合成基因范文

合成基因范文（精选11篇）

合成基因 第1篇

1 材料

1.1 主要试剂

Taq plus DNA Polymerase购自北京天根生化科技有限公司;DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA小量快速制备试剂盒购自杭州博日生物技术公司;DL2000 Marker购自TaKaRa公司。pMD18-T购自大连宝生物生物技术有限公司、JM109感受态细胞购自北京天根生物工程有限公司。

1.2 仪器设备

基因扩增仪、凝胶图像处理系统;DK-S12电热恒温水浴锅 (上海森信实验仪器有限公司) 、高速离心机, 紫外可见分光光度计;净化工作台;振荡培养箱;精密电子天平及台式低温冷冻离心机。

2 实验步骤和方法

2.1 引物设计与合成

根据NCBI上GenBank查找鹅FSH-α和β亚基的基因序列。α亚基索引号:Eu563911, 共363bp (表1) ;β亚基索引号为:Eu563910, 共396bp (表2) 核苷酸序列, 各设计12条引物片段, 并送往上海生工生物工程有限公司合成。

2.2 引物稀释和PCR扩增

F1-F12, P1-P12各个引物分别稀释为10ul mol/L, 分别取F2-F11和P2-P11各取10uL, 混匀后再稀释10倍, 分别作为FSH-α和FSH-βPCR反应的模板。

反应条件:94℃预变性1min, 94℃40s, 55℃退火40s, 72℃延伸45s, 循环扩增30次, 最后72℃延伸10min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.3 第二次PCR反应

用1%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物, 按照杭州博日生物技术公司生产的DNA回收试剂盒说明操作, 来回收目的基因。回收的目的基因进行第二次PCR反应。

2.4 第二次PCR反应产物回收与T Vector的连接转化

用1%的琼脂糖凝胶电泳分离第二次PCR产物, 按照杭州博日生物技术公司生产的DNA回收试剂盒说明操作, 来回收目的基因。按照大连宝生物技术有限公司生产的克隆载体p MD18-T的说明书, 将载体和回收的目的基因连接在一起, 并转化到JM109感受态细胞中。筛选并培养阳性克隆菌。

3 结果

3.1 重叠区扩增法DNA扩增及第二次PCR DNA扩增结果

通过重叠区扩增方法扩增出FSH基因, 经1.0%的琼脂糖电泳见图1, 能扩增出FSH-α、FSH-β基因片段长度分别约为363bp、396bp, 且该目的片段是两条特别清晰的目的条带, 其大小与预期结果相一致。第二次PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测, 结果表明扩增条带与目的的条带大小一致, 条带清晰且无杂带, FSH基因PCR扩增的结果良好。

M:Marker;α:FSH-α亚基;β:FSH-β亚基

M:Marker;1:空白对照;2:FSH-α亚基;3:FSH-β亚基

3.2 重组阳性质粒PCR鉴定结果

质粒PCR鉴定产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定, FSH-α、FSH-β基因片段长度分别约为363bp、396bp, 见图3, 且该目的片段是两条特别清晰的目的条带, 其大小与预期结果相一致。

M:Marker;α:FSH-α亚基;β:FSH-β亚基克

3.3 测序结果

阳性质粒的测序结果与NCBI序列进行比对, 结果完全一致, 表明全基因合成的FSH基因及所构建的克隆载体序列完全正确。

4 结论

通过基因全合成实现基因的分子改造和人工组建, 正在成为一种实验室常规手段, 因此, 建立一种能够相对低廉和短时间内准确高效合成基因的方法十分重要。以往大多数的基因合成技术存在着花费高、错误率高等缺陷[1], 而PAS法合成基因相对简单、迅速、精准、廉价, 能够合成高G+C区域、重复序列以及复杂的二级结构等[2]。用PAGE方法纯化所有引物, 应用高保真酶进行PCR, 以确保低错配率;出现非特异性扩增, 为了保证后续实验基因序列的纯度, 还得用1.0%琼脂糖凝胶分离纯化PCR产物, 用纯化的第1次PCR产物再进行第2次PCR。

卵泡刺激素是一种由脑垂体合成并分泌的激素, 属于糖基化蛋白质激素, 因最早发现其对女性卵泡成熟的刺激作用而得名。卵泡刺激素和黄体化激素在生殖相关的生理过程中协同发挥着至关重要的作用。FSH对于维持机体正常的生理功能具有重要的作用。FSH可与细胞膜上的卵泡刺激素受体结合, 对细胞的代谢或功能活动产生影响, 促进雌性动物子宫内膜生长、排卵等功能[3]。本次实验通过PAS的方法进行FSHα和FSHβ双链的合成, 并得到了FSHα和FSHβ的基因, 这为后续研究FSH基因对鹅产蛋性能的影响奠定了基础。

参考文献

[1]Carr P A, Park J S, Lee Y J, et al.Protein-mediated error cor-rection for de novo DNA synthesis[J].Nucleic Acids Res.2004, 32 (20) :e162.

[2]Xiong A S, Yao Q H, Peng R H, et al.PCR-based accurate syn-thesis of long DNA sequences[J].Nat Protoc, 2006, 1 (2) :791-797.

合成基因 第2篇

听课的过程中我就在思考两个问题： 一是什么样的课堂是有活力课堂？

听了郑老师的一节课我有一些体会。有活力的课堂也可以说是高效的课堂，它要求教师必修在备课上下功夫、动脑筋。郑老师的课堂就是一节典型的活力课堂课例。具体表现为以下五个方面： 1.调动学生的积极性。郑老师充满激情，对学生的启发、诱导和激励手段自如，学生参与面广，充分调动了学生的积极性。由此可以看出学生在课堂上的学习状态和参与度关键取决于老师用何种方法怎样诱导。

2.通过问题的解决不断生成新的课堂问题，又不断引导学生提出新的问题，激发学生的学习兴趣。3.如何克服上课老师问一些“是不是、对不对”的问题或者提问式等的教学方式，郑老师作了一个很好的示范。郑老师在整个教学过程中，有讲、有练、有问、有看、有落实、有亲身体验等多种教学方法，不断点拨，比较灵活。

4.培养小组合作意识，能抓住小组合作的时机，在个人不能完成的情况下再进行合作，充分抓住了学生的心理需求。

5.老师上课应该走下讲台，走进学生，让学生和老师的心灵彼此融合在一起，学生更容易接受更愿意去学。郑老师在这方面做得比较好。二是信息技术如何与学科教学进行整合？

信息技术是为课堂服务的。为了让抽象的知识形象化，让静态的内容活起来，信息技术与学科整合是指在教学过程中把信息技术、信息资源、信息方法和学科内容有机结合，共同完成学科教学任务的一种新型的教学方式。整合的三个基本点是：⑴要在多媒体和网络为基础的信息化环境中实施学科教学活动。⑵ 对学科教学内容进行信息化处理后成为学习者的学习资源。⑶利用信息化加工工具让学生进行知识重构。郑老师在本届课中，把信息技术融入到教学中运用的恰如其分，如开始时用阿根廷人用克隆牛生产胰岛素，可以充分调动学生的学习兴趣，用转录和翻译的动画演示抽象的过程，更直观，把难的问题简单化。赵凤鸣的点评：

1.利用能治疗糖尿病的转基因牛引入课题激发学生的学习热情。2.带着问题看书且有具体要求很好。

3.课件制作精美，用动画展示形象直观。学生自由回答和总结，老师鼓励，充分调动了学生的积极性。

4.引领学生体验生物进化过程形成的精细的结构与功能的适应性。

5.通过小组合作探究把密码子、反密码子和氨基酸的对应关系分析透彻。

6.小组合作教具制作精美，使看不见摸不着的翻译过程能够让每一个学生得以体验，同时也让学生感受到基因表达的逻辑美和简约美。

7.小组评价作用效果明显，充分调动了学生的求知欲。

8.结尾回扣主题，激情洋溢。引入和结尾充分情感态度价值观的教学目标。郑海波的教学反思：

感谢：感谢学校给我们创造了一个相互学习的机会，感谢学校领导、级部领导和生物组的支持帮助。

本节课教学大纲要求是两课时，我的设计思想是一节课把主要知识点全讲完。首先整节课的构思是按照问题总领递进式进行的，从最初提出“基因中的遗传信息如何传给蛋白质？”这一问题为总领，逐一解决基因中的遗传信息如何传给mRNA（转录过程）和mRNA遗传信息如何传给蛋白质（翻译过程）这两个问题。再在具体问题上考虑教学目标如何达成，如何设计具体环节的衔接和巩固落实。具体环节：

课前预习评价：用大屏幕给表扬好的同学发一个大大的“奖状”，增加这部分同学的学习热情，同时对其他同学也是一种鼓励。

分析目标：说明本章节和本节在高考中的地位，让同学们明确本节的重要性。

教学引入：用一段当前糖尿病患者情况引入转基因牛的视频进而引出胰岛素合成的原理是什么，让同学们带着疑问开始本节课。这样可以激发学生的学习热情，有利于后面学习环节顺利进行。过渡语运用：“基因主要位于细胞核，蛋白质在细胞质中合成，基因携带的遗传信息如何传给蛋白质？”，“遗传信息是如何传给mRNA的呢？”，“mRNA的信息如何传给蛋白质的？”递进式疑问句？有利于激发学生的求知欲，也让老师的教学思路更加清晰，更好的把握和调控课堂。针对练习的编制：针对练习1和针对练习2它们具有互补性，针对练习3具有总结性，综合了本节转录和翻译的过程。针对练习形式多样化，学生做着感觉比较新颖，不那么千篇一律。

Flash课件的作用：转录和翻译过程都比较抽象，所以选用了课件展示动画过程，学生更易理解接受，比老师描述说教更有效。

小组合作探究环节设计：选择了本节中的一个教学难点mRNA上几个碱基决定一个氨基酸为探究点，激发学生的创造性思维，并用白板相互展示各自团队的答案，引导个团队进行相互激辩，从而引出密码子表。

小组评价设计：以各个团队队长的名字为番号，把他们贴在笔筒上，团队每得一分向笔筒中投一支笔作为奖励，这样可以充分调动学生的学习积极性。

板书设计：老师和学生共同板书。边讲解边板书，并且让针对练习1和针对练习2和教师的板书内容相呼应。

合成基因 第3篇

关键词:洋葱;类黄酮;查尔酮合成酶基因;基因克隆;基因表达

中图分类号:Q785 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)05-0001-04

洋葱(Allium cepa L.)是百合科葱属二年生草本植物,是类黄酮含量较高的蔬菜种类之一,别名洋蒜、圆葱、葱头等。它以肥大的肉质鳞茎为产品,根据其皮色可分为红皮、黄皮和白皮等品种[1～3]。它是世界上重要的蔬菜作物,欧美国家誉之为“菜中皇后”。 洋葱具有适应性强、耐贮运、供应期长、产量高、效益好等特点,不仅可以鲜食,而且还是很好的加工原料,已成为我国主要的出口创汇蔬菜之一[4]。

类黄酮(flavonoids)是自然界中存在的酚类物质,属植物次级代谢产物。它具有广泛的生物活性和重要的药用价值,对人体健康有重要影响,在防治心脑血管疾病、抗肿瘤、抗自由基、抗氧化、抗过敏、消炎、抗病毒等方面有重要作用[5]。因此生物类黄酮已引起国内外学者的广泛关注, 成为研究开发的热点。

