动物/方法范文

动物/方法范文（精选12篇）

动物/方法 第1篇

1 开展PBL教学, 提高学生教学参与性

PBL教学 (problem based learning) 是一种以构建主义理论为基础的基于问题的学习方法, 最早是由美国神经病学教授Borrows于1969年提出的, 逐渐发展成为一种以问题为导向的教学方法[2]。此方法以学生为中心, 注重唤起学生的好奇心和学习兴趣, 强调在课堂教学中充分调动学生的主动思考能力。这种教学理念与传统教学理念不同的是:强调以发挥学生的主动学习为主, 而不是传统教学中的以教师讲授为主。通常将学习设置到复杂的、有意义的问题情景中, 通过学生的自主探究和合作来解决问题, 从而学习隐含在问题背后的科学知识, 在这一主动学习过程中不但完成了相关知识的学习, 而且逐渐培养了学生自主解决问题的技能与学习能力。目前, 在国家大力提倡自主创新精神的倡导下, 将这种教学方法应用于实验动物与实验动物疾病学中, 在传授实验动物相关知识的同时, 开发了学生的自主创新能力, 挖掘与培养了学生的科研素质, 获得了较好的教学效果。具体做法是:取消传统的闭卷考试, 以科研论文及进行现场答辩的方式代替。根据每节课的教学主题, 列出相关参考书以及重要文献, 课后围绕所讲授的内容列出论文选题, 学生可以根据自己的兴趣自主选择论文选题, 完成文献检索、文献阅读、归纳总结、撰写论文、现场答辩这一系列过程, 教师根据学生现场答辩的表现及其所撰写的论文质量进行点评, 明确指出学生的优缺点, 并以此为依据给学生相应分数。近4年来, 采用此种方法进行实验动物与实验动物疾病学的课堂教学, 令学生耳目一新, 极大地调动了学生参与教学、学习相关知识的积极性, 与传统教学方法相比获得了更为令人满意的教学效果。学生在撰写论文的过程中, 充分发挥了自主学习的精神, 撰写的相关论文选题切入角度新颖, 能够跟踪检索最新发表的中英文文献, 对其所选问题的最新研究进展有着充分的掌握。在论文论述过程中, 思路清晰, 逻辑合理, 论证严密。在答辩环节, 学生反应尤为强烈, 积极参与, 大家纷纷就自己感兴趣的问题进行了提问, 甚至是深入探讨, 学生所提的问题质量非常高, 充分反映了学生对相关科学问题的了解程度。甚至个别学生所提问题具备科研立项, 进行深入研究的科学价值。笔者将质量比较高的论文投至相关专业期刊, 获得了较好的效果。这一教学方法的应用最大限度地开发了学生的自主学习能力, 提高了学生教学参与性, 获得了比课堂上教师单纯讲授还好的教学效果。在完成基本教学内容与目标的同时, 还锻炼了学生发现问题、分析问题、解决问题的能力, 为其将来进行相关科学研究、从事相关专业工作奠定了坚实的基础。

2 采用多媒体教学, 提高教学质量

实验动物与实验动物疾病学的教学内容包括实验动物、实验动物常见疾病学两大方面[3,4], 其中实验动物部分包括实验动物中外发展史及发展现状介绍、实验动物遗传、微生物质量控制、实验动物的分类、实验动物的选择、实验动物的饲养与管理及常见实验动物介绍等;而实验动物疾病学部分包括实验动物常见的病毒性、细菌性传染病及常患的寄生虫疾病。从该门课的教学内容上看, 包含了较多的教学内容, 但是该门课程的教学学时十分有限, 因此在实际教学工作中必须有效解决较多的教学内容与较少的教学学时这一重要问题。传统的教学采取教师板书授课的教学方式, 但是这一传统方法存在很多缺陷, 主要反映在以下几个方面:1) 课程所容纳的信息量较少。例如, 在介绍实验动物发展现状时, 随着科学技术的飞速发展, 实验动物这一学科近年来在生命科学的多个领域中多取得了令人瞩目的研究成果, 教师在备课时准备得非常充分, 但是由于时间有限, 无法以板书的形式展示, 而这一部分恰恰是激发、引导学生学习这门课程的重要内容。2) 传统教学方法缺乏形象感, 很难给学生留下深刻印象。例如, 在介绍实验动物饲养管理时, 生产实践中出现了很多先进、科学、简便的饲养设施及其辅助设施, 无法使学生见到实物, 仅仅通过语言描述很难介绍这些仪器或设备的科学与精妙之处, 这就导致学生走上工作岗位后, 遇到虽然了解其功能及使用方法但是不认识、无法实际操作的尴尬场景;又如在介绍常见实验动物时, 这些动物的外貌特点、一些特殊品系动物所具备的独特外貌形象无法向学生展现, 学生不知道这些动物长什么样, 讲授的内容过于抽象, 导致学生很难有比较深刻的认知。3) 此外, 在传统的教学方法中, 教师像在唱独角戏, 缺乏教学过程中的互动, 造成教师讲学生记, 无法形成良好的教学信息传递与反馈, 会导致学生学习热情下降, 课堂注意力不集中, 继而影响到教学效果。随着计算机技术的飞速发展, 将多媒体应用于教学已经成为一种常规的教学手段, 其内容涵盖范围越来越广泛, 不仅包括图像、文字、动画、声音, 还可以将相关的内容拍成视频应用于实验动物与实验动物疾病学的教学当中。多种形式的运用, 将抽象、生涩难懂的概念, 相关仪器、设备及常用动物品系、品种的简单、贫乏的语言描述转化为生动、形象的视频观看, 更容易吸引学生的注意力, 同时很好地解决、弥补了上述传统板书教学的缺点, 激发了学生的学习热情, 有效地提高了教学的效果, 尤其是目前新开发、研制出的小鼠各类型的疾病模型及具有特殊外貌特征、特殊应用领域的小鼠展示, 这样不但加深了学生对这些实验动物的印象, 更启发了学生投身科学研究的热情。

3 提倡动物福利理念, 注重德育素质教育

动物福利概念的提出已经具有上百年的历史, 随着社会进步和文明的发展, 生命科学研究领域实验动物用量增大, 动物福利理念越来越受到人们的重视, 不再是停留在伦理学研究方面, 而是将动物福利的核心价值观“3R” (减少、替代、优化) 原则渗透在日常的科学实验中。在开展实验动物与实验动物疾病学教学过程中, 更要强化学生的动物福利理念, 使学生的德育素质得到全面发展。要使学生清楚地意识到, 在生命科学及其相关领域研究中, 实验动物作为直接的实验材料, 充当了人类替难者的角色, 是推进生物、医学、药学发展、治疗人类疾病的幕后英雄, 人类在生命科学领域所取得的每项重要研究成果都离不开实验动物的献身。据统计, 60%的诺贝尔医学和生理学奖获得者所取得的成果都是通过动物实验获得的。在教学过程中, 开展以“善待、科学使用实验动物, 贯彻3R原则”为主题的讲座, 从科学的角度阐述、宣传实验动物福利的重要性, 发起学生关于科学合理使用实验动物, 保障实验动物福利的讨论, 不但扩展了学生关于提倡动物福利的先进科学理念, 还促使学生在其他的专业课学习过程中, 尤其是在需要实验动物的课程学习中, 能够做到科学、合理地使用动物, 积极地设计相关动物实验, 在尽可能多地获得科学数据的前提下减少实验动物的使用量。在实验动物饲养管理中, 应保障其免受饥饿的权利, 保障其具有足够的生活空间, 保障其免受伤害、疾病痛苦的权利, 保障其免受恐惧和悲伤的权利, 保障其表达天性的权利[5,6]。牢固学生的这种动物福利的科学理念, 不仅有利于在我国大力推广这一科学理念, 还有利于学生的德育素质教育, 使学生从简单的善待动物的朴素情怀上升到动物福利的科学层面, 并将这种理念应用到将来的工作与科学实验过程中, 使学生得到全面的素质教育与培养。

4 加强与从事实验动物专业人员的合作与交流

作为高等院校, 主要以教学为重点, 但是应积极开展与从事实验动物研究的专业研究机构合作与交流, 实现真正的优势互补。上海实验动物研究中心是国内专门从事实验动物研究的科研机构, 与其开展相关的合作交流, 不仅为学生提供了可供参观、学习、实习的场所, 更能使学生们了解到目前实验动物研究发展的方向与动态, 开阔了学生的眼界与思路, 有利于创新性人才的培养与教育, 开辟了一条高校与专业研究院所教学、科研合作交流的新思路, 极大地提高了教学水平与实际的教学效果。

5 结语

实验动物与实验动物疾病学是一门新兴的、综合的学科, 只有对现有的教学方法不断进行探索, 在实践中逐渐积累宝贵的经验, 尝试多种教学方法的灵活、综合应用, 才能激发学生的学习兴趣, 活跃课堂气氛, 达到良好的教学效果。教与学是相互促进的, 高校教师更应该孜孜不倦地探索, 在吸收成功教学经验的基础上, 勇于探索创新, 一切为了学生, 在完成教学基本任务的同时与学生积极互动, 了解学生的心理特点, 保证高质量的教学效果。

摘要：实验动物与实验动物疾病学是研究实验动物与实验动物各类常见传染病的一门新兴、综合学科, 是当今生命科学研究领域最为活跃、最为重要的学科之一。为了更好地讲授该门课程, 将PBL相关教学方法应用于其中, 进行了初步的实践与探索, 获得了较好的教学效果, 介绍如下供同行参考。

关键词：实验动物与实验动物疾病学,教学方法,PBL,多媒体技术

参考文献

[1]陆承平.兽医微生物学[M].4版.北京:中国农业大学出版社, 2007.

[2]汪雪兰, 朱小南.中国式课堂PBL的实践与探索[J].中山大学学报论丛, 2007 (3) :13-16.

[3]何诚.实验动物学[M].北京:中国农业大学出版社, 2006.

[4]崔淑芳.实验动物学[M].3版.上海:第二军医大学出版社, 2007.

