皮层神经元范文

皮层神经元范文（精选8篇）

皮层神经元 第1篇

关键词：冈田酸,神经毒性,皮层神经元

阿尔兹海默病 (Alzheimer’s disease, AD) 即老年性痴呆是以进行性记忆和认知功能丧失为临床特征的大脑退行性疾病[1], 神经细胞外以β淀粉样蛋白 (Aβ) 沉积为核心形成老年斑 (senile plaques, SP) , 神经细胞内以异常过度磷酸化的tau蛋白为核心形成神经元纤维缠结 (neurofibrillarytangle, NFTs) , tau蛋白是一种微管相关蛋白主要存在于轴突内, 它的主要功能是促进微管的形成和保持微管的稳定性[2]。研究表明, tau蛋白磷酸化程度是体内多种蛋白激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶的去磷酸化两种作用平衡的结果, 其中, PP2A是脑内调节tau蛋白去磷酸化主要的磷酸酶。冈田酸 (okadaic acid, OA) 是一种海洋生物提取物, 对蛋白磷酸酶2A (PP2A) 有特异性抑制作用[3], 研究证实, OA 能特异性降低PP2A活性引起神经元微管相关蛋白tau异常过度磷酸化[4,5], 继而引起神经元毒性。

1 材料与方法

1.1 皮层神经元的培养

选用新生3 d以内的Wister大鼠 (山西医科大学动物管理中心提供) , 乙醚麻醉后, 常规消毒, 打开颅骨, 取出两侧大脑半球, 置于D-Hank’s液中。剥除脑膜, 分离出大脑皮层组织。将皮层组织锐性切割成1 mm3大小, 转移至离心管, 加入0.125%的胰酶, 小心吹打后静置2 min, 吸出并收集上清液, 用D-Hank’s液重悬沉淀的组织, 再次吹打, 直至均形成单细胞悬液。1 000 r/min离心5 min, 弃上清液。加入全培液, 吹打均匀。将细胞悬液转移至预先铺有多聚赖氨酸的培养板上 (MTT测定是细胞培养在96孔板上) , 置37 ℃, 5%CO2培养箱中贴壁培养。细胞贴壁3 d后, 依据细胞生长情况, 按每毫升培养液加入6 μL10 μmol/L的阿糖胞苷作用24 h～48 h, 以抑制胶质细胞的生长, 使神经元得以纯化。根据细胞生长速度和培养液的pH变化, 2 d～3 d半量换液。

1.2 实验分组

将Wister大鼠随机分为正常组、5 nmol/L OA组、10 nmol/L OA组、20 nmol/L OA组与皮层神经元共培养。

1.3 乳酸脱氢酶 (LDH) 的测定

加入OA24 h后, 收集培养上清液, 用PBS洗两遍, 每瓶加入0.1 mol/L PBS -0.05 mmol/L EDTA (pH8.0) 3 mL, 再加入150 μL 1%Triton-X100, 用长吸管反复吹打使细胞溶解, 收集细胞悬液。参照试剂盒说明书测定培养液LDH的活性。

1.4 四唑盐 (MTT) 法测定细胞存活率

取96孔板培养的10 d左右的细胞, 吸弃各孔原培养液, 加入含10%血清的DMEM培养基100 μL, 再加入5 mg/mL MTT工作液20 μL, 混匀, 37 ℃孵育4 h。吸弃各孔培养液, 每孔加入100 μL DMSO, 振荡10 min, 使其充分溶解, 在酶标仪490 nm处测量各孔A值。以正常组A值均数为100%, 计算细胞存活率 (%) =各孔A值/正常值A值均数×100%。

1.5 统计学处理

数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 所有数据用SPSS软件进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代神经细胞培养

原代细胞呈贴壁生长, 接种1 d后, 细胞完全贴壁, 形成椭圆形的芽孢状, 周围有明显的光晕, 细胞折光性好, 活性强。3 d后加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长, 并观察细胞的增殖情况, 得到纯化的神经元。培养至10 d左右细胞状况良好, 胞体呈梭形或锥形, 胞浆透明, 折光性强, 有明显的立体感, 突起发育好, 相互交织成网状。可以用来进行以下试验。

2.2 LDH检测 (见表1)

加入OA后, 随着浓度的增加, LDH也显著增加, 且呈现剂量依赖性, 5 nmol/L OA组与正常组差异无统计学意义。显微镜观察显示, 加入20 nmol/L OA后大部分神经元的胞体折光性下降, 突起回缩明显, 甚至断裂溶解成碎片, 而5 nmol/L的OA与正常组差异无统计学意义。

2.3 MTT检测 (见表2)

正常组细胞存活率为100%, 加入OA后, 细胞活力显著降低, 5 nmol/L OA组与正常组比较差异无统计学意义, 10 nmol/L OA组、20 nmol/L OA组的OA引起细胞活力逐渐下降 (P<0.05) , 表现为MTT水平降低。

3 讨论

皮层神经元 第2篇

目的` 观察巴曲酶对原代培养新生SD大鼠皮层神经元上钙激活钾通道(Kca)作用.方法 采用细胞贴附和内面向外两种膜片钳单通道记录技术检测巴曲酶对Kca作用.结果 在钙浴液内,细胞贴附式膜片上,钳制膜电位+30 mV,加入不同浓度巴曲酶0.15 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L,通道开放概率由0.005分别增加为0.013±0.002、0.082±0.011、0.131±0.012、0.211±0.010、0.062±0.009(P＜0.01),在0.75 mmol/L以内表现出浓度依赖性.在无钙浴液内,细胞贴附式膜片上,钳制膜电位+50 mV,随巴曲酶浓度增加为0.15 mmol/L、0.40 mmol/L、0.60 mmol/L、1.0 mmol/L时,通道开放概率由0.005分别增加为0.013±0.001、0.112±0.007、0.193±0.010、0.301±0.009(P＜0.05).6例内面向外式膜片上,钳制膜电位+40 mV,分别加入巴曲酶0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L 3 min后,通道开放概率分别为0.012±0.007、0.011±0.009、0.013±0.008(P>0.05),巴曲酶在胞内Kca开放概率,平均开放/关闭时间,电流幅值均无明显变化.结论 巴曲酶通过影响胞内游离钙水平间接调节Kca,可能对神经元有直接保护作用.

作 者：赖晓晖 朱文梅 徐刚 袁光固 LAI Xiao-hui ZHU Wen-mei XU Gang YUAN Guang-gu  作者单位：赖晓晖,朱文梅,袁光固,LAI Xiao-hui,ZHU Wen-mei,YUAN Guang-gu(四川大学华西医院,神经内科,成都,610041)

徐刚,XU Gang(四川省人民医院)

刊 名：四川大学学报（医学版）  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2006 37(5) 分类号：Q5 关键词：神经元   钙激活钾通道   巴曲酶   膜片钳  

皮层神经元 第3篇

对于给定刺激, 建立神经元响应与刺激之间的模型已有多种建模方法, 20世纪90年代, Olshausen和Field提出了稀疏编码模型, 对V1区简单细胞感受野进行建模[1]。目前, 其研究成果已成功地应用于图像合成、特征提取、图像恢复等方面。Bell、Hateren、Hyvarinen等人通过独立分量分析 (ICA) 方法, 得到了与稀疏编码相类似的结果[2—4]。近年来, 随着技术手段和认知水平的提高, 人们对视觉系统的处理机制有了更加深入的了解, 发现视皮层神经元的发放活动由多重因素共同影响[5], 且大多采用非线性的信息处理方式[6]。D.C.Knill等人提出了贝叶斯编码假说, 认为贝叶斯推断是通过神经元发放序列重构外部刺激的基本法则之一[7]。Pillow等利用广义线性模型 (GLM) 对视网膜神经节细胞进行建模, 预测了单个神经节细胞的刺激响应发放序列[8];Calabrese等人对GLM进行改进, 将神经元发放历史对神经元发放的影响加入模型, 在刺激滤波器后加入神经元发放历史滤波器, 预测了听觉神经元的刺激响应序列[9]。然而, 以上研究均未考虑神经元之间的耦合作用。Park和Pillow建立了基于线性-非线性-泊松 (LNP) 模型的神经元发放模型, 模型中考虑了神经元之间的耦合作用, 并用猕猴初级视觉皮层胞外记录的神经元发放数据对模型正确性进行了验证[10]。然而, 该模型计算了所有神经元之间的耦合作用, 与生物神经系统高效的信息处理机制不相符合。生物学研究表明, 生物神经系统具有高效的信息传递能力, 神经元间的连接结构具有小世界网络的特征[11—13]。