类黄酮系色原烷或色原酮的衍生物, 其基本骨架具有C6-C3-C6 的特点, 即由两个芳香环A和B, 通过中央三碳链相互连结而成的一系列化合物。其生物合成前体为丙二酰CoA 和对香豆酰CoA,由查尔酮合成酶(Chalcone Synthase,CHS)催化二者形成查尔酮,再在查尔酮异构酶(Chalcone Isomerase,CHI)催化下,使查尔酮的中央三碳链和氧形成闭合的C环。可见查尔酮合成酶是类黄酮基本骨架形成的第一个关键酶[6,7]。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以洋葱的新鲜叶片和花为材料,采自山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地,取样后迅速放入液氮中冷冻,于-80℃保存备用。

1.2 RNA提取

洋葱的总RNA用RNAsimple总RNA提取试剂盒(Tiangen,北京)提取,cDNA 第一链的合成用TIANScript RT Kit(Tiangen,北京)完成。

1.3 PCR反应

本研究所用的一组引物P1: 5′-CATGTCCAAGATCAACATCGATGAG-3′和P2: 5′-CAATCCCGAACGCACCCATTAACA-3′以及另一组引物P3: 5′-CACTACACTTAACTGAACCATGTC-3′和P4: 5′-CCTAACCATCAATGGCCACACT-3′,由博尚生物技术有限公司合成。

PCR反应总体积为25 μl,其中模板cDNA 1 μl,2.5 mmol/L dNTPs 2 μl,引物各0.5 μl,10×Ex-Taq buffer 2.5 μl,Ex-Taq DNA polymerase(Takara,大连)0.13 μl,用灭菌蒸馏水补充至25 μl。扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,58℃退火 1 min,72℃延伸1 min 30 s,35个循环;最后72℃保温8 min。

1.4 目的片段的克隆

扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,然后在凝胶成像系统上检测并照相记录,分子量Marker DL2000从大到小依次为:2000、1000、750、500、250和100 bp。

PCR 扩增产物用凝胶回收试剂盒(Tiangen,北京)进行回收,与克隆载体pMD18-T(Takara,大连)连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性克隆送到博尚生物技术有限公司进行测序。

1.5 序列分析

序列比对在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)进行。生物信息学分析主要采用DNAMAN 软件及http://www.expasy.org 、http://www.softberry.com/等链接的网上软件进行。

1.6 基因表达半定量分析

用AcTublin作为内标,所用上游引物为5′-CCATCTCCTCAGGTCTCAACTTC-3′,下游引物为5′-CGCTTCGTCTTTATTGTCGCCA-3′。通过PCR产物条带的亮度调整模板cDNA的浓度,使其达到一致。然后再用基因特异引物进行扩增,PCR循环25～30次,对电泳结果进行记录和分析。

2 结果与分析

2.1 洋葱AcCHS1和AcCHS2基因的克隆

洋葱 RT-PCR 产物经电泳分离(图1),再通过回收、连接、转化后,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性克隆进行序列测定。对其中一条序列进行ORF分析,发现有完整的开放读码框,其ORF序列1 182 bp,预测的蛋白质由393个氨基酸残基组成,将其命名为AcCHS1基因。对另一条序列进行ORF分析,发现其ORF序列1 176 bp,预测其编码的蛋白质由391个氨基酸残基组成,将其命名为AcCHS2基因。

洋葱AcCHS1和 AcCHS2基因的碱基序列相似性达到78.43%(图2)。与网上洋葱EST库进行序列比对,结果AcCHS1基因对应1条EST,AcCHS2基因对应8条EST。

2.2 洋葱AcCHS1和AcCHS2基因编码蛋白的特征

将洋葱AcCHS1基因和AcCHS2基因预测的编码蛋白与模式植物水稻和拟南芥的CHS蛋白进行序列相似性比较(图3)。结果显示它们的部分区域很保守,保留了所有的高度保守的催化活性中心氨基酸残基(半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、天冬酰胺):AcCHS1 蛋白的Cys166、Phe217、His305、Asn338和AcCHS2蛋白的Cys164、Phe215、His303、Asn336。

用Signal P3.0 Server 检测,结果显示AcCHS1和 AcCHS2蛋白不含信号肽序列,为非分泌蛋白。采用SOPMA 进行二级结构预测,结果表明,AcCHS1 蛋白二级结构主要由α-螺旋(Alpha helix,40.97%)和随机卷曲(Random coil,34.86%)以及延伸链(Extend strand,17.05%)和β-转角(Beta turn,7.12%)组成。AcCHS2蛋白二级结构主要由α-螺旋(Alpha helix,42.46%)和随机卷曲(Random coil,33.50%)以及延伸鏈(Extend strand,17.14%)和β-转角(Beta turn,6.91%)组成。说明两者的蛋白二级结构非常相似。

2.3 CHS编码蛋白的进化树分析

将洋葱的查尔酮合成酶蛋白与拟南芥、大豆和高粱的查尔酮合成酶蛋白进行聚类分析。拟南芥基因组只有一个CHS基因,而在大豆和高粱基因组中CHS是多基因家族。结果(图4)单子叶植物洋葱和高粱聚成一个类群,双子叶植物拟南芥和大豆聚成一个类群。并且洋葱、大豆和高粱的CHS重复基因,都是一个物种内的基因聚在一起。

2.4 洋葱AcCHS1和AcCHS2基因表达分析

我们利用RT-PCR的方法,用AcTublin作为内标,对不同皮色和不同育性洋葱的AcCHS1和AcCHS2基因进行了表达分析。结果(图5)显示,洋葱的AcCHS1和AcCHS2基因在不同皮色和不同育性的材料中,其表达没有显著差别;但在同等条件下,AcCHS2基因的表达明显高于AcCHS1。这与在洋葱基因库中AcCHS1基因对应1条EST、AcCHS2基因对应8条EST结果相一致。

3 讨论与结论

核酸序列和蛋白质序列的分析结果表明,我们已成功克隆了洋葱AcCHS1和AcCHS2基因的全长cDNA序列。AcCHS1的ORF序列 1 182 bp,预测的蛋白质由393个氨基酸残基组成;AcCHS2的ORF序列 1 176 bp,预测其编码的蛋白质由391个氨基酸残基组成。

查尔酮合成酶是类黄酮类物质生物合成途径中的关键酶,调控着色素合成、防御反应、植物育性等生理生化过程。目前已从苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物中克隆了约700个CHS基因及其相关基因的序列,从基因结构看, 多数CHS基因包含1个内含子和2个外显子,并且内含子的位置在所有已知序列中相同[8,9]。我们可以借鉴这些成果,设计合适的引物从洋葱基因组DNA中扩增AcCHS1和AcCHS2基因的内含子,并进一步进行多态性分析。

研究发现在多数植物基因组中存在CHS重复基因。我们已经克隆了2个洋葱CHS基因,是否还存在其它成员,还有待进一步的研究。这些重复基因的序列相似性往往很高,但它们的表达模式却明显不同[9,10]。我们也得到了类似的结果:相同条件下,AcCHS2基因的表达明显高于AcCHS1。重复基因表达模式的分化在很大程度上受启动子和顺式调节元件的影响。下一步,我们可以用缪军等[11]的方法,克隆AcCHS1和AcCHS2基因的启动子,对它们的表达和调控做深入地分析。

对紫花苜蓿(Medicago sativa)的一个查尔酮合成酶蛋白的晶体结构进行研究,证实其活性位点为Cys164、Phe215、His303和Asn336, 这4个氨基酸残基在至今发现的所有查尔酮合成酶中均相同[12]。本研究结果也证明了这一点。这种高度一致的基因结构说明:所有查尔酮合成酶基因可能来源于一个共同的祖先基因。

查尔酮合成酶活性的积累与类黄酮类物质的积累是紧密相关的,因此对查尔酮合成酶的分子生物学研究可以为提高农作物中类黄酮类物质的合成,产生对人类健康有益的食品奠定基础。

参 考 文 献:

[1] Patil B S,Pike L M,Yoo K S. Variation in the quercetin content in different colored onions(Allium cepa L.) [J]. J.Amer.Soc.Hort. Sci.,1995,120 (6):909-913.

[2] Clarke A E, Jones H A, Little T M. Inheritance of bulb color in the onion [J]. Genetics,1944,29 (6):569-575.

[3] 刘冰江,杨妍妍,吴 雄. 洋葱品质育种研究进展[J]. 山东农业科学,2009,4:38-41.

[4] 刘冰江,杨妍妍,吴 雄. DNA分子标记在洋葱遗传育种研究中的应用[J]. 分子植物育种,2007,5(6):118-122.

[5] 謝棒祥,张敏红. 生物类黄酮的生理功能及其应用研究进展[J]. 动物营养学报,2003,15 (2):11-15.

[6] Holton T A,Cornish E C.Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Cell,1995,7:1071-1083.

[7] Shirley B W. Flavonoid biosynthesis:a colorful model for genetics,biochemistry,cell biology and biotechnology[J]. Plant Physiology,2001,126:485-493.

[8] 杨 继,顾红雅.查尔酮合酶超家族(chalcone synthase superfamily) 基因重复和分化的式样[J]. 科学通报,2006,51(7):745-749.

[9] Sommer H , Saedler H. Structure of the chalcone synthase gene of Antirrhinum majus[J]. Mol.Gen. Genet.,1986,202:429-434.

[10]Koes R E,Spelt C E,Reif H J,et al. Floral tissue of Petunia hybrida (V30) expresses only one member of the chalcone synthase multigene family[J]. Nucleic Acids Research,1986,14(13):5229-5239.

[11]缪 军,霍雨猛,杨妍妍,等. 高效TAIL-PCR的改良及在洋葱中的应用[J]. 山东农业科学,2009,10:1-4.

基因指导蛋白质合成的教学案 第4篇

1.概述遗传信息的转录和翻译。

2.运用数学方法, 分析碱基与氨基酸的对应关系。【导学重点】遗传信息的转录和翻译的过程。

【导学难点】遗传信息的翻译过程。【导学过程】

一、对基因的理解

从我们前面学过的“噬菌体侵染细菌”实验导入。

老师:从噬菌体侵染细菌的这个实验中, 我们不仅知道了DNA是遗传物质, 还知道了什么呢?

学生:DNA可以指导蛋白质的合成。

老师:那我们这节课要研究的标题是:基因指导蛋白质的合成, 这边的基因和DNA存在怎样的关系呢?

(很自然的将基因和DNA联系来) 然后请同学们阅读教材P68的内容。

学生:基因是有遗传效应的DNA片段。

教师:换言之, 基因存在那个上面?

学生:DNA。

教师:是不是DNA上任何一个片段都能称为基因?

学生:不是, 而是有遗传效应的。

教师:这样看来存储遗传信息的更小单位是什么?

学生:基因。

这样的问答自然的将基因的概念引出, 并强调了注意点。 (习题巩固)

二、遗传信息的转录

根据基因存在场所和蛋白质合成场所导入到转录过程

老师:DNA (基因) 主要存在于细胞什么部位?蛋白质又在那里合成?

学生:基因在细胞核内, 蛋白质在核糖体上。

老师:核糖体又位于细胞的何部位?

学生:细胞质。

有的学生有了疑惑:“怎么可能细胞核的基因能够指导细胞质的蛋白质合成?”

