全基因序列范文

全基因序列范文（精选12篇）

全基因序列 第1篇

大鲵 (或称娃娃鱼) 是世界上现存最大的濒危珍稀两栖动物, 为我国所特有、被列为国家二级保护野生动物。虹彩病毒在全球范围普遍流行, 是侵染众多鱼类、两栖类及爬行类等水生动物的重要病毒病原。虹彩病毒是包括蛙和大鲵在内的两栖类自然种群显著下降或消亡的原因之一, 而鉴定虹彩病毒病原并阐明其基因组结构特征是研发相应病害防控技术的前提。

最近, 中国科学院水生生物研究所张奇亚研究员、桂建芳研究员和南昌大学洪一江教授联手就大鲵虹彩病毒的全基因组序列及其结构变化开展研究, 在新分离鉴定导致大鲵致死性出血病病原大鲵虹彩病毒 (Andrias davidianus ranaviurs, ADRV) 的基础上, 测定了其全基因组序列, 并与已知两栖类蛙虹彩病毒基因组进行点阵及结构变化分析。结果显示, ADRV基因组全长为106 734 bp, 可编码101个开放阅读框, 其中含虹彩病毒家族26个核心基因、蛙病毒属成员24个特有基因及两栖类蛙病毒亚属的11个特有基因;发现几个涉及病毒毒力及宿主感染性的关键基因发生显著变化。在大鲵虹彩病毒基因组中有明显变化的这些基因可在削弱或改变宿主抗病力、增强ADRV致病性以及跨种传播中起关键作用。该研究不仅首次揭示导致大鲵自然种群衰减与养殖群体疾病频发的虹彩病毒分子特征, 也为深入了解这类病毒流行和基因组进化规律、以及研发两栖类病毒病免疫防控技术提供了新的研究思路。

(www.bioon.com)

人hole基因的克隆和序列分析 第2篇

目的 克隆人的hole基因,并进行生物信息学分析.方法 以胚胎心脏cDNA文库为模板,进行PCR扩增得到hole基因的.ORF.并进行亚克隆入PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,用Xho1进行酶切和测序鉴定阳性克隆.利用Internet和GeneBank数据库对测序结果正确的hole基因进行生物信息学分析. 结果克隆了hole基因,测序结果正确;生物信息学分析表明, hole基因开放读码为960 bp,编码319个氨基酸;同源性分析表明,人的hole与鼠、鸡hole蛋白具有高度同源性.多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在心脏、肝脏、肺、脑、肾脏、脾脏、胰脏均有表达,其心脏表达最高. 结论成功克隆hole基因,对其功能进行了初步预测,为进一步的功能研究打下基础.

作 者：姚峰 周军媚 王佐 陈春芳 吴端生 刘鑫 余坚 作者单位：姚峰(南华大学,实验动物学部,湖南,衡阳,421001;南华大学,心血管病研究所)

周军媚(南华大学,生命科学与技术学院)

王佐(南华大学,心血管病研究所)

陈春芳,吴端生,刘鑫,余坚(南华大学,实验动物学部,湖南,衡阳,421001)

全基因序列 第3篇

对我国而言，新中国第一部《专利法》制定于1985年，直到1993年专利法首次修改之前，根据1985年的《专利法》第25条，“药品和用化学方法获得的物质”以及“动物和植物品种”均被排除在专利保护范围之外，作为遗传物质的基因序列自然得不到专利保护。《专利法》在1993年进行了第一次修改，修改后的《专利法》第25条删除了对“药品和用化学方法获得的物质”不授予专利权的规定，这实际上为遗传物质授予专利权打开了通道。但是基于下面三方面的考虑，首先是难以界定基因序列究竟是发明还是发现；其次是对基因授予专利会面对一些伦理问题；最后就是担心授予基因序列专利权会阻碍基因技术的发展，因此，虽然我国在1993年的《专利法》修改中已经为生物遗传物质专利提供了法律上的依据，但是关于基因专利的详细规定一直没有出台。国家知识产权局在2001年10月出台了新的《专利审查指南》，有关基因专利的审查和授权规定在第十章“关于化学领域发明专利申请审查的若干规定”中的第七节“涉及生物技术的发明的特殊问题”，这是我国第一次对基因序列专利的授权范围和审查标准作为具体而明确的规定。此版的《专利审查指南》，首次明确了基因属于化学物质，明确了基因包括人体基因属于专利保护的客体。时至今日，2010年2月1起实施的修订后的《专利审查指南》在第二部分第十章第9.2.2节至第9.5.3节对于涉及基因序列的审查标准和授权范围等做出了详细的规定，并增加了遗传资源来源披露的审查。可见，我国的专利审查实践采纳的是后一观点，即，基因序列不属于科学发现，是可授予专利权的。

对于可授予专利权的客体而言，专利保护范围宽窄是专利体系中的核心议题，它直接影响到权利持有人的实际垄断地位，涉及基因序列的发明尤其如此，基因发明通常居于生物科技产业链的上游位置，而伴随上游专利的，是下游生物科技产业须支付昂贵的专利许可费。从另一角度而言，涉及基因序列的专利保护范围的大小直接影响下游生物技术的研究进展，甚至能决定竞争企业的研究方向。

本领域技术人员公知，采用“同源性”、“缺失、取代或添加”、“杂交”等表述方式对请求保护的序列进行限定往往能够扩大保护范围，然而这种限定方式往往会因存在得不到说明书支持的缺陷，而被要求修改。这种限定方式是否绝对不允许呢？申请文件怎样撰写，这样的限定方式才能够被获准，并最终授权以获得更宽的保护范围呢？

2010年版《专利审查指南》规定【2】：对于涉及基因、载体、重组载体、转化体、多肽或蛋白质、融合细胞、单克隆抗体等的发明，说明书应当包括下列内容：产品的确认，产品的制备，产品的用途和/或效果。

（1）产品的确认

对于涉及基因、载体、重组载体、转化体、多肽或蛋白质、融合细胞、单克隆抗体等的发明，说明书应明确记载其结构，如基因的碱基序列，多肽或蛋白质的氨基酸序列等。在无法清楚描述其结构的情况下，应当描述其相应的物理-化学参数，生物学特性和/或制备方法等。

（2）产品的制备

说明书中应描述制造该产品的方式，除非本领域的技术人员根据原始说明书、权利要求书和附图的记载和现有技术无需该描述就可制备该产品。

（3）产品的用途和/或效果

对于涉及基因、载体、重组载体、转化体、多肽或蛋白质、融合细胞、单克隆抗体等的发明，应在说明书中描述其用途和/或效果， 明确记载获得所述效果所需的技术手段、条件等。例如，应在说明书中提供证据证明基因具有特定的功能，对于结构基因，应该证明所述基因编码的多肽或蛋白质具有特定的功能。

正是依据此规定，采用“同源性”、“缺失、取代或添加”、“杂交”等表述方式限定出的序列往往会因产品的用途和/或效果未得到验证，而基因编码的氨基酸，作为多肽的一级结构，是多肽空间结构的基础，而空间结构又直接决定其功能，氨基酸序列的微小变化可能会导致空间结构的巨变，进而导致功能发生变化，即，“同源性”限定出的序列其效果也难以预期，因而得不到说明书的支持，不符合专利法第二十六条第四款的规定。

然而无论是《专利法》还是《专利审查指南》都并未规定，不允许采用“同源性”的方式对基因序列进行限定，也未规定这种方式必然得不到说明书的支持。《专利审查指南》在第二部分第十章还有如下规定：

9.3.1.1 基 因

（1）直接限定其碱基序列。

（2）对于结构基因，可限定由所述基因编码的多肽或蛋白质的氨基酸序列。

（3）当该基因的碱基序列或其编码的多肽或蛋白质的氨基酸序列记载在序列表或说明书附图中时，可以采用直接参见序列表或附图的方式进行描述。

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【例如】

一种DNA分子，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。

（4）对于具有某一特定功能，例如其编码的蛋白质具有酶A活性的基因，可采用术语“取代、缺失或添加”与功能相结合的方式进行限定。

【例如】

编码如下蛋白质（a） 或（b） 的基因：

（a）由Met-Tyr-… -Cys-Leu所示的氨基酸序列组成的蛋白质，

（b）在（a） 限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酶A活性的由（a） 衍生的蛋白质。允许用上述方式表示的条件是：