[5]孙晓燕, 纪海旺, 王亚超, 等.动物福利的现状及在我国实施的必要性[J].河南畜牧兽医, 2007, 28 (7) :3-5.

动物的剪纸方法 第2篇

动物的剪纸方法

动物的剪纸方法

1动物的剪纸方法

2动物的剪纸方法

3动物的剪纸方法

4动物的剪纸方法

5拓展阅读：鸟类动物

特征：全身披有 羽毛，身体呈流线型，有角质的喙;眼在头的两侧，颈部长而灵活可270度转;前肢特化成翼，后肢有鳞状外皮，具四趾;恒温动物（能通过自身的生理过程产生热量，即使外界温度很低，他们也能维持高而恒定的体温），平均体温比哺乳动物高出10度左右（平均42度）。

主要特征

⑴体表被羽毛，有翼，能飞翔。皮肤薄而软，便于肌肉的剧烈运动。

⑵新陈代谢旺盛，体温恒定。高而恒定的体温，促进体内新陈代谢的速度。恒温减少了动物对外界温度条件的依赖性，获得夜间活动的能力和在极地大陆上存活的能力。

⑶具有发达的神经系统和感官。鸟类的大脑、小脑、中脑都很发达。大脑半球较大，这主要是由于大脑底部纹状体的增大。在鸟类，纹状体是管理运动的高级部位，也和一些复杂的生活习性相关。实验证明：切除鸟的一部分纹状体后，它的正常的兴奋和抑制就被破坏，视觉受影响，求偶、营巢等习性丧失。鸟类的大脑皮层并不发达，小脑很发达，这与鸟类飞翔运动的协调和平衡相关。

正确使用药物治疗动物疾病的方法 第3篇

摘要：在动物养殖过程中常出现滥用药物的现象，轻者加大动物应激反应，影响生长，重者引发疾病，使畜（禽）群抗体水平参差不齐，造成经济损失。本文从药物使用过程中存在的问题，药物的正确使用原则，药物正确使用方法，药物的使用禁忌几个方面进行了阐述，旨在为在治疗动物疾病过程中正确使用药物，降低成本，增加效益提供参考。

关键词：动物疾病；药物使用；问题；原则；方法

中图分类号：S859 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.20.0053

随着畜牧养殖业的不断发展，养殖户为了增加收入，减少经济损失，在养殖过程中都要使用药物，但由于对药物使用缺乏正确认识，使得养殖户在使用过程中存在诸多问题。因此，如何正确使用药物对于养殖户来说显得尤为重要。

1 药物在使用过程中存在的主要问题

1.1 对抗生素过分依赖

很多的养殖户对药物的知识欠缺，盲目认为抗生素是万能的，不仅能治病，还能起到预防作用。使用抗生素时越新越好、越贵越好、越高级越好。所以在养殖过程中经常使用抗生素，以达到增强抗病能力和快速生长的目的。实际上，各种抗生素都有各自的特点，优势也各不相同，要做到正确诊断，对症下药。

1.2 对药剂量掌握不准

许多养殖户认为药物用量稍大点，治疗的效果会更好些，为了达到更好的治疗效果，自行加大药剂量；有些养殖户因为药剂的消费大，便采取每次少用一点，便能多用几次的方法来减少治疗费用，忽略了药的剂量大会引起中毒，甚至死亡；而剂量过小又达不到疗效，治疗成本反而提高。

1.3 盲目搭配用药

不论什么疾病，不管药理药效，听到他人介绍效果好，就多种药物胡乱搭配使用。比如益生素是活菌，会被抗生素杀死，造成两种药效果都不好。

1.4 盲目使用原粉

每一种成品药都要经过科学的加工，大部分是由主药、增效剂、助溶剂、稳定剂组成，才会使用效果比较好，而现在很多的商家直接销售原粉，并误导养殖户 “原粉纯度高，效果好”。

2 药物的正确使用原则

养殖户由于对药物使用存在误区，才导致了经济的损失，所以要加强对药物使用的认识，遵循正确使用的原则。首先要做到诊断的正确、用药要有明确的针对性、了解用药的疗效和不良反应，其次避免使用多种药物或固定剂量的联合用药。

2.1 了解药物的分类、剂型及特点

兽药按照剂型分为原料药、添加剂、片剂、针剂、溶剂、生物制剂等。按照作用分为抗菌消炎药、驱虫药、消毒防腐药、维生素、疫苗等。原料药成本低，使用时注意混匀；添加剂成本较低，使用较为方便；片剂成本较高，但能定时、定量、定向按体重给药；针剂成本低，作用快，效果明显；溶剂成本低，主要为消毒剂，作为预防用药；生物制剂主要为疫苗等。

2.2 了解药物的主要成分和含量

在使用药物时， 要充分了解药物的主要成分、含量。以免在使用过程中，使用了同一成分却又不同名字的药物，误认为两种药效，无形中加大了药量，损害畜禽的机体，延误治疗。

3 药物的正确使用方法

3.1 遵照说明使用药物

要选用质量好、信誉好的正规兽药生产企业的产品。严格遵照药物明确规定的使用剂量和疗程。用药剂量要按说明用药，过大或较小都不宜，更不要超过极量。例如抗菌类和磺胺类药，在首次使用时要用药量要大，后期可根据病情适当减少药量，即使病症消失后，也应继续给药1～2天，以免疾病复发。如要用药2天后症状未减轻，便可换其他抗菌素。

3.2 合理选择药物

要依据病因特点合理选择药物。尤其是母畜用药时，不仅要考虑药物对母畜本身的影响，还要考虑到对胎儿或乳儿的影响。如养禽长期使用磺胺类药物可导致产软壳蛋，磺胺类药物及某些抗生素（卡那霉素、链霉素等）长期使用会损伤肾脏功能，引起痛风等。要根据病情分析病因，做出科学的临床诊断，如革兰氏阳性菌引起的禽病，应首选青霉素、四环素或磺胺类药物治疗。

3.3 交替使用药物

对同一疾病选择几种有效药物交替使用，可提高疗效（按疗程交替），避免产生抗药性。对于反复发生的疾病，应更换成未长期用过的药物或新品牌，疗效会更好。

3.4 合理更换药物及停药

若用药后3～4天不见效，应马上停药，更换其他药品。若见效则不能立刻停药，应确定康复后再用药几次，以巩固疗效。

3.5 加强综合治疗措施

在进行药物治疗的同时，还应考虑改善饲养管理，增强机体抵抗力，电解质和酸碱平衡，补充能量，避开免疫干扰，注意并发感染，选择正确治疗途径，使机体尽快恢复健康。如家畜的腹泻要考虑进行综合治疗，抗菌、止泻、补液和纠正酸碱失衡，这样治疗效果更佳。

4 严禁使用农业部明令禁止用于动物的药物

允许在执业兽医的指导下使用符合《中华人民共和国兽药典》、《中华人民共和国兽药规范》、《兽药质量标准》、《兽用生物制品质量标准》、《进口兽药质量标准》规定，如钙磷硒钾等补充药、酸碱平衡药、体液补充药、电解质补充药、营养药血、容量补充药、抗贫血药、维生素类药、吸附药、泻药润滑剂酸化剂局部止血药收敛药和助消化药。按照农业部有关规定严禁使用规定的兽药如瘦肉精、性激素类、抗病毒化学药品、明文禁止的抗生素、精神药、农药等。并严格执行休药期制度。

5 结语

总之，在畜牧养殖业的过程中，要遵循药物的正确使用原则，合理选药、用药，严禁使用农业部“明令”禁止用于动物的药物，做到药物治疗和综合治疗相结合。

实验动物的处死方法 第4篇

1 物理方法致死

1.1 急性失血法

此法应用于大鼠和小鼠等小动物时, 常是剪断动物的股动脉, 放血致死。可以采用摘眼球法, 在鼠右侧或左侧眼球根部将眼球摘去, 使其大量失血致死。如果是犬、猫或兔等稍大型动物应先使动物麻醉、暴露股三角区或腹腔, 再切断股动脉或腹主动脉, 迅速放血。动物在3~5 min内即可死亡[3]。采用急性失血法动物十分安静, 对动物的脏器无损害, 但器官贫血比较明显, 若采集组织标本制作病理切片时可用此法。

1.2 断头法

此法适用于鼠类等小动物, 可用直剪刀, 也可用断头器。断头法处死动物时间短, 并且脏器含血量少, 若需采集新鲜脏器标本可采用此法。断头法会引起血液循环的突然中断和血压的迅速下降并伴随意识的消失, 只能用于恒温动物。对于变温脊椎动物不推荐用断头法, 因为它们相对能更高的抵制缺氧[4]。

1.3 空气栓塞法

当空气注入静脉后, 可阻塞其分支, 进入心脏冠状动脉可造成冠状动脉阻塞, 发生严重的血液循环障碍, 动物很快死亡。此法适用于较大动物的处死, 家兔、猫用此法需注入20~40 m L空气, 犬致死的空气剂量为80~150 m L。由于应用此法后, 动物死于急性循环衰竭, 所以各脏器淤血十分明显。

1.4 断髓法

此法适用于小鼠、大鼠等小动物。用于家兔时可敲击延髓致死, 用木锤用力锤动物的后脑部, 破坏延脑, 动物痉挛后死亡, 简单迅速。用于蟾蜍、蛙类可直接捣毁脊髓, 将金属探针插入枕骨大孔, 破坏脑脊髓使动物死亡, 操作过程中要防止毒腺分泌物射入实验者眼内。

2 化学药物致死

常用安乐死药物有:吸入式麻醉剂 (包括CO2、CO、乙醚、三氯甲烷等) 、氯化钾、巴比妥类麻醉剂、二氯二苯三氯乙 (DDT) 等。

2.1 药物吸入

药物吸入致动物死亡适用于啮齿类, 如小鼠、大鼠、豚鼠等小动物, 操作简单, 是实验中安乐死的常用方法。因CO2无毒, 制备方便, 效果确切, 是最常用的致死药物。对1日龄的雏鸡研究表明, CO2是有效的安乐死试剂, 它几乎不引起痛苦, 抑制神经紧张活动, 在5 min之内引起动物的死亡。CO2浓度越高, 动物失去意识的时间就越短。当CO2浓度增长缓慢时, 也会延长动物失去意识的时间[5]。可以采用特制的安乐死箱, 能使CO2气体充满整个箱室, 确保麻醉致死效果和人员安全[6]。

