E-cadherin

E-cadherin（精选7篇）

E-cadherin 第1篇

1 E-cadherin的结构和功能

Cadherin (钙黏蛋白) 是一类细胞黏附分子, 在细胞黏附及分化, 尤其是早期的分化, Cadherin起着非常重要的作用。由于仅在Ca2+存在时才有作用, 由此得名, 根据组织学分类可分为神经细胞钙黏蛋白 (N-cadherin) 、胎盘钙黏蛋白 (P-cadherin) 和上皮细胞钙黏蛋白 (E-cadherin) 。E-cadherin为重要成员, 是一种跨膜糖蛋白, 分子量约120kD, 基因位于第16号染色体长臂 (16q22.1) , 广泛存在于上皮组织中, 在钙的参与下介导细胞间的黏附, 维持细胞极性和参与分化调节, 对维持组织结构形态和完整性起重要作用[1]。E-cadherin与连接素 (α﹑β﹑γ-catenin) 协同而发挥细胞黏附作用, 它们结合形成E-cadherin/catenins复合体, 是细胞间黏附分子 (CAM) 的重要成员。E-cadherin/catenins复合体的黏附功能有赖于其完整性, 其组成成员质和量的改变都可能引起复合体的功能异常, 导致细胞的脱离、浸润和转移。

2 E-cadherin与癌发生、发展及预后的关系

癌的浸润和转移包括一系列相当复杂的过程, 包括细胞黏附、基质降解和细胞运动3个步骤, 其中细胞-细胞间黏附的破裂是肿瘤转移复杂过程的第1步。E-cadherin是介导上皮细胞间黏附的主要黏附分子, 主要介导同质性细胞黏附, 因为同质型细胞间的黏附使瘤细胞之间保持密切的接触, 难以脱离原发瘤侵入周围组织和血管, 所以癌细胞E-cadherin表达减弱或无表达可致癌细胞间黏附松散, 癌细胞极易从原发部位脱落, 并沿淋巴管、血管外膜及组织间隙浸润蔓延, 破坏邻近正常组织并继续生长, 形成转移癌。近年来国内外学者研究并发现了E-cadherin在正常上皮中E-cadherin总是均匀稳定地在细胞边缘区呈阳性表达, 而几乎所有的人类上皮性肿瘤, 包括乳腺、结肠、前列腺、胃、肝、食管、皮肤、肾和肺在癌的发展过程中丢失, 也有少数肿瘤组织虽表达E-cadherin, 但却不能相互黏附、聚集。如Pap等[2]报道E-cadherin在结肠癌组织和正常组织中表达存在着差异:E-cadherin在正常结肠上皮细胞膜上表达, 而在结肠癌组织E-cadherin表达阳性率显著降低, 表明E-cadherin的低表达在结肠癌的发生、发展起着重要作用。

E-cadherin表达异常与肿瘤的分化程度、浸润深度、转移的范围及预后密切相关。研究揭示, E-cadherin表达降低与肿瘤分化程度相关, 在分化良好的癌细胞系中, E-cadherin表达接近正常状态;而未分化或低分化癌中, 其表达减弱或呈阴性。例如:Sloan等[3]报道E-cadherin低表达显著与食管癌组织浸润、转移有关;Kinsella等[4]对E-cadherin表达与大肠癌细胞之间的关系进行了研究, 结果显示E-cadherin表达水平降低与大肠癌浸润能力之间有显著相关性。7株大肠癌细胞系中有2株E-cadherin的表达水平显著降低, 进一步的研究发现这2株E-cadherin表达水平降低的肿瘤细胞能够浸润胶原凝胶和胶原膜。陆洪军等[5]报道E-cadherin在结肠癌中的表达水平与肿瘤的浸润深度、组织学分型、分化程度、淋巴结转移及Dukes分期均有关。其中, 在黏液癌 (印戒细胞癌、黏液腺癌) 、低分化、浸及浆膜、有淋巴结转移及处于Dukes C+D期的结肠癌中, E-cadherin表达明显减少 (P<0.01或<0.05) 。转移癌与原发癌之间E-cadherin表达在食管癌、胃癌、乳腺癌和卵巢癌中, 有淋巴结转移的肿瘤与无淋巴结转移的的肿瘤E-cadherin表达有显著差异, 伴有淋巴结转移者表达多降低。Ikeguchi等[6]发现不仅原发灶E-cadherin表达明显降低, 而且转移性淋巴结和肝转移灶中的E-cadherin表达明显增强。E-cadherin同时是癌预后的预测因素之一, 赵仲生等[7]报道E-cadherin蛋白异常表达与胃癌的浸润深度、脉管侵犯、淋巴结转移和远处转移紧密相关。单因素分析提示, E-cadherin5年生存率显著低于保存型表达者, 多因素分析提示E-cadherin蛋白表达降低是一独立的预后因素。

在癌的发生发展中, 对引起E-cadherin表达异常的可能调控机制有以下几方面: (1) 基因的缺失、失活及转录、翻译的异常。 (2) 转录抑制因子和启动子高甲基化。 (3) 连接素 (catenins) 异常或缺失。其中转录抑制因子Snail是目前研究的热点, 在人类多种肿瘤, 如黑色素瘤、食管鳞状细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、结肠癌及肿瘤细胞系中, Snail的表达与E-cadherin的表达下调密切相关[8]。

综上所述, E-cadherin 作为一种重要的肿瘤转移抑制基因, 由它介导的细胞黏附在癌的发生发展中起重要作用, 而且对评价肿瘤的恶性程度、浸润深度、预测转移及判断预后均有重要的参考价值。全面分析癌标本E-cadherin水平, 可能有助于评估癌的恶性演进状态, 对患者的早期诊断、综合治疗和预后具有重要的指导意义。但E-cadherin是否与某些类型的癌特异性相关及E-cadherin能否成为特异性肿瘤标记物, 尚需从E-cadherin的分子生物学等多方面作深入的研究。

关键词：E-钙黏蛋白,癌症,关系,综述

参考文献

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E-cadherin 第2篇

1 资料与方法

1.1 材料

收集中国人民解放军第二五一医院病理科2006～2010年喉鳞癌手术标本60例。男49例,女11例;年龄48～77岁,中位年龄62.5岁。按UICC1997年TNM分期标准:Ⅰ+Ⅱ期21例,Ⅲ+Ⅳ期39例;T分期:T1+T2期25例,T3+T4期35例;病理分级:高、中分化49例,低分化11例。病理证实均为鳞癌,其中甲状软骨累及16例,未累及44例;淋巴结转移18例,未转移42例;远处转移15例,无远处转移45例。术前均未进行放疗或化疗,同时检测30例喉不典型增生和20例慢性炎症。

1.2 试剂及其来源

Snail原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(MK2640-h),探针为针对人Snail靶基因的m RNA序列(5'-AGAGTTTACCTTCCAGCAGC-CCTACGACCAGGCCC-3';5'-AAGGCCTTCAACTG-CAAATACTGCAACAAGGAATA-3';5'-TACCAGTGC CAGGCGTGTGCTCGGACCTTCTCCCG-3'),显示系统为生物素化鼠抗地高辛和过氧化物酶标记链霉卵白素(SABC-POD),DAB显色。兔抗人Snail多克隆抗体购自Abcom公司(17732),鼠抗人E-cadherin单克隆抗体(MAB-0589)免疫组织化学SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 原位杂交

石蜡切片复温,脱蜡至水。3%H2O2室温作用10min,蒸馏水洗3次,3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶室温消化30 min。1%多聚甲醛室温固定10 min,蒸馏水洗3次,按每张切片滴加20μL预杂交夜,湿盒放入40℃恒温箱中4 h。滴加杂交液20μL/片,38～42℃恒温箱中过夜。37℃预温的2SSC冲洗5min3次,37℃预温的0.5SSC冲洗5 min3次,37℃预温的0.2SSC冲洗5 min3次。滴加封闭液,37℃30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60min。滴加SABC,37℃20 min。滴加生物素过氧化物酶,37℃20 min。DAB避光显色,苏木素复染,脱水,透明,中性树胶封片。每批染色均用已知阳性切片作为阳性对照,用PBS代替杂交液作为阴性对照。

1.4 免疫组织化学染色(S P法)