老师:这个问题提的很好, 细胞核的DNA不可能出来, 但可以通过媒介, 将DNA上的信息传送到细胞质中。究竟谁像个信使一样传达信息呢?

从表格中, 学生能发现:

(1) RNA也是由核苷酸连接而成, 所以也能储存遗传信息。

(2) RNA一般是单链, 而且比DNA短, 因此能够通过核孔进到细胞质中。

再请同学们阅读课本内容了解RNA的种类:

(1) 起模板作用:信使RNA (m RNA) ;

(2) 起转运, 运载作用的是:转运RNA (t RNA) ;

(3) 参与构成核糖体成分的是:核糖体RNA (r RNA) 。

老师:那DNA上的信息怎样被传送到RNA上的呢? (课件播放过程)

学生讨论后归纳总结过程:

(1) (1) 解旋:DNA解旋酶将双链DNA解开, 使双链的碱基得以暴露。

(2) 配对:细胞中游离的核糖核苷酸上的碱基与供转录用的DNA的一条链上的碱基互补配对 (A-U T-A C-G) 形成氢键。

(3) 连接:在RNA聚合酶的作用下, 依次连接, 形成新的分子—m RNA。

(4) 脱离:合成的m RNA从DNA链上释放, 而后DNA双链恢复螺旋

(2) 定义:细胞核内, 以DNA的一条链为模板, 按照碱基互补配对的的原则合成RNA的过程。

习题巩固

三、遗传信息的翻译

通过转录过程我们才使遗传信息到达细胞质。那在细胞质里又是如何将m RNA上的信息转化成蛋白质的呢?

学生根据转录的定义模拟翻译的定义:

1. 概念:在细胞质中, 以m RNA为模板, 合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。

老师 (解释实质) :实际上就是RNA上的碱基序列转化成氨基酸的排列序列。

2. 碱基与氨基酸之间的对应关系是怎样的?设疑:

学生分析课本P70的密码子的表格得出:

学生分析得出:一种密码子只能对应1种氨基酸;但一种氨基酸可能有多种密码子编码 (简并性) 。所有的生物共用一套遗传密码 (通用性) 。

有了模板, 有了对应关系可是游离在细胞中的氨基酸还需要被运送到核糖体上去, 哪个成分充当这个“搬运工”的角色呢?

学生:t RNA。

老师 (分析t RNA的结构特点) :t RNA呈三叶草型, 其一端有三个碱基可以与m RNA上的三个碱基配对, 称为反密码子, 另一端可以携带氨基酸。

一种t RNA只能携带1种氨基酸;一种氨基酸可能由多种t RNA携带。

请同学们观看翻译过程的动画课件后, 学生讨论得出:起始阶段 (起始密码子) 延伸阶段终止阶段 (终止密码)

习题巩固

四、小结:

1. 基因指导蛋白质合成过程:

合成基因 第5篇

半胱氨酸合成酶是植物硫代谢过程中催化O-乙酰丝氨酸和硫化氢合成半胱氨酸的`关键酶.用全长cDNA文库EST随机测序的方法获得了蜡梅的半胱氨酸合成酶胞质异形体基因,构建了全长正义植物表达载体pBI121-CPOASTL.

作 者：向白菊 林俊 眭顺照 皮伟 闫明旭 蒋安 作者单位：向白菊,蒋安(重庆市畜牧科学院,重庆荣昌,402460)

林俊(重庆市第一农业学校,重庆,401329)

眭顺照,皮伟,闫明旭(西南大学园艺园林学院,重庆北碚,400716)

合成基因 第6篇

关键词：栽培烟草；植物螯合肽合成酶；镉转运

中图分类号： Q785；S572.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0034-04

收稿日期：2013-09-11

基金项目：贵州省科技厅农业攻关项目（编号：黔科合NY字[2011]3047号）；中国烟草总公司重点项目（编号：中烟办[2010]221号）；中国烟草总公司重大专项（编号：中烟办[2012]146号）。

作者简介：付强（1984—），男，贵州赤水人，博士，助理研究员，主要从事烟草遗传育种与蛋白质组学研究。E-mail：nesta1984fu@sina.com。

通信作者：任学良，男，博士，研究员，研究方向为烟草基因组学。E-mail：renxuel@126.com。当环境受到镉污染后，镉便在生物体内富集，并通过食物链进入人体而引起慢性中毒。镉被人体吸收后，可在人体内形成镉硫蛋白，并选择性地蓄积在肝、肾中，其中肾脏可吸收近1/3，是镉中毒的“靶器官”。镉在人体内的生物半衰期达到30年之久，往往会引起慢性毒性[1]。通過对我国烟叶主产区的重金属含量调查发现，镉是我国烟叶中的主要重金属元素，含量远高于铅、汞、砷等，平均含量达到2.95 mg/kg[2]。随着人们对健康生活关注度的提高，烟草中镉含量已经成为烟草行业关注的热点。

烟草中的镉来源于土壤，即便是在镉污染不是很严重的土壤中，烟草仍然能够通过根吸收镉，然后被吸收的镉再通过一些转运蛋白进入烟草的各个组织，从而导致镉在烟草中大量富集；此外，植物中负责转运锌、铁金属离子的转运蛋白也有运输镉的功能[3]。植物螯合肽（phytochelatins，PCS）是一种谷胱甘肽衍生的金属结合肽，在多种植物中扮演着解除镉和砷毒性的作用，近期的研究报道，植物螯合肽参与镉在韧皮部中的长距离运输。植物螯合肽的形成需要植物螯合肽合成酶的催化，而植物螯合肽合成酶基因已经成功在植物、真菌和线虫中得到克隆[4-8]。但是植物螯合肽在栽培烟草中是否存在仍然未知，并且如果在烟草中存在，其在镉代谢过程中扮演的角色也值得研究。

电子克隆（in silico cloning）是近年来伴随着基因组计划和 EST 计划而发展起来的新的基因克隆方法[9-12]，其技术核心是利用生物信息学技术组装延伸ESTs序列，获得基因的部分乃至全长cDNA序列。本研究采用电子克隆的方法获得了1个植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），并对其进行生物信息学分析，为进一步研究烟草中镉的转运代谢奠定了基础。

1材料与方法

1.1试验材料

本研究中所用烟草的基因序列均由GenBank提供。

1.2烟草PCS1基因的电子克隆

以马铃薯的phytochelatin synthases 1（PCS1）基因全长cDNA序列（GenBank登录号：AJ548472.1）为信息探针[13]，对GenBank中EST_others数据库的普通烟草（Nicotiana tabacum）进行BLAST检索，并参考菲莫公司的林烟草和绒毛状烟草的全基因组测序结果[14]，使用Codon Code Aligner软件对检索到的来自美国普通烟草的全部EST序列进行拼接，形成重叠群（contig）。利用拼接获得的重叠群作为探针，再次进行同源检索、拼接。重复以上过程直至没有更多的EST被检出，最终获得美国普通烟草的PCS1 cDNA序列，最后再用此序列片段在GenBank中进行BLAST比对，分析与其他物种同源基因的相似性和一致性，检验拼接所得cDNA片段的正确性以及读码框（open reading frame，ORF）序列的完整性。

1.3烟草PCS1基因的生物信息学分析

序列比对、ORF查找和翻译均在 NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的相应模块上完成。利用 ExPASy 网站上的Prot-Param、pI/Mw操作对蛋白质的理化性质进行基本分析；利用在线资源SignalP 4.1、TargetP 1.1、NetOGlyc 4.1、NetNGly 1.0、NetPhos和SOPMA软件进行信号肽、糖基化位点、磷酸化位点和蛋白二级结构的分析；利用clustalX 2.0、MEG A4.0软件进行氨基酸序列比对和进化树分析。

2结果与分析

2.1烟草栽培品种PCS1基因的电子克隆

利用马铃薯PCS1基因的全长cDNA序列（GenBank登录号：AB559522）为检索探针，对GenBnak中的烟草EST数据库进行BLAST检索分析，同时比对菲莫公司2013年发布的烟草基因组测序数据[14]，发现18条一致性和相似性较高的EST序列。按照“1.1”所述方法进行重叠群分析，结果显示，18条EST可拼接成1条独立的cDNA序列，长度为1 596 bp，暂命名为NtPCS1（Nicotiana tabacum PCS1））。

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2.2NtPCS1蛋白的基本参数和可能的翻译后修饰

NtPCS1蛋白的长度为531个氨基酸，分子量为

58.36 kDa，等电点（pI）为 6.44。在氨基酸组成上，酸性氨基酸（天门冬氨酸+谷氨酸）有56个，占10.5%；碱性氨基酸（赖氨酸+精氨酸）有52个，占9.7%；含量最丰富的为亮氨酸（Leu），占总氨基酸的11%，其次是丝氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala），分别占8.9%、8.1%。NCBI保守域检测表明，NtPCS1蛋白含有 2 个保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin，说明所克隆的NtPCS1 基因是植物螯合肽合成酶基因家族成员）。分析还表明：NtPCS1蛋白质不稳定指数为41.79，属于不稳定蛋白；脂溶指数为88.53，总平均亲水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.087，具有轻度疏水性。采用 SignalP 4.1对NtPCS1蛋白进行预测[15]表明，NtPCS1蛋白无信号肽。利用TargetP1.1在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）对推导蛋白的定位特性分析[16]显示，NtPCS1 没有特殊的定位偏好性。用NetOGly 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）和NetNGly 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）进行预测的结果表明，NtPCS1 没有信号肽，即便是具有5个O-糖基化位点，也不会发生O-连接糖基化，但是在第64、154、323位氨基酸可能发生N-糖基化，这3个糖基化位点位于NtPCS1蛋白质的保守功能结构域里，对蛋白的功能可能起着重要作用。NetPhos2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测表明，NtPCS1蛋白存在20个磷酸化位点，其潜在的Ser、Thr、Tyr活性位点数分别为 14、4、2个。NtPCS1蛋白存在着丰富的磷酸化位点，说明磷酸化位点修饰对PCS家族的蛋白活化起着重要作用。

2.3NtPCS1蛋白的二级结构分析

通过SOPMA方法预测的NtPCS1蛋白质的二级结构如图3所示。可以看出，参与α-螺旋的氨基酸含量达到501%（266 个）；177 个氨基酸可能参与形成无规则卷曲，占33.3%；另外有55个氨基酸可能参与延伸链，占10.4%；33个氨基酸可能参与β-转角，占6.2%。以上分析表明，α-螺旋和无规则卷曲是NtGT5a蛋白质的主要结构。

2.4NtPCS1基因同源性分析和系统进化树分析

为了分析NtPCS1与其他植物的植物螯合肽合成酶基因的同源性，在NCBI数据库中对NtPCS1进行了BLASTN。结果表明，NtPCS1与番茄的StPCS1、StPCS18、StPCS16、StPCS19和山莴苣的LsPCS1基因具有较高的核苷酸序列同源性，说明该基因应该是一个与重金属离子的吸收转运相关的新基因。同时BLASTP分析发现，NtPCS1所编码的蛋白质氨基酸序列与番茄同源基因的氨基酸相似性最高，达到85%以上；与树烟草相比，NtPCS1在N端多出30个氨基酸[4]。另外研究表明，NtPCS1与葡萄、蓖麻、可可、杨树、大豆、拟南芥的植物螯合肽合成酶基因也有较高的同源性，同源性分别为73%、68%、68%、67%、63%、60%。从GenBank上获得的多个植物PCS同源基因编码蛋白的氨基酸序列，经过clustalX 2.0比对后生成aln比对文件，然后利用进化分析软件MEGA 4.0，并采用中邻位相接（Neighbor-Joint）算法构建系统进化树[17-18]。分析结果表明，栽培烟草中的PCS蛋白与茄科植物PCS基因编码蛋白的进化关系更近；而在同科植物中，与树烟草、番茄和马铃薯的同源基因相比，烟草栽培品种的PCS蛋白与树烟草的PCS蛋白同源性更高，在进化关系上更近。