2.2 药物注射

药物注射是通过将药物注射到动物体内, 使动物致死。这种方法适用于较大的动物, 如兔、猫、犬等。

氯化钾适用于家兔和犬, 可采用静脉注射的方式。高浓度的钾可使心肌失去收缩能力, 心脏急性扩张, 致心脏迟缓性停跳而死亡[7]。实验证明注射氯化钾后细胞损伤严重, 线粒体肿胀很明显, 嵴模糊不清, 细胞核明显异常[8]。家兔和犬的致死量分别为10%氯化钾5~10、20~30 m L。

巴比妥类麻醉剂适用于兔、豚鼠, 用药量为深麻醉剂量的25倍左右。一般用量为90 mg/kg, 约15 min内死亡。该类药物能抑制丙酸氧化酶系统, 从而抑制中枢神经系统 (特别对大脑皮质及下丘脑) , 使反射机能逐渐消失[9]。也有人称用麻醉方法处死实验动物不应称为安乐死, 这是按照设定程序“必须将其适时处死”, 选用了无痛方法[10], 在应用上还存在争议。

DDT适用于豚鼠、兔、犬。豚鼠致死量为3.0~4.4 mg/kg, 家兔为0.5~1.0 mg/kg, 犬为0.3~0.42 mg/kg[11]。豚鼠皮下注射, 家兔和犬静脉注射。其机理可能与DDT损伤细胞修复和免疫抑制有关, 并能诱导肝微粒体酶系统, 使某些酶发生抑制, 而且本身经肝代谢而表现肝毒性作用[12]。

3 特殊实验动物的处死

处死昆虫一般用烫死法, 快速, 可避免昆虫挣扎或人的抓捏而造成虫体的损伤。很多直翅目昆虫的腿可能会因剧烈的抽搐而脱落, 可在制作昆虫标本时用万能胶粘上去, 不会影响虫体的完整和美观[13]。处死青蛙时可用酒精麻醉, 用镊子夹取一浸透95%酒精的棉球, 塞入青蛙口腔中, 三四分钟后, 青蛙便瘫倒不动, 效果极佳。也可用香烟麻醉, 向装有青蛙的瓶里吹几口烟, 盖紧瓶盖, 几分钟后, 青蛙瘫倒不动[14]。狐的处死方法为将人用氯化琥珀酞胆碱针剂1支 (2 L, 内含100 mg) 稀释100倍, 注入其心脏中, 狐在10~60 s内昏迷, 4~7 min内死亡, 昏迷后即可取皮[15]。

随着时代的进步与发展, 科学工作者在从事生命科学研究时, 对待实验动物, 越来越考虑到动物福利的问题。动物福利是社会进步和经济发展到一定阶段的必然产物, 体现了人与动物协调发展的趋势。应爱护和善待实验动物, 树立人性化的实验精神。这样不仅能保证实验动物的质量, 确保实验结果的可靠性和准确性, 还能培养良好的临床心理, 实现人性化的实验与教学。

摘要：阐述了实验动物的几种常用的处死方法, 包括物理方法致死、化学药物致死、特殊实验动物的处死等, 并从动物福利角度讨论了这些方法的利弊, 以为实验动物的使用提供参考。

动物的自我保护方法 第5篇

为了保护自己，躲避险情，捕获猎物，动物们必须具备较强的应变能力。

1、壁虎逃生的绝技就是扔掉尾巴，在它遇到强敌或被敌害咬住时，挣扎一番后就自动将尾巴脱落，离开身体的尾巴还不停地抖动，以达到迷惑敌人、趁机脱身的目的，而过些时候，壁虎的尾巴又能完好如初。这在生物学上叫“残体自卫”，不少动物都具有这种本领

比如当蚂蚱被捉住时，为了逃命，它会断掉大腿，只留一条腿跳着逃跑；海参的逃生术则更奇特：当有敌人侵害时，警觉的海参会迅速地把自己体内的五脏六腑一古脑喷射出来，让对方美餐一顿，而自身则借助反冲力逃脱。经过50天左右的自身修复，海参又会重新生长出一副新的内脏。

2、枪乌贼和乌贼遇到敌害时，其自卫方式是向进犯者发放一团团液态火焰，其形状、大小往往与它们的自身体型相似，误导追踪者不去追捕被追捕者自身，而是进攻其替身──发光的火团，从而使追踪者受骗上当。与此同时，枪乌贼和乌贼便趁机逃生。这种自卫方式与用喷射墨汁掩护退却而御敌的道理十分相似；有的发光动物当被置于捕食者“虎口”的一刹那间，突然发出闪光，令捕食者目瞪口呆，从而趁机逃走；有的发光动物甚至被切成两段时，其尾段继续发光，头段却立即将灯熄灭，变成黑色；捕食者吞食了尾段，头段则在趁机逃走之后，“再生”出尾段。

3、乌龟，是我们非常熟悉的一种动物，它长有非常坚硬的背甲和腹甲。当它感到外界的危险时，便把头和四肢缩进甲壳里。全部被坚固的甲壳包裹起来，好似一辆披甲的坦克，把自己严严实实的保护住。你就是用再大的力气，都无法掰开它的甲壳。就是兽中之王的老虎，把它咬在口里，也奈何不了它半点。

4、螃蟹被强敌抓住脚，会立即断去被抓的脚，乘机逃生，这是“丢卒保车”战术。

5、金龟子在树上，遇到鸟吃时，纷纷从树上落地，脚朝天装死，鸟不吃死虫，金龟子死里逃生。

6、甲虫遇到敌害，会哒哒地连续发射“化学炮弹”，并伴有轻烟和怪味，敌害不敢再追。

7、竹节虫细长的身体如同竹枝，两者颜色也难分你我。

8、色彩斑斓的枯叶蝶，遇到敌害，两翅合拢，成为一片枯黄的树叶，落在地上混杂在树叶中。

9、在树上的尺蠖，见到雀鸟飞临，马上挺直身体，僵持不动，好像一根小树枝。

10、有一种蟾蜍，遇到危险受惊时，会将口张大，四肢伸展，一动不动，像死去一样。

11、同在一株杨柳树上爬行的螳螂，在枝叶上的呈绿色，而在枝干上的呈褐色。

12、在绿草丛中的青蛙，穿的是绿外衣，栖居在泥、石和枯草堆里的蟾蜍，体色是土褐色。

13、海参栖息在海底，体色是灰褐色，它匍匐不动时，好像海底里的一块石头。

14、石斑鱼和比目鱼能在不同背景下，连续变换7～8种体色。石斑鱼能够随着环境色泽的变化，不断变换颜色。能很快从黑色变成白色，黄色变成绯色，红色变成淡绿色或浓褐色。

15、比目鱼的色泽也是很适应海底生活的，有的就同周围的泥沙和石砾很相似，只要它不游动，几乎不会觉察到。

16、毛虫是蝴蝶或蛾的幼虫，它们是动物界中的弱者，既没有能飞翔的翅膀，也没有能快跑的脚，为了保护自己，它们有的具有保护色，身体和周围环境的颜色一样，可以逃避敌人的捕杀；有的身上有毒液和臭味，使其他动物不敢接近。

17、黄鼠狼遇到危险，就发出强烈的臭味。蜥蜴被袭击，就丢下自己的尾巴逃走；

18、斑马受到攻击时，大家紧紧地围成一个圆圈来保护自己。

19、长颈鹿的脚很长，跑得很快，而且它的脚上长着铁锤般的蹄，足足有30厘米长，遇到猛兽，长颈鹿群起用蹄猛踢。

20、我国长江以南各省区生活着一种豪猪。这种小动物身上披着钢针那样锋利无比的棘刺，所以抵御敌害的本领非常高明。它遇到敌害来袭，将身体后部的棘毛竖起，相互摩擦，发出“唰唰”的声音，向敌示威。如果敌害继续进攻，它就倒转身子，后脚一蹬，以背面和尾部朝着敌害冲。敌害若被刺中，针毛就留在肌肉里，疼痛难忍。所以狼、狐等都知道豪猪的厉害，都不敢招惹它。

动物/方法 第6篇

关键词：公交枢纽枢纽规划客流组织

0引言

随着大型交通枢纽的大规模建设，如何利用科学的理论和方法协调交通枢纽与枢纽外部道路交通流、合理组织枢纽内部的交通流，从而保证其内部的车流、人流协调畅通，方便乘客换乘，提高交通枢纽的整体运行效率，是当前城市规划研究的重点。

1枢纽规划的基本原则及方法

规划建设城市交通枢纽首先要考虑换乘协调，体现“以人为本”的原则，即保证人流在枢纽内换乘的安全性、连续性、便捷性、舒适性和客运设备的适应性。在交通枢纽内，各种接驳方式都有其存在的合理性，要组织好换乘交通，保证各交通系统间的衔接协调，必须遵循以下原则：①换乘过程的连续性；②客运设备的适应性；③客流过程的通畅性i④换乘的舒适性和安全性。

枢纽规划采用的方法主要应包括：①交通分析为主导；②定性分析和定量分析相结合；③静态和动态相结合；④枢纽规划与远景方案相结合。

2动物园公交枢纽规划中的问题

动物园公交枢纽位于北京市西直门外大街南侧，主要包括十条线路的公交始发站台，公交和地铁换乘，地下汽车库和地下自行车库，上部空间的商业开发以及部分回迁单位等。

枢纽所处地理位置四通八达，附近集中存在较多的客流吸引与集散点，处于重要连接通道处，具备设置公交枢纽的客流条件。但是由于西直门外大街交通负荷较重，而西直门外南街为单车道道路，客观而言，在这里集中设置始发站与中转站难度较大。