标本均经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm连续切片,采用0.01 mmol/L的枸橼酸缓冲液抗原修复,染色程序按SP试剂盒说明书进行,DAB显色,并用已知Snail阳性的乳腺癌切片作为阳性对照,用已知E-cadherin阳性的正常乳腺导管上皮切片作为阳性对照,用PBS代替一抗或二抗作为阴性对照。

1.5 结果判断

Snail m RNA原位分子杂交阳性信号为棕黄色颗粒,定位于细胞质,每例切片选择10个高倍视野,按阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比分为阳性与阴性,无阳性着色或阳性细胞数<10%为阴性,阳性细胞数≥10%为阳性[4]。Snail蛋白免疫组织化学阳性信号以胞核出现棕黄色染色为阳性细胞。按染色强度的深浅积分,0分:无染色;1分:弱阳性;2分:强阳性。按着色细胞百分比,1分:1%～25%;2分:26%～50%;3分:51%～75%;4分:76%～100%。然后按照阳性细胞染色强弱计积分,积分1～2为阴性,积分3～8为阳性[5]。E-cadherin阳性信号以胞膜和(或)胞质出现棕黄色染色为阳性细胞,每例切片选择10个高倍视野,按阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比分为阳性与阴性:无阳性着色或阳性细胞数<25%为阴性,阳性细胞数≥25%为阳性[6]。

1.6 统计学处理

数据采用SPSS 17.0统计分析软件处理,运用χ2检验、Spearman相关性检验分析,以α=0.05作为统计学检验水准。

2 结果

2.1 S na il mRNA及其蛋白、E-ca dhe rin蛋白在喉不同组织类型中的表达

60例喉鳞癌组织中,Snail m RNA及其蛋白阳性率分别为70%(42/60)和78.3%(47/60),分别高于不典型增生组织20%(6/30)、43.3%(13/30)和慢性炎症5%(1/20)、15.0%(3/20),其差异均有统计学意义(χ2=18.131,P<0.05;χ2=9.506,P<0.05和χ2=22.946,P<0.05;χ2=23.040,P<0.05);E-cadherin蛋白在喉鳞癌的阳性率为46.7%(28/60),分别低于不典型增生的76.7%(23/30)和慢性炎症的100.0%(20/20),其差异均有统计学意义(χ2=6.160,P<0.05和χ2=15.625,P<0.05),图1～4。

2.2 S na il mRNA及其蛋白、E-ca dhe rin蛋白表达与喉鳞癌患者临床病理特征的关系

Snail m RNA及其蛋白、E-cadherin蛋白在甲状软骨累及、淋巴结转移、远处转移、T3+T4期、Ⅲ+Ⅳ期中的表达高于甲状软骨未累及、无淋巴结转移、无远处转移、T1+T2期、Ⅰ+Ⅱ期的表达(均P<0.05),均与性别、年龄无关(均P>0.05),但Snail与E-cadherin的表达与病理分级有关(P<0.05),而Snail m RNA的表达与病理分级无关(P>0.05),见附表。

2.3 喉鳞癌中S na il mRNA及其蛋白表达的相关性

60例喉鳞癌组织中,Snail m RNA和Snail蛋白表达均阳性的37例,均阴性的8例,Snail m RNA阳性而Snail蛋白阴性的5例,Snail m RNA阴性而Snail蛋白阳性的10例。Snail m RNA和Snail蛋白在喉鳞癌组织中的表达明显正相关(r=0.362,P<0.05)。

2.4 喉鳞癌中S na il蛋白与E-ca dhe rin蛋白表达的相关性

60例喉鳞癌组织中,Snail蛋白和E-cadherin蛋白表达均阳性的17例,均阴性的2例,Snail蛋白阳性而E-cadherin蛋白阴性的30例,Snail蛋白阴性而E-cadherin阳性的11例。Snail蛋白和E-cadherin蛋白在喉鳞癌组织中的表达明显负相关(r=-0.400,P<0.05)。

3 讨论

EMT是指在特定生理和病理情况下,上皮细胞暂时丧失极性并表现出具有移行能力的间质细胞的现象[7]。在肿瘤细胞,EMT的调控主要通过某些转录因子(如Twist、Snail、Slug等)抑制E-cadherin的转录来实现,新近发现其与癌细胞早期转移密切相关[8,9]。笔者的研究显示,Snail m RNA及其蛋白在喉鳞癌中的表达分别高于不典型增生和慢性炎症组织,其差异均有统计学意义(均P<0.05);而E-cadherin蛋白在喉鳞癌中的表达低于不典型增生和慢性炎症组织,其差异均有统计学意义(均P<0.05),这与ROSIVATZ等[5]研究Snail在胃癌组织表达明显高于癌旁组织结果基本一致。Snail在喉鳞癌中表达高于非肿瘤喉黏膜(P<0.05),表明Snail参与肿瘤形成,促进EMT发生的Snail在喉鳞癌中表达升高和E-cadherin表达降低,说明EMT现象可能在喉鳞癌的发生和进展过程中发挥重要作用。由此推测,在喉鳞癌的发生发展过程中,随着癌前细胞向癌细胞的转化,喉黏膜中Snail的高表达及E-cadherin丢失表达可能对喉鳞癌发生、发展起重要作用。

笔者的研究还探讨了Snail m RNA及其蛋白、E-cadherin蛋白与喉鳞癌临床病理特征的关系,发现Snail m RNA及其蛋白在甲状软骨累及的表达高于未累及的(P<0.05),说明随着喉鳞癌浸润深度的增加,Snail的表达增高,提示Snail参与了喉鳞癌的进展;Snail m RNA及其蛋白在淋巴结转移、远处转移的表达高于未转移(均P<0.05),说明Snail也参与了喉鳞癌的转移;此外,Snail m RNA及其蛋白的表达也与T分期、TNM分期有关(P<0.05),分化越差、恶性程度越高的肿瘤,Snail的表达也越高,提示Snail可能与恶性肿瘤的发生、发展和浸润转移有着密切的关系。研究表明Snail高表达于乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、食管癌等,并与肿瘤的侵袭转移、组织学分级、临床分期密切相关[10,11],笔者的研究与文献报道基本一致。E-cadherin蛋白的表达与喉鳞癌的病理分级、T分期、TNM分期、淋巴结转移、远处转移和甲状软骨累及有关(均P<0.05),与SUN等[12]和GUO[13]的研究一致,说明E-cadherin丢失表达使喉鳞癌更易于转移、更具有侵袭能力,可能是E-cadherin表达下调使细胞间的黏附能力降低,进而促进肿瘤细胞的浸润和转移。

笔者的研究同时显示,Snail蛋白和E-cadherin蛋白在喉鳞癌组织中的表达明显负相关(r=-0.400,P<0.05),提示Snail蛋白可能通过上游调控造成E-cadherin表达降低或缺失是发生EMT的关键机制,从而增强肿瘤细胞的浸润和转移;Snail m RNA和Snail蛋白在喉鳞癌组织中的表达明显正相关(r=0.362,P<0.05),但Snail蛋白的表达高于Snail m RNA的表达,提示Snail蛋白表达的调控主要在转录水平上,Snail蛋白通过提高转录活性,促进蛋白质表达水平的上调;Snail m RNA的表达与病理分级无关,而Snail蛋白则与病理分级有关,其原因可能与m RNA的合成易受到酶降解等因素干扰有关,提示Snail蛋白的检测可能更能反映Snail与肿瘤浸润转移的关系。

总之,Snail和E-cadherin与喉鳞癌的临床病理特征及生物学行为有着密切的关系,联合检测其在喉鳞癌中的表达,可以为临床诊断和治疗提供可靠的生物学指标,可以评估肿瘤的恶性程度和患者的预后。同时,对Snail和E-cadherin的深入研究有助于揭示肿瘤发生转移的机制,从而促进肿瘤的防治。