3结论与讨论

许多研究表明，植物螯合肽在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用。Grill等早在1987年发现，在10多种高等植物中，PCS能结合植物所吸收的90%镉[19]。还有研究发现，PCS通过与植物根部吸收的镉形成复合物，能够减少镉离子对植物的毒害，从而增强植物抵抗镉胁迫的作用。

相较于其他高等植物，烟草具有更强的镉吸收累积特性，这与烟草对污染土壤中镉胁迫产生的耐性有关。Davis的研究表明，当土壤镉含量为69mg/kg时，烟草植株中镉的含量

是菠菜、莴笋的3倍[20]。烟叶中的重金属含量是由其生存的土壤中带入，而不是在生产加工过程中人为添加，而土壤中的镉、镍、铅等重金属元素的含量和pH值是呈负相关的，因此土壤越酸，重金属的含量也就越多。西南地区是我国酸雨最严重的地区，贵州的贵阳、都匀等地的酸雨量则更为严重，1982年都匀城区曾监测到降水pH值为3的惊人记录，因此这些地方的重金属含量有可能较高。吸烟时重金属对人体的危害，大大高于消化道的吸收量，因为在香烟不完全燃烧时即发生了一系列热分解与热合成化学反应，燃烧时的高温便将烟草中的重金属、类金属衍变为烟尘和雾（气溶胶），并直接由人体呼吸道进入体内，该过程包含了吸烟者和被動吸烟者，因此烟草中镉含量已经成为健康等领域关注的热点。

已有文献报道在植物中表达与PCS1合成途径相关酶的基因，能够增加PCS1的含量，并且提高植物对重金属的抗性和累积量[21]。本研究通过电子克隆方法从烟草栽培品种中克隆到1个植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），为利用此基因培育低镉富集的植物奠定理论基础。

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合成基因 第7篇

《基因指导蛋白质的合成》是人教版高中生物《遗传与进化》第四章第一节的内容,本节集中了本章的重难点,并为后续内容的学习奠定了基础,地位相当重要。本节主干知识是遗传信息的转录和翻译过程,侧枝内容为DNA与RNA的比较、三种不同种类的RNA及遗传密码的组成。教学中,教师要合理分配时间,处理好主干知识与侧枝内容的关系。

二、学情分析

通过前几章的学习,学生掌握了DNA是主要的遗传物质、DNA分子的结构、基因是有遗传效应的DNA片段等知识,在此基础上学习基因的表达,符合认知规律。然而本节课内容较多,且抽象难懂,因此教学中,可利用多媒体动画模拟转录、翻译的过程并结合教材插图进一步归纳总结,再利用自制模型演示翻译过程,以突破难点,使教学更直观形象,最后通过概念图总结,使学生形成较为完整的知识体系。

三、教学目标

(1)知识目标:概述遗传信息的转录和翻译;理解密码子和反密码子的概念。

(2)能力目标:运用数学方法,分析碱基与氨基酸的对应关系;尝试利用自制模型演示翻译过程,提高动手能力及团队合作能力。

(3)情感态度与价值观目标:体验基因表达过程的和谐美,基因表达原理的逻辑美、简约美。

四、教学重难点及解决方法

(1)教学重点:遗传信息转录和翻译的过程。

(2)教学难点:遗传信息的翻译过程。

(3)解决方法:多媒体动画模拟转录、翻译过程并结合教材插图进一步归纳总结,利用自制模型演示翻译过程,使教学过程直观、形象,最后通过概念图总结。

五、教学过程

1. 创设情境,导入新课

播放美国影片《蜘蛛侠1》的剪辑片段,引发学生思考:影片中主人公彼得·帕克被蜘蛛咬了一口后,获得了蜘蛛的什么物质?之后,他拥有蜘蛛特有的超能力——从手指喷出粘力极强的蜘蛛丝、能飞檐走壁等。请结合必修一的知识,说出蜘蛛丝的主要成分是什么。教师依据学生的回答板书关键词:DNA(基因)、蛋白质。继续提问:获得的是蜘蛛的DNA,怎么产生蛋白质了呢?对此,学生很感兴趣并大胆猜测,有的学生猜测“基因能够指导蛋白质的合成”,自然引出课题。

点评:用学生熟悉的知名电影引出课题,能调动学生学习的积极性和探索未知的欲望,使学生体验学习的乐趣。

2. 小组讨论RNA充当信使的原因

多媒体投影相关问题,学生分小组讨论:①DNA(基因)主要分布在细胞的什么部位?蛋白质合成场所在哪里?②位于细胞核中的DNA(基因)如何指导细胞质中蛋白质的合成?是DNA分子从细胞核出来还是核糖体进去?学生讨论后,多媒体展示资料1:DNA分子直径约2nm,核糖体大致为圆形颗粒,直径约23nm,而核孔只有0.9nm。通过该资料,学生很容易得出“DNA出不来,核糖体进不去”的结论。教师追问:③那空间距离无法解决,我们猜测势必在两者之间存在一种充当信使的物质,它可以将DNA上的遗传信息传递给蛋白质,那么需要具备怎样的条件才能担当这一角色?学生讨论得出该物质需具备以下条件:能携带DNA上的遗传信息;比DNA分子小,能从细胞核进入细胞质等。继续追问:④这种神秘使者究竟是什么?多媒体展示资料2:1955年,布拉舍用洋葱根尖和变形虫为材料进行实验,他用RNA酶分解细胞中的RNA,蛋白质的合成就停止;而如果再加入从酵母中抽提的RNA,则蛋白质的合成会有一定程度的恢复。同年,戈尔德斯坦(Gold-stein)和普劳特(Plaut)观察到用放射性标记的RNA从细胞核转移到细胞质。因此,人们推测RNA是DNA与蛋白质合成之间的信使。教师过渡:原来这种神秘使者是RNA,必修一就曾学过。

点评:通过一系列小问题引发学生思考,小组讨论可以加强学生的交流合作能力,结合资料1、2学生能自然探究出RNA充当信使的结论。该方法摆脱了传统教学模式中教师直接告诉学生答案的枷锁,体现新课程倡导自主、合作、探究学习的理念。

3. 引导学生学习RNA的结构特点及种类

点评:建构主义学习理论认为,任何学习都要涉及学习者原有的认知结构,学习者总是以其自身的经验来理解和建构新的知识。通过引导学生对两个表格进行阅读比较,使学生对DNA的相关知识有深入的了解,而将其与RNA进行对比,能使新知识的学习更为有效。

4. 动画展示转录过程,使抽象过程形象化

教师先进行提问:既然基因指导蛋白质的合成需要RNA充当信使,那么请同学们大胆猜测该过程至少分几步?分别叫什么?(由此引出转录和翻译)接着,动画展示转录过程,小组讨论转录的场所、模板、产物、原料、酶、遗传信息传递方向、碱基互补配对原则及产物的去向等问题。通过讨论,学生也很难得到所有答案,此时教师应不急于揭晓答案,而是让学生带着疑问阅读课本插图4-4,并请学生解析转录过程,不足之处再加以指正。最后,教师总结:转录是指在细胞核中,以DNA的一条链为模板,游离的核糖核苷酸为原料,在RNA聚合酶的作用下,按照碱基互补配对原则,合成mRNA的过程。通过该过程遗传信息从DNA的碱基排列顺序传递到了mRNA的碱基排列顺序中,类似于磁带录制,故名转录。

点评:通过动态模拟过程的观看及静态图的解析,学生不但对转录过程有了一定的了解,同时也培养了识图、辨图能力和语言表达能力。

5. 利用自制模型演示翻译过程,以突破难点

教师提问:转录了DNA遗传信息的mRNA,如何进一步把信息传给蛋白质呢?即mRNA上的碱基排列顺序如何决定蛋白质的氨基酸排列顺序呢?引导学生探究碱基与氨基酸之间的对应关系,总结出密码子的概念并解读密码子表,提出密码子的简并性和通用性。多媒体展示一系列问题:①氨基酸如何被搬运到核糖体?②它是如何决定搬运哪种氨基酸的?③一个核糖体如何同时结合mRNA上的几个密码子?tRNA搬运的氨基酸在核糖体上发生什么反应?④翻译何时终止?一个mRNA只能结合一个核糖体吗?⑤一个mRNA可以相继结合多个核糖体,有何意义?⑥翻译的场所、模板、产物、原料、酶、遗传信息传递方向、碱基互补配对原则分别是什么?带着这些疑问,要求每组学生将课前参照课本图4-6准备好的核糖体、mRNA、tRNA模型拿出,并请一组同学上台演示并讲解翻译过程。学生通过自制模型演示及小组讨论能得出大部分问题的答案。对于少数疑问,教师暂不解决,让学生带着疑问进一步观看翻译动画,并引导学生分析图4-6,多方位突破难点。

点评:通过自制模型模拟翻译过程,并由学生自己描述,整个过程中学生能表现出较大的学习热情,再通过动画模拟和层层设疑,学生能较好地理解翻译的动态过程。

6. 归纳总结,构建完整知识体系

播放转录和翻译的全过程,使学生从整体上把握基因表达的整个动态过程。归纳总结,板书构建如下概念图,并通过概念图推导DNA的碱基数、RNA的碱基数与氨基酸数的数量关系。

点评:通过概念图可帮助学生构建完整的知识体系。

六、教学反思

建构主义理论认为,教学是激发学生主动建构知识的过程而不是传授、灌输知识的活动。因此本节课通过设置一系列小问题、分小组讨论、多媒体动画结合教材插图,对于难点加以自制模型演示等方法引导学生自主探究,以学定教,不仅使学生较好地掌握知识,体验学习的乐趣,同时也提高了学生的团队合作能力、动手能力及语言表达能力。

但是,由于学生很少动手制作模型,部分学生在制作及演示模型过程中存在一些困难,这方面还有待加强。

参考文献

[1]白建秀.备课应抓住的几个问题——以“基因指导蛋白质的合成”为例[J].生物学通报,2014,49(2):40-44.

