他汀联合骨髓间充质干细胞心肌内移植治疗急性心肌梗死疗效增强, 其机制主要是两者联合增强抗炎、抗氧化应激作用, 促进血管新生, 从而协同改善梗死区心肌微环境, 提高组织内定植的骨髓间充质干细胞存活率。

既往已有实验研究[12,13]证实经静脉途经移植HUCBMCs治疗急性心肌梗死疗效。多数研究结果显示移植细胞可归巢于心肌梗死区域, 并能存活;移植细胞在心肌组织可发挥抗炎效应、促进组织内血管再生, 改善梗死区心肌微环境, 从而发挥对缺血损伤心肌细胞保护作用。且移植细胞可分化为心肌细胞, 参与梗死后心功能的恢复。

本研究结果显示阿托伐他汀或静脉移植HUCBMCs治疗急性心肌梗死, 心肌梗死区及其周边区域心肌组织内VEGF蛋白表达和毛细血管密度增加, 同时伴有心功能改善, 进一步证实本研究及其他国内外近期研究的结论, 证实他汀类或静脉移植HUCBMCs治疗急性心肌梗死, 上调心肌组织VEGF表达, 促进毛细血管再生是心功能改善的主要机制之一。更重要的是本研究结果显示, 与单纯阿托伐他汀或静脉移植HUCBMCs治疗比较, 静脉移植HUCBMCs联合阿托伐他汀治疗急性心肌梗死, 心肌梗死区及其周边区域心肌组织内VEGF蛋白表达和毛细血管密度进一步增加, 且心肌组织GFP标记阳性细胞数增多, 超声心功能指标改善。本研究结果提示HUCBMCs静脉移植联合阿托伐他汀治疗急性心肌梗死, 能增加移植细胞在急性心肌梗死区域存活率, 并进一步改善心功能, 其机制可能与联合治疗促进组织内血管再生, 改善梗死区心肌微环境有关。

本研究尚有以下缺陷:未对心肌内移植细胞是否分化为心肌细胞进行定性检测;未对心肌组织RAS系统活性进行分析;观察时间有限, 没有明确脐血细胞静脉移植治疗心肌梗死的远期疗效。这有待于进一步研究和探讨。

本实验证实HUCBMCs静脉移植联合阿托伐他汀治疗急性心肌梗死, 促进组织内血管再生, 增加移植细胞在急性心肌梗死区域存活率, 并进一步改善心功能。本研究是对提高干细胞移植治疗急性心肌梗死疗效方法学的新探索, 力求改善目前干细胞移植治疗心肌梗死疗效有限的困惑状况, 其结果对临床干细胞移植治疗急性心肌梗死推广应用具有指导意义。

摘要：目的 探讨人脐血单个核细胞 (HUCBMCs) 静脉移植联合阿托伐他汀对急性心肌梗死 (AMI) 模型兔心肌组织血管再生的影响。方法 中国家兔AMI模型60只随机分4组, 每组15只。对照组:术后24 h生理盐水0.5 m L静脉注射 (静注) , 生理盐水灌胃4周;阿托伐他汀组:同时间静注生理盐水0.5 m L, 阿托伐他汀5mg/ (kg·d) 溶入生理盐水灌胃4周;细胞移植组:同时间静注含3×107GFP标记HUCBMCs生理盐水0.5 m L, 生理盐水2 m L灌胃4周;联合治疗组:同时间静注含3×107GFP标记HUCBMCs生理盐水0.5 m L, 阿托伐他汀5 mg/ (kg·d) 溶入生理盐水2 m L灌胃4周。移植后分别超声检测左室短轴缩短率 (LVFS) 、左室射血分数 (LVEF) ;荧光显微镜检测GFP阳性细胞;免疫组织化学检测抗第VⅢ因子染色检测毛细血管密度、血管内皮生长因子 (VEGF) 。结果 1与对照组、阿托伐他汀组治疗后比较, 细胞移植组与联合治疗组LVFS、LVEF改善, 联合治疗组改善更加显著;2移植4周后, 细胞移植组及联合治疗组梗死区周边可见GFP阳性细胞, 后组GFP阳性细胞数量计数多于前组;3与对照组、阿托伐他汀组治疗后比较, 移植组及联合治疗组VEGF表达增加, 毛细血管密度增加, 后组增加幅度显著。结论 HUCBMCs静脉移植联合阿托伐他汀治疗AMI, 提高移植细胞在心肌组织内存活率, 进一步改善心功能, 心肌梗死组织内血管再生增强可能是其联合治疗AMI疗效改善的主要机制之一。

人心肌细胞 第2篇

1 材料与方法

1.1 人脐血单个核细胞提取与制备

脐血来自中南大学湘雅医院产科身体健康足月分娩(37~42周)产妇。无菌条件采脐血,一次性血袋取血80~120 mL,4~8 h内分离。5∶1比例加入6.0%羟乙基淀粉,800 r/min离心10 min去除红细胞,细胞悬液按1∶2体积比加Ficoll淋巴细胞分离液,2000 r/min离心20 min,取中间白膜层及白膜上层细胞,PBS洗涤2次,接种于细胞培养瓶中,培养液为含10%胎牛血清DMEM(GICBO公司),37℃饱和湿度CO2孵箱培养。48 h后更换培养液,弃去悬浮细胞,保留贴壁生长细胞,每7天更换培养液1次,细胞汇合度到80%消化传代,取传2代细胞为移植细胞。并行流式细胞仪SSC/CD34设门,检测CD34阳性细胞率。移植前24 h加Brd U(Sigma公司)10μmol/L标记,移植前调终浓度至2107细胞/50μL备用。

1.2 动物模型的制作和人脐血单个核细胞移植

健康纯种中国家兔45只购自中南大学实验动物学部,雌雄不拘,兔龄4~5个月,体重1.5~2.0kg。随机分为3组:移植组15只;对照组15只;假手术组15只。3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉麻醉,胸骨左旁剪断第3、4肋骨,暴露心脏,5-0手术缝线结扎左前降支,假手术组左前降支下穿线不结扎。心肌梗死模型成功标志为左室前壁颜色变白,活动减弱和心电图V1、V2、V3等导联ST段弓背样抬高。移植组术后24 h经耳缘静脉注入0.5 m L人脐血单个核细胞悬液(2107细胞),对照组与假手术组术后24 h经耳缘静脉注入生理盐水0.5 m L。