Ⅰ说明书例如实施例中例举了（b） 所述的衍生的蛋白质；

Ⅱ说明书中记载了制备（b） 所述衍生的蛋白质以及证明其功能的技术手段（否则认为说明书公开不充分）。

（5）对于具有某一特定功能，例如其编码的蛋白质具有酶A活性的基因，可采用在严格条件下“杂交”，并与功能相结合的方式进行限定。

【例如】

如下（a） 或（b） 的基因：

（a）其核苷酸序列为ATGTATCGG… TGCC T所示的DNA分子，

（b）在严格条件下与（a） 限定的DNA序列杂交且编码具有酶A活性的蛋白质的DNA分子。

允许用上述方式表示的条件是：

Ⅰ说明书中详细描述了“严格条件”；

Ⅱ说明书如实施例中例举了（b） 所述DNA分子。

（6）当无法使用前述五种方式进行描述时，通过限定所述基因的功能、理化特性、起源或来源、产生所述基因的方法等描述基因才可能是允许的。

可见，《专利审查指南》明确规定是可以采用上述方式进行限定的。因此，本文的第一个问题得以解答。然而怎样的撰写方式才能符合规定呢？要解答这个问题首先要明了，中国的专利申请采用审查制，实施审查的审查员是一个整体，他们执行统一的标准，他们均具有本领域普通技术人员的水平。因此，申请人或代理人在撰写申请文件时，首先应考虑本领域普通技术人员在阅读完申请文件公开的内容后能够预见的技术效果。具体结合涉及基因序列的申请而言，“同源性”、“缺失、取代或添加”、“杂交”等表述方式在专利申请文件中广泛出现，是有其学术基础的。所谓同源，简单而言是指某一共同祖先经趋异进化而形成的不同序列。需要指出的是，同源性与相似性是两个完全不同的概念，相似性是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低，当相似程度高于50%时，比较容易推测检测序列和目标序列之间可能是同源序列，正是由于同源性的定义，某一基因的同源序列往往具有相同或类似的功能，这也是本领域技术人员在某一基因序列已经公开后，在其他物种克隆相同或类似功能基因的理论基础。学术界通常认为保守取代，或是在非核心功能域进行非保守取代，对蛋白质的功能通常不会产生质的影响。

对于生物领域这一实验性较强的领域，翔实的背景技术介绍以及足够的实施例是必不可少的，只有建立在足够大样本上的实验数据，本领域技术人员才能够合理预期。以同源性为例，申请人如果期望使用“同源性”这种方式对序列进行限定，并最终获得保护，首先可以在背景技术部分详细介绍该基因的同源进化情况，并给出详细的参考文献供审查员参考，也可以依据已知的现有技术，制作出进化树等更直观的图表，让审查员站在本领域技术人员的角度初步了解该基因在不同菌株、物种等间的进化情况。其次，申请人可以对其中有代表性的同源序列的功能进行验证，因为对每个同源序列进行验证是不现实的，由于本领域技术人员对同源序列通常具有相同或类似的功能这一观点是认同的，对每条序列均进行功能验证，也是不必要的。从过往的审查实践来看，审查员在案件的实质审查过程中往往并不质疑同源序列的功能，质疑的是申请人所称的序列是否为同源序列。因此，让本领域技术人员明了，尤其是审查员明了，请求保护的序列确为同源序列是至关重要的。此外，申请人也应对同源序列的来源进行限定，以使本领域技术人员能充分肯定同源序列的功能。

专利复审委员会2012年度十大案件中的案例之一：热稳定的葡糖淀粉酶，其专利权人是（丹麦）诺维信公司。（丹麦）诺维信公司于2006年获得“热稳定的葡糖淀粉酶”的发明专利权。2011年，该公司向天津市第二中级人民法院提起诉讼，状告山东隆大和江苏博立两家公司侵犯其专利权。同年，上述两家公司请求专利复审委宣告涉案专利无效。

专利复审委经审理作出第17956号决定，宣告单纯以同源性和功能限定的淀粉酶权利要求无效，维持同时限定同源性、来源菌种和功能的权利要求有效。

该专利的权利要求6：一种具有葡糖淀粉酶活性的分离的酶，与SEQ ID NO： 7中所示全长序列之间同源的程度至少为99%，并且具有由等电聚焦测定的低于3.5的等电点。

10.根据权利要求6-9任一项的分离的酶，所述的酶来源于丝状真菌Talaromyces属，其中丝状真菌是T.emersonii菌株。

11.权利要求10的酶，其中丝状真菌是T.emersonii CBS 793.97。

13.权利要求12的DNA序列，其中所述的DNA序列来源于丝状真菌Talaromyces属，其中所述丝状真菌是T.emersonii的菌株。

专利复审委员会维持了权利要求10、11、13的专利权，其理由是：从属权利要求10进一步限定所述的酶分离自T.emersonii菌株，权利要求11限定酶分离自T.emersonii CBS 793.97，T.emersonii菌株与T.emersonii CBS 793.97属于同一种的菌株，而本领域通常认为同一种个体中，某种具体功能的活性基因在基因组层次上一般仅具有一种序列，或者其所具有的同源性极高的变体序列也会具有所述功能，但如果物种来源在进化地位上差异比较大时，很可能会有即使同源性高的序列，也不具有所述功能的情况存在，因此在说明书已经证实了来源于T.emersonii CBS 793.97的酶具有葡糖淀粉酶活性的基础上，本领域技术人员可以预计来源于T.emersonii菌株，且与SEQ ID NO：7全长序列具有至少99%同源的多肽也具有葡糖淀粉酶的活性，因此，权利要求10和11能够得到说明书的支持，符合 专利法第26条第4款的规定。【3】

因此，“同源性“的限定方式，并不必然得不到说明书的支持。学术观点不能代替专利审查标准，而专利审查标准又必需以学术为基础，申请人或代理人在专利申请文件的撰写上，应达到技术与法律的融合，以期取得更大的保护范围。

（作者均来自专利审查协作北京中心医药生物部且均为第一作者）

参考文献：

【1】《环境法学》史学瀛主编，清华大学出版社出版，2006年1月第1版第406页。

【2】《专利审查指南》，2010年1月第1版，知识产权出版社，第二部分第十章第9.2.2节。

【3】专利复审委员会2012年年度重大案件：“葡糖淀粉酶”专利无效宣告请求案。

全基因序列 第4篇

发布会上, 孙松所长代表牡蛎基因组计划研究团队发布了牡蛎全基因组序列图谱绘制完成的消息, 项目首席科学家张国范研究员、技术依托单位深圳华大基因研究院倪培相总监及赞助单位獐子岛渔业集团吴厚刚董事长分别发言, 介绍了牡蛎全基因组项目的研究及进展情况。同时接受了媒体记者现场提问。

海水养殖占我国水产养殖产量的41%, 其中贝类养殖产业规模和产量均居世界首位, 占海水养殖产量的75%。牡蛎是世界上产量最大的海水养殖动物, 在水产养殖中占有重要地位, 作为贝类的“模式种”, 一直受到科技界的广泛关注。牡蛎基因组序列图谱绘制工作历时两年, 已达到国际领先的基因组图谱标准。这是世界上首张养殖贝类的全基因组序列图谱, 标志着基于短序列的高杂合度基因组拼接和组装技术获得重大突破。初步分析表明, 牡蛎基因组由8亿个碱基对组成, 大约包含2万个基因, 基因组数据支持了海洋低等生物具有高度遗传多样性的结论。随着牡蛎基因组数据的深入研究, 将批量发掘生长、发育、生殖、抗逆性等性状相关的重要功能基因, 对重要经济性状的解析、新品种的分子选育提供基因基础, 为有效改变牡蛎的生活习性、使其能够更好地为人类所利用提供更广阔的技术思路。

全基因序列 第5篇

提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序.序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸.与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的.同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低.

作 者：熊毅 朱伟 徐贤坤 龙剑明 刘棋 XIONG Yi ZHU Wei XU Xian-kun LONG Jian-ming LIU Qi 作者单位：熊毅,朱伟,徐贤坤,刘棋,XIONG Yi,ZHU Wei,XU Xian-kun,LIU Qi(广西动物疫病预防控制中心,广西南宁,530001)

龙剑明,LONG Jian-ming(广西大学动物科学技术学院,广西南宁,530005)

鹅副黏病毒F基因的克隆和序列分析 第6篇

关键词：鹅副黏病毒；F基因；克隆；序列分析

中图分类号： Q785；S858.335.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0035-02

收稿日期：2013-09-27

作者簡介：吴民（1964—），男，海南海口人，兽医师，主要从事畜牧兽医学方面研究。E-mail：WM8398@163.com。鹅副黏病毒（goose paramyxovirus，GPMV）是影响养禽业发展的主要病原之一，它可引起鹅肠道糠麸样溃疡、胰腺肿胀且表面有灰白色坏死灶、脾脏肿大并有大小不等的灰白色坏死灶。近年来，该病在我国呈上升趋势，且感染宿主范围不断扩大，已有鹅、丹顶鹤、鸽等感染该病毒的报道[1-3]。本研究对以前分离的GPMV的F基因进行克隆，并与国内外分离株进行序列比对和分析，以期为进一步研究该病毒的F基因功能和GPMV分子诊断以及基因工程疫苗奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

从疑似感染GPMV的病死鹅中分离到鹅副黏病毒HN株，经过冻干后，于海南省动物疫病预防控制中心兽医诊断检验科-70 ℃冻存。

1.2病毒增殖

将病毒适当稀释后，经尿囊腔接种9～11 d非免疫鸡胚，0.2 mL/枚，于37 ℃恒温箱孵育48 h，弃去24 h内死亡胚，无菌收获尿囊液，于-70 ℃保存备用。