合成基因 第8篇

尽管人们已经应用许多生物碱长达几十年, 然而人们几乎不知道这些珍贵的植物次生代谢物是如何在植物组织内形成的。近些年来, 报道了许多生物合成的全新分子信息, 而这些都是科学家们平时最为关心的生物碱。大多数化合物都是从氨基酸出发, 途中涉及到一系列中间产物和酶。这些酶并不是位于细胞质中, 而是在亚细胞区室。不但编码这些酶的基因具有控制生物合成的功能, 像转录子这样的主调控基因也在整个机械化的生物合成途径中扮演重要的角色。通常来说生物碱各种合成步骤在不同的植物器官、细胞种类或者细胞器内发生, 胞内或胞间转运的过程中也很常见。白屈菜碱是第一条被充分认识的生物碱合成途径, 同时吗啡碱的合成途径也在趋于全面了解。目前全世界有好几个研究小组通过经典生化方法或者研究功能基因途径来揭示各种其他的生物碱合成途径。总之科学家们相信, 只要对目前正在研究途径的全面认识, 以及对目标代谢物发生和剂量的调节机制彻底理解, 就一定可以成功完成次生代谢途径的代谢工程研究。

随着功能基因工具有了较大发展, 拟南芥全部基因序列测序已经完成。随后的是稻米以及另外的农作物也将完成测序, 这样就可以用生物学的系统方法, 阐释初级和次级代谢物的合成。从基因组学和代谢组学中获得的巨大信息, 无疑将把科学家们带入一个理解植物以及其它生物系统的新纪元。笔者将介绍萜类吲哚和莨菪烷生物碱的最新研究进展。科学家们展现了一个成功开发的、基于功能基因的全新技术平台, 它被用于发现药用植物中, 从基因到代谢物的网络, 从而可以使科学家们操纵植物细胞合成已知或全新的生物碱。同时在合成、贮存和运输生物碱时, 转录基因的作用也受到关注。

1 植物基因组学和代谢组学的发展

由于对植物生物合成的途径及其调节机制了解甚少, 所以科学家们在对植物复杂的代谢途径进行合理的操作以获得次生代谢产物时, 遇到了很大的障碍。此外, 这些代谢途径的合成途径也几乎是未知的。一方面, 给予植物标识过的前体进行研究, 已经成功地绘制出一些代谢途径的化学反应图示, 但尚有很多不知道的途径。另一方面, 由于这些植物组织内特定的生物碱以及其各自的合成酶丰度极低, 所以很难用经典的分析方法来研究其生物碱途径。通过反向遗传学的方法, 氨基酸序列已经可以通过纯化的酶被确定。或者可以通过筛选同源的候选基因, 结合表型来分析。利用这些方法, 科学家们已经发现了数十种编码催化不同生物碱合成步骤的酶的基因。

传统的生物分析方法只能分析很少一部分基因和代谢物, 与之相对的是, 现在可以通过基因组方法来整体研究分析一些模式植物。可惜许多有意义且有价值的药用植物的染色体组信息不容易得到, 不管是基于完全的染色体组信息还是已经表达的序列标签 (EST) 。然而, 一种叫做cD-NA-AFLP转录表达谱 (扩增片段长度多态性) 的方法提供了另一个可行的方法。这种cDNA-AFLP最大的优点是不需要优先序列的信息, 这样一些外来的、稀有的药用植物就可以实现。此外, 这种方法还能给出定量的表达谱, 并且可以辨别出新的编码蛋白基因的亚型。

代谢物组学意味着可以平行测定大量的生物分子组分。它是最近才被认为是后基因科学的一个重要组成部分。代谢指纹法作为一种研究工具, 已经可以追溯到20世纪70年代。代谢物组学的第一个重大突破是在微生物中, 当这之后人们才发现了它在植物代谢物也有研究潜能。但是直到最近, 几乎所有的植物代谢研究仅仅包含了其初级代谢物。在揭示植物代谢物时遇到的普遍问题, 是植物体内化学物质高度的复杂性和种类众多。这在次生代谢物分析中尤为明显, 因为这比初级代谢谱要复杂得多。植物产生大约20万种代谢产物, 并且一个特定的物种都要达到5000～25 000种代谢物, 这就和基因数目在同一个数量级了。估计拟南芥25%～30%的基因都用于编码代谢产物的酶。要找到一个在测定代谢产物中精度和广度的平衡点, 是一个主要的挑战。在过去十几年中, 仪器设备的发展十分迅速。目前, 一个单一的分析就可以增加代谢物的测定范围。但是, 如果只用一个抽提系统, 许多植物代谢物很有可能残留在植物基质中, 不能被分析出来。因此科学家们提出至少要用两种以上的代谢平台, 例如LC-MS和GC-MS。化学属性、抽提条件、色谱分离以及后续仪器分析条件都相同的化合物可以一同分析。一项最近发表的关于西红柿顶部挥发物研究就很好地说明了, 对于特殊馏分, 不预先设定目的产物的检测得到了很好的成效。

Hirai及其同伴研究细胞代谢过程, 在缺乏硫和氮时, 结合全基因组层面的转录组以及代谢组, 取得了重大进展。此项研究是开创性的, 它成功地让科学家们更进一步理解植物中基因组数据和代谢功能间的重要联系。他们在研究中把微阵列分析和靶向定量分析结合在了一起, 并且运用了最新的生物信息学工具来处理数据。虽然这些研究主要是针对初级代谢产物的, 但是引起了研究硫苷、蒜氨酸等次生代谢物人员的高度关注。

2 对于萜类吲哚生物碱合成的最新基因代谢物网络

长春花, Catharanthus roseus L.G.Don, 是一种药用植物, 它含有120多种萜类吲哚生物碱 (TIAs) , 有一些在临床上作为重要的抗癌药物。其中最重要的两种生物碱即长春花碱和长春新碱, 只能从长春花产生, 并且产量很低。

生物合成TIAs是从两条途径进行一系列次生代谢反应 (见图1) 。

莽草酸途径是由色氨酸脱羧酶 (TDC) 将色氨酸脱羧后形成半吲哚色胺。半萜类裂环马钱子沿着萜类途径, 从香叶醇合成。而香叶醇, 是从由非甲羟戊酸质体途径 (MEP) 从甘油醛-3-磷酸和丙酮酸开始合成。异胡豆苷合酶 (STR) 催化色胺和裂环马钱子形成异胡豆苷, 其不但是长春花现有TIAs的主要生物碱前体, 还是许多像喜树碱这样重要抗癌化合物分子的前体。异胡豆苷由异胡豆苷葡萄糖苷酶 (SGD) 催化水解。结果, cathenamine配体可以互相转化, 得到了许多生物碱的基本化学骨架, 并且进一步添加取代基来修饰。像长春新碱等含有药用价值的双吲哚生物碱通过在文朵灵的基础上进一步化学反应形成。文朵灵来源于水甘草碱和长春碱, 需经过一系列反应, 涉及到水甘草碱16-羟化酶 (T16H) 、O-甲基转移酶 (OMT) 、N-甲基转移酶 (NMT) 、脱乙酰氧基文朵灵4-羟化酶 (D4H) 和脱乙酰文朵灵4-O-乙酰基转移酶 (DAT) 。必须指出的是, 无论是酶还是中间产物都需要分子内或者与其他分子间的转移, 有些反应还只在特定区域发生。除了空间需求, TIA合成还有严格的反应条件和环境控制。比如文朵灵的积聚就依赖于茉莉酮酸脂。生物合成基因的协同表达响应了外部和内部信号, 受到转录因子的控制。最近, 一些植物特有的AP2家族成员通过T-DNA激活标签分离得到, 像长春花中AP2区域响应ORCA2和ORCA3的转录调控。

科学家们现在对TIA合成知识的总结都是基于近50年来的研究。起初, 标记实验经常借用细胞培养, 从中得到一套代谢物相关的化学反应框架, 就好像尼古丁碱的途径。后来, 参与生物合成的酶被经典分析方法逐一分离和识别。随着系统生物学强有力功能基因组工具的发展, 快速的全面研究成为了可能。借用基于cDNA-AFLP的转录图谱, 科学家们最近能够通过一项实验来监视除2个基因以外的所有与TIA合成相关的基因对诱导的响应。能达到以上实验目的, 是因为cDNA-AFLP并不像微阵列分析这样的标准转录图谱分析工具, 必须依赖于经过测序的模式植物。总共417个不同表达转录的标签和单一序列一起得到。把这些序列与EMBL数据库中236个现有的长春花记录比较, 发现只有不到10%可以完全匹配, 这说明得到的大多数标签都是未知的序列。共有37%的标签与已知植物基因不相似。另外转录序列也与最近完成的长春花蛋白质组数据集相比较。一个相应的标签可以从标识的58个具有功能的蛋白质点中总共找到9个对应点。其中有两个STR亚型和一个PS蛋白与TIA合成有关。

为了找到基因表达和代谢积聚物之间的联系, 科学家们用转录图谱的相同样品进行了无目标的代谢谱测定。最终从TIA途径中获得178个代谢物, 包括9个已知是TIA途径的化合物。对转录和代谢图谱进行了主要成分分析后发现, 样品处理和取样时间之间没有联系。随后相关网络分析被用于研究长春花细胞中复杂的次生代谢合成网络。所构建的网络可以用于那些有可能和TIA代谢有关基因的快速鉴定。另一方面, 此网络可以通过连接未知或已知代谢物的积聚方式来帮助阐释未知的途径。既然第一个长春花次生代谢模式已经被研究获得, 可以想象, 未来以通量分析方法得到的综合代谢图谱最终会创造无数机会, 借此可深入挖掘代谢途径组织的细节, 并最终称为“预测代谢工程”。

3 从组合生物化学方法到托烷类生物碱途径工程

一小部分编码酶的关键基因负责合成主要骨架, 这是由不同特征的各类次生代谢物组成。对于这些基因的鉴别已取得重大进展。基本的骨架结构经过后来的修饰后, 各种植物次生代谢物发生了巨大的化学和药理变化。大部分的反应都被一小部分酶催化, 如甲基、糖基、酰基转移酶, 它们都是由多基因家族编码的。正常情况下酶都是底物、结构域和/或构象专一的。

“组合生物化学”思想基于这样的想法:不同植物物种可以合成结构上密切相关的化合物 (如种特异性的生物碱) , 将利用相似底物的酶, 以转基因的方式表达在另一种不含有该酶的植物中。这种方法有可能可以创造全新的物质, 就像Laurila及其同伴在1996年发表的那样。他们对两个茄属种马铃薯S.tuberosum和S.brevidens进行杂交。杂交结果显示, 不但产生了正常的番茄碱和茄次碱, 各自分别又产生了新的糖苷生物碱垂茄啶, 这是从未在亲本植株上报道过的。Toni Kutchan给出了另一个例子。他研究植物重组体O-甲基转移酶的底物特异性后, 发现这些酶甚至可以接受不同类别的次生代谢物为底物。对四种不同的唐松草的O-甲基转移酶各自底物特异性进行测试, 发现它们都能使咖啡酸O-甲基化, 其中两种还可以接受中间体乌药碱, 但并不清楚它们的首选底物。

研究“组合生物化学”的有趣想法源于两种茄科植物茄子和天仙子, 他们共有一部分公共的合成途径。托烷类生物碱, 尤其是天仙子胺和东莨菪碱, 在副交感神经系统中作为非常常用的抗胆碱药物。东莨菪碱非常有价值, 并且在中枢神经系统中成为首选药物, 它具有高度生理活性且少有副作用, 因此增加其在不同植物细胞内的产量受到了很多的关注。托烷类生物碱有N-甲基曲咯铵合成步骤 (图2) 。只有一些托烷类生物碱途径底部的功能酶被识别出来 (图2) , 即托烷还原酶I (TRI) 、托烷还原酶II (TRII) 和天仙子胺6β-羟化酶 (H6H) 。托品酮在托烷类生物碱合成过程中所起的作用很长一段时间没有搞清楚, 直到1990年Landgrebe和Leete发现其在托烷半脂中起的作用。托品酮进一步由两个已知的TRI和TRII酶催化转化为托品碱和假托品碱。littorine是天仙子胺的位置异构体, 由托品碱和苯基乳酸形成, 而后者又来源于苯丙氨酸。Robins及其同伴发现天仙子胺和合成littorine有直接联系。天仙子胺6β-羟化酶 (EC 1.14.11.11) 催化天仙子胺羟基化成为6β-氢氧化天仙子胺, 以及后者环氧化成为东莨菪碱两个反应。过量表达h6h基因, 这种方法最先由Hashimoto等人和Yun等人发表。最近研究发现, 天仙子胺可以完全转化为东莨菪碱。随后又发现, 天仙子胺的含量可以通过培养, 使黑茛菪毛状根比对照提高100倍, 而天仙子胺的含量并没有减少。最近, 在嚏根草 (H.niger) 中同时过量表达pmt和h6h, 导致东莨菪碱含量达到411mg/L, 这是迄今为止培养毛状根最高的含量。