针对以上问题, 提出了一种改进的LNP模型的神经元发放模型, 模型包含三个模块:刺激调制模块, 发放历史影响模块和集群活动整合模块。刺激滤波器选择为稀疏编码模型训练的基函数, 与传统方法相比更加符合视觉神经系统的生理特性;在构建集群活动整合模块时, 考虑大脑的高效信息处理机制, 引入小世界网络建立神经元间的连接结构。最后, 利用该模型对Long Evans (LE) 大鼠V1区神经元进行建模, 对重复光栅刺激及单次刺激下的神经元响应进行预测, 验证模型的有效性和正确性。

1 初级视皮层神经元发放模型的构建

生物学研究表明, 神经元发放活动主要受三个因素的共同影响———外部刺激信息的调制作用 (如刺激或行为) 、神经元自身发放历史的影响和邻近耦合神经集群发放活动的影响[14]。基于该理论框架, 提出了一个新的神经元发放模型, 模型的总体框架如图1所示。

模型包含三个模块:刺激调制模块、发放历史影响模块和集群活动整合模块。其中, 刺激调制模块表征外部信号的协同作用, 表示为刺激滤波器A与输入图像之积, 记为AX;发放历史影响模块表征神经元自身发放历史的影响, 表示为神经元自身发放历史与发放历史滤波器h之积, 记为h Yi;集群活动整合模块表征并发的集群活动的影响, 表示为邻近神经元耦合滤波器O与耦合强度p之积, 记为∑pi Oi;三个模块加权求和后取幂值, 得到神经元的发放序列Y, 即

式 (1) 中, i, j, k为加权系数, X为输入刺激图像, Yi为神经元发放历史序列。

刺激滤波器A选择为稀疏编码模型训练的基函数;考虑到皮层神经元的连接具有小世界网络特征, 在构建集群活动整合模块时, 将神经元的耦合滤波器O乘以经小世界网络模型优化的连接系数E, 对模型神经元的连接结构进行优化。

1.1 刺激调制模块

研究表明, 初级视觉皮层的视觉处理过程受到环境统计特性的影响[15]。稀疏编码模型从自然图像中训练得到基函数, 所得基函数反映了自然图像的统计特性, 且具有简单细胞感受野的特征。

在视觉系统进行信息处理的过程中, 感受野被看作是一组滤波器, 自然图像可表示为一组基函数滤波器的线性叠加, 即

式 (2) 中X为自然图像, A为线性的基函数, S为神经元的响应。

生理学研究表明神经元的响应S具有稀疏响应的特性[16], 即同时被激活的神经元数尽可能地少。定义一个稀疏代价函数衡量响应的稀疏度

f为非线性函数

同时定义一个函数项以衡量重构误差

两项求和得到稀疏编码模型的目标函数为

使用梯度下降法寻找目标函数的最优解实现对基函数阵A的学习。学习得到的基函数 (局部) 如图2 (a) 所示。

为了更清晰地表征基函数的各项特征, 对训练后的基函数做进一步的处理。使用与兴奋区具有相同二阶统计量的椭圆来近似兴奋区形状 (如图2 (b) 所示) , 近似的椭圆公式为

式 (7) 中近似椭圆长轴与横坐标的夹角θ表示基函数的朝向特征, 椭圆的中心位置W (x0, y0) 表示基函数的位置特征, 椭圆面积F表示频率特征。

计算电生理实验测得感受野特征与基函数特征之间的误差值

取误差最小的基函数构成刺激滤波器, 匹配得到的基函数 (局部) 如图2 (c) 所示。

选择的基函数构成刺激滤波器A, 与输入图像X之积构成刺激耦合模块, 表示为

1.2 发放历史影响模块的构建

神经元响应后, 会在短暂的时间 (3~5 ms) 内形成不应期, 以防止过快的连续响应[17]。依据神经细胞的这种机制, 以神经细胞的不应期表征神经元自身发放历史的影响, 并以此构建模型的发放历史影响模块。

发放历史滤波器选择为时延函数h, 由凸的余弦分量表示, 其表达式为

神经元的不应期用神经元的发放历史序列Y与时延函数h之积来表征。因此, 模型发放历史影响模块的数学表达式为

1.3 集群活动整合模块的构建

1.3.1 模型神经元的连接结构

生物学研究表明, 脑皮层神经元节点的连接方式满足小世界网络的结构特征。因此, 在考虑神经元之间的耦合作用时, 使用小世界网络模型方法建立神经元间的连接结构。

在模型中引入小世界网络之前, 首先要定义神经元之间的距离。这里将基函数特征向量之间的欧式距离近似定义为神经元之间的距离, 距离计算公式为

式 (12) 中, N (·) 是归一化函数, 它把函数值映射到[0, 1]之间。

依据式 (12) 计算出节1.1中选则的基函数之间的距离, 并依据该距离对神经元进行标号排序。用小世界网络模型方法建立排序后的神经元之间的连接结构, 这里使用WS小世界网络模型, 得到模型神经元连接系数矩阵E, 重连后的神经元连接结构如图3所示。

连接系数矩阵E为n×n维二值矩阵 (n为神经元个数) , 矩阵元素值为0或1;E (i, j) =0表示神经元i与神经元j无连接 (即无耦合作用) , 反之, 则表示有连接 (即有耦合作用) 。

1.3.2 模型神经元之间的耦合作用

模型中神经元j对神经元i发放率的影响由两个神经元历史发放序列之间的相互作用O与耦合强度p之积来表征, 计算公式如下。

式 (13) 中, p (i, j) 为n×n维 (n为神经元个数) 耦合强度矩阵, 矩阵中的参数由响应数据拟合得到;Yi和Yj分别为神经元i和神经元j的发放历史序列;t为迭代步, 取Δt=1;{·}表示求t步内的平均值, 拟合模型参数时, 取10步内的平均值。

将神经元间的耦合作用求和后, 乘以小世界网络优化得到的连接系数矩阵E, 得到集群活动整合模块的数学表达式为

2 模型的验证方法

2.1 电生理实验

实验采用健康的成年雄性LE大鼠, 体重200~300 g。术前腹腔注射10%的水合氯醛 (4 m L/kg) 进行完全麻醉, 术中持续补注水合氯醛 (2 m L·kg-1·h-1) 以维持大鼠的麻醉状态。将大鼠头部固定于立体定位仪, 剃去头部毛发, 切开头部皮肤, 暴露颅骨, 实施开颅手术。根据脑图谱在V1区对应位置开一个2 mm×5 mm的长方孔, 操纵微型操作器将Microprobes铂铱合金微电极阵列植入大鼠的初级视觉皮层。电极阵列为2×8排列, 电极间距250μm。手术结束后, 将大鼠眼睛遮蔽休息半小时左右后再进行视觉刺激, 刺激图像为12个朝向的全屏光栅, 光栅刺激仅朝向发生改变, 空间频率保持不变, 使用Cerebus TM数据采集系统采集大鼠V1区神经元信号。

2.2 模型参数的获取

采集到的生物信号将首先用于模型基函数的选取。从在稀疏编码研究领域被广泛采用的自然图像集 (自然图像集来源网站:http://www.cis.hut.fi/projects/ica/data/images) 中选择10幅自然图像, 从自然图像中随机抽取16×16像素的图像块, 经过白化处理后, 作为稀疏编码模型的输入, 经过10 000步迭代运算后, 得到256个训练过的基函数。利用节1.1中的方法, 将这些基函数与实验记录到的12个神经元的感受野特性征相匹配, 选出匹配度最高的12个基函数。

然后, 选择的12个基函数依据式 (12) 计算距离, 排序后通过WS小世界网络模型得到神经元的连接系数矩阵E。依据节1.1~节1.3的内容构建模型的各个模块, 加权求和后得到完整模型。神经生理实验测得的实际数据为模型神经元发放历史Yi提供初始值。

模型的训练数据从神经生理实验获得的响应数据中随机抽取, 采用交叉互验证法训练和验证模型。随机抽取80%的实验数据用以训练模型参数, 20%的数据用以验证模型的准确性。采用极大似然估计法估计模型参数, 迭代至收敛。

2.3 模型的性能评价

为了验证模型的性能, 首先利用模型预测重复光栅刺激下神经元的发放序列。本文中的模型与传统模型相比主要做了两点改进, 分别为刺激滤波器的改进和神经元连接结构的优化。为了研究两个改进对模型性能的影响, 共设置了三组实验:第一组实验的设置为了研究刺激滤波器的改进对模型的影响, 将刺激滤波器的选择作为变量, 实验组模型采用稀疏编码训练的基函数作为刺激滤波器, 对照组选为生理数据拟合的Gabor滤波器, 神经元之间的连接均设置为全连接方式;第二组实验中变量为神经元的连接结构, 模型的刺激滤波器为Gabor滤波器, 实验组模型引入小世界网络优化神经元连接结构, 对照组模型设置为全连接;第三组实验用既改进刺激滤波器又引入小世界网络优化结构的模型与传统模型进行对比。