1.3 超声心动图检测

分别于移植后1、2和4周超声心动图仪(HP-5500)测心功能,超声探头(7.5 MHz)在家兔胸骨旁以二维超声和M型超声行功能检测,测量指标为左室短轴缩短率(LVFS)、左室射血分数(LVEF),取3次测量平均值。

1.4 病理学与免疫组织化学检测

术后1、2和4周,各组随机选取家兔5只处死,取心脏,心室沿长轴切成4段,10%福尔马林固定,脱水,石蜡包埋,3μm连续切片,行Brd U免疫组织化学检测。术后4周心脏石蜡切片脱蜡,蒸馏水冲洗。按Abcam公司免疫组织化学试剂盒(天津灏洋)操作程序进行。第1次第一抗体为ab1973兔抗Brd U单抗,第2次第一抗体为Poly peroxidase-anti-mouse/rabbit Lg G或通用型二抗(羊抗鼠),DAB染色,苏木精复染。

1.5 ELISA检测血清MMP-9浓度

取出分别于移植术后1、2和4周处死的家兔心脏,用注射器在左心室处抽出血液2 mL,置于含有2%EDTA-Na抗凝的试管中,摇匀,立即在4℃下以1 000 r/min离心10 min,收集血浆于EP管中。严格按照兔金属基质蛋白酶-9酶联检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)说明,建立标准曲线,用酶标仪在492 nm处测吸光(OD)值检测MMP-9的浓度。

1.6 RT-PCR检测心肌组织MMP-9mRNA表达水平

主要试剂及仪器如下:Trizol、5XRT Buffer、d NTPs、Taq酶、引物、DG-III双稳数显电泳仪等来自鼎国生物公司,逆转录酶购自东洋纺公司。主要实验步骤如下:①RNA提取。取100 mg分别于移植术后1、2和4周处死的家兔心肌梗死周边组织,Trizol抽提组织总核糖核酸(RNA)。②荧光定量PCR体系。反应体系组成如下:c DNA 2μL,10PCR Buffer 2.5μL,d NTPs(10 m M)0.5μL,primerf(20pmol/μL)0.25μL,primer(20 pmol/μL)0.25μL,Taq酶(2u/μL)0.5μL,Sybr Green I(10)1μL,dd H2O18μL。③逆转录多聚酶链反应半定量分析心肌TNF-αm RNA表达水平。β-actin引物序列:F5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3',R5'-CATCTCTT GCTCGAAGTCCA-3'。MMP-9引物:F5'-ACAGCC AACTATGACCAG-3',R5'-TGCCACCAGGAACAGG-3'。PCR循环参数:①94℃预变性2 min,②94℃变性30 s,(3)63℃退火30 s,(4)72℃延伸30 s,①、③、④共35个循环。监测每个循环的荧光强度,取CT值分析得出MMP-9 m RNA相对值。取10μL RT-PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,β-actin产物大小318bp,TNF-α产物大小249 bp。

1.7 M asson法染色检测胶原蛋白变化

中性甲醛液固定组织,石蜡切片,取4周梗死周边区的切片常规脱蜡至水Masson复合染色液5min,0.2%醋酸水溶液稍洗,5%磷钨酸5~10 min,0.2%醋酸水溶液浸洗2次,再浸泡亮绿染色液5min,0.2%醋酸水洗2次,最后无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,显微镜下观察心肌内胶原纤维染为蓝色。

1.8 统计学处理

所有数据采用SPSS 10.0统计软件包处理,所有测定值用均数±标准差表示,多样本均数比较采用方差分析,多样本均数的多重比较用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脐血单个核细胞形态学观察及鉴定

原代分离脐血单个核细胞经过6 h体外培养后即可见少量细胞贴壁,自后,原代培养的细胞主要呈现两种形态并呈克隆样生长,一类细胞为长梭形,呈纤维母细胞样,克隆呈巢状或漩涡状;另一类细胞呈多边形或类圆形,克隆呈“铺路石”样外观(见图1)。传代至次代细胞时,长梭形,呈纤维母细胞样细胞明显增多,而呈多边形或类圆形的细胞逐渐减少(见图2)。次代细胞移植前,梯度离心法获取脐血单个核细胞。台盼蓝拒染结果活细胞百分率为(96±2)%,流式细胞术检测脐血单个核细胞CD34阳性率为(1.5±0.2)%。

2.2 各组超声心功能比较

表1显示,与假手术组比较,移植组和对照组术后1、2和4周心功能指标LVFS、LVEF均明显降低;与对照组比较,移植组术后1、2和4周LVFS、LVEF均有明显改善,而移植组术后1、2和4周之间相互比较,LVFS和LVEF差异均无统计学意义。

2.3 心肌免疫组织化学检测

Brd U免疫组织化学染色显示,术后4周仅在移植组见细胞核染色,呈黄褐色的Brd U阳性细胞散在分布于梗死周边区域(图3)。

2.4 血清MMP-9的ELISA检测结果

各组血浆MMP-9浓度比较见表2。与假手术组比较,对照组和移植组各时间点血浆MMP-9浓度显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与对照组比较,移植组各时间点血浆MMP-9浓度显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.5 PCR检测各时间点心肌组织MMP-9 mRNA结果

表3和图4显示,与假手术组比较,移植组和对照组各时间点心肌组织MMP-9 m RNA水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);与对照组比较,移植组同期心肌组织MMP-9 m RNA水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.6 心肌胶原蛋白M asson染色

注:1)与假手术组比较,P<0.05;2)与对照组比较,P<0.05

A移植组,箭头处见Brd U阳性细胞;B对照组

注:1)与假手术组比较,P<0.01;2)与对照组比较,P<0.01

注:1)与假手术组比较,P<0.01;2)与对照组比较,P<0.01

1:假手术组术后1周;2:对照组术后1周;3:移植组术后1周;4:假手术组术后2周;5:对照组术后2周;6:移植组术后2周;7:假手术组术后4周;8:对照组术后4周;9:移植组术后4周。β-actin产物大小318 bp,TNF-α产物大小249 bp