面根藤碱从托品碱途径的其它分支合成 (图2) , 是多羟基去甲托品烷碱类, 起到强烈的糖苷酶抑制作用。这个化合物最初是从打碗花中发现的, 后来又在许多茄科植物和一些不认为有托烷类生物碱途径的物种中发现, 如马铃薯。面根藤碱在TRII酶催化的反应中由托品酮形成。最近, 从颠茄中发现托品碱和假托品碱来源的生物碱之间的比例在trI或trII过量表达后有所改变。Rocha等将黑嚏根草中两个涉及托烷类生物碱合成的基因, trI和h6h, 在烟草中表达。令人惊奇的是, 在转基因烟草中, 除了发现这些酶的预期反应产物外, 还发现尼古丁以及相关生物碱的浓度水平也提高了。这说明基因工程方法, 可以引起整个尼古丁碱合成整个途径被诱导激活。另外在转h6h基因烟草毛状根中, 观察到尼古丁碱产量的提高。然而, 导致内源性生物碱合成改变的, 与其认为是由外来基因诱导所致, 还不如认为这是由激发子把天仙子胺作为一种外来底物而起到的效果。这些根组织大量吸收天仙子胺, 且85%都被转化为东莨菪碱并排到培养基中。

通过“组合生物化学”途径来进行代谢工程, 在科学家们最近的研究中体现出了价值。烟草生物碱代谢中起十分重要的基因, 在相关的天仙子和不相关的长春花中都过量表达。后来, 研究转基因后的代谢图谱, 科学家在天仙子毛状根中发现了导致非典型多胺和假托品碱来源的托烷 (如3β-乙酰氧基莨菪烷) 产量提高的烟草基因。其中一个基因在长春花根部同时导致了不同生物碱谱, 派生出不在对照组毛状根中的萜类吲哚生物碱。

4 未来展望

合成基因 第9篇

植物生长发育过程中,叶片、花和果实会产生不同的颜色,其中花色素苷起到重要的作用。大量研究表明,花色素苷是植物花朵、叶片和果实中红色、蓝色和紫色系色泽形成的物质基础[1]。在花色素苷合成过程中,二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)的表达起到关键性作用,被认为是关键酶[2],因此对叶片、花瓣、果实颜色的形成非常关键。近年来利用基因工程技术调控花色素苷形成取得显著的效果,蓝猪耳(Torenia fournier)中过表达DFR后,后代植株花色素苷含量在一定程度上明显增加,表明DFR的表达与蓝猪耳花冠色素合成相关。文樵夫等从观赏海棠中克隆DFR基因,并采用实时荧光定量PCR 技术检测不同叶色品种中DFR表达量,结果表明DFR在所有观赏海棠叶片中均有表达,与叶色密切相关。据报道叶色越红的品种,其花色苷含量越高,这已经在观赏海棠中得到验证[3]。

垂丝海棠(Malus halliana)属于蔷薇科苹果属,是中国特有的植物物种。其树形优美,花色丰富多彩,新叶紫红,成熟叶片棕绿色,健康美观,所以是园林景观中不可缺少的观赏树种资源。本文拟以垂丝海棠为试材,利用同源克隆技术,分离一个与花色素苷合成相关的DFR基因,并利用生物信息学技术对其进行分析,为该基因表达和功能研究奠定基础,为利用遗传工程培育海棠新品种提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

植物材料垂丝海棠(Malus halliana(Voss.)Koehne.)由扬州大学园艺与植物保护学院提供(5月份室外采收,生长平均温度为24℃,平均湿度为70%)。采集垂丝海棠叶片后,进行液氮速冻,置于-80℃保存备用。

1.1.2 试剂

实验过程中所用到的克隆载体为pMD18-T,来源于TaKaRa公司。感受态细胞为大肠杆菌DH5α,购自TaKaRa公司。生化试剂有:反转录酶 (Tiangen,China),EcolI (TakaRa公司)、RNase H酶、Taq聚合酶、dNTP (Tiangen,China)、DNA分子量标准购自TaKaRa公司,DNA胶回收试剂盒购自爱思进公司,引物合成由上海生物工程技术有限公司完成。

1.1.3 仪器

PCR仪、摇床、冰箱、离心机、移液器、烘箱等。

1.1.4 培养基

采用的培养基主要为LB液体和LB固体培养基。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取与cDNA第一条链的合成

叶片总RNA的提取采用CTAB法[4],在RNA提取过程中利用DNaseⅠ处理防止RNA污染。按照反转录酶使用方法进行合成cDNA第一条链,20μL PCR反应体系含有:模板总RNA量为1μg;dNTP(20mmolL-1):2μL;5RT buffer:5μL;RNase抑制剂(10UμL-1):1μL;反转录酶:1U;上下游引物各2μL(表1);利用RNase-Free ddH2O补足至20μL。PCR反应程序:37℃ 10min,42℃ 40min,99℃ 5min,4℃ 10min。合成后的cDNA于-20℃保存备用。

1.2.2 垂丝海棠MhDFR序列的克隆

以上述得到的垂丝海棠叶片cDNA为模板,利用同源克隆方法进行基因克隆。首先找到其它物种的二氢黄酮醇-4-还原酶基因,通过同源性比对后,找到该基因的保守序列,然后再根据保守序列设计引物F和R(表1)进行PCR扩增,反应体系为25μL:cDNA 1μL,上下游引物各1μL,rTaq酶0.125μL,dNTP 2 μL,MgCl2 1μL,ddH2O 16.875μL;PCR反应体系为:94℃预变性4min,40个循环(94℃ 45s、62℃ 40s、72℃ 2min),72℃延伸10min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测后,回收目标片段,纯化后与pMD18-T Vector连接,转化DH5α感受态细胞,蓝白斑筛选后测序,测序由上海英俊生物有限公司(invitrogen)完成。

1.2.3 序列分析

利用生物学软件BLASTn和BLASTp将该基因序列及推测的氨基酸序列进行序列同源性分析后,找到垂丝海棠二氢黄酮醇-4-还原酶基因的编码序列,同时对基因结构进行分析。使用Clustal X对序列进行多重比对后,利用MEGA4构建垂丝海棠MhDFR分子系统进化树[5]。

2 结果与分析

2.1 垂丝海棠MhDFR基因的克隆及序列分析

以垂丝海棠叶片为材料进行RT-PCR扩增,获得了一个长度为1 181 bp目标基因片段 (如图1所示),ORF(开放阅读框)为978 bp,编码394个氨基酸(图2)。对测序结果进行BLAST比对,结果显示该基因序列与观赏海棠“王族”(Genbank 登录号:FJ817487[3])DFR的同源性为98%,因此命名为MhDFR。序列分析表明,MhDFR序列中从第22个碱基到第84个碱基编码的多肽为“VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY”,这是DFR与NADP 的结合点,此结合位点在不同的物种中具有高度保守性,因此MhDFR属于DFR家族,为垂丝海棠花色素苷合成途径中的关键酶。

注;而黑色标注部分为DFR功能结构域。 GENBANK登录号:葡萄:VvDFR-AY780886.1,山葡萄:VaDFR-FJ64576801,美国红树RmDFR-GQ355943.1,水蓼:PhDFR-AB070932.1,草莓:FaDFR-AY695812.1,玫瑰:RhDFR-AB490072.1,桃:PpDFR-AB095030.1,山楂:CmDFR-AY786995.1,观赏海棠“王族”:McDFR-FJ817487.1,苹果:MdDFR-AF117268.1,西洋梨:PcDFR-AY227731。

利用DNAMAN进行多重序列比对,结果如图3所示,MhDFR与苹果(Malus domestica)、葡萄(Vitis vinifera)、西洋梨(Pyrus communis)等不同树种的DFR序列有较高的同源性,含有该家族同源基因相似的中央编码区,具有典型的DFR蛋白功能结构域,分属于短链的脱氢酶和还原酶(SDR)家族,这类酶多数为NAD-或者NADP-依赖的还原酶。另外从序列比对结果来看,来源不同树种中的DFR 具有很高的同源性,一方面说明DFR 在基因进化过程中高度保守,另一方面也暗示DFR 在花色素形成过程中起到重要的作用。

2.2 MhDFR分子进化树分析

为了研究植物中DFR的分子进化,我们利用MEGA4软件,对MhDFR与观赏海棠“王族”、苹果、葡萄、西洋梨等植物的DFR结构域蛋白进行进化树分析,从图4中可以看出MhDFR编码的氨基酸序列与其他物种来源的DFR具有较高相似性。特别是与观赏海棠“王族”的McDFR相似性最高,为98%,根据以上结果可以看出分子进化和植物进化具有高度的一致性。因此我们初步推测垂丝海棠MhDFR与观赏海棠“王族”的McDFR功能相似,和叶片着色密切相关,能够影响海棠叶片的颜色。

3 讨论

植物花色会随着代谢的进行而改变,而花色的改变一方面由外界环境所致,另外也受到内部遗传物质的调控[6,7,8,9]。通过花色的改变,植物一方面可以起到保护花器官的作用,另外也可以帮助植株完成授粉,进而完整个生活周期[10,11]。

影响花色表现的因素很多,大体上可分为外部因素和内部因素。其中外部因素包括光照、温度、植物激素及营养物质等;内部因素主要是基因。光照对花色表现影响很大,光质和光周期主要影响花器官中相关色素组分的生物合成,其中对花色素苷的影响最为明显。温度和温周期主要影响植物生长的生理状态,根据物种对温度喜好不同,适宜的温度及温周期对花的发育及花的颜色形成极为有利[12],并且将根据这些花色将品种进行分类方法也非常成熟[13]。在内部因素方面,PAL(苯丙氨酸解氨酶)、CHS(查耳酮合成酶)、CHI(查耳酮异构酶)和DFR(二氢黄酮醇-4-还原酶)等是花色素形成的关键酶,这些酶基因的表达对花色素成份的形成非常重要。研究表明DFR属于脱氢酶类,这类酶的主要特点为至少含有2个结构域即辅酶结合位点和催化作用位点,第一个结构域通常为辅酶的结合位点,第二个结构域为催化作用位点[14]。此外还包括NmrA区域,这个区域能够和其他作用因子结合,对AreA功能的调控具有重要的作用,另外在差向酶和霍霍巴酰基辅酶A还原酶中也发现了相同的结构域,说明该结构与对花色素苷的形成非常关键[15,16],此结构域还显示了DFR进化的保守性。在本实验所克隆的MhDFR中也发现了类似的结构,所以推测MhDFR的功能可能和花色素物质合成相关,这无疑对今后进一步研究垂丝海棠叶片和花朵中花色苷的形成具有重要作用。

