标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响

标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响（精选4篇）

标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响 第1篇

标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响

在临床检测中，常常遇到溶血的标本。溶血对ELISA检测乙肝表面抗原（HBsAg）究竟是否有影响，各文献报道很不一致，本文对标本溶血的原因及其对ELISA检测乙肝表面抗原的影响进行简要的讨论。1 标本溶血的原因

溶血是临床检验中最常见的一种干扰和影响因素。溶血可分为体内溶血和体外溶血［1］。体内溶血可由物理因素（如人工心脏瓣膜或大血管手术后）、化学因素（如恶性疟）和药物毒性反应等因素引起。体外溶血可由物理因素（抽血时负压过大、水浴温度过高、冰冻、振荡等机械性破坏）、化学因素（血样接触表面活性剂）和代谢因素（如遗传病引起红细胞脆性增加）引起。

在临床上常见的引起标本溶血的原因包括 ［2］ :由于病人严重脱水、低血容量休克等原因导致穿刺困难造成的溶血;由于抽血器具质量不合格如真空管负压不够或塑料试管质量较差导致的溶血;用干燥管采血为了尽快分离血清用竹签搅拌不当引起的溶血等。2 标本溶血对乙肝表面抗原检测的影响

一些研究没有发现标本溶血对HBsAg检测的影响。李穗芬 ［3］ 对20例HBsAg阴性和10例HBsAg阳性病人的溶血和非溶血标本包括10例OD值在临界值附近的标本进行了对照，结果非溶血和溶血标本的阴、阳性结果完全一致。20例HBsAg阴性和10例OD值在临界值附近的样本，溶血与对应非溶血标本OD值间差异没有显著性;10例HBsAg阳性样品，溶血标本OD值明显大于对应非溶血标本OD值。因此得出结论，标本溶血不影响HBsAg结果的判定，只是使HBsAg阳性标本的OD值提高。许斌等［4］ 对HBˉsAg强阳性样品的非溶血与溶血（Hb浓度为241g/L）标本的A值作了对照后未发现两者有统计学差异，得出结论:溶血对HBsAg的检测没有影响（严格意义上应表述为:溶血对HBsAg强阳性标本的检测没有影响）。单桂秋等［5］ 的研究也显示，HBsAg阳性样品的非溶血与溶血标本的A值间经t检验差异无显著性。

其他的一些研究则发现，溶血对HBsAg的检测有影响。钱厚明等 ［6］发现，在17例溶血标本中，初检的5例HBsAg阳性标本，经重新抽血复检后有2例仍为阳性，另3例转阴。认为是溶血导致了假阳性的出现。刘玉振等 ［7］ 研究发现，溶血对HBsAg的检测有影响，当红细胞浓度>25%造成的溶血可导致假阳性。龙宪和等［8］ 研究发现，无论在健康人还是乙肝病毒感染者中，溶血均导致了ELISA一步法检测HBsAg假阳性结果的出现，而采用二步法则可以保证结果判读无误。标本溶血对乙肝表面抗原检测影响的可能机制

溶血是由于各种原因造成红细胞破坏，胞内血红蛋白（Hb）等物质和细胞内液进入血清。溶血对ELISA的影响主要是反应孔对溶血血清中Hb的非特异性吸附和溶血时细胞内液对血清的稀释作用。单桂秋等［5］ 的实验也证明了溶 血对血清具有稀释作用。

在ELISA试验中，酶标反应板孔包被物的浓度是一个相对定值，抗原抗体反应存在最适比例和后带现象，因此，HBsAg浓度与A值只是在一定的范围内呈一定的线性关系;当HBsAg达到一定浓度时A值的变化进入平台期;当HBsAg浓度太高时，A值反而会降低。因此，溶血可以使HBsAg浓度很高的样品的A值升高（在一定程度上解决了后带现象）;当HBsAg浓度与A值呈线性关系时才会因溶血的稀释作用使A值下降;当HBsAg浓度近临界值时，可能造成假阴性。

Hb具有类过氧化物酶活性，其作用与辣根过氧化物酶类似，如果反应孔非特异吸附Hb而残留，则可催化底物显色，使本底A值升高甚至造成假阳性。如果洗涤质量好，则可能大大减少或排除非特异性吸附的干扰。单桂秋等［5］ 的实验未体现血中Hb非特异性吸附的影响。龙宪和等 ［8］ 采用二步法操作可以排除溶血释出的Hb对HBsAg检测的影响也说明洗板质量在ELISA检测中的重要性。