心肌内胶原纤维在显微镜下为蓝色线条,假手术组(图5A)胶原蛋白分布均一,呈条索状纤维包绕在每个心肌外;对照组(图5B)胶原剧增,排列紊乱,横切面上呈现弥散分布的粗条束状或斑片状,心肌细胞失去有序的排列结构;移植组(图5C)胶原沉积和胶原纤维较假手术组明显增多,但胶原纤维基本处于有序状态。

3 讨论

笔者的研究是在急性心梗模型建立后24 h,经耳缘静脉移植Brd U标记的脐血单个核细胞,结果证实心肌梗死周边区域有Brd U阳性细胞定植、存活,并显著抑制心梗后心肌胶原重构,减低心肌纤维化,伴有心功能改善。笔者研究的结果为细胞移植防治心梗后心力衰竭提供了实验依据。

笔者的研究结果显示,与对照组比较,移植组心肌组织胶原沉积,胶原纤维明显减少,且胶原纤维基本处于有序状态,同时,移植组血浆基质金属蛋白酶MMP-9水平和心肌组织MMP-9 m RNA表达水平均显著降低,结果提示,脐血单个核细胞静脉移植对心梗后心肌胶原重构治疗疗效与基质金属蛋白酶MMP-9抑制相关。

有研究证实[5]心梗后心室重构不仅表现为心肌细胞的凋亡、坏死、肥大,还表现为心肌间质纤维胶原合成和降解之间动态平衡的破坏。胶原纤维作为一种组织结构蛋白,在心肌内组成的胶原网对心脏的功能有重要影响:①为心肌细胞、血管和淋巴管的相互联系和排列提供支持;②防止肌纤维和心肌细胞滑脱;③将心肌细胞产生的压力传导至心室腔;④防止心肌细胞过度延长;⑤提供心肌舒张时的阻力。当胶原蓄积量超过20%时,心肌细胞被胶原隔离过度,被“封闭”的心肌细胞收缩力的产生和电传递均受到障碍,从而损害心室舒张功能和收缩功能,导致心脏射血分数和排出量降低[6]。胶原增生还可引起小血管狭窄、堵塞,使心肌供血遭到破坏,更进一步加重心肌功能障碍[7]。由此,抗心肌胶原重构对改善心梗后心功能有重要的意义。

MMP-9是已发现的MMPs中分子量最大的锌离子依赖性的内源性蛋白水解酶,其前体可由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞及血管平滑肌细胞等分泌[8]。MMP-9可降解基底膜和细胞外基质的多数蛋白质,在心梗后胶原重构的过程中发挥了关键性作用[8]。已有研究证明心肌梗死后MMP-9的活性升高,使胶原纤维合成和降解失衡,细胞外基质重构和进行性心室扩张[9]。ETOH[10]等发现猪心肌梗死模型缺血心肌间质中MMP-9的活性增高;在MMP-9基因敲除的转基因鼠模型,心肌梗死后左室扩大及心衰可明显阻抑[11]。故抑制心肌梗死后MMP-9的表达已成为治疗心梗后心室重构的一个靶点。

人心肌细胞 第3篇

1 材料与方法

1.1 实验动物

(200±20) g清洁级Wistar雄性大鼠, 出生1~3 d Wistar大鼠乳鼠 (中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心, 动物许可证号:scxk2005-0001) 。

1.2 主要仪器与试剂

5%二氧化碳 (CO2) 恒温培养箱 (Thermo) ;倒置相差显微镜 (XD-101 98010) ;立式自动电热压力蒸汽灭菌器 (LDZX-40BI) , 购自上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台;血球记数板 (上海市沪江医疗器材经营部) ;离心机 (LDZ5-2) ;i Q5荧光定量PCR仪 (美国BIO-RAD公司) ;transwell小室 (0.4μm, 美国Corning公司) 。DMEM/F12培养液 (美国GIBCO公司) ;特级胎牛血清 (FBS, 美国Hyclone公司) ;胰蛋白酶 (1︰250, 美国Hyclone公司) ;双抗 (青霉素和链霉素, 美国Hyclone公司) ;实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, QPCR) 试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 大鼠BMSCs的分离培养

采取全骨髓贴壁培养法:将颈椎脱臼处死的雄性Wistar大鼠于75%乙醇浸泡, 在无菌条件下将其双侧股骨、胫骨取出, D-Hank's液冲洗骨腔, 用100目筛网过滤骨髓, 以 (0.3~2.0) ×106个/L的密度接种于完全培养液 (L-DMEM含10%胎牛血清、100 mg/L双抗) 中, 置于细胞培养箱中孵育, 1 d后换液并去除悬浮细胞, 之后隔天换液。

1.3.2 大鼠乳鼠CMs的分离培养

采取组织块酶消化法:将新生3 d的大鼠乳鼠于75%酒精中浸泡, 无菌条件下将其心脏取出, 于4℃预冷的D-Hank's液中漂洗3、4次, 剪成1 mm3左右大小的组织块, 加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液, 于37℃恒温震荡箱中消化5 min, 吸去上清液。于沉淀中加入混合消化液6 ml (0.0625%胰蛋白酶:0.1%Ⅱ型胶原酶=1︰1) , 继续消化20 min, 加入含10%胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液到上清液中终止消化。重复上述消化过程直至组织块基本消化完毕。之后收集各次上清液, 过滤去除残留组织块, 采用差速贴壁分离法去除心肌成纤维细胞及未贴壁的心肌细胞, 接种于培养板中。培养前3 d加入0.1 mmol/L Brd U抑制成纤维细胞生长。2 d后换液, 之后隔天换液。

1.3.3 BMSCs与CMs共培养

将第二代BMSCs和CMs消化下来, 将BMSCs以2×104/cm2密度接种到六孔板中, 将心肌细胞接种于transwell小室中, 并将小室放于细胞板中, 本实验按照BMSCs与心肌细胞1︰1、1︰2、1︰4、1︰5、1︰10分为5组 (以1︰1组为对照组) , 用含有10%血清的DF12培养液共培养14 d, 在此期间, 每隔一天换液一次。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测c Tn T的表达

采用试剂盒法, 将目的基因和内参对照基因的引物 (见表1) 加入反应体系, 依照QPCR的说明书加入试剂、设定条件, 进行目的基因的扩增过程。

1.4 统计学方法

数据采用2-ΔΔCT相对定量法分析。ΔCT值=该组目的基因的平均CT值-该组内参基因的平均CT值;ΔΔCT值=各组ΔCT值-对照组ΔCT。采用SPSS 16.0软件包进行分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