合成基因 第10篇

乳链菌肽 (nisin) 亦被称为乳酸链球菌素, 是某些乳酸乳球菌亚种 (Lactococcus lactis) 在发酵生长过程中产生的一种细菌素[1]。成熟的nisin是由34个氨基酸残基组成的小分子多肽, 分子式为C143H230N42O37S7, 分子量为3 354Da。自20世纪50年代英国的Aplin和Brrett公司发现nisin, 至今nisin已被80多个国家和地区应用。由于在人体消化道内胰凝乳蛋白酶能够迅速将nisin降解为氨基酸, 所以nisin属于安全、天然的食品防腐剂, 主要的用途是乳及乳制品、罐装食品、乙醇饮料以及高蛋白饮料的防腐保鲜[2], 同时也可以应用于化妆品和医疗保健品等领域[3,4,5,6,7,8,9,10]。

根据细菌素的结构、相对分子量、稳定性和抑菌性等特性, 乳酸菌细菌素可以分为三大类, 其中nisin属于A类羊毛硫细菌素[11,12,13], 由57个氨基酸组成nisin的前体肽 (precusor nisin) , 其N端23个残基为信号肽, 而信号肽酶会在细胞表面将其水解去除。在nisin的合成过程中, 由核糖体合成nisin前体肽 (precusor nisin) , 此过程由nis A/Z编码, 而nis P对nisin前体肽进行加工, 将其转化为具有抑菌活性的成熟nisin (图1) 。在成熟的有抑菌活性的nisin的活性部位含有一些修饰性的氨基酸, 如羊毛硫氨酸 (Ala) 、脱氢丙氨酸 (Dha) 、β-甲基羊毛硫氨酸 (Abu) 、β-甲基脱氢丙氨酸 (Dhb) , 这些氨基酸通过二硫键形成5个分子内环, 经常被称作“黄金五环”。研究者之前发现的nisin分子有5种类型, 分别为A、Z、Q、U、F[14], 在最近的研究中, Perin Luana Martins等从山羊奶中发现了nisin另一种类型, 该nisin表现出广泛的抑菌谱[15]。

在nisin合成基因簇中, 首先由核糖体合成nisin前体肽 (precusor nisin) , 此过程由nis A/Z编码, 然后由nis B、nis C进行修饰;nis B使nisin前体肽发生脱水反应, 如nis B能够使丝氨酸脱水转变成脱氢丙氨酸 (Dha) , 苏氨酸脱水转变成β-甲基脱氢丙氨酸 (Dhb) , nis C是羊毛硫氨酸合成所必需的[17]。nis T负责nisin的转运, nis P通过切除nisin前导肽使之成为活性分子。nis I与nis FEG是nisin免疫系统不可缺少的成分, 而nisR和nis K被称为nisin生物合成双组分调控系统, 可以促使nisin启动子Pnis A/Z的转录。PnisR是控制nisR与nis K的强启动子, 但由于nisR的起始密码子为GTG, 转录效率较低, 且nis K没有合适的核糖体结合位点, 因此, 产nisin菌株中nisR和nis K的表达量都不高。因此之前实验室尝试将调节nisin合成的基因nisR和nis K以重组质粒的方式转入乳酸乳球菌N401中, 构建了重组表达载体p MG76e-nisRK并转入N401, 也尝试了将质粒pmsp3535H4转入N401, 三类重组菌株均明显提高了nisin的产量, 为重组菌株运用到nisin的工业化发酵生产提供了依据, 但是nisin产量提高的程度有限, 因此本实验尝试过量表达更多的nisin合成相关基因如nis ABTCI, 对nisin合成的机理进行深一步的研究。

也许是由于基因的表达水平存在差异而导致nisin产量的不同。因此试验将通过半定量RT-PCR方法来检测原始菌株N401和3株重组菌株N401A (p MG76e-nisRK的转化子) 、N401B (pmsp3535H4的转化子) 、N401C (p MG76e-nis A-BTCI的转化子) 相关基因在mRNA转录水平上的差异, 从而能够更好地认识nisin合成基因簇中的基因与其产量之间的联系, 可以为提高nisin的合成产量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

nisin Z产生菌株:乳酸乳球菌 (Lactococcus Lactis N401) 、指示菌藤黄微球菌 (Micrococcus luteus) 、p MG76e表达载体 (由p MG36e简单改造获得并保存) ;感受态细胞E.coli DH5α (北京全式金生物技术有限公司, 北京) ;连接酶T4DNA Ligase、载体p MD19-T simple Vector试剂盒、r Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、XbaⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、DNaseⅠRNasefree、d NTP、Cloned Ribonuclease Inhibitor、DL2000 DNA Ladder Marker、DL15000 DNA Ladder Marker等 (宝生物工程有限公司, 大连) ;抗生素类:红霉素 (Em) 、氨苄青霉素 (Amp) 、IPTG、X-Gal (Sigma公司, 北京) ;DNA纯化回收试剂盒 (Biomed公司, 北京) 。

1.1.2 试剂

TES、STE、SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ溶液、30%的PEG 1500、TE缓冲液、5 mol/L Na Cl、3mol/L乙酸钠、20%甘氨酸贮液、Trizol。

1.1.3 仪器

CJ-20超净工作台 (天津市泰斯特仪器有限公司) ;1-14台式高速离心机 (德国SIGMA仪器公司) ;THZ-C恒温振荡器 (太仓市试验设备厂) ;DHP-9082恒温培养箱 (上海合恒仪器设备有限公司) ;UV/VIS 2802PC紫外分光光度计 (美国UNICO公司) ;FA2004B电子分析天平 (上海越平科学仪器有限公司) ;FA/JA电子天平 (美国DENVER仪器公司) ;MET-TLER-TOLEDO p H计 (上海亦盛科学器材有限公司) ;BG-Power 600核酸电泳仪 (美国BAYBENE公司) ;Gene Pluser Xcell电转化仪 (BIO-RAD公司) ;EDC-810 PCR仪 (北京东胜创新生物科技有限公司) ;Biotech-5BG-7000型5L发酵罐 (上海保兴生物设备有限公司) ;Gene Drop ND-1000微量分光光度计 (美国Gene有限公司) 。

1.1.4 培养基

MRS、MRSS、MRSSM、CM1培养基的配方根据[18]进行, SI培养基。

1.2 方法

1.2.1 基因组的提取和克隆

根据Gen Bank上已发表的乳酸乳球菌nisin生物合成基因簇全序列, 利用软件Primer Premier 5.0设计引物。根据Lactococcus lactis N401所提取的基因组扩增目的片段。本试验设计nis ABTCI-F1、nis ABTCI-B1引物对扩增nis ABTCI基因片段以及采用菌落PCR方法验证转化实验结果所需的引物对红霉素抗性片段Em-F1、Em-B1 (表1) 。

以Lactococcus lactis N401为模板, 扩增基因nis ABTCI。在nis ABTCI-F1、nis ABTCI-B1引物上下游分别引入了XbaⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点, 扩增反应条件设置为:94℃预变性, 5min, 循环参数为:94℃变性1min;54℃退火30s;72℃延伸8min;循环次数为30;72℃终延伸10min。利用DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物后连接到p MD19-T simple克隆载体上, 转化感受态细胞E.coli DH5α, 筛选出阳性克隆并测序, 实验重复3次。

1.2.2 表达载体p MG76e-ABTCI的构建

如图2所示构建表达载体p MG76e-nis ABTCI。首先用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切并纯化回收目的片段nis ABTCI与载体p MG76e, 然后T4DNA Ligase在4℃连接nis ABTCI和p MG76e的酶切片段过夜并转化E.coli DH5α, 筛选阳性转化子并测序, 从而获得p MG76e-nis ABTCI。

1.2.3 重组质粒电转化乳酸菌N401

乳酸菌电转化方法按照文献[18]进行, 然后将MRSSM复苏菌液涂布于MRS/Em固体培养基 (5μg/m L Em) , 在37℃恒温箱中静置培养48h左右。菌落PCR方法验证筛选出阳性转化子。

1.2.4 重组转化菌株nisin产量的测定

采用生物抑制法测定发酵产物的nisin产量 (IU/m L) :以无菌的p H 2的盐酸溶液将从Sigma购买的nisin标准品 (106IU/m L) 进行稀释, 得到不同浓度的nisin溶液, 由于nisin对指示菌藤黄微球菌 (M.luteus) 有抑制作用, 量取不同浓度nisin对藤黄微球菌的抑制圈直径, 绘制nisin效价对数-抑制圈直径标准曲线[18,19,20], 根据标准曲线测定计算得到发酵产物nisin的抑菌活性。

1.2.5 质粒转化菌株N401C的筛选和生长发酵参数测定

重组菌株的生长曲线和发酵液的p H值每隔1h进行测定, 实验重复3次。

1.2.6 RNA的提取RT-PCR检测

根据Gen Bank上已发表的乳酸乳球菌nisin生物合成基因簇全序列, 通过Primer Primer 5.0软件对PCR引物进行设计, 设计后的引物由北京博迈德科技发展有限公司合成, 并根据所附说明将引物稀释至10μmol/L后使用。实验所选择基因的引物及扩增片段的相关信息见表2。乳酸乳球菌RNA的提取以及反转录参见[21]。

2 结果与分析

2.1 乳酸乳球菌基因组的提取[22]

按照实验方法提取出Lactococcus lactis N401的基因组后, 取出3μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳以检测提取出基因的完整性, 如图3所示, 结果表明基因组的完整性较好, 可以作为PCR扩增目的基因nis ABTCI的反应模板。

M:DL15000 DNA Marker;1:Genomic DNA of strain Lactococcus lactis N401.

M:DL15000 DNA Marker;CK:空白对照;1、2:nis ABTCI。M:DL15000 DNA Marker;CK:The negative control;1, 2:PCR fragments of nis ABTCI.

以nis ABTCI-F1、nis ABTCI-B1为引物对, 以L.lactis N401的基因组为扩增模板进行PCR扩增得到目的片段nis ABTCI, 凝胶电泳实验结果显示PCR片段大小约为7 000bp, 与NCBI核酸数据库中nisin合成基因簇序列相符 (图4) 。然后利用DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物后连接到p MD19-T simple克隆载体上, 从而得到p MD19-nis ABTCI。同时测序得回收片段大小为7 047bp, 与NCBI核酸序列数据库中nisin合成基因nis ABTCI进行比对, 序列匹配度达到100%, 可以用于后续实验。

2.2 表达载体p MG76e-ABTCI的构建验证

从E.coli DH5α中提取重组质粒p MD19-T-nis ABTCI和p MG76e, 进行XbaⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定, 电泳结果如图5所示。p MD19-T-nis ABTCI经双酶切后, 应出现大小为2 682bp和7 047bp两条带, 结果与之相符。

M:DL15000 DNA Marker;1、2:p MG76e质粒双酶切片段;3:p MG76e质粒;4、5:表达载体p MG76e-nis ABTCI双酶切产物;6:p MG76e-nis A-BTCI质粒。1, 2:p MG76e RE digests;3:p MG76e;4, 5:p MG76e-nis ABTCI RE digests;6:p MG76e-nis ABTCI;M:BM15000 DNA Marker.