总之，溶血对ELISA检测HBsAg有一定的影响，影响的性质及其大小因所使用的试剂、测定方法、标本HBsAg的有无及浓度高低、洗板的质量好坏而异。参考文献 靳敏.溶血对临床生化检验影响的探讨.广西医学，2002，24（9）:1363-1364.2 张小洁，刘建芝.真空采血标本溶血原因分析及预防措施.护士进修杂志，2001，16（3）:180.3 李穗芬.标本溶血对乙肝表面抗原检测的影响.广州医药，2001，32（5）:65.4 许斌，朱虎定.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨.临床检验杂志，2000，18（4）:232.5 单桂秋，苏建婷.溶血及脂浊样品对ELISA检测乙肝表面抗原的影响.临床检验杂志，1999，17（2）:102-103.6 钱厚明，赵江燕，张燕.应重视ELISA检测HBsAg灰区范围内样品的复检.上海医学检验杂志，2002，17（3）:156.7 刘玉振，张淑琴，马宏伟.溶血对抗-HCV、HBsAg等测定结果的影响.中国输血杂志，1999，12（1）:32-33.8 龙宪和，童华诚.溶血对乙型肝炎五项血清标志物检测结果的影响.中华医学检验杂志，1996，19（1）:47-48.作者单位:430061武警湖北总队医院检验科

标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响 第2篇

1检验目的及原理

1.1检验目的：乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒感染的最主要免疫指标，乙型肝炎肝病毒的感染带来了严重的公共卫生问题。母婴传播、性传播和血液传播是最主要的传播途径。尽早的发现感染可以有效减少疾病的传播。1.2检验原理：两步双抗体夹抗原ELISA试验

用于检测HBsAg的酶免疫检测法，是在1971年，首先由Engvall，Perimann1，VanWeemen以及Schuurs进行描述的。在1976和1977年，建立了固相“夹心”酶免疫检测法。HBsAg在包被有多克隆抗体（Anti-HBsAg）的固相上被捕获，随后由酶标Anti-HBs进行检测显示。在二十世纪80年代早期，开发了基于单克隆Anti-HBs的HBsAg检测法。

本实验采用单克隆Anti-HBs的两步夹心ELISA试验，微孔板上所包被及酶结合物所用分别为针对表面抗原不同位点的抗体。如果被检测血清中存在表面抗原，则可通过双抗体夹心的桥联将辣根过氧化物酶（HRP）连接到微孔板上，使TMB呈色。方法性能参数

2.1两步双抗体夹抗原ELISA试验(1)敏感性：

样品中HBsAg浓度达到0.5ng／m1，即可得到阳性结果。(2)特异性：

使用血浆、被检测者因各种病理因素而使血液中含有过高纤维蛋白原或者异嗜性抗体时，可能引起检测结果的假阳性。

标本

3.1乙型肝炎病毒表面抗原的适宜检材为新鲜血液样本分离出的血清，不适合于混合血清、血浆或其他体液样本，特殊检材的要求及结果判断见其具体要求，不适用本程序。3.2血液标本用不含添加剂的干燥洁净试管采集，采集后在37℃孵育1.5～2小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

3.3采用含有分离胶和促凝剂的试管采集的血液样本，采集后在37℃孵育0.5～1小时，2000 RPM以上离心5分钟，分离血清。

3.4严重脂血、严重溶血原则上不会影响检测结果，但洗涤一定要彻底、干净。检测系统

4.1 组成

乙型肝炎病毒表面抗原两步夹心ELISA试验试剂盒(英科新创科技有限公司)主要组成成份：包被HBsAb的预包被微孔板、HRP标记抗体、HBsAg阳性对照、HBsAg阴性对照、HBsAg样品稀释液（含BSA缓冲液）、浓缩PBS-T缓冲液、底物A（含H2O2）、底物B（含TMB）、终止液（含2 M H2SO4）、封板膜，自封袋。

试剂信息：以上构成仅对英科新创（厦门）科技有限公司的试剂盒有效，批准文号（国药准字S10910148），试剂储存于2-8℃避光保存，有效期六个月。4.2 试剂配制