枢纽规划中存在的主要问题有：①站台设计的不足；②换乘距离大；③导向系统有待完善。

此外，动物园公交枢纽的建设工程方面也存在着问题，譬如没有下水道，给清洗车辆带来了诸多不便。

3动物园公交枢纽的改进建议

针对以上提出的问题，结合周边商业环境从枢纽结构、外部流线设计、内部车流组织分析以及疏解能力匹配方面出发做出相应的改进。

3.1扩大公交停靠站的吞吐量延长现有公交停靠站的长度，达到80米－100左右，并施划公交停靠站标志线，禁止行人、其他车辆停靠影响公交车进出站。公交车停靠站区域内，公交车可以同时开门上下乘客，以减少等候时间。

在停靠车道方面，可以考虑设计为三车道，外侧两车道用于车辆停靠乘降，中间车道用于车辆停放或错车，安排两条线路车在一个站台上候车，以便充分利用站台空间。

3.2改造人行道针对单禁行线偏少、偏窄的情况，为了满足公交枢纽10条通道的通行需求，应全面改动动物园公交枢纽周边地区交通行驶规则，重新施划人行横道、设置单禁行线，具体措施有：

将原有的三至五米宽人行横道扩至八至九米。

在西外南街等主要通道路中心增设护栏，防止行人横穿马路。

枢纽东西两侧通道及西外南街采取单禁行措施。

调整西外大街辅路的出租车停车位，以保证西外大街辅路畅通。

将枢纽地下广场设为主要停车场。

3.3加强枢纽内部交通方式及联络衔接作为换乘和客流疏解的载体，枢纽必须针对涉及的交通方式做好联络衔接的设计。目前的动物园枢纽急需改进周边人行道、机动车道等疏解衔接的硬件设施，同时配合采取有效的软件措施(如：交通协管等)；枢纽东西两侧通道及西直门外南街宜采取单行或分时段通行措施。同时，充分结合周边商业建筑环境和行人需求，拓宽人行道，延伸扩展多方向的地下连接通道，可以使得由枢纽产生的步行人流尽可能直接進入周边建筑，避免乘客下车后直接在枢纽站台层平面穿行等行为。

3.4健全信息以及配套设施的服务在动物园公交枢纽改进中，可以在停车场、换乘通道、换乘站台等地方设置电子信息设备，给人们提供更多的出行信息。另外还要即时更新已经改变的公交线路信息，防止以前的导向标识对乘客产生误导，只有这样才能真正才能实现信息资源的高度共享和管理的统一，以科学系统的管理，促进枢纽系统功能的发挥。

4结束语

动物园公交枢纽虽然建设的出发点很好，又引进了公交线路站点电子调度系统等先进技术，有望向智能化方向发展，但在实际运营中却没有发挥应有的作用。反而因局边市场过多及自身具备商业功能，没有体现公交优先。

动物免疫副反应及应对方法 第7篇

一、免疫副反应的分类

在临床上, 免疫副反应分为以下两类。

㈠一般反应动物按疫苗说明书实施免疫注射后, 在48 h内注射部位出现红肿、热、痛等炎症反应, 注射一侧肢体跛行, 个别伴有体温升高、呼吸加快、恶心呕吐、减食或短暂停食、泌乳减少等现象为一般反应。一般反应是由疫苗本身固有特性引起的, 一般不会对动物生长、繁殖或使役等造成影响。一般反应不需进行处理, 持续1 d可自行消退, 恢复健康。

㈡异常反应极少数动物在接种疫苗后发生的反应与疫苗接种有一定关系, 程度比较严重的需要进行治疗的综合征。大体可以分为非特异性过敏反应、精神性反应、变态反应及其他原因不明的反应等。如果动物免疫后出现站立不安、卧地不起、呼吸困难、可视粘膜充血或水肿、肌肉震颤、瘤胃臌气、口角出现白沫、倒地抽搐、鼻腔出血、孕畜流产等为严重副反应, 这类临床症状比较严重的反应, 应及时发现并进行对症治疗和抢救, 否则会造成严重后果。

二、免疫副反应的救治

出现免疫副反应后, 应根据具体情况迅速做出处理决定。

㈠一般反应慢性型较多, 该阶段不宜使用抗生素或退热药物, 只需要供给复方多维, 自由饮水, 同时饲喂优质饲草料, 即可缓解反应症状并逐渐恢复健康。

㈡严重反应呈最急性经过, 疫苗注射后立即出现较为严重的异常反应, 如出现站立不安、卧地不起、呼吸困难、抽搐等现象, 可立即皮下注射0.1%盐酸肾上腺素1 m L进行救治, 然后观察动物病情缓解程度, 如果需要可在20 min后重复注射一次;也可肌肉注射盐酸异丙嗪100mg, 或肌肉注射地塞米松磷酸钠10mg, 但地塞米松不能用于怀孕动物。

㈢休克家畜的救治除按照上述严重反应动物的救治方法实施救治外, 还可采取以下措施。一是迅速针刺耳尖、尾根、蹄头、大脉穴等部位, 放血少许。二是迅速输液建立静脉通道, 将去甲肾上腺素2 mg, 加入10%葡萄糖注射液500 m L中静滴。待动物苏醒、脉律逐渐恢复后, 撤去该组药物, 换成5%葡萄糖注射液500 m L, 加入1 g维生素C、500 mg维生素B6静脉滴注, 之后再静注5%碳酸氢钠液100 m L。

三、预防疫苗副反应的方法

动物健康养殖模式技术原理与方法 第8篇

健康的动物, 应该有正常生理指标与生态行为;作为群体有极个别的动物发生疾病或死亡, 但不应出现流行病;动物的免疫功能及其抗逆能力强;动物体不应残留对人有害的药物、添加剂及代谢产物。为此, 其技术要求与原理为: (1) 培育或使用健康种畜禽, 避免使用携带特定病原体的种畜禽; (2) 尽可能切断病原的传播途径, 降低环境中的病原体密度; (3) 改善养殖环境, 从动物体表及养殖环境内外两个方面控制和维护; (4) 建设符合动物生长环境需求的动物养殖场, 包括选址、笼舍编排与安装、水料槽设计、排粪与排泄途径及处理措施等; (5) 使用优质、全价饲料, 选择高效、低毒或无毒药品, 制定科学、合理的用药方案及免疫程序。

动物细胞大规模培养方法分析 第9篇

1.1 细胞对基质的依赖性

根据细胞的生长特性和对基质的依赖性, 可分为贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。

贴壁依赖性细胞的生长需要适量带电荷的固体或半固体支持表面, 细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子, 使细胞依附在支持物表面、才能生长和增殖, 大多数动物细胞都属于此类, 包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞。接触抑制性是当细胞长满整个培养表面后, 就不再生长了, 但仍然能存活一段时间。

非贴壁依赖性细胞的生长不依赖于固体支持物表面, 可在培养液中悬浮生长, 所以也被称为悬浮细胞。血液、淋巴细胞、肿瘤细胞 (包括杂交瘤细胞) 和某些转化细胞属于此类。有些细胞对固体支持物的依赖性不严格, 可以贴壁生长, 但在一定条件下, 也可以悬浮生长。

1.2 生长基质

贴附细胞生长需要一个支持介质, 培养器皿表面的材质不适合, 因此人们采用在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质, 帮助细胞的贴附和生长。把改变生长表面特性, 促进细胞贴附的物质称为生长基质。生长基质一般为胞外基质成分, 主要介绍多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等。

多聚赖氨酸是合成的赖氨酸多聚体, 分子量为7-30ku的多聚赖氨酸可作为细胞生长基质。纤维连接蛋白是细胞表面与血清浆中的大蛋白分子, 具有维持细胞结构、促进贴附功能。

层黏蛋白为胞外基质中分子量900 ku的非胶原性糖蛋白, 影响细胞的贴附和运动, 调节细胞生长和分化。韧黏素是六聚体糖蛋白, 分子量190-230ku, 具有促进肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞贴附的功能。层黏蛋白是多聚体糖蛋白, 分子量65~75ku, 具有促进细胞、血小板的黏附、激活补体和纤溶酶原活性等功能。

2 动物细胞大规模培养方法

根据动物细胞的生长特点, 采用悬浮培养、贴壁培养、固定化培养3种主要方法进行大规模培养。

2.1 单层贴壁培养

单层贴壁培养是指把细胞贴附于一定的固体支持表面上进行的单层培养方法。由于大多数动物细胞具有贴壁依赖性, 贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。接种后, 细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面, 然后进行生长、分裂繁殖, 很快进入对数期。一般数天就长满整个表面, 形成致密的单层细胞。最后, 贴壁培养的细胞会形成两种形态, 成纤维样型细胞和上皮样型细胞。

单层贴壁培养必须根据细胞数目和培养液的体积, 增加基质表面积。实验室研究培养常用多孔平板、培养瓶, 进行静止培养。动物细胞大规模培养常用容器主要有转瓶或转管、玻璃珠、微载体和中空纤维等。

细胞黏附在固体表面主要力是静电引力和范德华力, 因为动物细胞在生理状态下带负电, 贴壁培养的固体表面要求具有正电荷和高度表面活性。适宜的电荷密度氨黏附和贴壁的关键, 电荷密度低, 不能有效黏附, 电荷密度高则会对细胞产生毒性。

转瓶是早期培养所采用, 现在仍用于疫苗等生产。转瓶结构简单, 投资少, 经济实用, 可做成支架, 大量培养, 收获细胞或培养液方便, 重复性好, 容易放大。非贴壁细胞处于悬浮状态, 而贴壁细胞则在瓶内壁上贴附生长形成单层细胞。主要优点是比表面积增加, 处于衡态转动, 增加气体交换。但转瓶的劳动强度大, 占用空间体积大, 产量低, 不易控制和监测培养环境变化。转瓶的空间变化较大, 在500~1800cm2之间, 塑料瓶一般一次性使用, 而玻璃瓶可重复使用。有时细胞在贴壁之前会发生集聚, 可将转速进一步降低到2-5r/h。选择适宜的血清或表面包被聚赖氨酸等, 能克服集聚现象。贴壁培养的优点是容易更换培养液, 在灌注培养时, 能达到高细胞密度;有利于产物的分泌表达, 可改变培养液与细胞的比例。其缺点是操作较繁杂, 细胞生长的检测受到一定限制, 培养条件难以均一, 传质和传氧差, 放大培养是瓶颈。