1.3引物设计与合成

根据GenBank中的GPMV全基因组核苷酸序列，经 Lasergene 7.10软件比对和Primer 5.0软件分析后，设计1对引物扩增F基因，上游P1：5′-TAGTTCGCCTGTCTATCAAA-3′，下游P2：5′-GTGATGCGGTAGAACGGAT3-3′；由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.4RT-PCR反应

将含有GPMV的尿囊液按照Invitrogen公司提供的RNA抽提操作说明书进行RNA模板的提取。反转录按照宝生物工程（大连）有限公司提供的Reverse Transcriptase XL（AMV）反转录酶使用说明书进行。PCR反应体系为：2 μL模板，各50 pmol上、下游引物，各200 μmol/L 4种dNTP，0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶，加水至50 μL。PCR反应条件为：97 ℃ 0.5 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃延伸 7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5F基因的克隆及鉴定

将新扩增PCR产物按一定比例与pMD18-T载体连接，连接产物转化入DH5α感受态细胞，阳性菌液经PCR鉴定后扩大培养并抽提质粒，重组质粒置于-40 ℃冰箱保存备用。

1.6序列分析

将鉴定的阳性重组质粒，送上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。用Lasergene 7.10软件将所测序列和与国内外病毒分离株的F基因序列进行相似性比对。

2结果与分析

2.1PCR扩增产物

利用设计的P1/P2引物对GPMV HN株的F基因进行RT-PCR扩增，结果获得大小约为2.1 kb的特异性条带，与预计产物大小相符（图1）。

2.2重组质粒的鉴定

菌液PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得大小约为2.1 kb的片段。

2.3序列分析

由序列测定结果可知，GPMV HN株的F基因全长为 1 662 bp，编码553个氨基酸。将GPMV HN株的F基因与国内外分离株的F基因序列进行比对，结果表明：GPMV HN株和国内已分离的GPMV的F蛋白核苷酸序列相似性在963%～97.3%之间，与传统疫苗株LaSota的核苷酸序列相似性为82.7%，与国外分离株的F蛋白核苷酸序列相似性在34.8%～38.7%之间（表1）；从F基因进化树来看，GPMV HN株与国内分离株处于同一分支，而与国外分离株处于不同分支（图2）。

3结论与讨论

GPMV HN株的分离鉴定再次证明水禽不再仅是禽Ⅰ型副黏病毒的宿主，而且已成为禽Ⅰ型副黏病毒自然感染发病、死亡的易感禽类。这可能与禽Ⅰ型副黏病毒发生变异、逐渐适应鹅体有关[4]。宿主范围的不断扩大，给禽Ⅰ型副黏病毒的综合防控提出了新的挑战。

国内外研究表明，禽Ⅰ型副黏病毒F蛋白的变异主要发生于F蛋白N末端信号肽区（1～32aa）和裂解位点区（112～117aa），其他部位的氨基酸较保守，且裂解位点区氨基酸的组成是构成副黏病毒毒力的分子基础[5]。GPMV HN株的裂解位点区的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117，与国外发表的强毒株序列112-Arg/Lys-Arg-Gln-Lys/Arg-Arg-Phe-117相符，表明所分离的GPMV HN株为强毒株。基因序列分析发现该分离株的F基因与GenBank登录号为AF162714株系的F基因核苷酸相似性为97.1%，氨基酸相似性为97.7%，二者的相似性较高。进化树分析表明两者处于同一分支，具有较近的亲缘关系，且同属于强毒株。GPMV HN株与传统疫苗株LaSota的核苷酸相似性为82.7%，氨基酸相似性为87.4%，二者的相似性较低，进化树上虽属于同一大分支，但亲缘关系相对较远，说明HN株与传统的疫苗株LaSota相比已发生一定的变异，这可能是造成水禽长期使用传统的新城疫病毒疫苗后仍暴发副黏病毒病的重要原因之一。

参考文献：

[1]秦卫红. 种鹅感染新城疫病毒的诊断[J]. 中国家禽，2012，34（23）：55.

[2]李静姬，李福军，梁玉嬉. 丹顶鹤非典型新城疫与大肠杆菌混合感染的诊治[J]. 中国畜牧兽医，2013，40（2）：211-213.

[3]赵扬，郭明萍，邹年莉，等. 两株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析[J]. 中国家禽，2012，34（23）：10-13.

[4]张伟，刁有祥，徐福亮，等. 鹅副黏病毒LS-1株的分离鉴定及F基因分析[J]. 西南大学学报：自然科学版，2011，33（4）：31-35.

全基因序列 第7篇

关键词：RT-PCR,新城疫病毒,基因组序列

新城疫 (Newcastle disease, ND) 是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV) 引起的一种烈性病毒性传染病, 是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一[1]。包含6个基因, 依次为3’-N P-P-M-F-H N-L-5’, 分别编码核衣壳蛋白 (nucleocapsid protein, NP) 、磷蛋白 (phosphoprotein, P) 、基质蛋白 (matrix protein, M) 、融合蛋白 (fusion protein, F) 、血凝素-神经氨酸酶 (hemagglutininneuraminidase, HN) 、大聚合酶蛋白 (large polymerase protein, L) [2]。本研究对其基因组序列进行测定, 这对我国NDV开展分子流行病学和跨种间致病研究提供科学资料, 为今后研制有效的N DV疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒及分子生物学相关材料

Ⅳ系La Sota是山东省农科院家禽所袁小远老师惠赠的。SPF (specific pathogen free, 无特定病原体) 鸡胚购买于山东省农科院。p M D 1 8-T, T 4连接酶购买于TaKaRa公司, E.coli DH5α为本实验室保存, DNA纯化回收试剂盒购买于天根公司。

1.2 病毒的纯化与收集:

用PBS稀释La Sota疫苗然后接种于9~11日龄的SPF鸡胚中扩增并收集病毒, 并通过血凝实验测得病毒效价为9。

1.3 引物设计:

根据GeneBank上公布的全基因组序列将全长分别分1 2段扩增La Sota株基因组, 使用primer5设计每个片段的上下游引物。引物序列如表1。

1.4 R N A的提取及R T-P C R:

按照TRNz o l A+总RN A提取的实验步骤抽提RNA, 按照厂商提供的TransScript twostep RT-PCR supermix说明书提供的方法进行RT-PCR。

1.5 克隆测序:

将扩增得到的各个cDNA片段连接到pMD18-T载体, 筛选含目的片段的单菌落, 阳性克隆送北京华大测序。将测序结果依次拼接后得到全长的基因组序列。

2 结果

2.1 新城疫病毒基因组各片段的克隆和鉴定

利用R T-P C R扩增出了包含了L a Sota全基因序列的12个片段, 经过琼脂糖凝胶电泳检测到与预期大小相同的条带, 各片段克隆到p MD18-T载体上, 用菌落PCR和测序的方法检测出阳性克隆。

2.2 NDV La Sota疫苗株全基因组序列测定

我们测通了NDV LaSota疫苗株全基因组各段cDNA阳性克隆, 运用DNAstar拼接出全基因组序列, NDV LaSota疫苗株全长15186bp, 符合6的倍数。含有6个开放阅读框, 各开放阅读框的大小分别为:1470bp, 1188bp, 1095bp, 1662bp, 1734bp, 6615bp。我们将拼接完的La Sota的全基因组序列提交到GeneBank上, 基因组序列号为JF950510。用MEGA5.0对这株病毒的全基因组序列和GeneBank上已提交的相应病毒全基因组序列作比对, 发现相似性高达99%。有意思的是, 在La Sota株的1 2 2 3 7 b p处多出一个碱基G, 而在12326bp处则发生了缺失突变, 这一变异可能导致30个氨基酸的改变。其他位置的突变有46处。

3 讨论

在我国, 主要是广泛接种新城疫疫苗来控制该病的爆发, 一些减毒株疫苗如新城疫Ⅳ系 (LaSota株) 、H株、Rokin株、克隆30, 等被广泛用于预防NDV[3]。由于减毒活疫苗易于饮水、喷雾、气雾等使用相对方便, 因此常被用于群体免疫, 且NDV免疫密度和次数也远远超过世界水平。由于大面积的疫苗使用, 新城疫得到了较好的控制, 但近些年来, NDV出现了一些新的疫情, 即在免疫过的鸡群中, 即使能产生高的抗体滴度, 新城疫仍时有爆发[4]。大量使用的疫苗株难免流失到环境中, 目前, 那些散落在环境中的疫苗毒株对新城疫病毒本身造成的影响并没有完全了解。在这里, 我们虽然发现了新城疫疫苗株的突变, 但是突变后果完全未知, 因此我们应该谨慎对待这类新城疫活载体多价疫苗。

本篇论文以家禽所的LaSota疫苗为材料, 通过测序得到全长序列。在测序时, 我们考虑了PCR过程可能造成基因的变异[5], 故对该病毒基因组的各区段至少测序三次, 综合多次测序结果获得其全长基因序列, 因此所获得的序列应该能够真实反映了该病毒株基因组的核苷酸序列。将我们得到的序列与之前已提交到N C B I GenBank中的LaSota株全长序列 (登录号为AF077761) 比较, 我们发现的核苷酸的变异, 说明疫苗株在自然免疫中就不断发生变异[6]。综上所述表明新城疫病毒在自然界的选择压力与免疫压力下, 其部分生物学特性已经发生变化, 这可能是病毒对外界环境变化而发生的一种适应性突变的结果。

这些结果为了解我国新城疫病毒疫苗的现状提供了新的信息, 也为新型疫苗的研制和开发提供了理论依据。

参考文献

[1]卡尔尼克BW.禽病学[M].第十版.高福等译.北京:中国农业出版社, 1999.692-694

[2]徐文.新城疫疫苗的最新研究进展[J].Poultry Science 2008.6:43-45

[3]王友华.鸡新城疫综合防控措施, 动物医院, 2010.3:39-40

[4]雍丽.鸡新城疫疫苗应用的研究进展.甘肃畜牧兽医, 2010.1:38-40

[5]Alexander, D.J.Newcastle disease[M].Boston:Kluwer Academic Publishers, 1988.147-160.