摘要：目的 观察Snail mRNA及其蛋白、E-cadherin蛋白在喉鳞癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系,并探讨其在喉鳞癌发生、发展中的作用及其临床应用价值。方法 应用原位分子杂交和免疫组织化学SP法检测Snail mRNA及其蛋白、E-cadherin蛋白分别在60例喉鳞癌、30例不典型增生和20例慢性炎症组织中的表达。结果 ①Snail mRNA及其蛋白、E-cadherin蛋白与喉鳞癌的甲状软骨累及、淋巴结转移、远处转移、T分期、TNM分期有关(均P<0.05),与性别、年龄无关(均P>0.05),但Snail和E-cadherin蛋白的表达与病理分级有关(P<0.05),而Snail mRNA的表达与病理分级无关(P>0.05)。②Snail mRNA和Snail蛋白在喉鳞癌组织中的表达正相关(r=0.362,P<0.05);而Snail蛋白和E-cadherin蛋白在喉鳞癌组织中的表达明显负相关(r=-0.400,P<0.05)。结论 ①Snail在喉鳞癌中过度表达及E-cadherin蛋白的下调在喉鳞癌的发生、发展中可能起协同作用。②联合检测Snail和E-cadherin蛋白对预测喉鳞癌浸润转移有重要意义,并可作为判断喉鳞癌生物学行为的指标。

E-cadherin 第3篇

1 资料与方法

1.1 研究对象

本组51例均为我院收治的脑胶质瘤患者,其中男44例,女7例;年龄28～75岁,中位年龄56岁。

1.2 方法

采用链霉菌生物素过氧化物酶法(SP法)进行免疫组化染色。PTEN单克隆抗体、E-cadherin鼠抗人单克隆抗体(即用型,克隆号4A2)、PCNA鼠抗人单克隆抗体(即用型,克隆号PC10)、SP超敏试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福建迈新生物技术开发公司。PTEN表达定位于肿瘤细胞的细胞浆。400倍显微镜下每张切片观察10个视野,每个视野100个细胞,阳性细胞数<10%为(-),10%～25%为(+),25%～50%为(++)。>50%为(+++)。E-cadherin为跨膜糖蛋白,定位于细胞膜,阳性染色为细胞膜被染成棕黄色。肿瘤细胞染色全部阳性及弱或无染区50%为正常表达;弱或无染区>50%及完全无阳性细胞着色为减弱表达[2];PCNA阳性染色定位于细胞核,呈棕黄色或深黄色。记数平均每58个视野(400)下每1000个细胞中的阳性细胞数。阳性细胞表达率50%为低表达,>50%为高表达[3]。

1.3 统计学方法

采用SPSS10.0软件对所得数据进行t检验、χ2检验。

2 结果

(1)本组病例中PTEN蛋白阳性表达为34例(66.67%),其中Ⅰ级10例中有9例(90%)表达,而4例胶质瘤Ⅳ级中阳性表达仅有1例(25%)。对各级胶质瘤进行两两比较的统计学分析表明:I级与Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤PTEN表达阳性率之间有显著差异(P<0.05);Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤之间也有显著性差异(P<0.05);而I级、Ⅱ级肿瘤之间,Ⅲ级、Ⅳ级肿瘤之间则无显著性差异(P>0.05)。

(2)本组病例中PCNA蛋白阳性表达为21例(41.18%),其中Ⅰ级10例中仅有1例(10%)弱表达,而3例胶质瘤Ⅳ级中全部阳性表达(100%)。对各级胶质瘤进行两两比较的统计学分析表明:Ⅰ级与Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤PCNA表达阳性率之间有显著差异(P<0.05);II级与Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤之间也有显著性差异(P<0.05);而Ⅰ级、Ⅱ级肿瘤之间,Ⅲ级、Ⅳ级肿瘤之间则无显著性差异(P<0.05)。

(3)本组病例中E-cadherin正常表达13例,减弱表达38例,减弱表达率74.51%(38/51)。

(4)PTEN蛋白与PCNA蛋白表达的相关性51例样本,经直线相关检验,r=0.479,P<0.05,提示PTEN与PCNA在胶质瘤中的表达存在负相关。

(5) E-cadherin与PCNA表达的关系比较E-cadherin正常、减弱表达组的PCNA阳性细胞表达率分别为(48.82±18.97)%、(65.33±22.00)%,前者显著低于后者(t=-2.754,P=0.008);PCNA表达率比较:E-cadherin正常表达组与减弱表达组的PCNA表达率比较有显著性差异(χ2=7.894,P=0.005)。

(6) PTEN在Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中的阳性表达率分别为80%、52%,组织学分级之间有显著差异(P<0.05),与对照组之间有显著差异(P<0.05);E-cadherin在Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中的阳性表达率分别为40%、24%,组织学分级之间无显著差异(P>0.05),与对照组之间有显著差异(P<0.05);PTEN和E-cadherin表达在胶质瘤中呈正相关(P<0.05)。

3 讨论

PTEN基因,又称MMAC1或TEP1,位于染色体10q23.3,全长200 kb,有9个外显子和8个内含子组成,编码产物为403个氨基酸组成的PTEN蛋白,分子量为47166Da。PTEN蛋白具有蛋白酪氨酸磷酸酶及双特异性磷酸酯酶(DSP)活性,能对酪氨酸和丝/苏氨基酸进行去磷酸化作用。10号染色体等位基因的缺失主要发生于高恶性度肿瘤如胶质母细胞瘤(GBM)及恶性脑膜瘤中,与此一致,PTEN的突变也主要发生于GBM,而很少发生于低恶性度胶质瘤中。PTEN在胶质瘤细胞系及GBM中突变率分别为41%～63%和17%～44%。Ali等[4]M1通过检索medline数据库回顾了文献报道的674例恶性胶质瘤(多形性胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤),PTEN的突变率为24%,突变类型包括移码突变,错义突变、无义突变及点突变的比例为63%,与其他肿瘤不同,恶性胶质瘤的错义突变所占比率达41%,而且大部分集中在外显子5的核心磷酸酶基序区域。目前,PTEN的研究热点主要在对其机制的探讨上。本结果显示,51例人脑胶质瘤标本中有34例(66.67%)呈阳性表达,其中Ⅰ级10例中有9例(90%)表达,而4例胶质瘤Ⅳ级中阳性表达仅有1例(25%),其表达阳性率之间有显著统计学差异。而且在Ⅰ、Ⅱ级肿瘤之间,Ⅲ、Ⅳ级肿瘤之间则无显著性差异(P>0.05),提示PTEN基因突变或缺失在胶质瘤的发生发展过程中起重要作用,且与肿瘤恶性分化程度密切相关。PTEN的临床应用价值主要体现在两个方面,即有助于判断胶质瘤病人的预后及应用于胶质瘤的基因治疗。通过对恶性星形细胞瘤病人的追踪观察发现,PTEN突变或低表达的病人预后明显差于PTEN正常病人[5]。PTEN基因突变与蛋白表达均与胶质瘤的恶性进展有关,通过检测PTEN基因突变或PTEN蛋白表达可判断患者的预后。

E-cadherin是一种钙离子依赖性细胞表面跨膜糖蛋白,由细胞外区、细胞内区、跨膜区三部分组成。主要介导同种细胞间的粘附反应,并起细胞骨架作用,其表达减弱有利于肿瘤细胞脱离原发灶发生转移。PCNA是一种核蛋白,为DNA多聚酶δ的辅酶。PCNA在调节DNA合成和细胞增殖方面起重要作用,其表达的高峰在细胞周期的G1期和S期,于G2期减少,应用免疫组化方法难以检测[6],因此,PCNA可作为细胞周期的内源性组织标记物,是反映细胞增殖活性的指标。在许多恶性肿瘤如结肠癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌中,PCNA阳性表达率表示细胞的增殖活性,与肿瘤转移潜能、复发均有显著相关性[7]。

肿瘤生长不仅是病变体积的增长,更重要的是细胞增殖活性发生变化,增殖活性是了解肿瘤生物学行为的一个有用的辅助手段。肿瘤细胞增殖活性的增加可能导致多克隆亚群的产生并有助于其中的某些亚群获得浸润、转移能力。研究发现,E-cadherin正常表达组PCNA阳性细胞表达率显著低于减弱表达组,E-cadherin正常表达与减弱表达组间的PCNA表达率差异(分别呈高、低表达率)有显著性,说明两者间可能存在一定的联系。肿瘤细胞相互间存在着接触性的生长抑制。St Croix等[7]认为E-cadherin不仅是一种浸润转移抑制物,且还是一种重要的接触性细胞生长抑制物,其抑制细胞增殖的能力是通过上调细胞周期素依赖性激酶抑制剂P27进而作用于细胞周期实现的,E-cadherin表达减弱后造成P27的下调,使细胞增殖增加,E-cadherin表达减弱还能抑制细胞凋亡,间接地使检测到的细胞增殖增加。同时,E-cadherin对肿瘤细胞生长的抑制作用是不完全的[7],可能为肿瘤细胞失去了依赖性生长抑制的敏感性或存在其他粘附机制的缘故。另外,当E-cadherin基因发生点突变和部分缺失、与α、β、Y连环蛋白形成复合物障碍、与β连环蛋白复合物中自身酪氨酸的磷酸化等都会抑制其功能而不影响其在免疫组化中的表达,但却会使E-cadherin的粘附功能下降[8],导致肿瘤细胞接触性生长抑制作用不完全。本研究发现部分E-cadherin正常表达的脑胶质瘤,其PCNA亦呈高表达,即可能为依赖E-cadherin的接触性生长抑制作用不完全所致。