共培养14 d, 经过PCR检测各组均有c Tn T表达, 且组间表达量差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2、图1。

通过表2和图1可知, 与1︰1组相比各组的c Tn T均有一定的表达, 且差异有统计学意义。其中, 1︰10组表达率均高于其他组 (P<0.05) , 即c Tn T的含量较其他组均高, 此比例对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞最为明显。故得出结论:在BMSCs与CMs共培养体系中, 1︰10是BMSCs向心肌样细胞分化的最佳比例。

3 讨论

近年来, 心肌梗死、心肌病、终末期心力衰竭等心血管疾病发病率居高不下, 严重地威胁人类健康, 其根本原因是CMs为终末分化细胞, 坏死后无法再生, 造成功能性心肌细胞减少, 以至发生顽固性心力衰竭乃至死亡。传统的治疗方法难以从根本上解决心肌细胞再生问题。BMSCs以强大的自我更新能力和分化潜能成为多系统疾病细胞替代治疗研究的热点, 为进行细胞移植治疗心肌梗死疾病开辟全新的治疗策略。在以往的实验中, 无论是单纯的药物刺激还是体内移植, 都具有其各自的局限性, 限制了研究的进展。为避免其局限性, 本实验采用BMSCs与CMs共培养方法, 此法也是最近的研究者们模拟体内微环境的主要方法[15,16]。

人心肌细胞 第4篇

心肌肽素, 是从乳猪心脏中提取出的小分子多肽, 为国家I类新药, 具有心肌保护和心肌细胞损伤修复的作用, 其在临床上多用于围手术期的心肌保护, 适用于心脏外科直视手术、急慢性心肌炎、心肌病以及其他种类的心肌损害的治疗[1]。近期的研究表明, 心肌肽素对缺血及再灌注的心肌及神经元有明显的保护作用[25]。临床上所见的创伤性休克、外科手术、烧伤、冻伤及血液循环障碍如高血压等都会出现组织器官的缺血再灌注损伤。目前认为, 缺血再灌注损伤主要是由组织中产生的活性氧自由基引起的, 这在很多的实验中得以证实[610]。使用心肌肽素预处理原代乳鼠心肌细胞, 观察其对过氧化氢作用后心肌细胞是否具有保护作用, 并探讨其机制。

1材料和方法

1.1实验材料

心肌肽素购自中国人民解放军第四五八医院, 其中多肽含量为10mg/mL;1d龄SD乳鼠, 购自第四军医大学实验动物中心;胎牛血清购自杭州四季青生物技术工程中心;I型胶原酶、DMEM培养基购自GIBCO公司;过氧化氢、MTT购自Sigma公司;MML-V逆转录酶、TaqDNA聚合酶等RT-PCR耗材购自Promage公司;SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所;引物为上海生物工程公司合成;其余试剂为国产分析纯。

1.2实验方法

1.2.1原代乳鼠心肌细胞培养

取出生1d龄SD乳鼠, 分别在两个盛放有75%酒精中浸泡10s后取出, 使用无菌眼科剪沿胸骨左缘剪开肋骨, 取出心脏后迅速放入PBS中冲洗, 去除心房及大血管, 洗干净残留血液。之后将心肌组织用眼科剪剪碎移入10mL无菌离心管中, 加入胶原酶进行消化, 37℃水浴, 共消化4次, 每次消化6min, 之后将上清用含血清培养基终止消化。离心后使用10%胎牛血清重悬, 二氧化碳培养箱中差速贴壁1h, 之后吸取上清心肌细胞接种到培养板中, 调整心肌细胞密度至5105/mL, 每24h换液一次。

1.2.2实验分组

原代乳鼠心肌细胞接种后分为以下组别:1) 对照组;2) 过氧化氢组;3) 过氧化氢+10mg/L心肌肽素组;4) 过氧化氢+100mg/L心肌肽素组;5) 过氧化氢+1 000mg/L心肌肽素组。心肌细胞用0.5%血清培养基中加入不同浓度的心肌肽素作用24h后添加200μmol/L过氧化氢孵育2h后进行检测。

1.2.3心肌细胞活力测定 (MTT比色法)

将培养中的96孔板心肌细胞经过药物预处理后, 每个组设置4个复孔, 每孔加入20μLMTT, 在二氧化碳培养箱中放置4h后吸弃培养基, 加入二甲亚砜100μL, 震荡10min后测定吸光度并将复孔取平均值计算平均吸光度 (平均OD值) 。

1.2.4心肌细胞超氧化物歧化酶测定

将培养的24孔板心肌细胞, 参照试剂盒说明书, 对超氧化物歧化酶 (SOD) 采用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶法测定活性。

1.2.5 RT-PCR检测Caspase-3mRNA表达水平

按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA。引物设计引用文献[11]中的设计 (表1) , 逆转录后使用琼脂糖凝胶电泳进行分离检测。

2统计学处理

数据以均数±标准差来表示, 应用SPSS软件进行统计学分析, 各组资料进行单因素方差分析及LSD-t检验进行统计学处理, p<0.05为有统计学差异。

3结果

3.1 MTT吸光度 (OD值)

使用MTT法可以间接检测出各孔心肌细胞的活力。如图1所示, 过氧化氢组OD值低于对照组, 表明该组心肌细胞活力明显降低 (p<0.05) 。使用心肌肽素进行干预后心肌细胞活力较过氧化氢组升高, 但是经过统计学检验各浓度心肌肽素组之间无统计学意义 (p>0.05) , 见图1。

3.2 心肌肽素对细胞内SOD活性的影响

与对照组相比, 过氧化氢组SOD活性明显降低, 使用心肌肽素进行干预后, SOD活性有所上升 (*p <0.05) , 各浓度心肌肽素组之间无统计学意义 (p >0.05) , 见图2。

3.3 Caspase-3 mRNA表达水平

分别进行3次RT-PCR, 取3次Caspase-3与Beta-actin吸光度的比值结果进行统计学分析, 结果显示过氧化氢组Caspase-3 mRNA水平明显增加, 高于对照组和心肌肽素组, 心肌肽素组之间无明显差异, 见图3。