为了进一步测试模型性能, 利用模型预测单次刺激下神经元和神经元集群的响应发放率。

为了量化模型性能, 引入Pillow和Paninski提出的方法[18], 计算模型捕获PSTH方差的百分比, 计算公式为

引入相关系数与均方误差衡量预测序列与实测数据间的相关程度和预测精度, 计算公式分别为

相关系数

均方误差

3 实验结果及分析

生理实验记录到的数据经过预处理后, 选出神经元发放数量较大的12个神经元的Spike序列进行建模。模型输入为16×16像素的全屏光栅。根据最大响应确定神经元的最优朝向, 使用1 s的最优朝向刺激重复刺激20次, 计算单个神经元发放响应序列的统计平均值, 以10 ms为bin宽做PSTH统计曲线, 并使用核半径为10 ms的高斯核平滑该曲线。

单个神经元在最优朝向刺激下各实验组模型、对照组模型与实测值的PSTH对比如图5所示。

计算图5中各模型捕获PSTH的方差百分比。刺激滤波器作为变量的实验组中, 采用基函数作为刺激滤波器的模型比采用Gabor滤波器的模型多捕获了2.7%的PSTH方差。引入小世界网络优化模型连接结构后, 模型捕获的PSTH方差百分比提高了7%。经过两种优化方法优化后, 模型捕获PSTH的方差百分比提高了10.1%。对7只不同大鼠V1区神经元进行建模, 统计对84个神经元的建模结果, 统计结果表明, 改进刺激滤波器后模型捕获的PSTH方差百分比提高了3.6% (±0.05%) , 引入小世界网络后模型捕获PSTH方差百分比提高了5.8% (±0.07%) , 经过两种优化方法优化后, 方差百分比提高了11.2% (±0.13%) 。改进模型捕获实测神经元PSTH的方差百分比均高于78% (±0.84%) 以上。该结果表明, 选择稀疏编码训练的基函数作为刺激滤波器以及采用小世界网络优化连接结构分别对模型精度有所提高;同时加入两种优化结构模型的预测精度显著提高。

进一步计算模型神经元的PSTH与实测PSTH之间的相关系数, 统计对7只不同大鼠建模的84个神经元所得到的结果, 得到三个对比组的相关系数对比结果如图6所示。

分别计算图6中各模型的相关系数平均值, 结果显示, 引入小世界网络优化模型结构后, 模型PSTH与V1区神经元PSTH之间相关系数达到0.904 1 (±0.011 9) , 改进刺激滤波器后相关系数平均为0.861 1 (±0.010 9) , 经过两种优化方法优化的模型相关系数平均值介于以上两种优化模型之间。各优化模型与实测数据间的相关系数均高于对照组模型。该结果表明, 加入小世界网络优化结构后, 模型值与实测值具有更高的相关性, 也即模型的生物相似性得到了提高。

进一步研究在单次光栅刺激下, 加入两种优化结构的模型的预测性能。统计单个神经元在不同朝向单次光栅刺激下的平均发放率, 通过模型得到的响应和生理学实验获得的响应的对比结果如图7所示。

利用模型进一步对单次光栅刺激下12个神经元的集群响应进行预测, 预测结果与生理学实验结果的对比如图8所示。

分别计算图7和图8中模型预测神经元发放率曲线与实测曲线之间的相关系数和均方根误差。单个神经元响应的相关系数为0.921 9, 均方根误差为0.043 9;集群响应的相关系数为0.861 8, 均方根误差为0.645 7。统计对7只大鼠建模的结果, 单个神经元模型值与实测值相关系数达到0.915 9 (±0.014 5) , 集群响应的相关系数达到0.867 7 (±0.010 7) 。该结果表明, 模型较为准确的预测了神经元在不同朝向光栅刺激下的发放率。

4 讨论

皮层神经元 第4篇

1 材料方法

1.1 材料

健康Sprague-Dawley (SD) 大鼠由山西医科大学动物中心提供。DMEM培养基、胎牛血清、D-Hank’s平衡液购于Gibco-BRL (Carlsbad, CA, USA) 。谷氨酰胺、MTT、Calcein-AM和Humanin购于Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA) 。丙二醛 (MDA) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 检测试剂盒购于中国南京建成生物公司。全自动酶标仪 (Elx800, 基因公司, 广州) , 荧光显微镜 (OLMPUS, Tokyo, 日本) 。

1.2 方法

1.2.1 原代皮层神经元培养

无菌分离1 d～3 d 大鼠额前皮层, 无菌手术剪刀剪碎, 0.125% 胰蛋白酶消化10 min, 机械吹打至均匀分散。灭活胎牛血清 (FBS) 终止消化, 0.22 μm滤器过滤。800 g 离心5 min后弃上清, 用含10% FBS, 4 mmol/L谷氨酸, 4.5 g/L D-葡萄糖和100 U的青霉素的DMEM/Ham’s F12培养基稀释沉淀。将细胞种植在提前包被多聚赖氨酸的培养皿上。置于37 ℃, 5% CO2孵箱中进行培养。培养24 h 后加入阿糖胞苷阻止胶质细胞分裂。通过相差显微镜进行细胞生长状态的观察。培养10 d后取生长良好的细胞进行实验。

1.2.2 神经元鉴定

培养10 d的细胞用4%甲醛固定20 min。PBS洗3次, 每次5 min。用0.4% Triton配制的5% BSA室温封闭1 h, PBS洗3次, 每次5 min;抗MAP2一抗 (1∶1 000) 37 ℃ 2 h, PBS洗3次, 每次5 min;生物素化的二抗 (1∶200) 室温1 h, PBS洗3次, 每次5 min;Cy3孵育37 ℃ 2 h, PBS洗3次, 每次5 min。用Olympus BX40 显微镜进行观察, 图片用IPP 4.5软件进行处理。

1.2.3 缺氧分组和HN处理

取培养10 d状态良好的神经元, 对照组继续正常培养4 h, 缺氧组置于缺氧孵箱内 (氧含量<2%) 4 h。药物组分别于缺氧前24 h加入终浓度为10 μmol/L和20 μmol/L的HN。

1.2.4 MDA、SOD、LDH测定

依据南京建成生物公司试剂盒的说明书操作。

1.2.5 MTT测定

细胞种植于96孔板上。缺氧实验后每孔加入20 μL 0.5 mg/mL MTT孵育4 h。弃上清, 每孔加入150 μL DMSO, 摇床上放置10 min。全自动酶标仪490 nm波长进行吸光度测定。细胞存活计算公式如下: (实验组吸光度-空白对照组吸光度) / (对照组吸光度-空白对照组吸光度) ×100%。

1.2.6 Calcein-AM染色

Calcein-AM 可以作为一种活细胞的荧光探针。缺氧后加入终浓度为20 μmol/L Calcein-AM 37 ℃ 孵育30 min。 D-Hank’s平衡液冲洗3次, 每次5 min。 使用OLMPUS荧光显微镜进行观察。

1.3 统计学处理

实验数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示。组间比较用成组t检验。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 神经元鉴定

细胞种植到培养皿上4 h～5 h 后即可观察到轴突生长。3 d 后观察胞体呈椭圆形或三角形, 饱满有光晕。可以看到单极或双极神经元。10 d 后观察细胞成熟, 突触生长良好, 相互之间形成网络状。MAP-Cy3免疫组化显示神经元数目可以达到95%。

2.2 HN提高缺氧引起的细胞活力下降

2.2.1 MTT法检测 (见表1)

以对照组为100%计算, 缺氧4 h 可以引起细胞活性由100%降低到86.64% (P<0.05) , 缺氧前24 h 加入10 μmol/L HN可以保护细胞活性恢复至 94.13% (P<0.05) , 而缺氧前24 h 加入20 μmol/L HN可以保护细胞活性恢复至 97.10% (P<0.05) 。

2.2.2 Calcein-AM染色

缺氧4 h 后可以看到细胞的荧光活性明显降低, 并且可以看到有很多细胞碎片。缺氧前24 h 加入10 μmol/L HN可以看到细胞荧光活性有了明显改善, 而缺氧前24 h 加入20 μmol/L HN可以使细胞的荧光活性基本上恢复到正常水平。