2.2 悬浮培养

悬浮培养是指细胞在反应器内游离悬浮生长的培养过程, 主要对于非贴壁依赖性细胞, 如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展而来的, 经常借鉴发酵理论和经验, 但有自身的特点, 由于动物细胞没有细胞壁, 不能耐受剧烈的搅拌和通气剪切, 对环境适应性差。在培养过程中与微生物发酵培养不同, 在悬浮培养中要注意发挥动物细胞的特性。常用的反应器有通气式搅拌混合气升式生物反应器。方法的优点是:操作简单, 培养条件相对均一, 传质和传氧较好, 容易放大培养。缺点是:细胞体积小, 密度低, 培养病毒易失去标记而降低免疫能力。

2.3 固定化培养

固定化培养是将动物细胞包埋在微载体内或胶囊内, 即细胞固定化后, 进行悬浮培养。适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞的培养。具有细胞密度高、提高了抗剪切力和污染能力等优点, 是生产首选方法。细胞固定化是在酶固定化基础上发展起来的, 固定化的方法有多种, 对于特定情况, 必须合理选择。

吸附法是通过物理吸附使细胞贴附在固体载体表面的一种固定化方法, 如微载体培养和中空纤维培养等。虽然吸附法的操作过程简单, 但由于相互作用弱, 细胞容易从戴体上脱落。

包埋法是将细胞包埋在载体内部的一种固定化方法, 分为网格型和微囊型两种。网格型的载体为高分子凝胶细网格, 而微囊型的载体为高分子半透膜, 直径为几至几百微米, 比网格载体小得多。包埋细胞的高分子材料有人工合成的聚合物、琼脂糖凝胶和血纤维蛋白等。包埋细胞的材料可以是人工合成的高分子聚合物、多糖和蛋白质类, 最常使用的是海藻酸盐包埋非贴壁细胞和胶原包埋贴壁细胞。包埋的机理是通过物理作用而实现的, 如1%~2.5%琼脂糖在高温加热下融化, 低于37~45℃凝固, 与细胞混合, 分散在石蜡油中, 降低至10℃, 得到0.1~0.3mm微球。海藻酸钠为液体, 与细胞混合后, 滴到氯化钙溶液中, 因钙离子的介入凝固, 形成1mm微球。凝血酶的加入可使纤维蛋白对细胞进行包埋。

结束语

一项新的细胞培养技术的发展成熟需要较长的时间。大规模培养动物细胞是一项复杂而且经验性很强的工作。严格控制细胞培养的环境, 防止污染, 是进行大规模培养的前提。通过减少培养基中各种不利因素, 配置细胞生长的专一性无血清培养基, 以及选择条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器和最适合细胞生长的微载体, 可提高细胞的活性和表达水平。

参考文献

[1]李连奋.用无血清培养液生长的哺乳动物细胞产生干扰素[J].国际生物制品学杂志, 1980, 1.

提取动物组织DNA的方法比较 第10篇

关键词：DNA提取试剂盒,DNA,改进

1 引言

DNA是构成基因最主要的部分, 在某个生物群体里面往往会共同具备着两个或者多个不持续的基因型、变异型以及等位基因等被叫做基因的多态性, 其有着非常多的种类, 例如:DNA序列的多态性、DNA长度的多态性以及单核苷酸的多态性等。

2 试剂盒提取DNA简介

2.1 基因组DNA提取的原则

确保核酸一级架构的整体性 (由于所有的遗传信息都储藏于核酸一级架构里面, 因此较为全面的一级架构是确保核酸功能与结构分析的基石) 。

排除其他类型的分子 (例如:多糖、蛋白质以及脂类等) 所造成的污染, 使得接下来的实验能够成功地完成。

2.2 动物基因组DNA提取的方法

2.2.1 损伤性取样材料DNA的提取

2.2.1. 1 乙醇保存的动物标本基因组DNA提取方式

用乙醇保存动物标本是最为常见、效果最好的方式。因为大部分的DNA酶必须具备某个二价阳离子当做辅助的因子 (例如:Ca2+、Mg2+等) , 在70%的乙醇里面倒入合适数量的EDTA, EDTA能够在较短的时间内调控住DNA酶的活性, 从而避免DNA所发生的降解。莫邦辉等人在酒精标本DNA模板迅速提取里面并未运用蛋白酶K, 只有在缓冲液 (0.5%SDS, 10 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/LEDTA, p H 8.0) , 37℃温浴1h之后消化相关的材料, 同样得到了比较好的扩增效果, 然而这样的方式只能够运用片段比较短的PCR扩增中去。通常而言, 使用酒精标本提取DNA的方式均会加入一定量的蛋白酶K, 同时56℃的温度之下消化8~14 h, 以使得组织里面所含有的蛋白质全部消化。

2.2.1. 2 甲醛溶液保存的动物基因组DNA提取方式

在之前所进行的探索里面针对福尔马林标本的DNA提取方式做出了非常大的改善, 在标本的预先处理过程中, 主要有临界点干燥与梯度酒精浸泡这两种不同的形式。然而梯度酒精浸泡的方式造成乙醇和标本里面的甲醛发生反应形成缩醛与半缩醛等, 接着经过酒精变换被过滤出去。徐来祥等人为了避免标本吸入较多的水分而导致细胞被损害, 运用PBS溶液融合乙醇溶液对样品进行浸泡、洗脱, 同样获得了比较好的成果[1]。在针对DNA进行提取的环节里面, 周美玉与杜世章等人均均采取了抗氧化剂二硫苏糖醇 (DTT) , DTT可以非常好的避免甲醛氧化成甲酸, 然而甲酸同样会导致DNA出现降解, 所以抗氧化剂的通入对于DNA的提取有着非常重要的意义。

2.2.2 非损伤性取样材料DNA的提取

2.2.2. 1 从毛发里面提取DNA的方式

从毛发里面获得DNA, 与其有关的报道非常之多。余舰等人在蛋白酶K的作用之下, 运用酚-氯仿反复抽提的形式便已由毛发里面获得极少数的DNA。徐艳春与伍新尧等人采取Chelex-100处理毛发提取DNA, 然而运用这样的方式对于毛囊细胞的裂解并不充分, 所遗留的消化液对于之后所进行的PCR实验有非常的负面影响[2]。之后, 李军林等人以普通的酚-氯仿提取方式为基础进行改善, 以p H 8.8Tris-HCl、Mg Cl2溶液与蛋白酶K作为裂解液进行消化, 得到了品质比较高的DNA[3]。

2.2.2. 2 从血液样本里面提取DNA的方式

从血液里面取得DNA最为重要的便是清除掉里面所含有的蛋白质与红细胞等其他物质。通常所采取的方式为:首先获得淋巴细胞, 接着运用蛋白酶K、SDS进行消化, 接着采取酚氯仿抽提进行提取、使用乙醇进行沉淀。然而这样的方式比较繁琐, 同时所使用的试剂对于人们的健康有着较大的影响, 因此有大量的专业人士对其作出了改善。赵权等人运用Triton X-100来对白细胞与红细胞进行破碎, 直接获得白细胞核, 接着运用NaCl O4, SDS分解聚核蛋白, 然而并未运用蛋白酶K, 最终运用PCl (酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1) 进行抽提, 使用乙醇进行最后的沉淀。这样的方式能够更加好的去除红细胞[4]。

3 试剂盒提取DNA的步骤

3.1 开展试验之前所需要注意的几点

首次运用之前需要根据试剂瓶外所贴的标签指示首先在漂洗液PW与缓冲液GD里面倒入适量的无水乙醇。所选取的样品需要防止重复此能够的冷冻与溶化, 不然会造成所提取出的DNA片段相对较小, 提取的数量减低。如果缓冲液GB或者GA里面有沉淀物, 能够将其置入56℃的水浴里面再次溶解, 摇匀之后继续运用。全部的离心过程都需要运用台式的离心机, 在室温背景下进行离心。

3.2 具体的操作步骤

3.2.1 处理相关的材料

3.2.1.1如果所提取的材料是血液, 能够直接运用200μL冷冻、新鲜或者是融入各式各样抗凝剂的血液, 如果没有200μL能够加入适量的缓冲液GA进行补充。

3.2.1.2若所需处理的血样是鸟类、禽类以及两栖类等其他更加低级生物的抗凝血液, 他们的红细胞是有核细胞, 所以处理量在5~20μL的范畴以内, 能够加入缓冲液GA达到200μL之后实施以下的裂解过程。

3.2.1.3由贴壁培养所获得细胞首先需要处理成细胞悬液, 10 000 rpm (-11 200×g) 离心1 min, 去处上清, 倒入200μL缓冲液GA, 不停的振荡直到完全的悬浮。

3.2.1.4动物组织 (脾组织的用量需要低于10 mg) 首先需要打碎成细胞悬液, 接着放入10 000 rpm (-11 200×g) 离心1 min, 去处上清, 倒入200μL缓冲液GA, 不停的振荡直到完全的悬浮。

3.2.2 倒入20μL的蛋白酶K溶液, 摇晃均匀

3.2.2.1在提取血液基因组的时候, 仅仅需要加入蛋白酶K摇晃均匀, 便能够进入一下道程序。

3.2.2.2在提取细胞基因组的时候, 仅仅需要加入蛋白酶K摇晃均匀, 便能够进入一下道程序。

3.2.2.3在提取组织基因组的时候, 加入蛋白酶K摇晃均匀之后, 进行56℃水浴, 直到所有的组织全部溶解, 简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠, 再进入下一道程序。

3.2.3倒入200μL的缓冲液GB, 全面颠倒使其均匀, 在70℃中搁置10 min, 溶液变得非常的清亮, 简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠。