4 讨论

自由基的活性极高, 可以与细胞膜、线粒体膜中的不饱和脂肪酸反应造成脂质过氧化, 在机体生理状态下, 自由基可以被SOD等清除。而在心肌缺血再灌注、高血压等病变中, 自由基大量产生, 造成大量的脂质过氧化, 而脂质过氧化产物又可以进一步分解成为更多的自由基, 引起瀑布效应, 损伤细胞膜甚至造成细胞的死亡。过氧化氢是体内的代谢产物, 由于其性质活泼, 且具有自由基的氧化特征, 因此可以用来模拟多种心脏疾病的病理状态[12]。实验使用心肌肽素孵育细胞24 h后过氧化氢刺激心肌细胞, 对心肌细胞进行氧化损伤, 结果显示, 与对照组相比, 心肌细胞存活率以及SOD在过氧化氢组明显下降, 而事先使用心肌肽素干预后, 心肌细胞存活率及SOD有水平下降并不明显, 这表明心肌肽素具有抵抗过氧化氢造成的心肌细胞损伤的作用。

另外, 还发现过氧化氢组Caspase-3 mRNA表达水平明显增加。Caspase-3广泛分布于人体各种细胞中, 其在凋亡中处于中心环节, 一旦被激活, 即可启动凋亡。实验并未检测被激活的Caspase-3蛋白表达水平, 而且Caspase-3 mRNA的水平增高, 并不意味着具有促进凋亡活性的Caspase-3的水平的增高, 因为Caspase-3在正常细胞中大量存在, 在未受到刺激的时候以无活性的酶原形式存在。但是Caspase-3转录水平的增高加大了具有活性的Caspase-3的前体的基数, 一旦Caspase-3 被激活, 其在数量方面较对照组来说也是客观的。还证明了在过氧化氢的作用下, Caspase-3 mRNA表达量增加的过程中, 其活性片段Caspase-3 P20水平也增加, 从而导致了其酶活性的增高[13]。

综上所述, 实验证明了心肌肽素具有减轻过氧化氢造成心肌细胞损伤的作用, 该作用与提高心肌细胞SOD水平及降低Caspase-3mRNA水平有关, 这可能是其保护心肌的机制之一。

干细胞心肌修复的研究进展 第5篇

1 转基因骨骼肌成肌细胞

第一种被认为可用于心肌再生的干细胞是自体骨骼肌成肌细胞,它的许多独特优点使它成为首选[1]。然而有研究表明,骨骼肌成肌细胞最终分化为骨骼肌细胞而不是心肌细胞[2],且MAGIC试验[3]表明,骨骼肌成肌细胞并不能改善心功能。同时,骨骼肌成肌细胞由于缺乏某些蛋白质而不具有电-机械偶联特性,易致室性心律失常,且在心肌修复过程中会大量凋亡,在缺血心肌部位存活率较低,因此现在已不是研究热点。

2 骨髓来源干细胞

骨髓来源单核干细胞(BMMNCs)是应用最多的干细胞。它是干细胞的一大类,包括造血干细胞、内皮祖细胞和间充质干细胞。Orlic等[4]研究发现,Lin-/cKit+表型的BMMNCs可分化为心肌细胞和血管结构,且可以修复心肌梗死后坏死的心肌。对BMMNCs的确切机制仍不明确,目前解释主要包括:旁分泌作用、直接分化作用和激活体内心肌干细胞。尽管有部分研究结果存在异议,但大多数研究结果已证实BMMNCs对心肌梗死后心功能恢复有效。

有研究发现,miRNA过度表达可诱导体细胞向不同方向分化。若该基因被抑制,BMMNCs治疗作用和存活率都会提高[5],且BMMNCs可介导旁分泌作用,释放IGF-1,抑制miRNA-34a凋亡基因的表达,而发挥心脏保护作用[6]。

3 间充质干细胞(MSCs)

MSCs又叫多潜能干细胞,是BMMNCs的一种,来源于人体结缔组织,具有多能性,可分化为心肌细胞,还具有较强的内分泌功能,分泌的生长因子可促进心肌自我修复。自体MSCs定向分化潜能较低,有研究发现[7],上调某些心脏特定转录因子的表达,不仅保证MSCs获得心肌细胞表型,还能保留自身增殖能力。结果显示,LVEF比基础值提高17%,试验前后左室容积缩小而6 min步行距离增加。而在试验中未发现MSCs的明显缺陷[8]。

MSCs缺点是其移植后存活率较低。通过体外基因修饰,即过度表达抗凋亡基因的方式,可增强移植细胞生存能力。动物实验发现,定向编码MSCs的某些基因,如热休克蛋白27(Hsp27)、microRNA-1、蛋白激酶1型α等,可提高其存活率;而胸腺素β4则可帮助MSCs抵御低氧环境,增加其留存率[9]。

4 心脏干细胞(CSCs)

Beltrami等[10]在心肌梗死后病人心肌中发现有丝分裂和CSCs。它表面存在C-Kit+,使其可向心肌细胞分化。Ellison等[11]研究证实,这些在心肌损伤后新生成的细胞是C-Kit+表型CSCs的后代。van Berlo等[12]指出CSCs生成心肌细胞能力有限,并且活体提取分离和扩增CSCs不可行。移植的CSCs在梗死区缺氧环境下存活率低,分化率不高。Mohsin等[13]用基因技术把促存活基因—Pim1激酶加入人CSCs中,使这些干细胞表现出更优异的移植和分化性能,具有更好的修复功能,且不具有致瘤性。

避免CSCs在缺氧环境下凋亡的另一种方法是预先用药理学方法对干细胞进行预处理。如,用原卟啉钴处理的CSCs可上调血红素氧合酶-1和抗凋亡基因(Bcl-2/Bcl-2A1/MCL-1)的表达,增加NRF2磷酸化以减少凋亡。移植CSCs前预先在双氧水中浸泡2 h,可促进缺血再灌注损伤后围梗死区血管增生[14]。有研究还发现,若控制缺血心肌FGF释放,不仅可增加CSCs移植成活率和转化率,还可提高心功能[15]。

5 同种异体干细胞

同种异体干细胞疗法较多优势:①使用方便,预先培养好后,随取随用,特别是经皮冠状动脉介入治疗病人,不需要取自身组织培养,以免延误病情;②获取简单,只需从健康的青年志愿者身上提取,可有效避免老弱病残病人干细胞不合格所致的病情延误。