2.3 HN抑制缺氧引起的细胞损伤

2.3.1 LDH检测

缺氧4 h可以使细胞和培养基中LDH水平分别上升1.56倍和2.17倍 (P<0.05) 。缺氧前24 h 加入10 μmol/L HN可以使细胞和培养基中的LDH水平分别降低1.35倍和1.50倍 (P<0.05) 。缺氧前24 h 加入20 μmol/L HN具有更明显的效果, 可以使细胞和培养基中的LDH水平分别降低了1.07倍和1.37倍 (P<0.05) 。

2.3.2 MDA检测 (见表3)

缺氧4 h可以使细胞和培养基中MDA的生成分别上升1.83倍和1.69倍 (P<0.05) 。缺氧前24 h 加入10 μmol/L HN可以使细胞中MDA的生成降低1.52倍 ( P<0.05) , 可以使培养基中MDA的生成降低1.65倍, 但差异无统计学意义 (P>0.05) 。缺氧前24 h 加入20 μmol/L HN具有显著的抑制作用, 可以使细胞和培养基中的LDH水平分别降低1.04倍和1.37倍 (P<0.05) 。

2.3.3 SOD检测 (见表4)

缺氧4 h可以使细胞和培养基中SOD活性分别上升1.22倍和1.29倍 (P<0.05) 。缺氧前24 h 加入10 μmol/L HN可以使细胞中SOD活性降低1.03倍 (P<0.05) , 可以使培养基中MDA的生成降低1.25倍, 但差异无统计学意义 (P>0.05) 。缺氧前24 h 加入20 μmol/L HN可以使细胞和培养基中的SOD水平进一步分别降低0.98倍和1.08倍 (P<0.05) 。

3 讨论

Humanin是2001年由日本学者在老年痴呆患者的大脑皮层枕叶发现的一种由24个氨基酸组成的线性多肽[1]。研究发现, HN可以抑制由Aβ完整肽链及Aβ25-35片断诱导的神经元死亡[2,3]。之后的研究发现, HN除能拮抗Aβ引起的神经细胞死亡之外, 还能拮抗家族性遗传基因突变引起的神经损伤。而对其他原因的损伤似乎不表现保护作用。因此, 发现者将其定义为AD特异性的神经保护肽。由于AD发病因素复杂, 机制不清, 缺乏有效的防治, 因此, HN的发现受到了神经科学工作者的广泛关注, 被认为有可能成为未来治疗AD的有力工具。但随着研究的逐步深入发现, HN可以降低Ca2+超载, 维持胞内Ca2+稳态;可以提高三磷腺苷 (ATP) 从而改善细胞功能[4];可以抑制Bax由胞浆转位至线粒体, 从而抑制线粒体途径的凋亡[5];可以抑制JNK-c-jun及FasL[6]的表达, 从而抑制死亡受体途径的凋亡。HN的上述神经保护机制强烈提示, HN不只是一种特异性针对AD相关损伤的神经保护因子。因为无论是抗凋亡还是降低Ca2+超载或提高ATP改善细胞功能都不可能是只针对某一特定损伤产生保护作用的机制。而且已有的一些实验研究也提示, HN对AD以外的损伤也具有保护作用, 如HN可拮抗东莨菪碱等诱导的神经损伤以及缺血引起的PC12细胞的损伤[7]。鉴于上述因素, 设计了本实验, 旨在观察HN是否可以保护由缺氧造成培养皮层神经元损伤。

本实验采用的观察指标包括两个方面, 一是对细胞活力的检测, 包括MTT细胞活力分析及Calcein-AM染色, 它们都可用来反映细胞活力从而确定细胞在缺氧及给予HN处理后存活率的变化。另一指标体系是测定与缺氧损伤相关的三种物质的变化: MDA、SOD、LDH[8,9]。MDA是一种在缺氧状态下生物膜中多不饱和脂肪酸受到自由基攻击所形成的一种脂质过氧化物, 因而测定MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度, 间接反映细胞损伤的程度[10,11]。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合, SOD是以氧自由基连锁反应前体物O2-为唯一底物的天然酶类清除剂, 构成了机体抗活性氧的第一道防线[12]。SOD 活性的高低可反映氧自由基水平。所以MDA的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度, 而SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。此外, 中枢神经元中存在大量LDH, 其化学和生物学性质十分稳定。通常情况下神经细胞内的LDH很少释放, 而神经元受损后会引起LDH的大量释放, 因此LDH测定可反映神经细胞损伤程度。

本研究中MTT的活性分析表明缺氧后细胞活性明显降低, HN (10 μmol/L) 可以使细胞活性提高, 而HN (20 μmol/L) 的保护作用则更加显著。Calcein-AM染色结果和MTT活性分析结果相一致, 缺氧导致Calcein-AM染色阳性的细胞明显减少, 即有活性的细胞明显减少。预先应用HN (10 μmol/L) 对缺氧的损伤即有保护作用, HN (20 μmol/L) 的保护作用明显增强, 表现为Calcein-AM阳性染色的细胞明显增加。缺氧后LDH升高, 说明缺氧引起细胞膜破裂, HN预处理后LDH的降低说明HN可以保护细胞膜的完整性。同时HN可以降低缺氧导致的MDA的升高, MDA的升高说明缺氧后脂质过氧化反应增强, 而HN可以通过减少脂质过氧化达到保护细胞的作用。虽然有很多研究报道细胞损伤后SOD的活性下降, 但是在我们的实验模型中缺氧后SOD的活性升高, 说明缺氧后细胞应对外界损伤的抵抗作用增加。HN作用下SOD的降低也说明了外界的损伤减少, 也可以从另一个角度说明HN可以降低外界损伤, 对细胞起保护作用。

皮层神经元 第5篇

1 材料与方法

1.1 实验试剂

胎牛血清、马血清、DMEM (Gibco) , 阿糖胞苷、L-多聚赖氨酸、N2营养因子、B27营养因子、胰蛋白酶 (1 ∶250) 、碘化丙啶 (PI) 、Hoechst 33342、中性红 (sigma) , 神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 单克隆抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) , 醋酸铅Pb (CH3COO) 23H2O (天津化学试剂六厂, 分析纯) , 其余为国产分析纯试剂。

1.2 实验仪器

CO2培养箱 (NU-2500, 美国) , 生物安全柜 (BSC-15002B2, 中国) , 荧光倒置相差显微镜及照相系统 (XI-70, Olympus, 日本) , 酶标仪 (MK3, 中国) , 解剖显微镜 (X-TR, 日本) 。

1.3 实验动物

出生24 h以内的新生Wistar大鼠 (购自甘肃中医学院实验动物中心, 动物合格证号:spf级动物质量合格证号:scxk甘2004-006-152) 。

1.4 乳大鼠皮层神经元体外分散培养

在超净台内无菌低温取出新生乳大鼠的皮层组织, 在解剖显微镜下用眼科镊剥除脑膜和血管, 用解剖液 (表1) 冲洗2遍, 剪碎组织, 用0.125%的胰蛋白酶37 ℃消化20 min。用种植液 (表2) 冲洗2遍后, 加2 ml种植液, 用吸管轻轻吹打10～15次, 制成细胞悬液, 将细胞悬液静置一二分钟, 吸取上清入另一管, 再加2 ml种植液, 重复上一过程, 合并上述细胞悬液。用200目滤网过滤, 计数后, 按6孔板1106/孔, 12孔板5105/孔, 24孔板2105/孔的密度接种于用0.1 g/L的L-多聚赖氨酸包被过的培养板上, 在37 ℃、5%CO2、100%湿度的条件下生长。24 h后改用饲养液 (表3) 培养, 每三四天半量换液。接种后5～7 d后用2～5 mg/L的阿糖胞苷作用48 h, 去除神经胶质细胞。

注:将配好的解剖液调节pH值至7.2～7.3, 0.2 μm滤器过滤备用。

注:将DMEM的pH值调至7.2～7.3, 0.2 μm滤器过滤备用。

注:将DMEM的pH值调至7.2～7.3, 0.2 μm滤器过滤备用。

1.5 体外培养皮层神经元鉴定

皮层神经元的鉴定采用免疫组织化学的方法, 一抗用兔抗人NSE单克隆抗体, 操作按北京中杉生物技术有限公司提供的过氧化物标记的链霉素卵白素染色试剂盒所附说明书进行。操作步骤如下:倾去培养液, 用PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定2 h;用蒸馏水冲洗, PBS浸泡5 min;加入正常血清工作液封闭, 置室温下10～15 min后倾去;加入1 ∶100稀释的一抗, 置4 ℃过夜:用PBS冲洗, 3 min/次, 洗3次;加入生物素标记羊抗人IgG, 置室温下10～15 min, 用PBS冲洗, 3 min/次, 洗3次:加入辣根酶标记链霉素卵白素工作液, 置室温10～15 min, 用PBS冲洗, 3 min/次, 洗3次;DAB显色系统显色;显微镜下观察。