全基因序列 第8篇

石斑鱼是名贵海产鱼类之一, 营养丰富, 经济价值巨大。它是典型的雌雄同体雌性先熟鱼类, 在高龄的时候会发生天然的性别转变。在石斑鱼全基因组测序的基础上, 将能鉴别石斑鱼性别调控的基因并揭示石斑鱼性别分化和性别转化的相关功能基因的作用机制, 对揭示整个脊椎动物性别决定机制的形成及进化途径有非常重要的理论价值, 对建立鱼类性别控制的生物技术途径具有重要意义。

石斑鱼全基因组序列图谱绘制完成将提供大量的重要性状相关功能基因和分子标记, 有利于从功能基因组角度揭示石斑鱼生长发育、营养代谢、繁殖遗传等重要生命现象的分子机制, 建立石斑鱼品种改良的理论基础, 为建立石斑鱼基因组辅助育种技术, 快速培育抗病、抗逆、优质、高产的优良品种奠定重要基础。

项目负责人、中国工程院院士、中山大学生命科学学院教授林浩然表示, 石斑鱼过去主要依靠天然捕捞, 人工养殖困难。从基因组水平进行研究, 成为全面解读石斑鱼的重要突破口。华大基因科技合作总裁尹烨表示, 鱼类的基因很复杂, 完成石斑鱼基因图谱绘制对科学和产业的意义都很重大。

香猪SRY基因的克隆及序列分析 第9篇

香猪为我国西南地区特有的微型猪种,以肉嫩味鲜而闻名。由于饮食习惯的原因,人们更加偏爱食用阉割后的公香猪,导致香猪公母比例失调,因此开展香猪性别决定机制方面的研究,对于提高该品种的生产效率、服务人们生活具有重要意义。本研究克隆了贵州香猪SRY基因,分析了香猪SRY基因与其他物种SRY基因的序列变异,为香猪性别决定机制的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

公母香猪样品由贵州大学香猪养殖场提供,耳静脉抽取血样5 ml,EDTA抗凝,-20 ℃保存。

1.2 方法

试验于2008年7月至2008年12月在贵州大学生命科学学院生物技术专业实验室进行。

1.2.1 香猪基因组DNA

的提取 按常规酚、氯仿抽提法提取基因组DNA[7]。

1.2.2 香猪SRY

基因的PCR 扩增 采用比较基因组学方法,根据人SRY 基因序列(GenBank登录号NM_003140)设计引物,引物由上海生物工程公司合成。引物序列为:5′-GGTGGTACTGGGGGCGGAGAAAT-3′;5′-TAAACCACGGTGAAAAGGCAAGTC-3′。PCR反应体系如下:0.2 mmol/L dNTPs,2 mmol/L MgCl2 ,0.5μmol/L上、下游引物, 500~800 ng 模板DNA,2U Taq聚合酶。PCR扩增程序为,94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,50 ℃退火40 s,72 ℃延伸80 s,共35个循环。

1.2.3 香猪SRY

基因的克隆及测序 按Boehringer Manneheim公司生产的PCR 产物纯化试剂盒(产品号1732676) 的说明书纯化PCR 产物,再按Promega公司生产的PCR 产物直接克隆试剂盒(产品号A1360)的说明书进行“T 载体”连接反应。将连接好的重组质粒pGEM- T通过电击法(条件为:2.5 kV,25 μFD,脉冲时间4~5 ms) 转化大肠杆菌DH5α,将转化菌涂布于含氨苄青霉素的X-gal和IPTG的LB 平板上,于37 ℃培养16~18 h,可见平板上出现约70%的白色和少量的蓝色菌落。挑取单个白色菌落进行亚克隆,再挑取单个白色亚克隆菌于40 μl无菌水中煮沸10 min 使菌体裂解,离心后取上清作为模板,按1.2.2方法进行PCR 扩增。取上述PCR 扩增证实为阳性克隆的质粒,送往大连宝生物工程公司进行测序。

1.2.4 香猪SRY

基因的序列分析 根据香猪SRY 基因的序列,运用DNASTAR软件进行核苷酸差异、序列相似性分析,并在此基础上使用邻接法( neighbor-joining method,NJ)构建系统树[8]。用自举检验( bootstrap test )估计系统树各分支节点的置信度, 共1 000 次循环[9]。

2 结果

2.1 香猪

SRY基因的分子克隆和测序 从图1电泳结果中可以看出,利用设计的SRY基因引物对公香猪基因组PCR 扩增能够得到一条约800 bp明显目的带,而母香猪及空白对照均只有引物二聚体,无该带。对所扩增片段进行回收克隆测序后,通过与Genbank上检索到的其它物种的SRY基因序列比对,去掉PCR扩增的多余序列,推导出香猪SRY基因的开放读码框以及HMG-box编码的氨基酸序列(图2)。开放阅读框全长627 bp, 编码226 个氨基酸。起始密码子位于1~3 bp 处, 终止密码子位于625~627 bp处。其中HMG-box 区域包含79个氨基酸(D52~E130)。

注:扩增产物约为800 bp

2.2 与部分动物

SRY 基因序列的同源性分析 用香猪的SRY基因同GenBank中获取的白鲸、人、牛、绵羊(登录号分别为AB108518、NM_003140、U15569、Z30265)的SRY基因序列进行同源性分析,在分析的5种动物中共存在238个核苷酸多态位点。表1为5种动物SRY基因序列相似度和歧异度百分比。其中香猪和白鲸的同源性最高,达到82.1%;香猪和人同源性最低,为69.4%。在HMG-box区域,除了一定的核苷酸变异外,香猪与人相比缺失3个核苷酸,与白鲸相比缺失1个核苷酸。

基于5个动物个体SRY基因部分序列差异,对其彼此间的距离进行分析,采用NJ法以人为外群构建聚类进化树(见图3),从聚类图中可以看到,香猪与白鲸聚为一类进化分支,牛和绵羊聚为一类进化分支,而这4种动物都与人的进化分支最远。

注:阴影部分为HMG-box

注:枝长代表分歧度,数值为bootstrap 1 000次重复抽样检验得到的支持率

3 讨论

对公、母香猪DNA体外扩增的结果表明,公猪显示出一条600 bp左右的目的带,而母猪没有特异性条带,这与前人的研究结果一致[1,2,3],再次证明了SRY基因只存在于雄性动物中,因此用SRY基因来进行猪的性别鉴定具有很高的可靠性,这对于建立猪胚胎性别鉴定技术有着重要的意义。

鲸类和偶蹄类在传统上被认为是两个特征明确的支系, 但近年来分子系统学和古老鲸类化石的研究表明,鲸类与偶蹄类具有很近的亲缘关系[10,11]。在我们的研究结果中,无论是序列相似性还是聚类图分支都表明,在所分析的5种动物中香猪与白鲸有较近的亲缘关系,这些结果也支持以白鲸为代表的鲸目和以香猪为代表的偶蹄目有亲缘关系的观点。同时,聚类图中绵羊和牛聚为一类进化分支,这也符合现在普遍公认的牛和羊同属于牛科下的两个不同属(分别为牛属和羊属),而猪科则是与牛科并列的一个独立科的观点[12,13]。在SRY基因的核心HMG-box区域,5个物种均有一定的核苷酸变异,甚至还有少量的核苷酸的缺失,这种由于物种不同所产生的核苷酸变异或缺失会进一步导致氨基酸的变异或缺失。这些变异或缺失对该段核心序列编码蛋白质的空间结构和功能等是否有影响,是否表现在不同物种的进化规律上,还有待进一步研究。