MSC表面缺乏HLAⅡ,可通过直接与T细胞接触并分泌抗炎因子来阻止排异反应[16]。Hare等[17]率先通过人体试验证明异体MSC移植安全可靠,在试验中发现,心肌梗死面积越大,MSC移植获得的收益就越大。通过对比自体和异体MSC的疗效[18]发现,两者均可缩小梗死心肌面积。

间充质干细胞前体细胞(MPCs)是源自骨髓干细胞的一个未成熟亚群,表面有Stro3+标记,它是多能细胞,具有比MSCs更强的增殖、分化和旁分泌作用,和异体MSC一样具有免疫特异性,可用于心肌再生。Penn等[19]从骨髓来源干细胞中分离出一种新的干细胞—多能干细胞(Multi Stem),并用于人体试验,结果发现,该细胞安全可靠有效。

6 其他来源干细胞

胚胎干细胞(ESCs)是多能干细胞,可分化为功能心肌细胞,并提高左心室功能。ESC使用的问题主要是免疫排斥反应和致瘤性。同时,伦理问题也制约其广泛应用。Takahashi等[20]发现诱导多能干细胞,即i PSCs,它与ESCs具有相似的免疫表型,解决了异体ESC移植的排异问题,但无法避免致瘤性。诱导体细胞重新编程转化成i PSCs效率低,方法复杂,步骤繁琐,不适合临床大规模推广应用。

脂肪来源干细胞(ADSCs)来自人体脂肪组织,可分化为包括心肌细胞和血管内皮细胞在内的多种体细胞[21]。它与其他类型干细胞相比有两大优点:①方便易得,可反复操作,一般通过微创方法可从人体获得大量脂肪组织;②体外培养条件下可大量增殖。临床前期试验已证实ADSCs和BMMNCs效果类似[22]。

7 小结

再生疗法是心血管内科新的发展方向,已从起步阶段进入快速发展时期。早期研究成果虽不能证明细胞修复疗法确实切实可行,但证明干细胞疗法的安全性,且为干细胞的来源、增殖和接入途径提供了方法。目前,心肌再生的分子机制仍是未解之谜,干细胞治疗的最佳来源、处理方法、介入途径及介入剂量等尚不明确。随着干细胞分子遗传学机制的深入了解和新型干细胞的广泛应用,可能实现损伤心肌修复和再生。

摘要：心肌梗死的干细胞疗法是再生医学研究的热点。从早期研究结果来看,虽然干细胞治疗取得了一定进展,对于其疗效却不尽一致,且在研究中发现一些问题。解决这些问题,需要对心脏发育和心肌再生的分子机制有深入了解。学者运用基因技术和遗传药理学知识,对原来干细胞经过改良和研发,创造出新的干细胞,成为研究新方向。目前,新的干细胞已通过动物实验及早期临床试验验证,被广泛应用于Ⅲ期临床试验,为心肌梗死病人心肌再生提供希望。

人心肌细胞 第6篇

1 材料与方法

1.1 动物及模型的制作

健康新西兰大白兔32只,体重1.5~2.5 kg,由中南大学湘雅医学院动物部提供。所有动物从耳缘静脉推注戊巴比妥钠30 mg/kg,分离气管并切开插管,连接动物呼吸机控制呼吸,潮气量10~15 m L/kg,频率40次/min,循原切口分离单侧颈总动脉,以22号导管一端置入颈总动脉,另一端连接压力换能器监测平均动脉压。连接心电图,记录标准导联心电图,在心尖搏动最明显处的上一肋间隙作切口开胸,暴露心脏及左室表面的血管,以左冠状动脉主干为标志,在左心耳根部下方2 mm处进针,3/0丝线穿过心肌表层在肺动脉圆锥旁出针,硅胶管套线,束紧后在贴紧硅胶管的上端用止血钳将线夹紧,造成心肌缺血,左室前壁紫绀充血,心电图示S-T明显抬高,确认阻断成功。阻断前给予肝素500 u/kg。放松结扎线后心脏表面转红,S-T段下降1/2为模型成功。

1.2 实验分组

随机分为4组,每组8只。(1)S组,即假手术组(1组),开胸后穿线套环,不收紧结扎线。(2)I/R组(2组),结扎冠状动脉左前降支(LAD)30 min,再灌注180 min。(3)缺血后处理组(3组),结扎LAD30 min,然后灌注30 s,阻断30 s,重复4次,继而再灌注直至180 min。(4)双下肢缺血后处理组(4组),结扎LAD24 min时,用血管夹夹闭双侧股动脉5 min,松开1 min,再灌注直至180 min。

1.3 标本采集

在心肌再灌注结束后,在结扎线以下取左心室前壁缺血危险区同一部位的心肌,一半用4%的甲醛固定12 h,切片,包埋用于细胞凋亡的检测,另一半放入液氮用于蛋白质检测。

1.4 心肌细胞凋亡的检测

(1)从原位化学法(TUNEL)试剂盒(武汉博士德生物工程公司;编号MK1020)中取出2个50μL标记溶液作为两个阴性对照,将试剂1中的全部液体(50μL)加到试剂2中剩余的450μL标记溶液中,配成500μL TUNEL反应混合物;(2)石蜡切片,常规脱蜡至水洗;(3)新鲜配制3%H2O2,室温处理10min,蒸馏水洗2 min2次;(4)胃蛋白酶消化10min;0.01M TBS洗2 min3次;(5)标本加标记缓冲液20μL/片,0.01 MTBS洗2 min3次;(6)加封闭液50μL/片,室温30 min;(7)用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体,混匀后50μL/片加至标本上,37℃反应30 min,0.01 M TBS洗2 min3次;(8)用抗体稀释液1∶100稀释SABC,37℃反应30 min;(9)0.01 M TBS洗5 min4次;(10)DAB显色,封片,光镜下观察分析结果:每一心脏随机抽取3张切片,每块切片中随机取5个高倍视野,着色为黄色或棕黄色者为TUNEL阳性细胞,计数凋亡细胞数与正常细胞数,计算心肌细胞凋亡指数,心肌细胞凋亡指数(%)=(凋亡心肌细胞核数/正常心肌细胞数)100%。