（1）PBS-T缓冲液：取浓缩PBS-T缓冲液若干，以蒸馏水或去离子水按照20倍稀释成应用液。

试剂保存：室温。4.3主要仪器

Tecan Sunrise酶标仪、汇松PW-960酶标洗板机、20～200 ul可调式微量移液器、25～56℃可调式气浴恒温振荡器。校准

可调式微量移液器由武汉市技监局校准完成，酶标仪、酶标洗板机、气浴恒温振荡器均由仪器生产厂家的技术支持部门负责每年一次技术校准。检验程序

6.1 操作步骤

6.1.1、平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18～25℃），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。

6.1.2、编号：取所需要数量微孔固定于支架，按序编号。6.1.3、稀释：每孔加入20 ul样品稀释液。

6.1.4、加样：分别在相应孔中加入100 ul待测样本血清、阴阳性对照血清或质控血清。6.1.5、温育：置37℃温育60分钟。

6.1.6、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。

6.1.7、加酶：在每一微孔中加入酶标记抗体50 ul。6.1.8、温育：置37℃温育30分钟。

6.1.9、洗涤：用PBS-T缓冲液充分洗涤5次，洗涤后扣干，每次应保持30～60秒的浸泡时间。

6.1.10、显色：每孔加底物A、底物B各50 ul，轻轻振荡混匀，37℃暗置30分钟。

6.1.11、终止：每孔加入终止液50 ul，混匀。

6.1.12、测定：用酶标仪双波长法450nm/630nm测定每一微孔OD值，记录结果。6.2 结果判断

6.2.1、临界值Cut off（CO）的计算：CO = 阴性对照OD均值×2.1 阴性对照OD均值低于0.05时，以0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。

6.2.2、样品OD值S / CO ≥ 1者，结果阳性

样品OD值S / CO ＜ 1者，结果阴性

6.2.3、如果阴性对照OD均值 >0.1或阳性对照OD均值< 0.4时，则表明不正常的操作或试剂盒已经变质损坏不能使用，需要重新试验，若问题仍然存在，应该立即停止使用该批号产品，并与试剂厂商联系。

6.2.4、注意：

A.通过以上检测阴性的样品，由于方法学以及其他不可控因素影响，不能绝对保证样本中没有低滴度抗原的存在，不能完全排除HBV感染的可能。

B.过以上检测阳性的样品，应通过人Anti-HBs的中和试验予以确认。如果样品在确证试验中发生中和，则该样品可以视为HBsAg呈阳性，无需进一步检测。质量控制

7.1 室内质量控制

室内质量控制血清的两个浓度值分别为：1 ng/ml、2 ng/ml，均购自卫生部临床检验中心，每批次试验加入两个水平质控血清各一孔，同其他待测样本一同记录S/CO值。

7.2室间质量控制：每年参加卫生部、湖北省以及武汉市临床检验中心乙型肝炎病毒表面抗原的质量评价。

7.3尽可能排除干扰因素对试验的影响。干扰因素及变异的潜在来源

以下类型的冻融过的样品可能会引起本实验结果的假阳性：含高滴度免疫球蛋白（IgG 骨髓瘤，IgM骨髓瘤，怀孕前3个月的妇女，流感疫苗受体），大肠杆菌抗体，抗-CMV阳性，抗-EBV阳性，抗-HSV阳性，风疹抗体阳性，霉菌感染，抗核抗体阳性，梅毒阳性，类风湿因子及弓形虫抗体阳性。结果计算及测量不准确度

无结果计算及测量不确定度 生物参考区间

无 患者检验结果可报告区间

阴阳性 警告/危急值

阳性为警告 安全性预警措施

13.1所有样本、试剂和各种废弃物应按传染物处理，潜藏有传染成分。目前尚没有已知的方法，能够确保人源制品或灭活微生物无传染性。因此，所有取自人源材料必须视为潜在的污染物质。

13.2强烈建议严格按照有关血液滋生病原体的标准对检测系统所使用试剂和人源标本进行处理。对于含有或怀疑含有污染物的制剂材料适用生物安全2级或其他相应的生物安全措施。这些预防措施应包括但不局限于以下内容：

A.处理样本或试剂时，佩戴手套。B.不要用嘴吸液。

C.不要在处理这些材料的区域内吸烟，吃东西，饮水，使用化妆品或戴取隐形眼镜。D.使用杀菌消毒剂，如0.5％次氯酸钠、84或其他相应的消毒剂，对样本或试剂的所有溢出物进行清洁和消毒。