3.2.4倒入200μL的无水乙醇, 全面振荡混匀15 s, 这个时候或许会形成絮状的沉淀物, 简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠。

3.2.5将以上所获得的溶液与絮状的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面, 接着再将吸附柱置入收集管里面, 12 000 rpm (~13 400×g) 离心30 s, 过滤掉废液, 把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.6往吸附柱CB3里面倒入500μL的缓冲液GD (在运用之前首先需要检验是不是已经倒入了无水乙醇) , 12 000 rpm (~13 400×g) 离心30 s, 过滤掉废液, 把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.7往吸附柱CB3里面倒入600μL的漂洗液PW (在运用之前首先需要检验是不是已经倒入了无水乙醇) , 12 000 rpm (~13 400×g) 离心30 s, 过滤掉废液, 把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.8重复执行步骤7。

3.2.9把吸附柱CB3置入收集管里面, 12 000 rpm (~13 400×g) 离心2 min, 过滤废液。把吸附柱CB3放入室温里面几分钟的时间, 以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液。

3.2.10把吸附柱CB3转移到其他未使用过的离心管里面, 接着往吸附膜的中间区域悬空滴入50~200μL的洗脱缓冲液TE, 室温摆放2~5 min, 12 000 rpm (~13 400×g) 离心2 min, 将所有的溶液采集到离心管里面。

4 两种动物组织DNA提取方法的比较

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.1. 1 试验样本

此次试验所运用的猪肉组织都源自于在售的新鲜动物, 在完成样品收集之后储藏在-80℃的冰箱里面。

4.1.1. 2 试验试剂以及相关的设备

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 (天根生化科技有限公司) ;漩涡混匀器 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ;微型离心机 (杭州米欧仪器有限公司) ;FA2004N电子天平 (上海精密科学仪器有限公司) ;SP-1900UV型紫外可见分光光度计 (上海光谱仪器有限公司) 。

4.1.2 实验方法

4.1.2. 1 酚-氯仿抽提

一是取50 mg猪肉组织剪碎之后置入1.5 m L的离心管里面, 倒入400μL的裂解液、200μL的l SDS以及20μL的蛋白酶K, 经过56℃的水浴消化之后过夜处理;二是往里面加入相同体积的饱和酚, 充分摇晃5~6 min, 静静的搁置5 min, 12 000r/min离心10 min;三是细致的提取上清部门转移到全新的1.5 m L的离心管里面, 融入相同体积的体积比是25饱和酚∶24氯仿∶1异戊醇, 充分摇晃至均匀, 静静的搁置4~5 min, 12 000 r/min离心10 min;四是细致的提取上清部门转移到全新的1.5 m L的离心管里面, 融入相同体积的体积比是24氯仿∶1异戊醇, 充分摇晃至均匀, 静静的搁置4~5 min, 12 000 r/min离心10 min;五是细致的提取上清部门转移到全新的1.5m L的离心管里面, 倒入2倍的无水乙醇, (无水乙醇需要提前摆放于-20℃的环境中冷冻5~10 min) , 12 000r/min离心10 min;六是排除无水乙醇, 倒入1 m L的75%乙醇, 反复吹打, 12 000 r/min离心10 min, 此步骤需要重复1次;七是通风、干燥5~10 min, 倒入50μL的纯水。

4.1.2. 2 试剂盒提取

一是取50 mg猪肉组织剪碎之后置入1.5 m L的离心管里面, 融入200μL的缓冲液GA, 倒入20μL蛋白酶K摇晃均匀之后, 进行56℃水浴, 直到所有的组织全部溶解;二是倒入200μL的缓冲液GB, 全面颠倒使其均匀, 在70℃中搁置10 min, 溶液变得非常的清亮, 简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠;三是倒入200μL的无水乙醇, 全面振荡混匀15 s, 这个时候或许会形成絮状的沉淀物, 简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠;四是将以上所获得的溶液与絮状的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面, 接着再将吸附柱置入收集管里面, 12 000 rpm (~13400×g) 离心30 s, 过滤掉废液, 把吸附柱CB3置入收集管里面;五是往吸附柱CB3里面倒入500μL的缓冲液GD (在运用之前首先需要检验是不是已经倒入了无水乙醇) , 12 000 rpm (~13 400×g) 离心30s, 过滤掉废液, 把吸附柱CB3置入收集管里面;六是往吸附柱CB3里面倒入600μL的漂洗液PW (在运用之前首先需要检验是不是已经倒入了无水乙醇) , 12 000rpm (~13 400×g) 离心30 s, 过滤掉废液, 把吸附柱CB3置入收集管里面, 重复再做一次;七是把吸附柱CB3置入收集管里面, 12 000 rpm (~13400×g) 离心2 min, 过滤废液。把吸附柱CB3放入室温里面几分钟的时间, 以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液;八是把吸附柱CB3转移到其他未使用过的离心管里面, 接着往吸附膜的中间区域悬空滴入150μL的洗脱缓冲液TE, 室温摆放2~5 min, 12 000rpm (~13 400×g) 离心2 min, 将所有的溶液采集到离心管里面。能够直接开展PCR反应。

4.1.3 DNA浓度与纯度的检测

运用核酸蛋白定量仪检测DNA样品的OD260、OD280吸光度具体数值同时测定DNA的浓度与纯度 (如表1所示) 。

4.1.4 PCR扩增实验

猪cytb基因引物所设计的序列为:上游5′CAC-GACCAATGACATGAAAAATC3′, 下游5′GCTGC-GAGGGCGGTAAT3′。PCR的反应过程如下:PCR反应总体系是50μL, PCR反应组成成分主要有以下几种:其间10×Buffer 5μL, 10 mmol/Ld NTP 4μL, 12.5μmol/L上下游的引物均为1.5μL, Ex Tag DNA聚合酶2U, 倒入超纯水直到50μL。PCR所必备的反应条件如下:94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 一共有35个重复过程, 最终72℃延伸10 min, 温度降调4℃储藏。御用酚-氯仿抽提的方式所获得的DNA置入4℃的温度中储藏3~5 d之后, 进行PCR扩增。采取试剂盒所获得的DNA能够直接进行PCR扩增。

4.1.5 琼脂糖电泳检测

4.1.5. 1 基因组DNA的检测

运用1%的琼脂糖电泳检查两种方式所提取出的DNA, 见图1。

(M:marker (1kb) ;1、2为酚-氯仿抽提的猪的基因组DNA;3、4、5为试剂盒所提取出的DNA)

4.1.5. 2 PCR扩增的检测

运用1%的琼脂糖电泳检查扩增的结果, 见图2。

4.2 结果

4.2.1 DNA纯度、浓度的测定结果

从以上两种方式所测得的DNA纯度层面来看, 酚-氯仿抽提是1.58±0.18, 试剂盒提取法是1.74±0.15, 两者之间的差距非常明显 (P<0.05) , 试剂盒所提取出的DNA纯度更加接近于1.8。从DNA的浓度层面来看:酚-氯仿抽提法时120±25μg/m L, 试剂盒提取法是112±11μg/m L, 两者之间没有太大的差距。

(1、2为酚-氯仿抽提的基因组DNA作为模板, cytb基因经过PCR扩增之后的效果;3、4、5为试剂盒所提取出的DNA作为模板, cytb基因经过PCR扩增之后的效果。)

4.2.2 DNA琼脂糖电泳结果

琼脂电泳检测DNA带型相对比较聚集、整齐 (如图1所示) , 表明以上两种方式所提取获得的基因组DNA都是非常全面的、无降解的。

4.2.3 PCR扩增后结果

图2所代表的是cytb基因经过PCR扩增之后的效果, 此两种不同的方式所提取得到的基因组DNA均能够当作PCR扩增所需的模板, 同时均有着非常好的扩增成效。

5 结论

使用试剂盒进行提取非常的迅速、便利, 相同样品的操作与比酚-氯仿抽提相比少用了非常少的时间。使用试剂盒进行提取防止运用含有毒性的氯仿与苯酚等其他相关的试剂, 避免了具体操作环节里面对于工作人员自身的健康造成伤害。使用试剂盒所提出的DNA产量相对较高, 纯度较好, 能够直接运用于PCR与其他的酶切试验中去。

因为试剂盒提取的方式运用了离心柱, 防止了多次重复性的换管, 节约了大量的资源, 离心的时间较少, 离心只需要在室温下就能够完成, 避免对离心机造成损害, 同时采取试剂盒进行提取是绿色无污染的。试剂盒提取具备较强的重复性、平稳的结果以及较高的成功率等优点, 减少了提取所需要的费用, 比较适合用于大量DNA的提取。

参考文献

[1]徐来祥, 张知彬, 宋铭晶, 等.福尔马林保存的动物标本基因组DNA的提取方法[J].动物学报 (Current Zoology) , 2002, 48 (2) :264-269.