摘要：试验参照猪SRY基因保守序列设计了1对引物,对香猪基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产物通过T-A互补法克隆到质粒pGEM-T载体中,筛选阳性克隆进行DNA测序。测序结果显示,香猪SRY基因开放阅读框全长627 bp,编码227个氨基酸。其中核心区域HMG-box长237 bp,并且编码79个氨基酸。与白鲸、人、牛、绵羊4种哺乳动物的SRY基因序列相比较,香猪和白鲸的SRY序列具有较高的相似性,相似度达82.1%。序列相似性和邻接法聚类树的结果均显示,在SRY基因中香猪和白鲸有着较近的亲缘关系,表明以白鲸为代表的鲸目和以香猪为代表的偶蹄目有较近的亲缘关系。

三穗麻鸭MT基因克隆与序列分析 第10篇

金属硫蛋白(metallothionein,MT),化学名金属硫组氨酸三甲基内盐,是一类广泛存在于生物中低分子质量的金属结合蛋白。自1957年Margoshoes M和Vallee BL[1]在马肾皮质中首次发现金属硫蛋白以来,因其具有多种复杂多样的生理活性和功能[2,3,4],逐渐成为生命科学研究领域的热点。目前发现并确定氨基酸序列的金属硫蛋白超过200种。

随着现代社会工业的迅猛发展与地下矿产资源的不断挖掘,重金属镉的污染问题日趋严重,而镉主要是通过水环境和食物链的途径进入动物体内,可导致动物肝肾功能受损、骨质疏松和神经病变等多种毒性作用[5,6]。鸭作为一种饲养规模较大的水禽动物,镉污染对其危害则首当其冲。三穗鸭是贵州省的一个地方优良麻鸭品种,在贵州省“十二五规划”中的发展目标是饲养量达到4亿只。这些三穗鸭尚若存在重金属镉污染,那定会给消费者带来严重的食品安全问题。Domouhtsidou等[3,4,5,6,7]研究表明,哺乳动物体内MT基因的表达水平,可作为重金属暴露及其毒性效应早期预警的主要生物标志,但对水禽这方面的研究较少。因此,本文开展贵州三穗鸭MT基因克隆与序列分析,以期为今后的重金属镉污染对三穗鸭的安全性评价提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

实验用三穗麻鸭5只,6月龄,体重2.2kg左右,购自贵阳市花溪区某生态养殖园。

1.1.2 试剂

总RNA提取试剂盒、反转录试剂、PCR试剂、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和DL2000 Marker等,均购自大连宝生物公司;琼脂糖为SANTAIBIO产品;氯化镉(分析纯,98%),上海生物工程公司生产。

1.1.3 仪器

微量可调移液枪(0.1～10μL、10～100μL、100～1 000μL),德国产品;自动双重纯水蒸馏器(SZ-93A),上海亚荣生化仪器厂;Sigma高速冷冻离心机,德国制造;制冰机(XB 70),GRANT公司;电泳仪(DXY-8C型),北京市六一仪器厂;三用恒温振荡器(THZ-82A),上海医疗厂;PCR仪,为杭州博日科技有限公司产品;SYGENE 凝胶成像仪,Gene公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据 GenBank 上登录的金属硫蛋白基因序列(No.U34231),应用Primer5.0软件设计引物:UP(5′-ATGGACCCCCAGGACTGCAC-3′)/LOW(5′-CAGCAGCT GCACTTGCTGCT-3′),预期扩增大小为181bp,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2 三穗鸭肝组织总RNA提取

捕杀实验用三穗麻鸭,剪取肝脏组织,研磨处理后,应用 总RNA提取试剂盒提取鸭肝组织总RNA,并采用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.2.3 三穗鸭肝组织MT基因扩增与序列测定

按照大连宝生物公司的反转录试剂盒说明,合成三穗麻鸭肝组织的MT基因第一链cDNA后,采用T4 DNA聚合酶扩增目的基因,反应程序为:95℃ 变性5min;95℃变性30s、55℃ 退火30s和72℃延伸 30s,35个循环;最后72℃延伸 10min。取PCR产物10μL进行琼脂糖凝胶电泳分析,采用DNA回收试剂盒纯化回收目的基因,并送至上海生物工程公司进行测序。

1.2.4 三穗鸭肝组织MT基因序列分析

测序正确的目的基因,应用NCBI BLAST进行同源搜索,与GeneBank登录的其它禽类MT基因序列进行比对;MEGA 4.0软件进行同源性分析并绘制进化树;ProtParam和ExPASy软件分析三穗麻鸭MT基因编码蛋白的基本特性及预测该蛋白的亚细胞定位、跨膜结构、信号肽二级结构特征。

2 结果与分析

2.1 三穗麻鸭肝组织MT mRNA检测结果

采用MT基因引物对鸭肝组织总RNA提取物进行RT-PCR,结果5个样本均可扩增出一条大小为185bp的目的条带(见图1)。

M:DNA标准DL 2000;1～5:鸭肝组织RNA提取样本。

M:DL2000 Marker;1-5:RNA extraction samples of liver tissue.

2.2 三穗麻鸭MT基因测定与进化树分析结果

经测序显示,三穗麻鸭肝组织MT基因大小为185bp(见图2);应用NCBI BLAST搜索和MEGA 4.0软件进行比对和绘制进化树,发现三穗麻鸭肝组织MT基因的核苷酸序列与绿头鸭MT基因只有一个碱基的差异,核苷酸同源性达99%(见图3),但编码氨基酸一致即氨基酸同源性达100%。

2.3 三穗麻鸭MT基因编码蛋白生生物信息学分析结果

应用PSORT软件分析显示,金属硫蛋白MT在鸭肝脏细胞中存在于细胞外、细胞核与细胞质中,其中细胞外分布最多;应用SOSUI软件分析显示,金属硫蛋白MT为可溶性蛋白,平均疏水分值为-0.242623;应用SignalIP软件分析显示,金属硫蛋白MT不存在信号肽(见图4)。

注:Sheldrake麻鸭;Cairinamoschata疣鼻栖鸭;Anas platyrhynchos绿头鸭;Chicken鸡; Meleagrisgallopavo火鸡; Phalacrocorax carbo鸬鹚;Calidris alpina黑腹滨鹬 ; Limosa limosa黑尾塍鹬。

应用ProtParam软件分析显示,三穗麻鸭MT基因可编码61个氨基酸,其中含量最高的是半胱氨酸(C),占31.1%;其次是丝氨酸(S),占14.8%;不含芳香族氨基酸;理论分子量为6221.2Da,等电点为8.41,为一种碱性蛋白。经ExPASy预测,三穗麻鸭MT蛋白的二级结构为:α螺旋为0;β转角为0;延伸链为Val51-Lys52;无规则卷曲为Met1-Cys49、Lys53-Glu54和Ser57-Cys61(见图5)。

3 讨论

金属硫蛋白(MT)是一种广泛存在于人体、动物、植物及微生物中的一种低分子量蛋白。MT在动物体内主要分布在内脏器官上,尤以肝、肾细胞为主,其次是中枢神经系统的星性胶质细胞和神经元细胞,同时在生殖细胞、消化道胶质细胞上也少量分布。镉最初主要累积在肝脏,暴露毒性剂量的镉首先引起肝脏受损[8],诱导肝脏MT增加,呈现剂量依赖性[9,10],而且MT基因转录率与MT蛋白水平二者高度相关[11]。本研究以鸭肝组织为提取总RNA的原料,克隆了贵州省三穗麻鸭MT基因的cDNA序列全长,结果显示三穗麻鸭MT基因全长为185bp,可编码61个氨基酸,其中半胱氨酸(C)19个,丝氨酸(S)9个,不含芳香族氨基酸,这与有关文献报道的疣鼻栖鸭、绿头鸭等品种的MT基本一致。金属硫蛋白30%以上的氨基酸为半胱氨酸,其含有大量的巯基基团,MT还原状态的巯基具有亲核性,使MT对自由基具有较强的清除作用[12],研究资料表明金属硫蛋白清除羟自由基的能力是还原性谷胱甘肽的300倍[13],避免因体内自由基过多,造成细胞结构和功能的破坏,甚至导致细胞突变[14]。

注:Alpha helix为α螺旋;Beta bridge为β转角;Extender strand为延伸链;Random region为无规则卷曲。

三穗麻鸭肝脏金属硫蛋白为非跨膜结构、无信号肽可溶性细胞外蛋白,在三穗麻鸭MT的二级结构预测上,不同的生物信息学软件预测的结果不尽一致。ExPASy预测结果是:α螺旋为0;β转角为0;延伸链为Val51-Lys52;无规则卷曲为Met1-Cys49、Lys53-Glu54和Ser57-Cys61。而DNASTAR预测结果是:无α螺旋;β折叠为Thr7-Cys8,Val50-Lys52;T转角为Met1,Pro3-Cys6,Ala9-Cys49和Pro54-Cys61;无规则卷曲为Asp2和Glu53。这些差异可能与分析软件自身的设计有关。