E.按照当地政府规定，对所有样本，试剂和其他潜在传染材料进行去污和处理。13.3安全预防措施：终止液含有较低浓度H2SO4,对皮肤、眼睛有损伤。如果溶液不慎接触眼睛，立即用清水冲洗。如果刺激依然存在，则请求医护人员帮助。临床意义

乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科。完整的病毒称为Dane颗粒，直径42 nm，球形，其外层包膜即HBsAg，由病毒S基因编码，是病毒衣壳蛋白，包括S、前S1和前S2蛋白；HBsAg是病毒感染的主要标志。除Dane颗粒外，感染者血液中还存在16 – 25 nm的球状和杆状体，是病毒组装过剩的HBsAg。

标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响 第3篇

患者:男, 45岁。2010年9月16日来我院内科门诊做健康体检。门诊检查血压、心率正常, 无既往病史。心电图正常, 肝胆B超未见异常。患者于清晨空腹以真空采血管按要求定量采血检测血常规、肝、肾功能及乙肝二对半, 按常规操作分离血清, 无溶血、乳糜及黄疸等。

实验室检测结果:血、尿常规检测正常;生化肝、肾功能指标正常。用ELISA方法检测乙肝二对半结果为HBs Ag (+) ;HBs Ab (+) ;HBe Ag (-) ;HBe Ab (-) ;HBc Ab (-) 。再用ELISA方法复查, 仍为此种模式。改用金标方法复查HBs Ag, 结果为 (-) 。我们又检测了该标本的HBV-DNA含量, 结果为低于检测值下线。

本次ELISA试剂为英科新创 (厦门) 科技有限公司生产, 批号2010035104, 有效期20110310;金标试剂为英科新创 (厦门) 科技有限公司生产, 批号2010064211, 有效期201106;HBV-DNA检测试剂为中山大学达安基因股份有限公司生产, 批号2010004, 有效期20110216。

2 讨论

ELISA方法检测HBs Ag假阳性的报道有过。从文献上看, 引起假阳性的原因有很多。大体上分标本、试剂、操作等因素[1]。试剂的因素可通过改换试剂批号、试剂厂家来避免;操作的因素可通过严格按照操作规程、树立严谨的工作作风、提高手工操作的熟练程度、严格做好室内质控和阴阳性对照、制定灰色区, 对在灰色区范围内的结果必须进行复查等来避免。对于标本自身的影响因素, 我们在排除了如标本前期处理、保存不当 (污染、溶血、凝集不全等) 、添加抗凝剂等[2]原因, 由于标本内在的因素, 即内源性干扰物质引起的假阳性是不易避免的。有报道称大约40%的人体血清标本中含有非特异性干扰物质, 如类风湿因子、补体、自身抗体、甲胎蛋白及其他交叉反应物质等, 但由此引起的假阳性结果A值往往较低[3]。

因此, 遇到HBs Ag单独阳性或HBs Ag阳性的二对半少见模式应引起重视, 最好是换一种方法的试剂进行复查。最简单易行的方法就是用质量较好的金标试剂复查, 确保检验结果的准确性。

参考文献

[1]叶千红, 张丽霞.关于标本因素对ELISA检测结果影响的分析[J].中国实验诊断学, 2003, 7:440～441.

[2]张家均.酶联免疫吸附法测乙肝病毒表面抗原假阳性原因的分析及解决方法[J].现代检测医学杂志, 2005, 20:88.

标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响 第4篇

[文献标识码]B

[文章编号]1005-0019(2009)7-0266-01

[摘要]目的:探讨ELISA法检测乙肝表面抗原产生假阳性原因进行分析及解决的办法。方法:对近二年来本室ELISA检测18234例标本的检测结果进行回顾性分析,统计假阳性结果,对产生假阳性结果的原因行归类。结果:18234例标本中阳性结果1710例,阳性率9.37%;假阳性结果75例,假阳性发生率0.4%;产生假阳性的原因:黄疸10例,占13.3%;脂血5例占6.6%;溶血6例占8%;污染3例占4%;洗板因素14例,占18.7%;离心不好29例,占38.7%;弱阳性结果误判6例,占8%其它2例占2.7%。结论:ELISA法检测乙肝表面抗原产生易出现假阳性,离心不好及洗板不彻底是产生假阳性的主要原因。用ELISA法检测乙肝表面抗原从标本准备、检测及判断结果,每一环节均可能发生假阳性,严格把握每一个环节质量,可有效预防假阳性结果的发生。