本研究所有脑肿瘤患者均为首次发病,手术前未经化疗、放疗或生物治疗以排除这些因素带来的影响,并且采用1993年WHO脑胶质瘤组织学分类分级标准,通过较大样本的PTEN、E-cadherin和PCNA三个指标的研究,将病理学诊断与PTEN、E-cadherin和PCNA紧密联系,即为脑胶质瘤病理分类分级提供一个有效的辅助方法,能避免许多不利的主观因素,从分子生物学水平评估其分化状态,更加客观地反映脑胶质瘤各病理分类分级及不同肿瘤生长部位增殖能力的差异,可作为一个评价脑胶质瘤生物学行为的有力指标,从而为临床制订治疗方案提供更加可靠的依据、相信随着对脑胶质瘤PTEN、E-cadherin和PCNA的更深入的研究,它们在临床上的实用价值将得到更进一步的体现。

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[7] StCroix,SheehanC,RakJW,et al.Ecadherin dependent growth suppression is mediated by the cylin dependen kinase inhibitor P27K I P I J Cell Biol,1998;142(2) :557～571

E-cadherin 第4篇

关键词：胃肠道间质瘤,E-cadherin,Ki-67,免疫组化

目前认为，胃肠道间质瘤（GIST）是消化道最常见的、起源于胃肠道ICC(interstitial cells of cajal）细胞的一种未定向分化的间叶源性肿瘤[1]，特征性地表达CD117和CD34是其最主要的免疫组化特征。GIST临床发病隐匿，无特异性表现，其生物学行为变化很大，还没有特殊形态学标准能够准确地预测其生物学行为，这使其在诊断及临床治疗上存在较大困难[2]。E-钙黏蛋白（E-cadherin）和Ki-67与肿瘤的发生及发展密切相关[3,4]。因此，本研究分析E-cadherin、Ki-67在胃肠道间质瘤中的表达，并探讨与其预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院经CD117和CD34证实为GIST的标本78例。良性指标：肿瘤小于5 cm或核分裂<5/50HP，且无细胞多型性，细胞成分少，无黏膜侵犯或坏死。恶性指标：黏膜侵犯，肿瘤坏死和显著的细胞多型性，核分裂>10/50HP。介于良恶性之间的为潜在恶性。按此标准，78例GIST中，良性28例，潜在恶性18例，恶性32例。其中，男48例，女30例；年龄最小23岁，最大71岁，平均51岁；胃间质瘤52例，小肠间质瘤26例；肿块直径最大28.0 cm，最小0.5 cm，平均7.6 cm。

1.2 免疫组化方法

病理科提供石蜡切片，切片规格为每例4张4μm连续切片。SP法检测E-cadherin及Ki-67的表达情况，1张做HE染色，1张用PBS代替一抗作阴性对照。用已购阳性切片作阳性对照。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行统计分析。免疫组化结果与临床病理特征比较采用四格表χ2检验，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 E-cadherin和Ki-67与GIST的临床病理关系

78例GIST中，51例（65.38%）E-cadherin阳性表达，阳性蛋白定位于细胞膜。通过χ2检验，不同性别、不同年龄组之间E-cadherin的表达率无显著性差异（P>0.05），但与GIST的发生部位、恶性潜能分级有关（P<0.05）。两两比较显示，极低危、低危和中危、高危GIST之间E-cadherin的阳性表达率有显著性差异（P<0.05），但极低危和低危之间，中危和高危之间的表达率无显著性差异（P>0.05）。43例（55.13%）Ki-67表达阳性，阳性蛋白定位于细胞质，通过χ2检验，不同性别、不同年龄组之间Ki-67的表达率无显著性差异，但与GIST的发生部位、恶性潜能分级有关。通过两两比较，极低危、低危、中危组间表达间无显著性差异（P>0.05），但高危组与其他3组间表达有显著性差异（P<0.05）。见表1、图1～2。

2.2 E-cadherin与Ki-67在GIST中表达的相关性

见表2。

2.3 E-cadherin与Ki-67等多因素与GIST预后的关系

应用Kaplan-Meier法计算全组患者术后2年复发及转移率和5年生存率分别为31.8%、72.3%，平均生存时间为64.9个月，术后转移及复发率约为61.11%（11/18），发生在18个月内。单因素分析（Log-rank检验）不同性别、不同年龄组患者复发及转移率和生存率无显著性差异（P>0.05），肿瘤原发部位、大小、核分裂象、E-cadherin和Ki-67的表达对GIST的5年生存率有显著影响（P<0.05），肿瘤发生部位、大小以及E-cadherin表达与GIST 2年复发及转移率密切相关（P<0.05），不同Ki-67表达对复发及转移率的影响无显著性差异（P>0.05）。见表3。

3 讨论

GIST是一类发生于胃肠肌壁间的最常见的间叶性肿瘤，起源于胃肠道的间质干细胞———cajal细胞[4]。形态上由梭形细胞和上皮样细胞构成，或两者混合存在。其生物学行为很难预测，对良、恶性的判断，国内外尚没有统一的标准。其组织学形态与生物学行为常常存在不一致性，即使细微的病灶（2 cm以下）以及细胞分裂并不活跃的GIST也可出现远处转移[5]。肿瘤的大小及核分裂象是较为公认的预后因素。Ki-67作为一种反映细胞分裂和增殖活性的标志物，可较准确地反映细胞增殖的状况，Ki-67在肿瘤组织中表达越高，表明肿瘤细胞增殖越活跃。对GIST患者而言，Ki-67表达有重要的预后意义，是有效的预后判断指标。目前，日本和西方国家已把Ki-67列为判断GIST危险度和预后观察的指标之一[6]。本研究结果显示，Ki-67的增殖指数在不同危险度之间具有显著性差异，增殖指数越高，危险度也越高，提示Ki-67可能是判断GIST危险度和预测预后的辅助指标之一。本研究发现，从良性、潜在恶性到恶性的GIST,Ki-67阳性表达率逐渐升高，说明随着GIST从良性到恶性转变的过程中，肿瘤分化越差，增殖性越强，恶性度越高，生长速度加快，复发和转移可能性增加，反映了肿瘤细胞增殖和分化的情况。因此，可以认为Ki-67是判断GIST良、恶性及用于组织学分级的一个较好的指标。E-cadherin是分子量为120 kD的细胞膜整合蛋白，广泛分布于上皮细胞，通过具有钙依赖性的同型细胞黏附作用，在保持组织的形态发生、发展和细胞连接中起关键作用[7]。E-cadherin主要介导同型细胞的黏附功能，其阳性表达有抑制肿瘤转移的功能，E-cadherin表达的下降或缺失，会导致细胞之间黏附力下降，从而使细胞易于分散而向外周浸润生长，一旦获得转移的必要条件，便可脱离原发灶而发生转移。2003年，House等[8]报道，在38例GIST中亦发现E-cadherin基因的甲基化现象，并且认为E-cadherin是GIST早期复发的一个独立预后指标。本研究中，E-cadherin及Ki-67在胃肠道间质瘤中均有表达，其表达与恶性潜能分级相关，提示其与GIST的发展过程密切相关。肿瘤的原发部位、大小、核分裂象、E-cadherin及Ki-67的表达情况与肿瘤的预后密切相关。E-cadherin的表达情况是GIST的早期复发转移的独立预后因素。联合E-cadherin及Ki-67检测有助于更加准确地判断GIST的预后情况。