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动物/方法 第11篇

关键词：彗星实验（单细胞凝胶电泳）；DNA损伤；HepG2细胞；电泳图像质量

中图分类号： Q291；X503.22文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0041-02

收稿日期：2013-10-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：31100379）；江苏省高校自然科学基金（编号：11KJB610001）；中国博士后科学基金（编号：20100470062）；江苏省博士后基金（编号：1001024C）。

作者简介：王楠（1984—），男，山西大同人，硕士，从事环境毒理学研究。E-mail：nan.wuhan.2006@163.com

通信作者：杜道林，博士，教授，从事生态学研究。E-mail：ddl@ujs.edu.cn。DNA存储着生物体赖以生存繁衍的遗传信息，细胞DNA损伤是细胞生物学领域的研究热点之一。当细胞受到损伤时，其DNA双链会发生断裂，断裂过程中会发生特异性级联生化反应，依赖Ca2+、Mg2+的核酸内切酶被激活，优先作用于连接DNA的核小体间区域，将DNA链切割成180～200 bp或其倍数的片段，在彗星电泳中发生断裂的DNA迁移速度与迁移距离均数倍于正常细胞的核DNA，呈现脱离细胞核的“彗星”状，据此可将DNA受损细胞与正常细胞区分开[1]。彗星试验（comet assay）也被称作单细胞凝胶电泳（SCGE），是1种在单细胞水平上检测真核细胞DNA损伤的方法。通过测定细胞电泳时彗星出现率、彗尾DNA含量百分比、彗尾长度等指标，即可对细胞药物引起细胞DNA损伤进行全面评价[2]。1993年，Olive等首次将彗星试验应用于细胞凋亡检测[3]。真核细胞的DNA分子量较大，DNA呈负超螺旋结构附着在核基质中，采用琼脂糖凝胶将细胞包埋在细胞裂解液下，细胞膜、核膜等被破坏，细胞内的RNA、蛋白质等其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，核DNA仍然保持缠绕状，附着在剩余的核骨架上，并留在原位。在强碱（pH值为13）电泳液中电泳时，若细胞未受到损伤，核DNA分子量大且未发生断裂，仍停留在核基质中，经荧光染料染色后，核在原位形成1个明亮的头部，无拖尾现象；若细胞受损，会出现DNA单链或双链断裂，强碱环境下DNA解旋为单链，DNA断裂片段进入凝胶中，在电场力作用下，断裂的DNA片段因携带负电荷脱离核DNA向阳极移动，DNA碎片形成彗星状尾部，即可形成彗星图像。彗星电泳检测技术具有所需样品量少、适用于任何真核细胞、灵敏度高、细胞不需处于有丝分裂期、无需放射性标记等优点，已被广泛应用于真核细胞DNA损伤及修复、药物筛选、肿瘤发病机制与治疗等研究。目前，用于彗星电泳检测分析的样品制备过程主要包括样品凝胶制备、细胞裂解、解旋与电泳、中和洗涤、荧光染色、采用彗星凝胶电泳摄像系统拍摄荧光照片等步骤。通常，荧光染色步骤中所使用的荧光染料为溴化乙锭（ethidium bromide，EB），EB是1种强诱变剂，容易挥发，对操作人员的健康造成威胁。使用后的染色玻片直接扔进垃圾箱可能会对周围环境造成潜在危害。此外，目前用于彗星电泳分析所制备的凝胶玻片通常要铺3层凝胶，且在后续裂解、电泳及漂洗过程中，凝胶极易脱离载玻片，造成制胶失败，影响彗星电泳技术的推广与应用。咪唑类离子液体因具有不挥发、不易燃、导电性强、性质稳定、对许多无机盐及有机物有良好的溶解性等物化性质，使得其在化学合成、催化、电化学、分析化学等领域得到了广泛应用[4]。然而，研究表明，咪唑类离子液体不仅对细菌及真菌的生长具有很强的抑制作用，对人类上皮细胞也具有较强的细胞毒性，且细胞毒性随着离子液体烷基侧链长度的增加而增加[5-8]。本研究采用基于人肝脏肿瘤细胞系HepG2的彗星试验检测了离子液體1-丁基-3-甲基溴代盐（[C8mim]Br）的DNA损伤作用，旨在为评价咪唑类离子液体的遗传毒性提供依据。

1材料与方法

1.1材料

[C8mim]Br（上海成捷化学有限公司），纯度>99%，[C8mim]Br用0.01 mol/L磷酸缓冲溶液（PBS）溶解，贮存液浓度为10 mol/L，4 ℃保存，临用时用10%胎牛血清培养液稀释至所需浓度；DMEM培养基、正常熔点琼脂糖（NMA）、低熔点琼脂糖（LMA）、Gel Red核酸凝胶染料均为美国Gibco公司产品；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），-20 ℃ 保存，临用时经56 ℃水浴灭活 30 min；胰蛋白酶（美国Amresco公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

CO2培养箱（美国Heal Force公司）、TE601-L电子天平、BS124S分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、JM250水平电泳仪（大连捷迈科技发展有限公司）、Ti-E2000型倒置荧光显微镜（Nikon公司）、超净工作台（苏州市新区枫桥净化设备厂）。

1.3方法

1.3.1细胞培养HepG2细胞来源于American Type Culture Collection（ATCC HB-8065），购自江苏大学药学院。细胞贴壁生长于DMEM培养液中，培养液中加入10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，每天换液，每隔2～3 d传代。

1.3.2细胞处理取处于对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液收获，调节细胞浓度为1×106个/mL，接种于6孔板中，培养24 h至80%融合度，分别加入[C8mim]Br至终浓度为1、2 mmol/L，37 ℃下作用24 h，以0.1 mmol/L H2O2作为阳性对照，作用1 h。以PBS为阴性对照。细胞染毒后，用PBS洗涤2次，800 r/min离心5 min收集细胞，将细胞重悬于1 mL预冷PBS中，用台盼蓝法测定细胞存活率>95%，调整细胞浓度为1×105～5×105个/mL备用。

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1.3.3凝胶制备第1层胶制备：将100 μL 1%正常熔点的琼脂糖滴至磨砂边载玻片上，用另一块玻片均匀推开，盖上盖玻片后迅速置于4 ℃冰箱中固化10 min。第2层胶制备：将 60 μL 待测细胞悬液与0.78%低熔点琼脂糖在42 ℃水浴中按1 ∶2（体积比）混合，滴80 μL上述混合液至第1层胶上，盖上盖玻片置于4 ℃冰箱中固化10 min。得到铺有2层凝胶的玻片。

1.3.4细胞裂解用弯头镊子小心平移走盖玻片，将铺有2层凝胶的玻片浸入装有预冷细胞裂解液（2.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L pH值为10的Tris缓冲液、1%肌氨酸钠、1% Triton X-100、10% DMSO）的平皿中，4 ℃避光裂解1 h。取出载玻片，用蒸馏水轻轻漂洗2次。

1.3.5DNA解链与电泳将上述细胞裂解后的玻片置于水平电泳槽正极端，缓缓倒入新配制的电泳缓冲液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 值为13），约覆盖过玻片胶面0.3 cm左右，避光静置30 min，电泳电压为25 V，电流 300 mA 电泳20 min。

1.3.6中和脱水将电泳后的玻片浸入0.4 mmol/L pH值为7.5 的Tris-HCl中和缓冲液中浸洗3遍，用0.01 mol/L PBS洗净，玻片依次经体积分数为50%、75%、100%的乙醇梯度脱水，每次2 min，室温下晾干。

1.3.7荧光染色在脱水后的玻片上滴20 μL Gel Red核酸凝胶染料，用盖玻片轻轻推开Gel Red染料，使Gel Red在琼脂糖表面均匀铺开，盖上盖玻片，避光染色10 min。

1.3.8 镜检拍照将制得的样品玻片与空白对照玻片置于倒置荧光显微镜下，激发波长为515～560 nm，用100倍物镜观察，每个样本随机选择10～20个细胞拍照摄取图像。每个样品玻片随机选取10个拖尾细胞，采用CASP彗星分析软件测量彗星尾长（tail length）、彗星尾力矩（tail moment）、彗星尾DNA百分含量。

1.3.9数据分析采用Origin7.5软件分析数据。

2结果与分析

，[C8mim]Br与HepG2细胞接触24 h，在荧光显微镜下，经Gel Red 染色的细胞DNA呈橘红色，未发生断裂的DNA只有1个完整的头部，断裂的DNA形成拖尾，HepG2细胞呈现“彗星”样细胞，，随着[C8mim]Br剂量的增加，拖尾现象更加明显，表明细胞DNA损伤程度加重。由表1可知，咪唑类离子液体[C8mim]Br可诱发HepG2细胞DNA原始损伤。

表1不同浓度[C8mim]Br 下HepG2细胞DNA损伤程度

受试物浓度（mmol/L）彗尾DNA含量（%）彗星尾长（μm）彗星尾力矩（μm）PBS 2.2±0.313.1±4.90.4±0.1H2O20.163.0±9.3**145.2±20.0**81.6±11.9**[C8mim]Br1.022.7±3.8**79.0±12.5**25.4±3.9**2.038.2±1.8**105.3±14.8**47.3±3.8**注：同列数据后“**”表示差异极显著。

3结论与讨论

彗星试验是一种灵敏、可靠的检测细胞核DNA损伤的技术，可以检测DNA双链断裂、单链断裂、碱基不稳定位点等多种类型损伤，是评价外来化合物遗传毒性的有效手段。近年来，研究人员采用HepG2细胞彗星试验对消毒剂处理饮用水的有机提取物以及农药等的遗传毒性进行了研究[9-10]。本研究所涉及的凝胶制片步骤只要铺2层胶，与传统的彗星试验样品玻片要铺3层胶的“三明治”铺胶工艺相比，具有可操作性强、不易脱胶、易于推广等优点。同时，采用梯度乙醇对样本进行脱水，可使样本脱水更加彻底，分析彗星电泳图像时，可减弱荧光衰减程度，提高图像质量。此外，与传统荧光染料相比，Gel Red核酸凝胶染料低毒、稳定，对哺乳动物细胞毒性小，且废弃物不会造成环境污染。

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冠状动脉微栓塞动物建模方法评析 第12篇

1 开胸途径建立CME模型

1.1 实验动物

兔(新西兰大白兔为主)、大鼠(SD大鼠为主)。这两种动物易获取,价格便宜。大鼠体型小,成本低最常用,但是大鼠主动脉和冠状动脉纤细,常规手术操作困难,相对动物体型局部创伤大,且模型动物成活率低,采血较困难,血量少,限制血生化的检测。兔较大动物价格便宜,操作方便,耳缘静脉易采血,比大鼠血量多,较为理想[1,2]。

1.2 开胸途径建立CME动物模型构成(动物+栓塞剂)

新西兰大白兔+月桂酸钠、SD大鼠+微球、SD大鼠+月桂酸钠、SD大鼠+自体血栓混悬液。

1.3 实验步骤

新西兰大白兔采用盐酸氯胺酮注射液麻醉。SD大鼠用盐酸戊巴比妥腹腔内注射麻醉,消毒左胸心前区:兔子胸骨左缘第2肋~4肋水平,大鼠于第2肋水平,逐层切开、钝性分离胸壁、切开心包并止血,暴露出心脏,分离出主动脉根部。阻断升主动脉根部约10s,同时从被阻断的升主动脉近端注入栓塞剂或从左心室注入栓塞剂。之后压迫止血,待心率稳定后逐层缝合,关闭胸腔,自主呼吸稳定后拔除气管插管,缝合颈部。术后常规抗感染处理[1,3,4,5,6,7,8]。