[关键词]乙肝表面抗原;ELISA;假阳性

双抗体夹心法是检测抗原最常用的ELISA法,但由于标本、检测过程、实验环境等因素影响,在实际工作中仍然会出现少量假阳性结果。本文对近二年来18234例标本中75例假阳性结果(阳性结果910例)进行分析,以探讨出现假阳性原因及解决办法。

1材料与方法

1.1标本来源:为2007年5月至2009年5月本院18234例门诊、住院病人及健康体检者的血清。

1.2材料:所用试剂为上海荣升生物技术有限公司生产的乙肝表面抗原诊断试剂盒。

1.3仪器:wellscanMK3酶标仪labsystemsDragon型洗板机。

1.4检测方法:检测标本均按严格按照说明书进行检测。结果判断方法:用酶标仪进行判断,并结合肉眼观察。假阳性结果的确认依据:对乙肝表面抗原阳性结果进行分析,在以下几种情况下,应用金标法或是同样的酶法复查,复查两次为阴性者确认为假阳性结果:一是与其它乙肝检测指标对比,乙肝表面抗原阳性者,其它指标均为阴性者;二是同一批次检测中连续多份标本出现阳性者;三是临床病人信息反馈对阳性结果有争议者;四是肉眼判断为弱阳性结果者。

1.5统计学分析:对实验数据进行x2检验和分析。

2结果

在18234例标本中,阳性结果1710例,阳性率9.37%;确认为假阳性结果者75例,发生率为0.4%。各种原因引起的假阳性结果,见表1。

3讨论

乙型肝炎在我国的发病率很高,是严重危害人们身体健康的传染病之一。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙肝的感染指标之一,为体检的必检项目,对乙肝的预防和治疗具有重要的意义。ELISA法由于灵敏、特异、操作简便、易于自动化且无放射性污染等诸多优点,是目前应用最广的一种免疫技术。作为评价临床测定方法临床应用价值的诊断特异性(specificityofdiagnosis)指标,是将实际无病者正确的地判断为阴性(真阴性)的百分率,计算公式为TP/TN+FP,其中TN为真阴性;FP为假阳性。与此相对应的是阳性预测值,(postivepredictivevalueppv),是指实验方法测得的阳性结果在真阳性的比率,计算公式为TP/TP+FP,测定方法中两个指标理想的值均应为100%[1]。要达到此标准,FP应当为0,即没有假阳性。各实验室为保证检测质量,采取了一系列质量控制措施,但在临床检测中,仍会出现假阳性结果。造成假阳性的原因很多,常见有标本因素如污染、溶血、脂血、黄疸;操作不当如离心、洗板不彻底等;结果判断误差等。本组中,血清分离及洗板不彻底是引起假阳性结果的主要因素,标本污染[2]溶血、脂血[3]、弱阳性结果误判等也是常见原因。

溶血标本对检测结果的影响较大,对弱阳性结果影响更为明显[4],主要是因为血红素基团具有类似过氧化物酶的活性,在以辣根過氧化物酶为标记酶的ELISA测定方法中,如血红蛋白浓度过高,温育过程中吸附于固相,与加入的HRP底物反应而显色。离心不好引起假阳性结果的原因是[5]:(1)血清中的补体可与IgG的Fc段结合,可造成假阳性;(2)血浆中纤维蛋白原和酶结合物一起易粘附到ELISA检测板上不易洗掉,可造成假阳性;(3)血清中若有类风湿因子(RF),RF可与抗体结合,造成假阳性;(4)免疫球蛋白聚合物、免疫复合物易吸附于塑料表面,可造成非特异性吸附,导致假阳性。标本污染造成假阳性主要是因为细菌生长分泌的一些酶会对抗原抗体等蛋白产生分解作用,一些细菌的内源性酶会对固相酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。不同工作人员对弱阳性结果的判断不同也是引起假阳性的因素,有文献报道ELISA法检测HBsAg的弱阳性结果中,真弱阳性占5.45%;前带现象占62.82%;假阳性占32.72%。[6]