参考文献

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E-cadherin 第5篇

关键词：喉鳞状细胞癌,Dermol,E-cadherin,免疫组化

喉癌是头颈部肿瘤中最为常见的一种,其中又以喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)最为多见,喉鳞状细胞癌具有较高的侵袭能力,发生局部复发和转移的能力较高[1]。虽然喉癌在早期有很高的生存率,但是大多数患者确诊时已到了晚期(Ⅲ-Ⅳ期),从而导致了不良的预后效果。尽管手术技术和放疗技术得到明显改善,但喉鳞状细胞癌的疗效仍不十分理想。探索与喉鳞状细胞癌发生、转移相关的肿瘤因子,对喉鳞状细胞癌的的治疗有着重要的临床指导意义。Dermol也被称为Twist2,属于碱性Helixloop-helix (b-HLH)蛋白家族的成员。目前的研究发现Dermol蛋白在不同的肿瘤中表达并不相同,它在发育和肿瘤发展过程中的作用及机制尚不十分清楚.有待进一步研究。为了进一步探讨Dermol与E-cadherin在喉鳞状细胞癌发生、发展及侵袭过程中的作用及两者的相关性,本研究采用免疫组化法检测喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织中Dermol与E-cadherin的表达情况并进行相关性分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年2月～2013年3月沧州市人民医院(以下简称“我院”)耳鼻喉科的喉鳞状细胞癌手术切除标本及其癌旁正常组织,其中48例喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织30例。癌旁组织均经病理检查明确为正常组织。所有喉癌患者术前都未行放、化疗,临床资料完整。年龄41～80岁,中位年龄60.2岁;高分化13例,中分化19例,低分化16例;Ⅰ、Ⅱ期(早期)18例,Ⅲ、Ⅳ期(晚期)30例;声门上型17例,声门型31例。本研究已经我院医学伦理委员会批准通过。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂

Dermol鼠单克隆抗体(Twist2C1a):sc-81417 Santa Cruz Biotechnology,Inc);E-cadherin鼠单克隆抗体(ZM-0094北京中衫金桥生物技术有限公司);鼠二抗免疫组化试剂盒(SP-9002北京中衫金桥生物技术有限公司);DAB显色液(ZLI-9032北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2.2 免疫组织化学S-P方法

所选标本均制成石蜡标本,4μm连续切片,一抗所选浓度Dermol鼠单克隆抗体1:100,E-catenin鼠抗人单克隆抗体为1:50。采用免疫组化SP法,严格遵守操作步骤进行实验。设置PBS代替一抗为阴性对照,为质量控制标准,喉癌旁正常组织为正常对照组。

1.3 结果判定

Dermol蛋白阳性着色位于细胞质,出现片状或颗粒状的棕褐色的胞质或胞核细胞为阳性细胞。结果采用半定量记分法判定[2],首先按阳性着色程度评分,再按阳性细胞所占比例评分,将两者的乘积作为判定结果:4～12分为阳性,<4分为阴性,阳性表达为异质表达。E-catenin染色定位于细胞膜,采用Mattern积分法[3],将阳性细胞百分率评分和染色强度评分相乘:阳性指数>3为阳性,≤3为阴性。>10%细胞出现胞质和/或核表达为异位表达,异位表达均阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析,不符合正态分布的改用中位数;计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验;相关性分析用Spearman等级相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dermol、E-cadherin在喉鳞癌及癌旁正常组织中的表达

Dermol在喉鳞状细胞癌中的阳性表达率为58.33%(28/48)高于癌旁正常组织黏膜的16.67%(5/30);E-cadherin在喉鳞状细胞癌中的阳性表达率为22.91%(11/48),低于癌旁正常组织黏膜的100.00%(30/30)(P<0.01)。见图1、2,表1。

2.2 喉鳞状细胞癌中Dermol、E-cadherin表达与喉鳞癌临床病理参数的关系

Dermol在有淋巴结转移的喉鳞癌组织中的阳性表达率明显高于无淋巴结转移者;E-cadherin在有淋巴结转移的喉鳞癌组织中的阳性表达率明显低于无淋巴结转移者,差异均有高度统计学意义(P<0.01)。Dermol在Ⅰ、Ⅱ期(早期)喉鳞癌组织中的阳性表达率明显低于Ⅲ、Ⅳ期(晚期)者;E-cadherin在Ⅰ、Ⅱ期(早期)喉鳞癌组织中的阳性表达率明显高于Ⅲ、Ⅳ期(晚期)者,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。Dermol在不同病理分化程度的喉鳞癌组织中阳性表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。E-cadherin在高分化鳞状细胞癌中的阳性表达率较高,而在中低分化鳞状细胞癌中未见表达,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。Dermol与E-cadherin在声门上型喉癌中的阳性表达率与在声门型喉癌比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。不同年龄喉鳞癌患者喉鳞癌组织中Dermol与E-cadherin阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 Dermol与E-cadherin在喉鳞癌中的相关性

在48例喉癌中,3例癌组织中Dermol、E-cadherin均呈阳性表达,12例癌组织中Dermol、E-cadherin均呈阴性表达。Dermol表达阳性但E-cadherin表达阴性的喉癌组织有25例;E-cadherin表达阳性但Dermol表达阴性的喉癌有8例。经Spearman等级相关分析,两者表达呈负相关(r=-0.344,P<0.05)。

3 讨论

Dermol是一个高度保守的转录因子,属于螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族,在不同的种属之间其核苷酸和氨基酸序列高度保守。Dermol是在使用E12作为引物的一种双酵母杂交体中首次被发现,由于它的表达模式是在老鼠胚胎的dermis(真皮)组织中,所以被称为Dermol[4]。后来由于Dermol与Twist 1的高度同源和表达模式的重叠性被命名为Twist2。目前大量的研究已经证实,Twist1可以诱导EMT的发生。Dermol可能与Twist1相似诱导EMT的发生。最近研究发现Dernmol异常表达与肿瘤有着密切关系,Dermol与乳腺癌、结肠癌、胃癌、甲状腺癌及肝癌的表达在国内外有相关报道[5,6,7,8,9,10,11,12],但其在喉鳞状细胞癌中的表达及其意义却鲜有报道。

本研究结果表明:Dermol蛋白表达位于细胞质中,呈棕褐色。48例喉鳞癌组织中阳性表达率(58.33%)明显高于30例癌旁正常组织中阳性表达率(16.67%)(P<0.01)。在喉鳞癌组织中Dermol蛋白表达与淋巴结转移、临床分期相关(P<0.05或P<0.01),而与肿瘤病理学分级、临床分型及年龄无关(P>0.05)。由此可见,Dermol在喉鳞状细胞癌中高表达,且在淋巴结转移与临床分期具有统计学意义,由此推断Dermol高表达的鳞状细胞癌组织具有更强的侵袭能力,Dermol可能成为判断喉鳞状细胞癌预防或预后的检测指标之一。目前研究发现,在口腔/咽部癌症患者中,Dermol与较高的肿瘤分级和较短的生存率有关,Dermol通过上皮间充质转化、抑制细胞凋亡来助于头颈部鳞状细胞癌的侵袭[13]。

E-catenin是Wnt信号传导通路中重要的调控一员[14],当肿瘤细胞中E-catenin遇到启动子区域甲基化、转录抑制或基因突变时,其结构功能便会出现异常,细胞的黏附功能出现障碍,导致了肿瘤细胞的侵袭性生长及远处转移[15]。在甲状腺癌[16]食道癌[17]、胃癌[18]及喉癌[19]中均发现E-catenin表达下调,并与肿瘤的转移及复发有一定相关性。国外曾有研究发现[20],E-catenin在头颈部鳞癌中表达下调,并与头颈部鳞状细胞癌的血管侵袭性和患者生存率相关。本研究发现,癌旁正常组织中E-catenin表达阳性染色定位于细胞膜,而喉鳞状细胞癌组织中E-catenin表达主要位于细胞质及细胞核中。喉鳞状细胞癌中E-catenin阳性表达明显低于癌旁正常组织,喉鳞状细胞癌的转移、侵袭能力越高,E-catenin的阳性表达率越低,也同样证实了E-catenin与喉鳞状细胞癌的侵袭与转移相关。