MT具有多种生理功能,在调节和维持细胞内金属离子平衡、氧化还原反应平衡,以及细胞增殖和凋亡等方面起着重要作用[15,16,17],而且体内诱导MT高表达,能减轻心脏、肝脏、肾脏、脑组织缺血再灌注损伤[18],以及肿瘤组织及周围MT的含量变化与肿瘤的分化程度都具有相关性[19],特别是MT在缓解重金属镉的毒性效应上发挥重要作用[20]。国外学者研究发现MT对重金属的解毒能力顺序为Cd>Zn>Cu>Ag[21]。国内外学者对金属硫蛋白进行了广泛的研究,但以常活动于易受重金属污染水域的水禽作为研究对象的文献报道较少。本文首次对三穗麻鸭MT基因进行了克隆和序列分析,这为后续探讨环境镉污染对三穗麻鸭MT mRNA表达水平的影响研究提供了资料,也为MT与三穗麻鸭免疫机能的相关性研究奠定了基础。

摘要：目的:为三穗麻鸭金属硫蛋白(MT)的结构与功能研究提供基础材料。方法:应用MT特异引物,通过RT-PCR从三穗麻鸭肝组织总RNA中扩增目的基因,克隆测序后应用生物信息学软件对该编码蛋白二级结构、亚细胞定位、跨膜结构及信号肽进行预测。结果:三穗麻鸭MT基因全长185bp,可编码61个氨基酸,其中半胱氨酸19个,丝氨酸9个,不含芳香族氨基酸;该基因序列与绿头鸭MT基因的核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性达100%;该蛋白为可溶性蛋白,可分布细胞核内和核外,不含信号肽。结论:首次克隆出三穗麻鸭金属硫蛋白基因。

全基因序列 第11篇

关键词：猪；akirin2基因；克隆；组织分布；序列分析；基因功能

中图分类号：S828.2 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0025—04

在畜牧业中，肌肉的产量和质量是肉用畜禽的重要经济性状，对畜禽饲养业的经济效益起决定性作用。肌细胞的发育开始于成肌细胞或前体细胞。成肌细胞经过分化和融合过程形成肌管，其随后进一步分化成肌纤维。肌肉抑制素（my-ostatin，MSTN）（或生长分化因子8，GDF-8）是一种调节肌肉生长和发育的主要因子，MSTN表现出对肌肉生长的负调节。肌肉抑制素基因中11 bp的缺失在牛中导致比利时蓝（belgian blue）或双臀肌（double-muscled）表型，比利时蓝牛在肌肉质量上增加20%～30%。尽管在遗传分析中已经揭示出MSTN的重要功能，然而对MSTN信号通路下游调控肌肉发生的相关基因的了解还不多。akirin是Miner等通过小鼠消减抑制杂交文库筛选出的MSTN下游调控基因。这一新核蛋白基因的发现，填补了MSTN调控肌肉生成的上下游基因的空缺。在脊椎动物中akirin基因非常保守，至少存在akirin1和akirin2等2个同源基因。然而，在鸟类和爬行动物中没有akirin1，只有akirin2基因，在硬骨鱼中akirin基因家族有2～8个成员，在细菌、植物和酵母中均未发现有akirin的存在。张志强等首次克隆到猪的mighty（akirin1）基因，并对该基因在猪不同组织中的表达谱进行分析。本研究克隆猪的akirin2基因，并对其组织分布及序列特征进行分析，为进一步研究该基因的功能奠定基础。

1材料与方法

1.1样品采集

取健康猪的心、肝、脾、肺、肾、空肠、十二指肠、回肠、直肠、大脑、肌肉、皮肤、脂肪、胸腺、淋巴、下颌、子宫、睾丸等18个组织，用锡箔纸包好迅速冷冻于液氮中，置于-80℃低温冰箱保存备用。

1.2主要试剂与仪器

Trizol（Invitrogen）；DEPC（Serva）；Reverse TranscriptaseM-MLV（RNase H_）、RNase inhibitor、dNTP-mix、Premix TaqVersion 2.0、DL2000 DNA Marker、凝胶回收试剂盒（TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0）、pMDl9-T Vector均购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5ct菌株为笔者所在实验室保存。台式高速离心机（Eppendorf，Germany）；温度梯度PCR仪（sensoquest，Germa-ny）；凝胶成像系统（Alphalmager HP，USA）；微量核酸蛋白检测仪NanoDrop-100（Thermo，USA）。

1.3方法

1.3.1引物设计 根据NCBI上GenBank中小鼠和人的aki-rin2基因序列，在GenBank数据库中对猪的ESTs和UniGene数据库进行搜索，对搜索到的ESTs序列进行拼接，结合软件BIOXM2.6及引物设计软件，设计1对引物[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]：akirin2-F，5′-ATGGCGTGCG-GAGCTACTCTG-3′；akirin2-R，5′-TCATGAAACATAAC-TAGCAGGCTG-3′。

1.3.2总RNA的提取及cDNA的合成 取50～100 mg经液氮处理过的大脑组织，用Trizol法从中提取总RNA。取2μL样品，采用ND-1000分光光度计检测总RNA的浓度及纯度，取8μL进行甲醛变性胶电泳检测，其余总RNA样品-80℃冰箱中保存备用。反转录体系：0.5μg/μL Oligo（dT）₁₅1μL、总RNA 2μg、M-MLV Buffer（5×）5.0 IxL、10 mmol/LdNTP 6.0 txL、40 U/μL RNase-Inhibitor 0.7 txL、200 U/μLM-MLV Reverse Transcriptase 1.0μL、DEPC H₂O补足至25.0μL。反应程序：25℃10 min，42℃60 min，72℃15 min。反应结束后，迅速冰浴2 min，得到cDNA，置于-20℃保存。

1.3.3目的基因豬akirin2的扩增 以上述cDNA稀释5倍作为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系：Premix Taq聚合酶12.0 μL、10μmoL/μL akirin2-F 1.0 μL、10μmol/μLakirin2-R 1.0μL、cDNA 2.0 txL，用灭菌的蒸馏水补足至总体积为25.0μL，混匀，瞬时离心，立即置于PCR仪上。反应程序：95℃预变性5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，30个循环；72℃延伸15 min。反应结束后，取5μLPCR产物用

1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.3.4猪akirin2基因的克隆 PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行切胶纯化，产物純化回收采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒进行。将回收的产物与pMD19-T载体直接进行连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α，涂布于含有50μg/mL Amp的LB平板上，37℃培养过夜。挑取3～5个单克隆作菌液PCR鉴定，经初步鉴定为阳性的克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.5组织分布 提取采集的猪心、肝、脾、肺、肾、空肠、十二指肠、回肠、直肠、大脑、肌肉、皮肤、脂肪、胸腺、淋巴、下颌、子宫、睾丸等18个组织的总RNA，经RT-PCR后得到相应的cDNA。选择猪的β-actin基因作为内参，引物序列：β-actin-F，5′-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3′；β-actin-R，5′-AGGAAGGAGGGCTGGAAGAG-3′，产物片段预计为138 bp。用于扩增猪akirin2基因的引物序列：akirin2-F2，5′-TCCATCAGCAACGTCCTCAC-3′；akirin2-R2，5′-AACTAGCAGGCTGTTCTCCA-3′，扩增片段预计为218 bp。各取5μLPCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，分析猪akirin2在以上各组织中的分布及表达情况。

1.3.6序列分析 利用ncbi在线分析服务器软件Blast（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行序列同源性比对。应用ExPASy（http：∥expasy.ch/tools/protparam.html）在线分析推测氨基酸序列的理化特征。信号肽序列的预测采用signalP 3.0在线软件（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/Signalp）。应用SABLE（http：∥sable.cchmc.org）在线软件对蛋白质的二级结构进行预测分析。

为了研究akirin基因在进化上的特点，选取NCBI中绵羊、牛、人、小鼠、大鼠以及鸡这几个物种的相关序列进行多序列比对，并用MEGA 5.0软件，选择邻接法（Neighbor-Join-ing）并自举（Bootstrap）1000次计算置信值，建立系统进化树。

2结果与分析

2.1总RNA的提取

肌肉组织总RNA采用Trizol法提取后，采用ND-1000分光光度计检测总RNA的浓度及纯度。D_260nm/D2_280nm为1.83，电泳条带以28S rRNA和18S rRNA为主（图1）。

2.2猪akirin2基因的克隆

总RNA经反转录后，以得到的cDNA为模板，经PCR扩增后，取5μL PCR产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示，扩增得到1个约为609 bp的片段（图2），该片段大小与预期目的基因大小位置接近。

2.3菌液PCR鉴定

经切胶纯化回收后，将该DNA片段与pMD19-T载体进行连接、转化、涂板及挑斑后，经菌液PCR对阳性克隆进行初步筛选，菌液PCR结果（图3）显示，在609 bp处有预期大小的目的条带。