1.6 醋酸铅对皮层神经元的作用

将前述细胞悬液分别接种在6孔板中 (每孔中放置4～6片盖玻片并预先用多聚赖氨酸包被处理) , 37 ℃、5%CO2孵箱中培养爬片, 第8天将6孔板分为对照组和铅染毒组, 于不同浓度醋酸铅 (50、100和200 μg/ml) 处理24 h后捞片, 对照组不做任何处理, 分别进行PI-Hoechst 33342双重染色和神经元尼氏体染色。另将细胞悬液接种在96孔板中, 第8天将96孔板分为对照组和铅染毒组 (每组3个复孔) , 于不同浓度醋酸铅 (50、100和200 μg/ml) 染毒24 h后进行中性红染色。

1.6.1 PI-Hoechst 33342双重染色及荧光显微镜观察[5]

分别用PBS将荧光染料PI和Hoechst 33342均配置成100 μg/ml的浓度, 4 ℃避光保存。染色前, 将细胞爬片用PBS洗一遍后加入染色混合液 (180 μl PBS, 20 μl Hoechst 33342和200 μl的PI) 100 μl;37 ℃孵育15 min, 在荧光显微镜下观察, 照相。

1.6.2 中性红染色[6]

用去离子水配置0.4%中性红储存液, 0.22 μm过滤后, 4 ℃避光保存。使用之前将中性红储存液用新鲜培养液配置成50 mg/L, 37 ℃孵育8～12 h, 1500 r/min离心5 min (离心半径=80 mm) , 沉淀结晶。检测前吸去培养液, 加入适量50 mg/L的中性红溶液, 置孵箱3 h;吸去培养孔内的中性红, 加入适量的钙-甲醛溶液 (甲醛溶液1%, 无水氯化钙1%, 去离子水98%) 固定, 固定时间少于2 min;吸去固定液, 加入与中性红等量的酸性乙醇 (含体积分数1%冰醋酸, 50%乙醇) 溶液, 抽提出吸附于活细胞的中性红, 混合均匀;在540 nm波长处测吸光度值。

1.7 统计学分析

实验数据以均值±标准差表示, 采用SPSS 6.12统计软件包对实验数据进行单因素设计资料的多水平方差分析, Student-Newman-Keuls test (SNK) 检验进行均数两两比较, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代培养皮层神经元形态及鉴定

上述方法分散的皮层神经元呈单个分散状态, 胞体明亮, 直径约5～10 μm。大多数皮层神经元在接种后1 h贴壁, 绝大多数是单个分散的, 少数有细胞聚合的现象, 3～5 h后细胞开始变平, 并且长出一二个突起。3 d后, 许多细胞长出数个突起, 呈现锥体形或星形, 神经元胞体清晰明亮, 呈明显突起, 胶质细胞胞体呈扁平状, 无规则。神经元在7～10 d后开始成熟, 胞体逐渐延长至30～40 μm, 晕光明显, 突起变粗、变长, 并且有分支, 边缘清晰, 形成明显的神经网络 (图1a) 。免疫组织化学方法显示, 皮层神经元被特异地染上了棕红色, 细胞之间形成了明显的神经网络。皮层神经元底部铺着大而扁平的神经胶质细胞支持其生长, 但神经胶质细胞未被染上棕红色 (图1b) 。

a:培养7 d后皮层神经元;b:皮层神经元NSE标记后免疫组化图

2.2 醋酸铅对皮层神经元形态的影响

不同浓度醋酸铅染毒皮层神经元6 h后, 有少量细胞漂浮现象, 少部分细胞突起开始变细, 胞体变小, 与对照组比较, 从形态上观察没有显著的差别;12 h后, 漂浮的细胞增多, 部分细胞收缩变圆, 但未失去折光性, 中、高浓度醋酸铅组细胞出现聚集现象;处理24 h后, 圆形细胞继续增多, 且失去光泽, 大部分细胞突起变细, 胞体变小, 中、高浓度醋酸铅组有大量细胞聚集现象;48 h后, 大部分细胞死亡, 存活的细胞形态不完整。

2.3 PI-Hoechst 33342双染色

皮层神经元在正常培养条件下, 绝大部分细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光 (图2a) 。各组醋酸铅处理后12 h, 部分细胞核出现核固缩, 胞内形成蓝色圆形颗粒, 即开始出现凋亡, 随着醋酸铅浓度的增加和培养时间的延长, 出现核固缩细胞增多, 呈红色荧光细胞比例增加, 且红色荧光聚集成团, 即凋亡细胞增加。24 h小时时呈红色荧光的细胞比例明显增加, 50 μg/ml醋酸铅染毒细胞呈红色荧光细胞的比例 (34.4%, 图2b) 明显低与醋酸铅组 (中浓度和高浓度87.3%和94.5%,

图2 c, 2 d) ;在48 h醋酸铅各组细胞均大部分 (>90%) 呈红色荧光, 无明显差异。

2.4 中性红染色检测

不同浓度醋酸铅作用于皮层神经元不同时间后利用中性红染色测定细胞活性 (图3) 。各染铅组细胞活性随时间的延长而降低, 但除200 μg/ml醋酸铅处理组在24和48 h较6 h差异有统计学意义 (P<0.05) 外, 其余差异均无统计学意义 (P>0.05) 。各染铅组细胞活性随染铅剂量的增加而降低, 尤其是高铅组 (200 μg/ml) 与对照组 (0 μg/ml) 及低铅组 (50 μg/ml) 相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

a:正常培养条件;b:50 μg/ml醋酸铅染毒24 h; c:100 μg/ml醋酸铅染毒24 h;d:200 μg/ml醋酸铅染毒24 h。

3 讨论

铅是一种存在于环境中的神经毒元素。虽然近些年来人们做了不少努力, 比如限制含铅油漆的使用, 降低汽油中的铅含量等等, 但是环境中的铅污染依然存在, 铅中毒仍然是儿童环境健康的首要问题, 生长发育期的中枢神经系统对铅的毒性特别敏感[7,8]。铅在大脑中引起的损害主要集中在一些特殊的区域, 例如大脑皮层的额前区、海马回和小脑, 铅中毒的一些特征性临床表现正是与这种特殊部位的特点密切相关[9,10,11,12]。大脑皮层控制着动物和人的行为及认知功能, 脑皮层也是铅神经毒性作用的敏感部位。

本实验在慢性铅中毒对大鼠脑组织损伤研究的基础上[4], 在细胞水平观察到低、中、高浓度醋酸铅 (50、100、200 μg/ml) 作用于皮层神经元不同时间后细胞存活明显低于正常对照组, 并呈剂量和时间依赖关系。我们通过中性红染色和PI-Hoechst 33342双染色探讨了醋酸铅对体外培养大鼠皮层神经元的毒性效应。PI和Hoechst 33342是2种亲核染料, 它们与DNA的结合是非嵌入性的, 其主要结合在DNA的A-T碱基区。Hoechst 33342相对分子质量较小, 可穿透活细胞和死细胞的细胞膜, 与DNA结合后在紫外光的激发下呈蓝色。相比较而言, PI的相对分子质量较大, 只能穿透凋亡的细胞, 与DNA结合后可掩盖Hoechst 33342的蓝色荧光而呈现红色荧光。因此, 可根据细胞在紫外光下的颜色判别细胞的状态, 间接了解细胞的凋亡情况[5]。中性红是常用的活体染色染料, 它可将细胞的溶酶体染成红色。正常细胞能充分从溶酶体中吸收中性红, 当细胞产生病变时, 其对中性红的吸收能力降低, 而细胞对中性红吸收的多少可用分光光度计测定。随着细胞活性的降低, 中性红吸收的吸光度降低, 因此中性红染料吸收法测定的吸光度值反映了细胞的活性[6]。FI和Hoechst 33342染色和中性红染色结果表明随着醋酸铅浓度的增大和作用时间的延长, 皮层神经元细胞出现核固缩细胞增多, 呈红色荧光细胞比例增加, 且红色荧光聚集成团, 即凋亡细胞增加, 以作用12 h以后的中浓度和高浓度醋酸铅组尤为显著。说明高、中、低3个剂量组铅对皮层神经元有明显的毒性作用。