E-cadherin 第6篇

关键词：缺氧诱导因子-1α,上皮-间质转化,锌指转录因子,上皮钙黏蛋白,结直肠癌

结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤, 预后较差, 侵袭转移和复发是导致患者死亡的主要原因。缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 是缺氧条件下存在于哺乳动物或人体内介导细胞适应于缺氧微环境的转导调控因子的功能亚单位, 可以结合缺氧反应元件 (HRE) 调节肿瘤的血管发生、红细胞生成、能量代谢、肿瘤细胞增殖和凋亡、肿瘤生长和转移等过程[1]。上皮-间质转化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 对肿瘤发生[2]、侵袭和转移[3]及多种慢性疾病的发生、发展也起重要作用。上皮钙黏蛋白 (E-cadherin) 与锌指转录因子 (Snail) 是EMT的关键调控因子, 可直接或间接导致EMT。本实验通过构建氯化钴 (CoCl2) 缺氧诱导模型, 观察缺氧与基因沉默条件下HIF-1α、Snail及E-cadherin在结直肠癌SW480细胞中的表达, 及其对SW480细胞生长增殖活性和侵袭迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人结直肠癌SW480细胞株由南华大学肿瘤研究所提供;RPMI 1640培养基 (Hyclone公司) ;小牛血清 (杭州四季青生物工程公司) ;胰酶 (Auragene Bioscience公司) ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 、二甲基亚砜 (DMSO) 和CoCl2均购于美国Sigma公司;Matrigel基质胶购于美国Becton Dickinson Labware公司;Transwell小室 (装有聚碳酸酯微孔滤膜, 孔径8μm) 、培养板购于美国Corning公司;逆转录聚合酶链 (RT-PCR) 试剂盒购于北京康为世纪生物公司;Trizol (总RNA提取) 试剂购于Invitrogen公司;HIF-1α、Snail及E-cadherin引物由北京三博远志生物技术有限公司设计合成;化学修饰的si RNA oligo由上海吉玛公司设计合成;Lipofectimane 2000脂质体转染试剂 (Invitrogen) ;余化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 小干扰RNA (siRNA) 及阴性对照 (Negative control) 序列的设计合成

根据GeneBank中HIF-1α人全长c DNA序列 (No:NM111530) 设计合成, 采用本研究前期实验筛选得到的具有较高沉默效率的HIF-1α-si RNA寡核苷酸片段, 正义链 (sense) :5'-CCACCACUGAUGAAUUAAATT-3', 反义链 (antisense) :5'-UUUAAUUCAUCAGUGGUGGTT-3'。将设计好经鉴定正确的寡核苷酸片段送上海吉玛公司合成。用不同源的序列作为阴性对照, 阴性对照序列:正义链5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3', 反义链5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.2.2 细胞培养及转染

人结直肠癌SW480细胞株, 用含体积分数为10%的小牛血清、100 u/mL青霉素及100 u/mL链霉素的RPMI 1640培养基培养于37℃、体积分数为5%二氧化碳、饱和湿度、恒温细胞培养箱中。该细胞为贴壁生长细胞, 细胞在对数生长期长满培养瓶时需传代。传代后分别将细胞置常氧和无氧 (根据本研究前期实验选择CoCl2终浓度为600μmol/L进行化学诱导建立细胞缺氧模型) 微环境中培养。无氧条件下培养的细胞转染严格按照LipofectaminTM2000试剂说明书进行, 实验分为常氧组、无氧组 (亦即干扰实验的空白对照组, 不做转染) 、阴性对照组 (无氧培养, 转染和选中的si RNA序列组成相同, 但无明显同源性的序列) 和基因干扰组 (无氧培养, 转染HIF-1α-siRNA) 。

1.2.3 四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 检测细胞体外生长增殖活性

取各组对数期生长的细胞, 消化后制成单细胞悬液, 调整浓度为1105个/m L, 接种至96孔板, 每孔加入100μL, 每组设4个复孔, 至细胞贴壁并长满后, 分别向各组加入CoCl2使其终浓度为600μmol/L, 常规培养6 h后, 每孔加入20μL MTT溶液 (5 mg/m L) , 继续培养4 h;吸去孔内液体, 每孔加入150μL DMSO, 在酶联免疫检测仪OD=490 nm处测量各孔的吸光值作图, 细胞存活率= (处理组OD值/常氧组OD值) 100%。

1.2.4 体外侵袭试验 (Transwell小室法) 检测细胞体外侵袭迁移能力

在24孔培养板中放入Tran swell小室, 将50 mg/L的Matrigel基质胶用无血清RPMI 1640培养基按1∶8稀释后包被Transwell小室底部膜的上室面, 胰酶消化收集常氧、低氧和无氧条件下培养的细胞, 用无血清RPMI 1640培养基重悬, 调整细胞密度至1105个/m L, 各组分别取100μL加入24孔板的上室 (Transwell小室) , 下室加入500μL含10%的小牛血清的RPMI 1640培养基, 常规培养12 h, 取出Transwell小室, PBS淋洗, 用棉签小心擦去基质胶上室面的细胞, 90%乙醇常温固定30 min, 苏木素染色10 min, 显微镜下观察并拍照, 每组实验重复3次。随机选取10个高倍镜 (400) 下视野, 计数迁移的细胞数, 计算平均值, 以穿过膜的细胞相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭迁移能力。侵袭迁移率= (处理组迁移细胞数/常氧组迁移细胞数) 100%。

1.2.5 逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测细胞中HIF-1α、Snail及E-cadherin

m RNA的表达收集各组细胞, Trizol一步法提取总RNA, 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA, 紫外分光光度计测量A260/280比值。取2μg总RNA用AMV逆转录酶合成第一链, 用1μL的逆转录产物作为模板进行PCR。RT-PCR按试剂盒说明书进行。HIF-1α引物序列为5'-GAACGACAAGAAAAAGATAAG-3', 5'-G CTTCGCTGTGTGTTTTGTTC-3', 片段长度为481 bp;Snail引物序列为5'-GACCCCAATCGGAAGCCTAAC-3', 5'-CCTCCAAGGAAGAGACTGAAG-3', 片段长度为337 bp;E-cadherin引物序列为5'-ACCCGATT CAAAGTGGGCAC-3', 5'-AGTGTATGTGGCAATGCG TTC-3', 片段长度为379 bp;以GAPDH为内参照, 引物序列为5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', 5'-TC CACCACCCTGTTGCTGTA-3', 片段长度为546 bp。反应条件:94℃预变性5 min, 94℃变性1 min, 58℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 共30个循环, 最后72℃延伸10 min。取10μL PCR产物在已加入EB的1.5%琼脂糖凝胶中电泳, 以Tanon自动凝胶数字扫描成像系统照相, 观察HIF-1α、Snail及E-cadherin m RNA的表达强度, 并测定条带积分光密度值, 每组实验重复4次。以待检基因条带与内参条带的积分光密度比值作为目的基因的相对表达量。RT-PCR产物比值=待检基因 (HIF-1α、Snail及E-cadherin) m RNA灰度值/内参照 (GAPDH) mRNA灰度值。

1.3 统计学方法

实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 多组间均数差异性的比较采用单因素方差分析 (One-way ANOVA) 和t检验, 相关分析采用双变量相关分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT检测细胞生长增殖情况

MTT检测结果显示, 与常氧组比较, 无氧组和阴性对照组细胞的生长增殖活性增加, 基因干扰组与无氧组、阴性对照组比较, 细胞生长增殖活性降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;无氧组和阴性对照组、常氧组与基因干扰组比较, 细胞生长增殖活性无明显变化, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。提示缺氧及HIF-1α可促进结直肠癌SW480细胞的生长增殖, 基因沉默HIF-1α可抑制其生长增殖活性 (见图1) 。

2.2 Transwell检测细胞的体外侵袭迁移情况

实验结果显示常氧组与基因干扰组仅少量细胞穿过基质胶和聚碳酸酯膜而被苏木素蓝染, 无氧组与阴性对照组穿膜细胞数多且多数被蓝染 (见图2) 。计数穿膜细胞数和细胞的侵袭迁移率结果显示无氧组、阴性对照组与常氧组比较, 结直肠癌SW480细胞侵袭迁移率均明显增加, 基因干扰组与无氧组、阴性对照组比较, 结直肠癌SW480细胞侵袭迁移率明显降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05) , 基因干扰组与常氧组、无氧组和阴性对照组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) (见图3) 。提示缺氧及HIF-1α可促进结直肠癌SW480细胞的侵袭转移, 基因沉默HIF-1α可抑制其侵袭转移。