2.4 RT-PCR分析猪akirin2基因组织表达谱

为了分析猪akirin2基因mRNA在不同组织中的表达及分布情况，本研究提取猪18个组织的总RNA，采用半定量RT-PCR的方法进行分析。目的基因猪akirin2的光密度值经内参基因β-actin进行修正，采用二者的比值作为目的基因的相对表达水平。结果显示，猪akirin2基因在猪不同组织中的表达和分布明显不同（图4），在有些组织如心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺等中几乎检测不到该基因的表达，在脑组织中该基因有相对较高的表达水平，在淋巴、睾丸等组织中可以检测到akirin2基因低水平的表达。

2.5序列分析

在GenBank中利用Blast工具对克隆到的猪akirin2基因进行同源性比较，猪akirin2基因与绵羊（Ovis aries，NM_001252176.1）和牛（Bos taurus，NM_001110087）的akirin2基因同源性最高，均为96%，与人（Homo sapiens，NM_018064.3）的同源性为95%，与小鼠（Mus musculus，NM_001007589.3）的同源性为91%，与大鼠（Rattus norvegicus，NM_001039914.2）的同源性为89%。从比对结果可知，该基因在不同物种间的同源性较高。

通过ExPASy软件在线分析预测到该蛋白质相对分子量为50 900.1，理论等电点为5.12，为酸性蛋白。采用signalP3.0在线预测信号肽软件分析发现，该多肽链序列无信号肽，不是分泌蛋白，序列分析发现存在1个10个肽的核定位信号序列19-PASPKRRRCA-28（图5），由此推测akirin2可能在细胞核中发挥功能，这在鼠和果蝇akirin2的研究中已经得到证实。

应用SABLE在线软件对猪Akirin2蛋白质的二级结构进行预测分析，结果显示，二级结构中含有2个α-螺旋（图6）。其中，靠近C-端的α-螺旋在猪、牛、羊、人、小鼠、大鼠及雞中都有。

为了研究akirin2基因在进化中的特点，选取NCBI中绵羊、牛、人、小鼠、大鼠以及鸡这几个物种的相关氨基酸序列进行多序列比对，并用MEGA 5.0软件，选择邻接法（Neighbor-Joining）并自举（Bootstrap）1000次计算置信值，建立系统进化树（图7）。在重建的系统进化树上，这几个不同物种的Akirin2蛋白分成3支，牛和羊先聚在一起，然后又与猪和人聚成其中一支，小鼠和大鼠聚成另外一支，鸡则单独在一支上。结果显示，猪Akirin2蛋白与人、牛和羊的亲缘关系比其与小鼠和大鼠的近，与鸡的亲缘关系最远。

3結论与讨论

目前已经报道了akirin基因在免疫、发育及肌肉再生等方面发挥了重要的生物学功能。本研究克隆了猪akirin2基因的编码区全序列，该序列包含612个核苷酸，由此推测编码203个氨基酸。人、牛、羊的akirin2基因的ORF的核苷酸序列也都是612 bp，编码203个氨基酸；小鼠和大鼠的akirin2基因的ORF包含609个核苷酸，编码201个氨基酸，鸡的akirin2基因的ORF仅有573 bp，编码191个氨基酸，比猪、牛、羊和人的少36 bp，共计12个氨基酸。大鼠和小鼠的akirn2连续缺少6 bp，氨基酸序列中连续缺少2个氨基酸残基，鸡连续缺失36 bp、12个氨基酸，缺失部分都不在α-螺旋区。由于氨基酸的缺失使得猪Akirin2氨基酸的序列同源性與大鼠和小鼠较近；而鸡Akirin2氨基酸残基缺失，导致猪与鸡的同源性最远，而氨基酸数目同样多的猪、牛、羊和人的同源性更近。人、牛、羊、大鼠、小鼠和鸡的Akirin2蛋白在其N-端都有一段保守的核定位信号序列，序列分析发现，猪Akirin2蛋白与其他物种的Akirin2蛋白一样，也含有1个核定位信号序列，这与报道的Akirin2是在细胞核中发挥功能的核蛋白相符合。此外，这一核定位信号序列在猪Akirin1蛋白中也能找到。应用SABLE在线软件对猪Akirin2蛋白质的二级结构进行预测分析，结果显示，猪Akirin2的二级结构中含有2个α-螺旋，靠近C-端的α-螺旋在猪、牛、羊、人、小鼠、大鼠及鸡中都有，该区域的保守性显示此区域可能对Aki-rin2发挥功能具有重要作用。

全基因序列 第12篇

关键词：IGFBP-5,克隆,基因,绵羊,蛋白质,序列

胰岛素样生长因子结合蛋白 - 5( IGFBP - 5) 是胰岛素样生长因子结合蛋白家族( IGFBPs) 的成员之一,存在于血液和组织中,IGFBP - 5、IGFs和ALS结合形成异源三聚体的形式存在[1],延长IGFs的半衰期。IGFBP - 5基因是IGFBPs家族中最保守的,作为主要的调控因子调控许多细胞系的生长发育过程,如肌细胞系和神经细胞系等[2]。D. A. Salih等[3]证实了IGFBP - 5在生长发育过程中的重要作用,通过繁育IGFBP - 5过表达的转基因小鼠表明IGFBP - 5既有依赖于IGFs又有独立于IGFs的作用,调节小鼠存活、生长、肌肉发育和繁殖率等方面。

芦春艳等[4]采用PCR - SSCP和PCR - RFLP两种方法分析了草原红牛的IGFBP - 5基因的外显子3的多态性,发现191 bp处的碱基突变与草原红牛的宰前活重、胴体重等显著相关。赵晓枫等[5]采用直接测序法检测了猪IGFBP - 5基因的SNP位点,发现SNP位点与猪个体断奶体重、肌肉系水力等显著相关。沈敏等[6]采用PCR - SSCP技术检测了中国美利奴羊IGFBP - 5基因的多态性,结果表明SNP位点的突变与中国美利奴羊的生长和羊毛生产性能具有一定的影响。吴苏日古嘎等[7]采用实时荧光定量PCR技术检测了IGFBP - 5基因在未训练和已训练蒙古马的不同运动时期肌肉组织中的表达差异,结果表明IGFBP - 5基因的mRNA的表达与蒙古马运动性能及骨骼肌生长发育有关。本研究以凉山半细毛羊为研究对象,克隆了IGFBP - 5基因的CDS全序列,利用生物信息学方法分析CDS序列及相应的氨基酸序列,为进一步研究该基因在绵羊生长发育过程中的调控以及标记的辅助选择育种奠定基础。

1材料与方法

以四川省凉山州布拖县的凉山半细毛羊原种场的7 ~ 9月龄凉山半细毛羊母羊为试验材料,采用颈静脉放血,宰杀后10 min内收集肝脏组织,浸泡于Sample Protector试剂[宝生物工程 ( 大连) 有限公司产品]中,置于液氮中,带回实验室于 - 80 ℃ 冰箱中保存,备用。

2方法

2.1引物的设计

参照NCBI Gen Bank数据库中 公布的普 通牛 ( Bos Taurus) 的IGFBP - 5基因( BC149394) 的mRNA序列,采用Primer Premier 5. 0软件设计引物,采用Oligo 6. 0进行引物评价,采用NCBI网站的BLAST工具检索比对以验证引物特异性。IGFBP - 5引物序列为F 5' - AGACTCGGAGAAGATGGTGCTC - 3',R 5' - TGGGATGGGGTGAGGGAAAGA - 3'。引物由宝生物工程( 大连) 有限公司合成。

2.2总RNA的提取

取凉山半细毛羊肝脏组织约100 mg,迅速把组织放入预冷好的研钵中研磨,期间不断加入液氮,直至组织被研磨成粉末状,采用TRIzol提取法提取总RNA,用1% 的琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性, 用核酸蛋白检测仪检测提取的RNA的浓度与纯度, 将得到的RNA置于 - 80 ℃保存,备用。

2.3RT-PCR扩增

反转录反应按Prime Script RT Reagent Kit( 反转录试剂盒,Ta KaRa公司生产) 说明书进行,反转录反应条件: 37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s终止反应。以合成的第1条c DNA链为模板,以IGFBP - 5基因的特异性引物进行PCR扩增,扩增体系( 50 μL) : Ta KaRa LA Taq酶0. 5 μL,2 × GC Buffer 25 μL,d NTP 8 μL,c DNA( ≤1 μg) 2 μL,上、游引物( 10 μmol / L) 各1 μL, dd H2O 12. 5 μL。扩增条件为: 95 ℃ 预变性5 min; 94 ℃ 变性45 s,58 ℃ 复性30 s,72 ℃ 延伸1 min,共35个循环; 72 ℃ 延伸10 min; 16 ℃ 保存。

2.4RT-PCR产物克隆

将回收的RT - PCR产物与p MD 18 - T载体连接,载体与片段的摩尔比控制在1∶2 ~ 1∶10,根据凝胶电泳或核酸蛋白仪检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。轻轻蜗旋离心管以混合内容物,短暂离心,将混合反应液置于16 ℃水浴中过夜连接。用灭菌牙签挑取单个白色菌落,接种于含有Amp的1. 5 m L LB培养液中,37 ℃ 、200 r / min振荡培养过夜。次日,吸取1 μL菌液作模板,依据RT-PCR扩增体系和条件进行PCR鉴定,通过1% 琼脂糖凝胶电泳来检测目的条带。根据菌液PCR检测结果,吸取含有目的条带的菌液( 1 m L) 送往Invitrogen公司进行测序。