摘要：目的探讨醋酸铅对体外培养大鼠皮层神经元的毒性效应。方法用不同浓度的醋酸铅 (50、100和200μg/ml) 染毒后, 原代培养乳大鼠皮层神经元, 通过中性红染色和PI-Hoechst 33342双染色法观察醋酸铅作用6、12、24和48h对细胞存活的影响;结果PI-Hoechst 33342双染色结果表明, 各组醋酸铅染毒12h后, 部分细胞出现核固缩, 随着醋酸铅浓度的增加和培养时间的延长, 出现核固缩细胞增多, 呈红色荧光细胞比例增加, 凋亡细胞增加。对照组细胞凋亡比例明显低与中浓度和高浓度醋酸铅组P<0.05) 。中性红染色结果表明, 不同浓度醋酸铅作用皮层神经元不同时间后各染铅组细胞活性随时间的延长而降低, 但除高醋酸铅染毒组在24和48h较6h差异有统计学意义 (P<0.05) 外, 其余差异均无统计学意义 (P>0.05) 。各染铅组细胞活性随染铅剂量的增加而降低, 尤其是高铅组与对照组及低铅组相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论低、中、高浓度醋酸铅 (50、100、200μg/ml) 作用皮层神经元12h后细胞存活都明显低于正常对照组, 并呈剂量和时间依赖关系。

关键词：醋酸铅,皮层神经元,毒性

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皮层神经元 第6篇

常规关于整合野调制特性的研究大多侧重于分析神经元的发放率特征和局部场电位的能量,主要得出的结论有: V1区神经元的整合野主要包括抑制型( 占68% ) 和易化型,且随着时间的推移,抑制性调制作用逐渐趋于主导[4]; 整合野的抑制性调制作用能够提高神经元的朝向选择性[5],增加V1区神经元响应的稀疏性[6],能够减少视觉响应的持续时间[7],提高神经元在特定类型刺激下做出响应的效率。近年来,随着研究的逐渐深入,人们发现大脑神经元的放电模式具有混沌、分形等非线性动力学特征[8],已有研究者通过对神经元复杂的放电模式进行模拟仿真,验证了神经元的非线性不规则放电并不是噪声引起的,而是神经系统本身的结构所决定的[9]。其近期的研究表明,整合野的调制作用能够增强神经元放电信号的混沌性[10],从而提高信息的传递效率。尚缺乏从分形特性角度分析整合野调制作用的研究报道。

分形原意指的是“分裂和分化”,这个概念最早由Mandelbrot提出,用于描述不规则的图形,后来才广泛应用于神经科学领域。对于研究神经信号而言,并不能找出组成复杂神经信号的基本元素。因此,利用分形原理可以直接由原始时间序列通过分形算法准确地描述信号非线性特征。随着非线性理论研究的深入,对时间序列的多重分形分析提出了多种方法。其中,最简单的方法是基于标准分配函数的多重分形理论[11,12]。但是此方法要求时间序列是规则的、平稳的,因此不适用于分析神经元响应信号。1994年,Peng等提出了去趋势波动分析方法 ( DFA)[13]。之后,Kantelhardt等又在DFA基础上提出了多 重分形去 趋势波动 分析方法 ( MFDFA)[14],此方法是基于去趋势均方差对非平稳的时间序列进行拟合消除趋势,能够获取时间序列的长程相关性,并方便地得到标度指数和多重分形谱。 已陆续有研究者将该方法成功地应用在分析心电信号[15]和颅内外脑电信号[16]的多重分形性,分别证明了该分析方法提取的多重分形特征对于诊断心律失常与癫痫疾病等都具有一定的借鉴意义。

现以朝向信息为例,采用去趋势波动的多重分形法,分析整合野朝向信息调制下神经元响应信号的多重分形特性,并对比分析分形特征与整合野调制作用强度之间的关系。分析结果表明: 神经元整合野的调制作用显著增强了神经元间的多重分形性; 神经元响应的分形特性与受整合野抑制的强度有关,受整合野抑制较强的神经元在整合野的调制下,其响应表现出了更高的分形值。

1材料与方法

1.1数据来源

数据来自于已发表文章[10]中的6只大鼠。关于动物手术以及信号采集的步骤在该文章中有详细介绍,这里不再赘述。

1.2刺激模式

采用与已发表文章[10]相同的三种类型刺激模式,如图1所示。模式1: 单独刺激神经元的经典感受野,光栅半径设为经典感受野的半径; 模式2: 整合野和感受野具有相同朝向,光栅半径设为整合野的半径; 模式3: 整合野和感受野的朝向呈正交,外圆的半径为测定的整合野的半径,内圆半径设为经典感受野的半径。三种模式的空间频率、对比度和时间频率均为最佳值,共设置12个不同朝向( 0° ~ 330°,30°递进) ,刺激过程中不同模式随机出现1 s, 中间用1 s灰屏间隔,三种刺激模式全部出现一次算一个周期,共重复10个周期。

1.3提取非线性分形特征

采用多重分形去趋势波动互相关分析( MF-DCCA) 的方法提取两两神经元间的分形特征。对于长度为N的非平稳时间序列x( t) ,t = 1,2,…,n ,其q阶去趋势波动的多重分形分析步骤如下

( 1) 计算序列的均值。

( 2) 计算时间序列的累积差

( 3) 将序列y ( j) 划分成Nl个小区间,则每个区间均含有l个数据。当n不能整除l时,x( t) 将会有一段剩余,为了能够不丢失数据,再针对序列的尾部数据重复这一分割过程,最终将得到2Nl个等长小区间,将序列的所有数据包含在里面。

( 4) 对各个区间的l个点,采用最小二乘法估算出局部的趋势yh( j )

( 5) 对于区间h(h = 1,2,…,2Nl)内的每段数据,去除局部趋势项,求其均方误差F( l,h)

( 6) 对每段数据的均方误差进行叠加平均,即得到如下q波动函数

式( 4) 中,q为任意不为0的实数。另F(q,l) 和l满足幂律关系,即

式( 4) 中,指数 λ( q) 即为q阶广义Hurst指数。对于较大的正q ,大幅波动占主导地位,λ( q) 描述了大波动的标度行为; 另外,对于负的或者较小的正q ,描述了小幅波动的标度行为。根据多重分形理论,λ( q) 和q的关系可以表示为

式( 6) 中,τ( q) 为质量指数,若与q是线性关系,则时间序列呈单分形性; 若不是纯线性关系,则时间序列呈多重分形性。奇异指数 α 和多重分型谱f( α) 可通过下述公式得到:

奇异指数 α 用来描述序列各个区间不同的奇异程度,其值与奇异程度成反比。f( α) 反映了奇异指数 α 的分形维数,计算过程中,可通过选取不同的q值,不同程度地消除时间序列中的趋势所带来的影响,以达到减少或消除非平稳性的目的。分形谱宽度 Δα = αmax- αmin,用来表征多重分形性的强度,Δα 越大,表示时间序列分布越不均匀,多重分形性越强。

2数据分析结果

重点分析V1区神经元在整合野信息调制下的多重分形性。共在6只LE大鼠上采集了50个神经元,对其进行统计分析。限于篇幅,仅对其中一例神经元在不同刺激模式下的分析结果进行阐述,并给出所有神经元的统计结果。

示例神经元在三种模式刺激下的分形谱和质量指数函数 τ( q) 分别如图2和图3所示。

从图2可以看出,该神经元在三种模式下的多重分形谱均为钟形,最大值都趋于1,可得知这几种模式刺激下的神经元响应信号都具有多重分形特性。图3中的虚线是对应的线性直线,已作对比。 从图3可以看出,三种模式刺激下 τ( q) 随q的变化曲线都不是线性关系,从而证明了这三种模式对应的响应信号之间具有多重分形特性,与图2所得到的结论相符。

进一步计算每种刺激模式下多重分形谱宽度 ( 即 Δα ) ,并将40次重复刺激下的结果进行统计分析,结果汇总在表1中。

从表1中可以看出,模式1条件下( 即仅刺激经典感受野时) 神经元响应的多重分形性最弱,模式3条件下( 同时刺激感受野和整合野,且朝向正交时) 神经元的多重分形性最强,而模式2条件下( 同时刺激感受野和整合野,且朝向相同时) 下神经元的多重分形性居中。其中后两种模式均有整合野信息调制作用的参与。由神经元整合野的调制特性可以知道,神经元在整合野的刺激下会出现一定的抑制状态,当内外朝向一致时( 即模式2) 抑制性最强,而内外朝向正交情况下( 模式3) ,抑制性最弱。通过将该神经元在两种典型整合野调制模式下的40组谱宽数据进行t检验,结果表明谱宽 Δα 能够显著地 ( p < 10- 5) 区分不同的整合野调制模式。