1.4 缺点

开胸对动物模型损伤较大,影响胸腔内压和心包完整性,对呼吸循环的影响明显,造成动物应激反应,影响CME病理生理机制发展过程,导致CME模型的理化因子改变并不能准确反映模型动物在CME后的实际情况,与需要模拟的实际CME病理生理发展过程存在差异。模型动物死亡率较高,不易长期随访[1,3,4,5,6,7,8]。

2 介入方法建立CME模型

2.1 实验动物

猪(巴马小型猪为主)、犬、羊。犬的心脏侧支循环系统比较发达,冠状动脉结构与人的差异较大,价格高不常选用。小型猪较好,心血管系统与人类的相似侧支少,心脏大小与人相似,冠状动脉直径更接近人类,较为常用[2]。

2.2 介入途径建立CME动物模型构成(动物+栓塞剂)

小型猪+微球(常见)、小型猪+明胶海绵、犬+脂肪栓子。

2.3 介入法常用特殊器材

股动脉穿刺针,股动脉鞘管,保存于体积分数为0.05%Tween 80中非放射性微栓塞球(美国E-ZTrac公司:白色,直径45.6μm±7.0μm,浓度1×106/mL;0.014英寸)指引导丝或多普勒导丝;7FJL 4.0指引导管;6FJR 4.0右心导管;3.0/2.8F微导管[9,10,11]。介入导管价格昂贵,多次使用,严格消毒。

2.4 实验步骤

选用小型猪,选股动脉入路,肌内注射氯胺酮和阿托品诱导麻醉后,穿刺耳大静脉给予戊巴比妥钠静脉滴注维持麻醉,偶有躁动不安时静脉注射地西泮。犬腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉。消毒腹股沟,在股动脉搏动最明显处穿刺置入股动脉鞘,经鞘注入肝素并达到肝素化,手术期间维持肝素化。用7FJL 4.0指引导管;6FJR 4.0造影导管分别行左、右冠状动脉造影,然后经指引导管将3.0/2.8F微导管沿指引导丝送至左前降支近段,撤除指引导丝,经微导管将栓塞剂注入左前降支内。撤除微导管、指引导丝、指引导管。术后股动脉压迫止血,常规处理预防感染[8,9,10,11,12,13,14,15,16]。

2.5 优缺点

优点:避免因开胸导致的心包内压力的变化,对心脏冠脉微循环的影响、开胸引发的全身应激反应。与开胸建模方法比较,创伤小,减少创伤因素引起的炎症因子变化等,造模动物存活率高,该类动物模型可长期随访观察;与开胸方法比手术时间短,更有利于提高模型动物存活率。较好地模拟了临床病人冠脉微栓塞的病理生理变化。

缺点:所需动物价格昂贵,对实验人员的技术要求高,尤其是动物的麻醉和心导管介入操作技术。需要熟练的心导管操作技术,造模成功的评价方法不统一[8,9,10,11,12,13,14,15,16]。

3 栓塞剂

制作CME动物模型的栓塞剂或致栓剂主要有微栓塞球、自体血栓、脂肪滴、月桂酸钠、明胶海绵[8,17]。比较如下。

3.1 微栓塞球

动脉异物法常用的微栓塞剂。将微栓塞球配成一定浓度的生理盐水混悬液备用。文献报道有:1挪威(Dyno公司)42μm微栓球配置成的30000/mL微球混悬液[3]。2三丙烯栓塞球(规格40μm~120μm,美国Biosphere Medical公司)10万个混悬20mL生理盐水[10]。3美国E-ZTrac公司非放射性微栓塞球(白色,直径45.6μm±7.0μm,浓度1×106/mL)溶于生理盐水注射液,配成浓度为(10~15)×104[11]混悬液。微栓塞球形成微栓塞机制:与临床冠脉血运重建术后微血栓、内皮细胞脱落,或者粥样斑块破裂碎片脱落后,随血流至冠脉微血管致栓原理相似。异物的诱导可激活血小板,使其黏附性和聚集性增加。血小板黏附于受损内膜下的胶原和异物,激活凝血途径形成血栓。优点:该法除直接影响血小板功能外,异物的植入也可能诱发冠状动脉痉挛加速血栓形成。缺点:所需的微球数目非常多(约5×106~10×106个42μm微栓塞球),价格昂贵。与临床上形成的微血栓成分不同;不能真实地反映微血栓本身所导致微循环障碍的病理生理特征,且塑料微球不能被血中纤溶物质溶解,不能形成再通,对进一步的药物干预研究,应用价值有限[18]。

3.2 自体血栓(混合血栓形成法)制备

每只大鼠取尾静脉血1mL常温下凝固或加入2mL肾上腺素促凝,在60°的烤温箱烘干,玻璃研磨器研磨5min使用50μm~100μm过滤塞过滤,使之成为小于100μm均匀微栓子颗粒,配置成生理盐水混悬液备用[19]。自体血栓形成微栓塞的机制:可真实模拟斑块破裂后释放的血栓栓子造成的冠脉微栓塞。优点:血栓来源自身,且富含血小板,纤维蛋白,红细胞等成分。基本符合临床CME时栓子特点,可较好模拟斑块破裂后释放血栓栓子造成的CME。缺点:血栓的制备相对复杂,且凝固后研磨成的颗粒状栓子的数量和大小均不好确定。不能模拟包括血管内皮损伤后始动的CME病变[1,18]。

3.3 月桂酸钠(化学药物损伤致血栓法)

常用剂量:新西兰大白兔和大鼠冠脉内注入月桂酸钠溶液剂量分别是1.5mg/kg(浓度为40mg/mL)[1],1.0mg/kg(浓度10mg/mL)[7]或200μg(0.2mL,1g/L)[20]。其致微栓塞原理:是利用损伤血管内膜造成内皮脱落、穿孔从而促进血小板黏附、聚集和促进血管活性物质的释放,形成闭塞性血栓(原位血栓的形成)造成冠脉微循环阻塞,并且可引起局灶性心肌缺血、缺氧及再灌注的损伤。所形成血栓主要成分为纤维蛋白。优点:以冠状动脉的内皮损伤为启动,诱发形成原位血栓,较大动脉内无明显血栓形成,与微栓塞球栓塞模型比较,更加接近实际的病理生理发展过程。缺点:不是临床上冠脉微栓塞形成的常见病因[1,7,20]。

3.4 脂肪栓塞

脂滴栓子制作,取10 mL的玉米油灭菌备用或者用动物自身脂肪。每次0.5mL,注射时间0.5s。如未出现无复流表现,间隔5min后重复上述步骤。产生慢/无复流现象的机制可能是:1脂滴的机械性栓塞;2促使血小板的黏附性增加;3刺激产生炎症反应。优点:符合人类介入术诱发的脂质池(斑块内容物)释放造成冠脉机械性阻塞而引发的微循环功能障碍[13]。缺点:单一的导致栓塞因素。

4 不同CME模型的拟合程度

拟合度:是指建立动物模型在模拟人类疾病实际病理、病理生理等发病机制和临床表现方面的相似程度。建立与临床冠脉微栓塞相似的CME动物模型,应选取模型动物心脏解剖结构与人类相似,并尽可能减少手术损伤的干扰,栓塞原理应与临床CME机制尽可能接近和利于进一步药物疗效观察治疗。详见表1。

5 CME动物模型的评价

临床上冠脉微栓塞病人可出现心律失常、心肌收缩功能不全、微梗死灶、冠脉血流储备降低、心肌灌注减少、心肌酶升高等[21,22,23]。冠状动脉微栓塞的模型成功评价标准,因各种栓塞剂引起冠脉微栓塞的原因不同,所以评价标准和指标不同。心脏的病理切片检测冠脉内栓子的情况,梗死灶的存在和面积大小,心肌凋亡细胞、血管内皮损伤情况及其周围炎细胞浸润。血流动力学指标和心功能检测主要包含冠脉血流储备分数、冠脉血流量、左室射血分数[3]。心肌损伤的检测指标有肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白。影像学方法有冠脉造影、心肌声学造影、正电子发射计算机断层、磁共振显像[24,25]。

6 问题与展望

在临床上,引起冠脉微栓塞病因有:1冠状动脉粥样斑块破裂;2冠状动脉介入治疗;3溶栓疗法。均可引起冠脉微栓塞,包括聚集的血小板、血小板或(和)纤维蛋白、透明蛋白、粥样斑块破裂(含胆固醇结晶)、基质层成分及内皮细胞、炎症细胞的黏附聚集[4]。主要是通过血管内皮损伤、功能异常、炎症反应、微血管病变、血流动力学异常,多项因素致病。因此建立理想的冠脉微栓塞动物模型应尽可能依据真实的致病因素,遵循复制人类疾病模型的基本原则:相似性、重复性、可靠性、适用性和可控性、易行性和经济性原则[2]。这样可真实反映疾病的实际情况,接近临床。但目前已有多种CME建模方法多是某种栓塞剂单一因素引起的冠脉微栓塞,均有其局限性,未能反映临床该疾病的多种发病机制[8]。将多种栓塞剂的混合使用致冠脉微栓塞可作为进一步的研究方向,且创伤小的导管介入建模途径均用于大动物,像兔、大鼠等小型动物未发现有通过介入方法建立CME模型的报道。综上所述,寻求理想的建模方法及对应评价方法有待进一步研究。

摘要：冠状动脉微栓塞动物模型是研究冠脉微循环障碍病理生理机制及治疗的重要工具,按照建模手术入路可分为经典开胸法和改良介入导管法两类。本研究就这两类建模方法所获得动物模型在真实反映临床冠脉微栓塞病理、病理生理改变等方面特点进行综述评析。