2.5生物信息学分析

将测序结果与测序峰图结合进行校对,寻找基因的起始密码子与终止密码子,确定基因的编码区序列。用NCBI的BLAST服务器和Clustal W软件进行序列的同源性分析。核酸序列与其他物种比对后,利用Ex PASy服务器( http: / /au. expasy. org /tools/) 相关软件预测各个基因的氨基酸序列的分子质量、等电点和氨基酸组成等,将序列提交到Ex PASy Scan Prosite、 HNN、SWISS - MODEL服务器,预测蛋白质的磷酸化位点、N - 磷酸化位点、O - 磷酸化位点、跨膜区、信号肽、疏水性、二级结构和功能域等。

3结果与分析

3.1总RNA的提取及RT-PCR扩增

从凉山半细毛羊的肝脏中提取的总RNA经1% 琼脂糖电泳后可以清晰地观察到3条带,见图1。

1,2. 总 RNA。

在图1上以迁移 率从大到 小依次可 见5 S rRNA、18 S rRNA、28 S rRNA,28 S条带亮度大约为18 S条带的2倍,5S条带亮度较低,总RNA样品完整,降解较少,质量良好。以凉山半细毛羊肝脏组织的c DNA为模板,用IGFBP - 5基因的引物扩增,得到长度约为850 bp的条带,凝胶电泳检测结果见图2。

M. DL - 2 000 Marker; 1. PCR 产物。

3.2序列分析

根据正反测序进行校正,采用DNAMAN去除载体序列和寻找上、下游引物序列,确定各个基因编码氨基酸的CDS区域,结果表明,IGFBP - 5基因的完整CDS序列长度为816 bp,编码271个氨基酸。利用NCBI中的BLAST程序比对克隆的绵羊IGFBP - 5基因与近源物种的同源性,结果表明,IGFBP - 5基因与牛、人、鼠CDS区的同源性 分别为97% 、94% 、 89% ,氨基酸序列同源性分别为98% 、98% 、95% 。 同源性比对 结果表明,克隆的基 因即为绵 羊的IGFBP - 5基因,将PCR扩增得到的序列提交到NCBI,登录号为EU727460. 1。

利用Bio Edit软件对此 次试验克 隆得到的IGFBP - 5基因CDS编码区的碱基组成成分进行分析,结果表明,IGFBP - 5的A、C、G和T等4种碱基组成含量 分别为19. 85% 、32. 84% 、32. 35% 和14. 95% ,单链分子质量为249. 74 ku,双链分子质量为498. 2 ku; IGFBP - 5的氨基酸 分子质量 为30. 3 ku,理论等电点( p I) 为8. 56。

3.3IGFBP-5基因的分子进化

从NCBI中Gen Bank下载山羊、牛、水牛、猪、人、 鼠、非洲蟾蜍、非洲爪蟾和鲑等物种的IGFBP - 5基因的氨基酸序列,用Mega 6. 06软件以Neighbor-Joining程序构建IGFBP - 5基因的分子系统发育树, 见图3。IGFBP - 5基因与其他物种的进化关系与传统的分类比较一致,绵羊与山羊关系最近,最先聚合, 随着亲缘关系的远近逐步与牛、水牛、猪、人和鼠等哺乳动物聚为一支,再与蟾类聚合,最后才与鱼类聚合。

3.4蛋白质特性预测

3. 4. 1疏水性分 析采用Ex PASy在线平台 的Prot Scale绘制绵羊IGFBP - 5基因的疏水性图谱,见图4。IGFBP - 5基因的N段区域存在明显的疏水性区域,而在N段及中部区域存在明显的亲水性区域。 因此,预测IGFBP - 5基因的中 部区域可 能是与IGF - Ⅰ和IGF - Ⅱ基因的结合部位,依据IGFBP - 5基因N段的明显疏水性区域推测在该位置可能存在信号肽。

3. 4. 2信号肽分析根据蛋白质的疏水性分析,IGFBP - 5基因的蛋白质可能存在信号肽,将IGFBP - 5基因的氨基酸序列提交到Signal P 3. 0服务器( http: / / www. cbs. dtu. dk / services / Signal P / ) ,结果见235页彩图5。

结果表明,IGFBP - 5蛋白质的N段存在信号肽的概率为1. 000,信号肽的长度为19个氨基酸残基, 切割位置为Gly ~ Leu之间。

3. 4. 3跨膜区分析登录到http: / / www. ch. embnet. org / software / TMPRED - form. html进行蛋白质的跨膜区预测,结果见图6。分析表明,IGFBP - 5存在1个跨膜区,位于信号肽位置,因此该基因无跨膜区。

3. 4. 4磷酸化和糖基化位点利用Net Phos 2. 0在线磷酸化位点预测服务器,对克隆的IGFBP - 5基因的磷酸化位点进行预测 ( http: / /www. cbs. dtu. dk /services / ) ,结果见235页彩图7A。IGFBP - 5基因中共发现22个磷酸化位点,分别为Ser ( 11个) 、Thr ( 5个) 、Tyr( 6个) 。

利用Net NGlyc1. 0及Net OGlyc3. 1服务器,对克隆的IGFBP -5基因的分子进行N - 和O - 糖基化位点预测( http: / /www. cbs. dtu. dk/services/) ,结果见236页彩图7B和彩图7C。结果表明: IGFBP - 5共有2个N - 糖基化位点,分别位于101 aa和170 aa; 3个O - 糖基化位点,分别位于122 aa、123 aa和130 aa。

3.5二级结构分析

利用HNN在线二级 结构预测 服务器,对IGFBP - 5基因进行预测 ( http: / / npsa - pbil. ibcp. fr / cgi - bin / npsa_automat. pl? page = npsa_nn. html) , 结果表明,IGFBP - 5基因以无规卷曲为主,其次为 α - 螺旋,β - 折叠最少,无规卷曲、α - 螺旋和 β - 折叠区域分别占66. 42% 、22. 51% 和11. 07% 。

3.6蛋白质功能域预测及分析

将序列递交到Ex PASy Scan Prosite( http: / /www. expasy. org / tools / scanprosite / ) 结构域分析数据库进行蛋白质结构域的查找与分析,结果见236页彩图8。结果表明: 克隆的IGFBP - 5基因的N端具有1个IGFBP_N功能域序列,位于22 ~ 102 aa。在C端,具有1个甲状腺球蛋白 - Ⅰ 型功能域,位置分别为188 ~ 262 aa; 在该域中,具有3个二硫键,位置为191 ~ 218 aa、229 ~ 240 aa、242 ~ 262 aa; 同时还具有大量的N - 豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C等磷酸化位点、1个依赖于c AMP - 和c GMP蛋白激酶 磷酸化位 点及1个酰胺化 位点 ( 233 ~ 236 aa,r GRK) 。

4讨论

蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等,在所克隆的6个基因中,已在线预测存在大量的磷酸化和糖基化等修饰过程。磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程,大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的,至少有30% 的蛋白被磷酸化修饰[8,9],磷酸化的作用位点为蛋白上的Ser、Thr和Tyr残基。在磷酸化调节过程中,细胞的形态和功能都发生改变,可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程,如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等[10]。

试验克隆的IGFBP - 5基因的蛋白翻译后修饰主要方式为磷酸化位点和糖基化位点,而其他的蛋白翻译后修饰的方式较少,预测的磷酸化位点主要以Ser残基位点为主,其次是Thr残基位点,最少的为Tyr残基位点。绵羊的IGFBPs蛋白翻译后修饰几乎未见报道,关于绵羊的磷酸化和糖基化位点的功能, 仅能与人类IGFBPs的研究位点的功能进行比较以探知其功能,并借助于金属离子亲和层析( IMAC) 、免疫沉淀、强阳离子交换色谱( SCX) 、强阴离子交换色谱( SAX) 、反相色谱等[11]技术研究各种蛋白翻译后修饰的功能。

IGFBP - 5基因在保守的N - 端区域存在12个Cys,在保守域内形成6个二硫键,其二硫键是以相邻的两个Cys依次构成,形成IGFBPs的第一亚域; 在C - 端的保守区域内存在6个Cys,也以相邻的两个Cys依次而构成3个二硫键,构成第二亚域。绵羊的IGFBP - 5蛋白氨基酸序列的二硫键与人的研究结果一致[12,13],经二硫键折叠形成稳定、精细的IGFBP-5球状结构,保证了基因与IGFs结合的亲和力。克隆的IGFBP -5基因在N - 端及中部区域都存在明显的亲水性区域,而疏水性区域占主导地位。根据信号肽的预测,每个基因在N - 端的前30 aa之内都具有信号肽,在N - 端都具有1个完整IGFBP_N功能域序列,在C - 端具有1个甲状腺球蛋白 -Ⅰ型功能域。