1.5 心肌Bcl-2的We s te rn blotting分析

取少许待测样本,用1PBS将组织洗2次,按照每10 mg组织加入500μL裂解液的比例加入裂解液。将组织块研磨呈匀浆,裂解30 min。然后在4℃下12 000 r/min离心5 min,取上清分装于0.5m L离心管中并置于-70℃保存。BCA法(BCA蛋白浓度测定试剂盒:碧云天生物技术研究所,编号P0012)测定蛋白质的浓度,计算含100μg蛋白的溶液体积。取出上样样品行SDS-PAGE电泳,然后转入PVDF膜,转完后将膜用1丽春红染液染5min。应用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h,加入鼠抗人Bcl-2单克隆抗体(Santa Cruz公司:编号sc-7382),洗膜后,加入抗鼠过氧化物酶的二抗(Santa Cruz公司),并室温下孵育膜1 h后,再洗膜,经化学发光,X线显影,分析条带,测光密度值(D值)。

1.6 统计学处理

计量数据采用均数±标准差表示,所有资料用SPSS 11.5统计软件包进行处理,组间比较采用ANOVA分析和SNK-q检验,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 各组兔心肌细胞凋亡的比较

在5个高倍视野下可见2~4组凋亡细胞数明显多于1组(P<0.05),2组又明显多于3、4组(P<0.05)。详见表1及图1~4。

2.2 各组兔心肌Bcl-2蛋白表达的比较

Western blotting显示,与1组相比,2~4组Bcl-2蛋白表达显著增强(P<0.05),表明缺血再灌注能上调其表达;其中3、4组的Bcl-2蛋白表达又较2组明显增强(P<0.05),说明缺血后处理更能上调其表达。见表2和图5。

注:覮与2组比,P<0.05

3 讨论

心脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤严重影响缺血后心脏功能的恢复,甚至危及生命。有效地防治心肌I/R损伤是心脏手术成功的关键所在,亦是非心脏手术患者和非手术缺血性心脏患者预防心脏意外缺血缺氧损伤的主要措施之一,1986年由MURRY等[1]首先提出的心肌缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC),能减少心肌梗死面积和再灌注心律失常等的发生,起到心肌保护作用。由于这种预处理需在缺血前实施,而在临床实际工作中很难预测急性缺血事件的发生,因此IPC在临床应用受到限制。

缺血后处理是指一个长时间缺血后,在再灌注开始时,通过反复短暂间断的缺血/再灌注而诱导的心肌保护现象。到目前为止,缺血后处理心脏保护措施已经在不同动物模型[2,3,4]及离体[5]心脏上得到证实,而且已有实验[2,4,5]证实缺血后处理产生的心脏保护作用确可达到与心肌缺血预处理相似的效果。2005年,有研究表明[6],心肌再灌注前给予5 min肾缺血再灌注,能减低心肌再灌注损伤后梗死范围,减少3 h再灌注末心肌组织肌酸激酶含量,保护心肌组织,从而提出了远程缺血后处理概念。近几年,已有研究[7]发现双下肢缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,但具体的机制特别是关于细胞凋亡方面的机制研究甚少。

再灌注早期引起的细胞凋亡是引起再灌注损伤的一个重要因素,VINTEN-JOHANSEN[8]等提到,后处理可减少再灌注损伤特别是心肌梗死、心肌凋亡和再灌注心律失常,其抑制心肌细胞凋亡的机制尚不清楚,推测可能与减少氧自由基的生成、抑制缺血区心肌线粒体通透性转运孔道的开放和激活磷酸肌醇3激酶有关。一氧化氮能够诱导或者抑制细胞凋亡[9,10,11],TSANG等[5]在鼠的离体心模型实验中观察到,缺血后处理组的内皮型一氧化氮合酶的表达较对照组明显增高,提示一氧化氮可能是缺血后处理的抗凋亡机制之一。

本研究中,心肌组织原位检测显示缺血区有近30%的TUNEL阳性细胞,表明缺血再灌注可诱导明显的心肌细胞凋亡,而双下肢与心肌缺血后处理均可以明显降低心肌细胞凋亡指数,抑制心肌细胞凋亡。在本研究中还观察到,一方面缺血再灌注可诱导Bcl-2蛋白的表达,另一方面与缺血再灌注组相比,双下肢与心肌缺血后处理可进一步上调Bcl-2蛋白的水平,抑制心肌细胞的凋亡。从而提示双下肢与心肌缺血后处理可能通过上调Bcl-2蛋白的水平,抑制心肌细胞的凋亡来发挥其心肌保护作用。

摘要：目的 探讨双下肢与心肌缺血后处理对缺血再灌注兔心肌凋亡的影响。方法 选择新西兰大白兔32只,建立兔心肌缺血再灌注模型,随机分为4组(每组8只):①S组,即假手术组,开胸后穿线套环,不收紧结扎线。②I/R组,结扎冠状动脉左前降支30 min,再灌注180 min。③缺血后处理组,④双下肢缺血后处理组。分别在实验结束后,用原位化学法(TUNEL)法观察各组心肌细胞凋亡,免疫印迹法(Western blotting)测各组心肌Bcl-2的表达。结果 双下肢与心肌缺血后处理组细胞凋亡均明显小于I/R组,且心肌Bcl-2的表达明显高于I/R组。结论 双下肢与心肌缺血后处理可能通过上调Bcl-2蛋白的表达,抑制心肌细胞的凋亡,对缺血再灌注兔心肌产生保护作用。

关键词：再灌注损伤,缺血后处理,细胞凋亡

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运动对心肌细胞第二信使的影响 第7篇

1 第二信使的研究进展

1.1 cAMP信号传递途径

cAMP是第一个被发现的第二信使,它对细胞的信息传递起着重要的作用。激素和受体结合后,通过G蛋白激活腺苷酸环化酶,使cAMP生成增加。cAMP激活依赖cAMP的蛋白激酶(蛋白激酶A,PKA)。蛋白激酶A可催化许多细胞内蛋白质的磷酸化,蛋白激酶A还可以磷酸化钙通道,引起Ca2+内流;磷酸化微管蛋白,改变其构象,引起细胞的内分泌功能改变。cAMP浓度的提高可起不同的作用,例如:引起糖原降解,应付细胞对能量的急需;激活特定基因的转录,合成所需的蛋白质[1]。蛋白激酶A通常无活性,但一旦它与cAMP结合,引起构象发生改变,而被激活。活化的A激酶催化特定的靶蛋白的丝氨酸或苏氨酸磷酸化,使靶蛋白被激活。动物细胞中普遍含有A激酶,但不同细胞中的A激酶底物有所不同,因而产生不同的作用。A激酶的重要作用是使某些基因调节蛋白磷酸化,进而激活特定的基因转录。