M:DL15000 DNA Marker;CK:空白对照;1~7:乳酸乳球菌N401的p MG76e-nis ABTCI转化子;P:阳性对照。M:DL15000 DNA Marker;CK:The negative control;1-7:The p MG76enis ABTCI transformed N401;P:The positive control.

2.3 重组载体p MG76e-nis ABTCI的转化与验证

电转化后的重组菌株的验证过程采用菌落PCR方法进行, 选择质粒p MG76e上的Em基因片段作为特异目标基因, 根据设计引物Em-F1、Em-B1, 目标片段大小370bp。电泳结果如图6可以看出, 结果与预期相符。因此, 重组质粒p MG76e-nis ABTCI已成功转入到乳酸乳球菌N401中。

2.4 重组菌株nisin产量的测定

将活化两代的重组菌株Lactococcus lactis N401C (N401的p MG76e-nis ABTCI转化子) 按1%接种量接入改良后的CM1液体培养基中, 30℃培养24h, 检测nisin的效价。

2.4.1 nisin效价标准曲线的绘制

用游标卡尺量取抑菌圈的直径, 以抑菌圈直径为纵坐标, nisin效价对数为横坐标, 绘制标准曲线, 如图7所示。

2.4.2 重组菌株产生nisin效价分析

对1~7号乳酸乳球菌N401的p MG76e-nis ABTCI转化子进行效价测定, 结果如表3所示。

由表3可知, 7号菌株nisin效价最高, 比原始菌株N401的效价3 873IU/m L提高约69.7%, 证明对nisin合成基因的超表达可以提高nisin的产量。因此以7号菌株为基础进行不调控p H和恒定p H发酵罐实验, 测定4~14h的OD600nm、p H和效价, 与原始菌株乳酸乳球菌N401进行对比。

2.5 重组菌株的筛选和生长发酵参数测定

通过对N401C进行p H调控发酵发现nisin的效价提高了10%左右。由于在乳酸乳球菌生长发酵过程中既有nisin的生成, 也伴随有副产物乳酸的产生, 乳酸的不断产生导致发酵液p H值下降, 这可以从图8得知在发酵过程中p H一直在下降直至4左右, 从而抑制了菌株的生长和代谢, 同时乳酸链球菌素对p H敏感, 由图9可知在发酵时间12h, nisin产量开始下降, 而恒定p H至最适宜nisin合成的条件p H 6.8时, nisin合成的速度可以保持, nisin产量最大值超过7 000IU/m L。

2.6 工程菌与原始菌的基因表达水平的比较

为进一步了解超表达nisin部分操纵子基因致使nisin Z产量提高的机制, 通过分别提取原始菌和工程菌的总RNA, 然后通过RT-PCR检测原始菌与工程菌nisin Z生物合成基因簇中11个基因的转录水平 (图10) 。结果可以由图10看出, 不同菌株的nisin合成基因的表达表现出了不同的特征。与对照菌株N401相比, N401B、N401C中基因nis E的表达无显著差异 (P>0.05) 。这可能是在nisin合成的过程中, 由于ni-s I、nis F、nis F、nis G共同承担免疫保护的作用, 而其中nis I起主要作用。除此之外, 与原始菌株相比, 3株重组菌株的其他的nisin合成基因则都存在着显著性差异 (P<0.05) 的情况。其中:与菌株N401相比, N401A (p MG76e-nisRK的转化子) 的nisin合成基因几乎全部上调, 其中nis A、nis K上调约20%, nis T、nis C、nis F约上调30%, 而nis B上调了84%, nis I约上调了52%, nisR上调了38%, nis P、nis E、nis G表达水平略微下降了;在N401B (pmsp3535h4的转化子) 中, 除了基因nis P、nis F、nis G的表达水平下降了外, 其他基因均呈上调趋势, nis I上调了约65%, nisR约上调了40%;与菌株N401相比, N401C (p MG76e-nis ABTCI) 中, 除了nis P表达水平下调、nis E表达水平变化不明显外, 其他基因均上调, 其中nis B、nis T、nis I的表达约上调了60%, nis C、nisR、nis K、nis F、nis G表达约上调了40%, nis A上调了约25%。这说明在不同菌株中, nisin合成基因的表达水平有所差异, 因此可能导致了nisin合成产量的不同。

图8 Lactococcus lactis N401C不恒定和恒定p H (p H 6.8) 发酵生长曲线—□—N401C不恒定p H发酵测定的OD600nm;—△—N401C恒定p H发酵测定的OD600nm;—○—N401C不恒定p H发酵测定的p H值。Fig.8 Growth of Lactococcus lactis N401C and p H in fermentor (p H 6.8) —□—OD600nmof N401C without p H adjustment;—△—OD600nmof N401Cwith p H control (p H 6.8) ;—○—p H changes of fermentation without p Hadjustment.

图9 Lactococcus lactis N401C和N401不恒定和恒定p H (p H 6.8) nisin产量测定-○-N401C不恒定p H发酵测定的nisin效价;-◇-N401C恒定p H发酵测定的nisin效价;-Δ-N401不恒定p H发酵测定的nisin效价;-×-N401恒定p H发酵测定的nisin效价。Fig.9 nisin production of Lactococcus lactis N401C and N401 with p H adjustment in fermentor (p H 6.8) and without p H control—○—nisin production of N401C without p H control;—◇—nisin production of N401C with p H control (p H 6.8) ;—Δ—nisin production of N401 without p H control;—×—nisin production of N401 with p H control (p H 6.8) .

3 讨论

由于nisin的安全、高效, 因此受到广泛的重视。近些年的研究主要集中在筛选产nisin的菌株、改善发酵条件以及运用基因工程手段提高nisin产量这些方面[1,15,23]。本实验中构建表达载体p MG76e-nis ABTCI并转入乳酸乳球菌N401中, 使得nisin的产量提高, 不仅比实验室之前构建两个质粒载体p MG76e-nisRK和p MG76e-nis IRK转入N401所测定基因工程菌株的发酵的nisin产量高, 而且比文献中的nisin产量高[1]。同时推出可能由于不同基因的表达量存在差异导致nisin产量的不同。本文第一次系统地比较了原始菌株N401和3株重组菌株中nisin合成基因簇中11个基因的表达水平, 通过比较差异推断出nisin合成中关键基因的存在。实验中通过检测不同菌株中nisin合成基因在表达水平的差异为探明在nisin的生物合成中某些基因的重要性打下基础。

合成基因 第11篇

一、设计矛盾冲突, 导入新课学习

学生经历了遗传物质的探索过程并知道了基因的本质, 已经对基因产生了浓厚的兴趣, 想进一步探知有关基因的各种问题, 如生物的性状是如何体现的, 基因中蕴藏的蓝图是如何一步步实施的。当然这需要设计一个充满悬念的情境。现行使用的苏教版教材的引入相对简单, 可以参照人教版教材的“问题探讨”引出恐龙能否复活的话题, 让学生提出正反方观点, 形成思维上的矛盾冲突。学生反应非常热烈, 提出多种方案, 但黑箱均集中在客观的遗传物质与丰富多彩的性状之间的实现, 经过这样的碰撞之后, 这堂课的教学内容就十分明朗了——基因是如何决定生物的性状的?

二、明确知识定位, 抓住教学主干

本节的知识点和内容较多, 笔者进行了一定的归纳和整理, 主干知识是遗传信息的转录和翻译的过程, 侧枝内容是DNA与RNA结构的比较、核糖与脱氧核糖的比较、三种不同种类的RNA以及遗传密码的组成。在侧枝内容中, 前两个知识点在必修一中已经学习过, 在这里只需作简短的回顾和比较;后两个知识点虽然是新内容, 但也不必加深和拓展, 学生只需要初步了解即可。

这节内容不仅抽象复杂, 而且涉及的物质种类也比较多, 因此学生往往会陷入“学习时都懂, 学完了都不懂”的困惑之中。这时一个详尽的概念图, 及时的归纳、比较和总结就显得非常重要。例如, DNA与RNA结构的比较、三种RNA功能的比较、转录与翻译过程的比较。

三、利用教材插图, 进行概念辨析

本节教材的特点之一是插图多而且复杂。充分借助插图处理本节内容, 是本节教学成败的关键因素之一。比如在讲完转录之后, 可以设计如下表格。

尤其是利用插图说明酶的作用, 两个过程的方向, 产生子链的去向, 通过图形进行辨别比较加深印象。

四、引导学生思维, 推动教学过程

本节内容的逻辑性非常强, 设计合理会有行云流水的感觉, 不同知识点的讲解可以利用主问题串联起来。如:①细胞核中DNA的遗传信息如何能够传递到细胞质中?②RNA能够从核孔出来, 同时也是碱基语言, 它必定是依赖DNA而合成的, 引出转录的过程。③信使RNA的碱基语言要转变成蛋白质中的氨基酸语言, 两种语言的转换就是翻译, 谁来充当译员?引出转运RNA, 从结构上对转运RNA进行分析说明它识别两种语言的原因。④必修一中学生曾学过核糖体是合成蛋白质的细胞器, 那么核糖体与模板信使RNA和译员转运RNA之间是如何组装成合成蛋白质的“生产线”的呢?

转录和翻译是细胞中所进行的分子水平的酶促聚合反应, 而通过由思维的碰撞而揭示出的一步步具体过程, 可以让学生感受到微观 (分子) 水平生命活动的严谨性和美妙性, 从而提高对学科的兴趣。

五、运用鲜活例子, 化解抽象难点

在讲解信使RNA上的碱基排列与氨基酸之间的对应关系, 也就是破译遗传密码时, 教材中举了一个很好的例子——电报密码。比如说“胰岛素”的电报密码是“3534 3213 2728”, 密码通过电波传到目的地后, 又按密码翻译成“胰岛素”。利用这个例子来看, 首先电报中4个数字对应一个中文, 那么信使RNA中几个碱基对应一个氨基酸?其次电报中“3534”对应“胰”字, 那么信使RNA上特定的碱基序列与特定的氨基酸之间是如何对应的。由此引入学生就很容易理解科学家为什么以及如何设计实验去破译遗传密码。

又如笔者在讲解翻译 (如下图) 时, 做了如下的比较:作为模板的信使RNA可以看成轨道, 装配机器核糖体看成火车头, 火车头中只能容纳两个搬运工, 火车一边在轨道上运行, 一边装配货物形成多肽。

当翻译过程讲解结束时, 往往让学生形成这样一种认识, 首先利用密码子表或题干获得某个密码子编码的氨基酸, 然后利用密码子和反密码子的互补关系, 明确进入核糖体该位点的转运RNA以及它所携带的氨基酸。而实际如果没有转运RNA的存在, 也就无所谓密码子了, 密码子的意义并不是单独由信使RNA决定的, 而是由信使RNA和携带氨基酸的转运RNA所决定的。所以当学生具备一定的知识基础时, 应让学生明确实际过程应为:不同的转运RNA因结构不同在特定的酶的作用下结合不同的氨基酸 (第1步) , 当核糖体与信使RNA结合进行翻译时, 进入该复合体中的转运RNA应是随机的, 但只有携带有与密码子互补的反密码子的转运RNA才能停留, 其他的转运RNA则又随机离开 (第2步) , 由此得出该密码子编码的氨基酸就是此时对应的转运RNA携带的氨基酸 (第3步) 。该过程其实是在长期的进化过程中逐步形成的。如此学生会进一步领略到生命的奇妙与精巧。