1:常氧组;2:无氧组;3:阴性对照组;4:基因干扰组

黑色箭头所示为穿过基质胶和聚碳酸酯膜的细胞, 被苏木素染成蓝色;蓝色箭头所示为未穿过基质胶和聚碳酸酯膜的细胞, 未被染色

2.3 RT-PCR检测HIF-1α、Snail及E-cadherin mRNA的表达情况

检测结果显示, 无氧组、阴性对照组与常氧组比较, 结直肠癌SW480细胞中的HIF-1α和Snail m RNA的表达增强, E-cadherin m RNA的表达降低, 基因干扰组与无氧组、阴性对照组比较, SW480细胞中的HIF-1α和Snail m RNA的表达降低, E-cadherin m RNA的表达增加, 差异均具有统计学意义 (P<0.05) , 基因干扰组与常氧组, 无氧组与阴性对照组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) (见图4) 。对3种因子进行相关性分析, 结果显示HIF-1α和Snail基因的表达呈显著正相关 (r=0.896, P<0.05) , HIF-1α和E-cadherin基因的表达呈显著负相关 (r=-0.912, P<0.05) , Snail与E-cadherin基因的表达呈显著负相关 (r=-0.935, P<0.05) (见附表) 。表明在结直肠癌SW480细胞中缺氧可促进HIF-1α、Snail基因的表达, 抑制E-cadherin基因的表达, 基因沉默HIF-1α可抑制Snail基因的表达, 促进E-cadherin基因的表达。提示HIF-1α高表达可促进Snail基因的表达, 抑制E-cadherin基因的表达, 而Snail的高表达可能抑制E-cadherin基因的表达。

1:常氧组;2:无氧组;3:阴性对照组;4:基因干扰组

M:Marker;1:常氧组;2:无氧组;3:阴性对照组;4:基因干扰组

注:与无氧组、阴性对照组比较, P<0.05;常氧组与基因干扰组、无氧组与阴性对照组比较, P>0.05;rAB=0.896, P<0.05, rAC=-0.912, P<0.05, rBC=-0.935, P<0.05

3 讨论

利用RNA干扰 (RNAi) 技术特异性地抑制癌基因的表达, 有望达到抗肿瘤的目的。在RNAi过程中真正发挥作用的是小干扰RNA (siRNA) , 其可以通过直接化学合成或体外转录产生。HIF-1α可以介导细胞对缺氧微环境进行适应性反应, 以调节肿瘤的血管发生、肿瘤细胞增殖和凋亡及肿瘤侵袭转移等过程。上皮-间质转化 (EMT) 是上皮细胞与细胞外因子相互作用过程中失去极性及细胞间紧密连接获得移行和游走能力, 转化成具有间质特性的过程, 其可以促进肿瘤的发生、侵袭和转移。上皮钙黏蛋白与锌指转录因子作为EMT过程中的关键调控因子, 通过其特定的生物学活性及相互作用调节EMT的发生从而促进肿瘤的发生、发展。HIF-1α、Snail蛋白的高表达可能是促进直肠癌侵袭转移的重要生物学标志[4]。

低氧微环境刺激肿瘤血管的生成, 促进肿瘤细胞外基质 (extracellularmatrix, ECM) 的结构改变, 增强细胞运动能力, 从而有利于肿瘤侵袭转移。因此ECM依靠蛋白水解酶的降解是肿瘤侵袭转移的关键步骤之一。大量的证据显示, 肿瘤细胞侵袭、转移能力与其产生或诱导基质金属蛋白 (matrixmetallop roteinases, MMPs) 的能力密切相关。研究表明HIF-1可引起MMPs的表达增加进而促进恶性肿瘤的转移。还有研究显示, HIF-1α可通过对肿瘤细胞黏附分子如E-cadherin、β链接素 (β-catenin) 等表达的影响而促进肿瘤转移[5]。本研究Transwell体外侵袭实验检测显示在缺氧条件下结直肠癌SW480细胞的侵袭迁移能力明显增加, 而基因沉默HIF-1α则使其侵袭迁移能力大大降低, 因此笔者认为, 缺氧及HIF-1α可促进结直肠癌SW480细胞的体外侵袭迁移, 增强其侵袭迁移能力。

在肿瘤的侵袭和演进的过程中, 上皮细胞的多形性改变和去分化表现是肿瘤演进的标志。大量证据表明, 在多数肿瘤的原位、恶性肿瘤细胞向周围组织侵袭和远处器官转移的过程中均存在EMT现象。EMT发生主要涉及上皮钙黏蛋白的表达及其稳定性的改变。E-cadherin是钙依赖性跨膜糖蛋白, 能促进细胞间的连接, 维持细胞间接触的稳定和细胞的极性[6]。E-cadherin被视为EMT的主要调控者, 其表达的下调是EMT发生的关键。大量研究表明E-cadherin的表达存在于许多人体肿瘤中, 如结直肠癌[7]、胃癌、乳腺癌、食管癌、肝癌、肾癌、前列腺癌等, 这些人体恶性肿瘤细胞中的E-cadherin常呈低表达, 且低表达组比高表达组侵袭能力强, 表明其与肿瘤的分化、侵袭和转移有显著的相关性[8]。EMT过程还受多种因子的调节, 其中Snail蛋白是一种含有锌指结构的DNA结合蛋白。其主要作用是能识别并与E-cadherin基因启动子部位的E-box序列相结合, 抑制其表达, 从而使E-cadherin表达下调, 引起EMT的发生[9]。大量实验研究已证明, Snail通过促进EMT过程的发生, 大大提高肿瘤的侵袭和转移能力。Snail诱导EMT的发生, 助长肿瘤细胞迁徙和侵袭的能力, 有利于肿瘤侵袭和远处扩散, 是导致患者预后不良的重要原因[10]。

本实验MTT、Transwell、PT-PCR检测结果显示, 缺氧条件下, HIF-1α与Snail呈高表达, E-cadherin呈低表达, 而基因干扰沉默HIF-1α后, Snail在结直肠癌SW480细胞中呈低表达, E-cadherin呈高表达, 且相关性分析发现, HIF-1α与Snail的表达成正相关, 与E-cadherin的表达成负相关, 三者之间具有显著相关性, 提示缺氧与HIF-1α可促进Snail在结直肠癌中的表达, 抑制E-cadherin的表达, Snail可能通过调节E-cadherin的表达促进EMT的发生, 而笔者通过体外生长增殖及侵袭迁移实验得出HIF-1α可以直接促进肿瘤的生长、侵袭和转移, 也可以通过调节Snail和E-cadherin促进EMT的发生发展而增加肿瘤的侵袭转移, Snail也可能通过调节E-cadherin诱导EMT的发生而促进肿瘤的侵袭转移。但具体机制尚待深入探索和研究。

参考文献

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E-cadherin 第7篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2009年10月~2011年10月在我院胸外科行肺癌根治术, 且病史资料完整的60例患者的肺癌组织标本, 同时采取9例正常肺癌组织 (手术标本上切缘, 距肿瘤边缘>5 cm) 。所有组织标本均由常规病理切片HE染色证实为肺腺癌.按TNM分期国际肺癌TNM分期标准进行。60例非小细胞肺癌组织标本中 (实验组) :年龄范围为:38~80岁;性别构成:男性26例, 女性34例;9例肺癌癌旁组织标本中 (对照组) :年龄范围为:37~74岁;性别构成:男性4例, 女性5例。非小细胞肺癌组织标本包含23例腺癌和37例鳞癌。TNM分期:9例Ⅰ期, 16例Ⅱ期, 35例Ⅲ期。组织学分级:①高分化有25例;②中分化有24例;③低分化有11例。未出现淋巴结转移有16例, 出现淋巴结转移有46例。

1.2 方法

标本采用甲醛固定, 石蜡包埋, 4μm连续切片, 常规脱蜡至水后同时行HE染色及免疫组化染色 (Hsp70、MMP-9、VEGF、E-cadherin及CD44v6) 。免疫组化染色阳性为棕黄色或黄褐色, Hsp70蛋白阳性者为细胞浆或细胞核着色。MMP-9和VEGF阳性者在细胞胞浆着色。E-cadherin和CD44v6阳性者主要在细胞胞膜着色。采用半定量积分方法进行分析, 高倍镜下随机选择10个视野, 以表达阳性细胞率和染色强度的得分之和进行判断。①计算阳性细胞百分率:无阳性细胞为0分, 阳在性细胞数<10%为1分;10%~50%为2分;51%~75%为3分, >75%为4分。②测算染色细胞深浅程度:染色强度呈弱染色 (淡黄色) 为1分。中等染色 (棕黄色) 为2分, 强染色 (黄褐色) 为3分。上述两项积分相加:总分为0至7分, 其中总分为0~1分为 (-) , 2~3分者为弱阳性 (+) , 4~5分者为中等强度阳性 (++) , 6~7分者为强阳性 (+++) [10]。