1.2 细胞内的钙信号

研究发现,细胞外和内质网腔中的Ca2+浓度显著高于细胞质基质,因此Ca2+在质膜和内质网膜的膜两侧存在着跨膜浓度梯度。膜中的Ca2+通道一旦被打开,细胞质基质中的Ca2+浓度会迅即升高,从而引起Ca2+反应蛋白的变化。研究发现:钙在细胞损伤过程中起重要作用,各种因素导致的细胞和线粒体内钙过渡集聚可引起细胞结构和功能的损伤,细胞及线粒体内钙的聚集程度与细胞损伤程度密切相关[2]。线粒体内钙异常增加程度常作为细胞损伤指标之一[3]。Ca2+的作用是通过影响一种Ca2+敏感蛋白来实现的,这种蛋白质称为钙调蛋白(钙调素)(calmodulin)。钙调蛋白是Ca2+的受体蛋白,钙调蛋白分子结合Ca2+后,发生构象改变,可参与多种反应的调节过程。Ca2+对钙调蛋白的别构激活类似于cAMP对激酶的别构激活,所不同的是,Ca2+/钙调蛋白无酶活性,它只可与别构的靶蛋白结合,改变靶蛋白的活性。质膜上的Ca2+-ATP酶既是一种可被Ca2+/钙调蛋白激活的Ca2+泵,激活后可将Ca2+抽到细胞外。细胞质基质中Ca2+浓度升高会激活Ca2+泵,从而使Ca2+浓度恢复常态。不过,大多数Ca2+/钙调蛋白是间接起作用的,还要通过Ca2+/钙调蛋白依赖蛋白质激酶才能发挥作用,后者又称为CaM激酶。CaM激酶包括很多种,组成了CaM激酶家族,它们都能使蛋白质的丝氨酸或苏氨酸磷酸化。

1.3 cGMP信号传递途径

与cAMP-蛋白激酶A途径相似的是cGMP-蛋白激酶G途径,这条途径多限于心血管系统及脑内。激素和受体结合后,通过G蛋白介导,释放亚基(Gia)。亚基可催化GTP转化为GDP,同时激活磷脂酶C。磷脂酶C可使膜结构中的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)分解成三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DG)。IP3主要的作用是提高细胞质基质中的Ca2+浓度,而二脂酰甘油则是激活蛋白质激酶C(又称C激酶或PKC)。IP3和IP3受体结合后,受体变构,钙通道开放,存在于内质网的Ca2+释放入胞液,使胞液内Ca2+浓度升高。内质网的Ca2+储备枯竭后,IP3还能结合细胞膜的钙通道,引起细胞外Ca2+内流,也使胞内Ca2+浓度升高。由此引起细胞内cAMP的水平发生改变[4]。DG经DG酯酶催化水解出花生四烯酸(AA),后者在细胞内脂加氧酶作用下,产生两个重要的前列腺素中间产物PGG2及PGH2,这两个内过氧化物可激活鸟苷酸环化酶(GC),GC催化GTP生成cGMP[5]。

2 运动对心肌第二信使的影响

目前关于运动对心肌第二信使影响的研究比较少,并且现有的研究也主要是集中在力竭运动对心肌第二信使的影响。黄元汛、张钧[6]研究发现,力竭运动大鼠心肌中cAMP和cGMP均明显高于对照组,说明力竭运动可造成心肌中cAMP和cGMP含量明显升高;张钧[7]研究还发现,大鼠力竭运动后心肌线粒体Ca2+含量明显高于对照组,Zn2+、Mg2+、Na+、K+等离子含量和对照组相比无显著性改变,而心肌线粒体中Mn2+含量显著低于对照组。

力竭运动引起心肌中cAMP升高的可能原因是,力竭运动能增加肾上腺素分泌,而肾上腺素作用于细胞膜上β受体,活化膜上腺苷酸环化酶(AC),从而使ATP分解加速[8];另外力竭运动还引起cAMP依赖的蛋白激酶催化心肌组织内部的蛋白磷酸化,使亮氨酸和糖类摄入量降低,抑制了RNA和DNA的合成,加速了蛋白质降解,导致细胞分化而致心肌损伤[9];同时心肌细胞的蛋白磷酸化还使基因转录调控失调[10],导致心肌损伤。

力竭运动引起心肌中cGMP升高的可能原因是,力竭运动造成心肌细胞膜流动性改变,增加了激素受体复合物和G蛋白的作用,增加了亚基的释放,激活了磷脂酶C,IP3和DG生成量增加,从而使cGMP升高。

力竭运动造成心肌线粒体中Ca2+浓度升高,可能是因为力竭运动可造成GSH/GSSG比值下降,线粒体巯基含量下降,激活线粒体膜上PLA2,使膜磷脂降解增加,膜结构受损和功能损害[11],造成心肌损伤。而Zn2+是细胞膜的重要组成成分,它结合于膜上的巯基起着稳定细胞膜的作用。何天培[5]实验证实,Zn2+可诱导内源性金属巯蛋白增加,金属巯蛋白是一种含有大量巯基的应激蛋白,可减轻应激性心肌损伤。

3 展望

第二信使在细胞内信号传递过程中起着重要的作用,对其研究也越来越受到人们的关注,而运动对细胞第二信使的影响也成为运动医学领域的热点。不同的运动方式对细胞第二信使的影响以及运动对第二信使影响的机制问题目前都还没有确切的研究和解释,相信这些都会受到科学家们的重视。

摘要：第二信使是指受细胞外信号的作用,在细胞质基质内形成或向细胞质基质释放的细胞内小分子,其负责将信号传到细胞内部,如cAMP、cGMP和Ca2+等。通过查阅大量文献资料,本文对第二信使的研究进展以及运动对心肌第二信使的影响进行综述。