为了说明该结论的通用性,本文计算了所有神经元( 50个) 在每种刺激模式下响应的谱宽,并将多次重复刺激下的结果进行叠加平均。图4给出了两种典型整合野调制模式下谱宽的对比图。

图4中的直线是表示斜率为1的直线。数据出现在直线的左上角,表示纵轴的值大于横轴的值。 反之则表示横轴对应的值较大。从图4可以看出, 虽然在同一种模式刺激下不同神经元的谱宽差异比较大,但是对于任意一个神经元,它在模式3刺激下的谱宽均大于模式2,即当整合野的抑制作用较弱时,神经元响应的多重分形性较大。对比表1和图4可以得出,神经元整合野的调制作用能够改变神经元响应的多重分形性,使其响应的复杂程度更高, 其携带信息的潜力也越大。

进一步分析神经元响应的分形性与整合野的抑制指数[表示为IS,采用式( 9) 计算]间的关系。

式( 9) 中,Rn CRF表示神经元在整合野( 即模式2) 刺激下的平均发放率,Rn CRF表示经典感受野刺激( 即模式1) 下的平均发放率。

50个神经元的抑制指数与它们在三种模式下多重分形谱宽( Δα) 的对比结果如图5所示。对于每种模式下的数据,分别采用线性方程进行线性拟合。拟合的参数汇总在表2中。

图5 不同模式下神经元响应的多重分形谱宽 Fig.5 Relationship between multifractal spectrum widths of neuronal response to three typical stimuli and their inhibition index

从图5可以看出,不同模式下神经元响应的多重分形性均与抑制指数呈正向线性相关关系,这说明,神经元在整合野的调制下,若它的响应会发生较大波动( 即抑制指数较大) ,则其在三种模式下响应的多重分形性会变大。这表明整合野的调制作用对神经元响应的多重分形性有一定的影响,该结论与前面分析的结论相一致。

3讨论

采用多重分形去趋势波动分析方法,分析了不同整合野调制模式下V1区神经元响应的多重分形性特征,以及神经元响应的多重分形性与其受整合野抑制程度之间的关系。研究结果如下。

1) 不同模式下V1区的神经元响应信号均具有多重分形的非线性动力学特征。因此,采用非线性动力学的研究发放能够更贴切地反应神经元的响应机制。

2) 神经元的分形性强度与整合野的抑制指数呈正相关,且整合野的调制作用能够显著增强神经元响应的多重分形谱 Δα 的值,从而增强神经元复杂程度,提高其携带信息的能力。

该研究从非线性动力学的角度探究整合野对神经元响应的调制作用机制,为理解V1区整合野的调制作用提供了新的思路,是对目前神经科学领域神经元整合机制相关研究的有效补充。

摘要：初级视皮层(V1区)神经元整合野的外周调制作用是动物执行视觉图像-背景分割和目标识别的神经基础。采用多重分形去趋势波动的方法,分析了整合野调制下神经元响应的多重分形性,并分析了其与整合野抑制作用的关系。结果表明:不同模式下神经元的响应信号均具有多重分形特征,谱宽Δα能显著区分两种典型的整合野调制状态,且神经元的分形性强度与整合野的抑制指数呈正相关。该研究表明整合野的调制作用改变了神经元响应的复杂程度,提高了其携带信息的能力。

皮层神经元 第7篇

吡格列酮 (Pioglitazone) 属于噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂, 主要通过结合和活化过氧化物酶体增殖物激活的受体γ (PPARs) 而增强细胞对胰岛素作用的敏感性, 在临床上主要用于2型糖尿病的治疗。已证实吡格列酮对侧脑室注射STZ的大鼠的空间记忆力和海马的突触结构和神经元的受损有保护作用[3]。而同样属于噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂的罗格列酮对散发性老年痴呆大鼠学习记忆功能有明显的改善作用[4]。噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂可能对AD有预防治疗作用[5]。吡格列酮对由STZ引起的神经损伤有保护作用。前期实验证实STZ对离体培养的神经细胞也具有损伤作用, 那么吡格列酮对离体培养的神经细胞STZ损伤是否也有保护作用?

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

新生1 d～3 d Wistar大鼠 (山西医科大学动物管理中心) 。STZ、Calcein-AM购于Sigma公司, 吡格列酮由浙江华义医药有限公司惠赠, DMEM购于Gibico, 胎牛血清 (FBS) 购于杭州四季青公司。将STZ溶于D-Hanks溶液中, 配成10 mmol/L的母液, 由于STZ溶液的半衰期在生理pH值条件下为19 min[6], 需要溶解后立即使用。吡格列酮用二甲亚砜 (DMSO) 溶解, 再用DMSO溶液稀释配置成0.1 mmol/L, 1 mmol/L, 10 mmol/L的母液, 常温保存, 培养液中DMSO终浓度不得高于0.1%。

1.2 实验分组

神经细胞培养到第7天时, 将培养的神经细胞随即分组:由于中枢的胰岛素主要来自两方面, 由胰岛产生即外周血浆中的胰岛素透过血脑屏障进入中枢和神经组织自身合成的胰岛素[6], 为了更好模拟在体情况, 在实验中都加入胰岛素15 μU/mL。对照组以全配液培养;STZ组, 在全配液培养;吡格列酮组, 在全配液中加入终浓度 (0.01 μmol/L, 0.1 μmol/L, 1 μmol/L) 的吡格列酮, 24 h后除了对照组以外其他组都加STZ (100 μmol/L) 。共同作用36 h后观察细胞的活力以及活细胞数目 (LDH, CCK-8和Calcein-AM染色) 。

1.3 原代皮层神经细胞培养

取新生1 d～3 d的Wistar大鼠, 将大脑皮层神经细胞分离成单细胞悬液, 按细胞浓度为1×106接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养皿或96孔板中, 放在37 ℃, 5%CO2培养箱中培养。24 h后加入阿糖胞苷 (10 μmol/L) 抑制胶质细胞生长。

1.4 细胞活力分析

在96孔板中培养的皮层神经细胞经提前24 h加入吡格列酮, 再经STZ诱导36 h后, 还新的全配液, 每空加入10 μL的CCK-8, 37℃避光培养2 h, 到酶标仪上测定450 nm吸光度值。

1.5 LDH释放的检测

将皮层神经细胞培养在培养皿中, 经提前24 h加入吡格列酮, 再加入STZ诱导36 h后, 收集细胞培养液进行LDH活性的检测。

1.6 Calcein-AM染色

将皮层神经细胞培养在有玻片的培养皿中, 经提前24 h加入吡格列酮, 再加入STZ诱导36 h后, 用PBS液冲洗3次, 加入终浓度为10 μmol/L的Calcein-AM, 37℃避光培养20 min, 再经PBS避光洗涤3次后, 在激光共聚焦显微镜 (Olympus, FV-1000) 下观察细胞, 激发波长为490 nm, 发射波长为515 nm拍片。

1.7 统计学处理

测定结果由统计软件SPSS 13.0进行分析, 用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 进行单因素方差分析, 检验水准取α=0.05, P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 CCK-8的测定

STZ组与对照组比较, 细胞活力明显下降, STZ组由对照组的100%降至63.93% (P<0.01) ;提前24 h加入吡格列酮 (0.01 μmol/L) 细胞活力升高12.83% (P<0.01, n=4) ;吡格列酮 (0.1 μmol/L) 细胞活力升高6.06% (P<0.05) ;吡格列酮不能抑制STZ引起的细胞活力下降。详见图1。

2.2 Calcein-AM染色

STZ处理后, 活细胞的数量明显减少, 伴有突起数目明显减少;提前加入吡格列酮明显抑制STZ引起的活细胞数目减少, 突起数目明显增加;吡格列酮抑制STZ引起的活细胞数目减少, 突起数目增加;吡格列酮不能抑制STZ引起的活细胞数目减少。

2.3 LDH释放的检测

STZ组与对照组比较, LDH的含量明显增加, 释放量增加42.31% (P<0.01) ;吡格列酮 (0.01 μmol/L) 可以降低有STZ引起的细胞损伤, 使LDH的释放减少14.46% (P<0.01) ;吡格列酮 (0.1 μmol/L) 可以降低STZ引起的细胞损伤, 使LDH的释放减少10.04% (P<0.05) ;吡格列酮 (1 μmol/L) 不能抑制STZ引起细胞LDH的释放。详见图2。