1.3 统计学分析

选用SPSS 15.0统计软件, 对实验结果进行分析软件。采用χ2检验分析方法, P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 Hsp70的表达与患者临床病理特征的关系

Hsp70在肺癌组织和肺旁正常组织中的阳性表达分别为78.3% (47/60) 和22.2% (2/9) 。Hsp70在肺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。从表1可知, 与肿瘤组织学分级、淋巴结转移、TNM分期有关 (P<0.05) , 与肿瘤的分型无关 (P>0.05) (见表1) 。

注:χ2与P值为组间对比

2.2 MMP-9的表达与患者临床病理特征的关系

MMP-9在肺癌组织和肺旁正常组织中的阳性表达分别为76.6% (46/60) 和33.3% (3/9) 。MMP-9在肺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。同时, 从表2可知, MMP-9与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移、TNM分期有关 (P<0.05) , 与肿瘤的组织分型无关 (P>0.05) 。 (见表2)

注:χ2与P值为组间对比

2.3 VEGF的表达与患者临床病理特征的关系

VEGF在60例非小细胞肺癌组织中有41例 (68.3%) 阳性表达, 在9例癌旁正常肺组织中有2例 (22.2%) 阳性表达。从表3可知, VEGF与肿瘤的分型、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期均无关 (P>0.05) (见表3) 。

2.4 E-cadherin的表达与患者临床病理特征的关系

E-cadherin在肺癌组织和肺旁正常组织中的阳性表达分别为83.3% (50/60) 和11.1% (1/9) 。E-cadherin在肺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。从表4可知, 与肿瘤组织学分级、淋巴结转移、TNM分期有关 (P<0.05) , 与肿瘤的分型无关 (P>0.05) (见表4) 。

2.5 CD44v6的表达与患者临床病理特征的关系

CD44v6在肺癌组织和肺旁正常组织中的阳性表达分别为81.7% (49/60) 和11.1% (1/9) 。CD44v6在肺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。从表5可知, 与肿瘤组织学分级、分型、TNM分期均无关 (P>0.05) , 与肿瘤的淋巴结转移有关 (P<0.05) (见表5) 。

注:χ2与P值为组间对比

注:χ2与P值为组间对比

注:χ2与P值为组间对比

3 讨论

肿瘤浸润转移是在基因调控下的多因素、多步骤、多阶段过程, 发现并证实与肿瘤转移高度相关的基因, 已成为研究肿瘤转移机制领域的一个热点。热休克蛋白 (heat shock protein, HSP) 是各种理化因子刺激细胞产生的一类高度保守的蛋白质。它通过影响细胞增殖过程必须的蛋白构象参与细胞周期调节, 并与肿瘤细胞的增殖密切相关, 在多种肿瘤中表达增高[1]。它与细胞的恶性转化过程密切相关[2]。

肺癌转移的发生发展是一个多阶段形成, 多基因参与的复杂过程[3]。在这一系列复杂的过程中, 转移相关蛋白 (metastasis-related protein) 起着关键的作用。主要有MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6等转移相关蛋白。MMP是一组锌离子依赖性内肽酶, 属于明胶酶, 是降解细胞外基质不可缺少的酶, 在恶性肿瘤细胞生长、侵袭、转移中起到很重要的作用。MMP-9在多种肿瘤中表达增高, 并与前列腺癌等多种肿瘤的侵袭和转移有关[3,4]。VEGF是目前公认的肿瘤血管形成的主要调节因子, 可促进肿瘤细胞生长、血管生成及肿瘤的血行转移, 介导肿瘤淋巴管的生成, 促进肿瘤淋巴道转移, 并且抑制细胞凋亡[5]。钙粘素超家族主要介导正常和肿瘤组织细胞-细胞间的黏附, 从而在调节细胞分化、增殖、迁移, 进而与肿瘤细胞的发生发展、浸润转移关系密切[6]。其中E-钙粘蛋白 (E-Cadherin) 是钙粘素超家族中的一个亚型, 属于跨膜蛋白, 由胞膜外区、跨膜区和细胞内区三部分组成。主要分布于上皮组织中, 其结构功能异常使癌细胞粘附松散, 脱落, 并沿血管、淋巴管、组织间隙蔓延生长, 而形成转移灶[7,8]。CD44是位于人类第11号染色体短臂上的基因所编码的细胞黏附分子, 介导细胞间、细胞与细胞外基质间的黏附, 通过细胞黏附、迁移、信号传导等促进肿瘤细胞的侵袭转移。CD44v6是最早被发现的含有变异型外显子v6编码序列的CD44分子, 多项研究发现, CD44v6的过表达与人体多种恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移和不良预后密切相关, 是判断肿瘤生物学行为及预后因素的重要指标[6,7,8,9]。

本研究发现Hsp70、MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6在肺癌组织中的阳性表达水平均明显高于在癌旁组织的表达, 并且Hsp70、MMP-9及E-cadherin与肿瘤组织学分级、淋巴结转移、TNM分期有关 (P<0.05) , 与肿瘤的分型无关 (P>0.05) ;CD44v6与肿瘤组织学分级、分型、TNM分期均无关 (P>0.05) , 与肿瘤的淋巴结转移有关 (P<0.05) ;VEGF与肿瘤的分型、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期均无关 (P>0.05) 。与大多数肿瘤组织中的研究结果相一致。近来研究发现:HSP70高表达与肿瘤密切相关, 在正常组织中多不表达, 但在多种肿瘤中高表达, CALDERWOOD等[10]研究发现, 乳腺癌中有HSP70高表达, 其高表达可能与肿瘤的发生、发展、浸润转移和预后有关。HANASH等[11]报道, Hsp70也可能是早期肝细胞肝癌的敏感指标。EGEBLAD等[12]发现与鳞癌相比较腺癌组织中MMP-9的表达水平更高, 该实验通过对实验数据的检验, 也得出同样的结论, 这符合腺癌较鳞癌更易转移的临床特性。国内帖永新等[13]对60例NSCLC患者的研究显示, E-cadherin蛋白表达与肺癌的分化程度相关, 认为E-cadherin的下调表达与肿瘤的低分化、浸润、转移有关, 本研究的研究结果与该研究有相同的部分。CD44s主要在正常细胞和非转移性肿瘤细胞中表达, CD44v则在肿瘤的发生和转移过程中起重要作用[14]。

综上所述, HSP 70、MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6阳性表达预示非小细胞肺癌具有较强的侵袭和转移能力, 可作为预测非小细胞肺癌转移潜能的生物学指标, 本研究结果可能为NSCLC的临床诊断提供更多的参考的指标, 有利于降低NSCLC的漏诊率和误诊率, 同时为抗肿瘤药物的研制提供新的思路及新的研究方向。

摘要：目的 检测Hsp70与肿瘤转移相关蛋白MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6在非小细胞肺癌组织中的表达, 探讨其表达与肺癌生物学行为的关系, 以研究这些蛋白对非小细胞肺癌转移的作用, 进而探讨其诊断价值。方法 应用免疫组化方法检测60例肺癌组织标本以及9例癌旁正常组织中Hsp70、MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6的表达, 采用统计学方法分析Hsp70与肿瘤相关转移蛋白的表达与患者的临床病理特征的关系。结果 Hsp70、MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6在肺癌组织中的阳性表达水平均明显高于在癌旁组织的表达, 并且Hsp70、MMP-9及E-cadherin与肿瘤组织学分级、淋巴结转移、TNM分期有关 (P<0.05) , 与肿瘤的分型无关 (P>0.05) ;CD44v6与肿瘤组织学分级、分型、TNM分期均无关 (P>0.05) , 与肿瘤的淋巴结转移有关 (P<0.05) ;VEGF与肿瘤的分型、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期均无关 (P>0.05) 。结论 Hsp70、MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6阳性表达预示非小细胞肺癌具有较强的侵袭和转移能力, 可作为预测非小细胞肺癌转移潜能生物学指标。