3 讨 论

中枢胰岛素主要由胰岛产生即外周血浆中的胰岛素透过血脑屏障进入中枢, 然而研究发现神经组织自身也可以合成胰岛素并参与代谢调节而发挥作用[7]。胰岛素受体在脑内皮层、海马等与认知功能密切相关的区域分布较密集。胰岛素通过它与细胞膜上的胰岛素受体 (IR) 相结合, 通过胰岛素信号转导过程激发细胞内特定的生理生化反应[8]。

研究证实, 糖代谢紊乱和AD发病机制有密切的联系, 尤其在晚发性AD中, 糖代谢紊乱可能是重要的始动因子。多种证据显示脑内糖代谢障碍可以引起认知功能受损, 而认知功能障碍为主的AD常伴有脑内糖代谢障碍。由于糖代谢紊乱 (糖尿病) 与AD间有着非常密切的联系, 有可能存在同样的发病因素和病理过程, 因而有专家提出AD可能是一种大脑特异的神经内分泌疾病或者称“3型糖尿病”[9]。

吡格列酮是一种作用于PPAR-γ的胰岛素增敏剂, PPAR-γ被激活后提高胰岛素敏感性, 通过胰岛素受体和受体后途径, 加强胰岛素信号系统作用, 增加靶细胞中胰岛素受体的表达;增加胰岛素受体底物 (IRS) 的表达, 促其磷酸化;增加靶细胞中PI- 3K调节亚基的表达, 促进胰岛素功能实现。吡格列酮也可能通过增加胰岛素受体酪氨酸激酶活性, 起到保护作用。吡格列酮对侧脑室注射STZ大鼠空间记忆力和海马突触结构和神经元的受损有保护作用[1]。而同样属于噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂的罗格列酮对散发性老年痴呆大鼠学习记忆功能有明显的改善作用[2]。

本实验应用离体神经细胞培养的方法证实一定浓度的吡格列酮 (0.01 μmol/L和0.1 μmol/L) 可拮抗STZ对培养的神经细胞产生的毒性作用, 包括细胞活力的逐渐增加, LDH的释放逐渐增少, 以及活细胞数目的逐渐增加。本实验结果为吡格列酮的神经保护作用提供了新的证据, 即除已经证实的吡格列酮对侧脑室注射STZ引起的大鼠神经系统损伤有保护作用以外, 在离体情况下, 吡格列酮同样可以起到保护作用。但本实验所观察到的低浓度吡格列酮 (0.01 μmol/L和0.1 μmol/L) 可以发挥保护作用, 而较高浓度吡格列酮 (1 μmol/L) 不能抑制发挥保护作用, 其详细机制不明, 有待进一步研究。

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[3]付鹏程, 杨期东.吡格列酮对痴呆大鼠模型空间记忆及海马结构的影响[J].中国现代医学杂志, 2009, 19 (9) :1294-1297.

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[8]CoBB HM, Rose MO.The insulin receptor and tyrosine protein ki-nase activity[J].Biochimicaet Biophysica Acta, 1984, 738 (1-2) :1-8.

皮层神经元 第8篇

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料

DMEM/F12 (l:l) 培养液 (Gibco公司) 、B27 (购于Boster公司) 、胎牛血清 (购于Boster公司) 、胰蛋白酶 (Sigma公司) 、多聚赖氨酸 (poly-L-Lysine碧云天生物技术研究所) 、0.01MPBS 液 (Gibco公司) 、Aβ25-35 寡聚体 (北京博奥森生物技术有限公司) 、兔抗小鼠神经元特异性烯醇化酶 (neuron specific enolase, NSE) 单克隆抗体 (北京博奥森生物技术有限公司) 、兔抗突触素抗体 (北京博奥森生物技术有限公司) 、兔抗PSD-95 抗体 (北京博奥森生物技术有限公司) 、兔SP检测试剂盒 (3%H2O2去离子水、封闭用正常 山羊血清工作液、辣根酶标记链霉卵白素工作液, 河北博海生物工程有限公司) 、DAB显色试剂盒 (河北博海生物工程有限公司) 。

1.2 方法及观察

1.2.1 方法

新生24h 内的清洁级昆明小鼠, 由佳木斯大学动物中心提供。实验前一天, 配制好的多聚赖氨酸, 滴入24孔培养板中, 放置2h 后吸净培养板中的赖氨酸, 过夜, 临用前加入0.6mL无菌三蒸水洗涤三遍, D-Hank’s 液洗涤一遍, 吸净, 接种液0.2mL送入37℃, 5%CO2培养箱中平衡2h以上。小鼠子鼠经消毒、断头、取脑、剪碎、吹打、消化、离心后培养7d, 经NSE染色鉴定为神经元。将浓度配置为5μmmol/L, 滴于24孔培养板部分孔中 (将培养好的皮层神经元吸去原液) , 分别在0h、1h、2h、4h、6h终止, 每个时间点设4孔, 设立对照组。经免疫组化观察突触素和PSD-95的表达情况。

1.2.2 观察

普通光镜下, 以胞浆内有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。在250 倍镜下分别计数4个孔各4个视野的阳性细胞数和总细胞数, 计算阳性细胞的百分比, 以此代表神经元纯度。图像分析系统采集在不同时间点突触素、PSD-95免疫反应复合物的灰度值。

1.3 统计学处理

全部数据以均数±标准差undefined表示, 应用SPSS 12.0统计软件进行方差分析。

2 结果

NSE免疫细胞染色细胞显示, 神经元胞浆内可见棕黄色阳性颗粒, 而阴性对照组未见相应的免疫反应;经阳性细胞计数, 培养神经元纯度为90%以上。Aβ25-35作用1h后突触素免疫反映复合物的灰度值明显下降, 即突触素的表达明显减少, 与同期时间点对照组相比差异有显著性 (P<0.01) , 于给药6h后突触素几乎未见到表达。见表1。

*与同期时间点对照组相比差异有显著性 (P<0.01) 。

Aβ25-35作用1h后突触后膜致密物PSD-95免疫反映复合物的灰度值明显下降, 即二者的表达明显减少, 与同期时间点对照组相比差异有显著性 (P<0.01) , 于给药6h后突触素、PSD-95几乎未见到表达。见表2。

*与同期时间点对照组相比差异有显著性 (P<0.01) 。

3 讨论

在阿尔茨海默病众多的可能发病机制中, Aβ致突触损伤学说越来越受重视, 成为研究的一大亮点。研究发现, 突触损伤不但是AD的早期事件, 而且神经元突触的丢失出现在Aβ斑块沉积形成之前。因此, 研究突触损伤对于阐明AD的发病机制有很大帮助, 而突触损伤主要表现在突触蛋白的减少上。本实验研究突触素和PSD-95这两种突触蛋白, 可以较好的反映神经系统对损伤反应的可塑性, 即可作为突触的功能标记。突触素 (synapsin) 作为突触前膜和突触囊泡的结构成分, 为神经出芽反应代表性的结构蛋白, 它是一种膜蛋白, 在神经元胞体合成后主要转运至轴突终末, 特异性地分布于突触前囊泡膜上, 与突触结构和功能密切相关, 用以反映突触的分布和密度。PSD-95是兴奋性突触中最有特征的突触PDZ蛋白, 因SDS电泳的分子量为90一95KD而命名, 是PSD中最丰富的蛋白之一, 存在于所有皮层结构中, 包括小脑, 大脑皮层和海马等, 占PSD总蛋白量的2.3%。近年来, 关于学习记忆的研究一直是人们话题。学习记忆的形成与变化和突触的形成与变化密切相关[5,6]。学习记忆是脑内高级活动之一, 其本质是信号在脑内的传导和处理的问题, 有报道认为突触的信号传递及可塑性正是学习记忆发生的机制[7]。在AD早期, 已有学习记忆能力的下降, 说明此时已有突触的损伤。突触素和PSD一95为突触功能的分子标志, 分别代表了突触前和突触后的可塑性过程, 在皮层可塑性中发挥作用。突触可塑性过程是突触前和后的统一和相互促进, 从而引起学习及记忆的发生。

在上述的细胞实验模型中, 对照组无突触蛋白的表达减, 实验组用5μmol/lAβ25-35致伤后小鼠皮层细胞突触蛋的表达明显减少, 而且随着时间的推移, 突触素和PSD-95的表达明显减少, 6h后基本看不到表达, 说明Aβ导致突素和PSD-95表达的减少, 可能是Aβ引起AD突触损伤病理因素之一。随着对Aβ寡聚体、突触可塑性研究机制的入, 将会促进针对Aβ寡聚体的药物的开发和临床应用, 可能会在神经变性之前阻断Aβ寡聚体对突触的损害, 使AD发生消灭在萌芽之中。对突触损伤机制的研究, 必将为AD发病机制的研究及治疗奠定坚实的基础。

参考文献

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