RT-PCR检测

RT-PCR检测（精选8篇）

RT-PCR检测 第1篇

分子生物学检测法是目前发展最快、最有发展前景的病毒检测技术。该方法特异性强、灵敏度高,从核酸水平检测病毒,可以进行大批量的样本检测,且克服血清学及其他检测方法中的一些缺点。目前,我国常采用单重RT-PCR检测病毒,如需检测复合感染样品,操作步骤繁琐,因为其局限是在1个反应管中只能检测1种病毒,已不能满足现代生产的需求。复合感染样品检测需要进行数次RT-PCR反应,耗时长、成本高、易造成交叉污染。

针对侵染马铃薯的主要病原病毒PVS、PVX、PLRV和PVA,本研究建立了高效RT-PCR检测体系,应用于检测四川省发生的马铃薯病毒病。该体系可以在同一反应管中同步检测4种病毒,提高了检测的准确性和检测效率,为培育和筛选马铃薯无病毒原种材料、种薯调运的检疫检验、实施病毒病害有效的防治措施提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为来四川省主要马铃薯生产区的试管苗、种薯、田间及网室植株共134个样品,从成都市各区、市、县和彭山、洪雅、雅安、简阳等共24个采样点,大田随机采集明显有花叶、皱缩、矮化等症状的马铃薯植株,通过DAS-ELISA检测后,筛选出单独或复合感染PVX、PVS、PVA和PLRV的植株叶片作为供试材料。

1.2 试剂

植物总RNA提取试剂盒(RNA-plant)(购自北京天根生化科技有限公司),RNA酶抑制剂(RNase inhibitor)、Taq DNA聚合酶、反转录酶(TIANScript M-MLV)(购自美国MBI公司)。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(gel Midi Purification Kit)、质粒小提试剂盒(prep Mini Plasmid Kit)、氨苄青霉素、X-gal、IPTG、限制性内切酶Eco RⅠ(购自日本TOYOBA公司)。

1.3 引物筛选与合成

通过查询Gen Bank中马铃薯病毒病4种病毒(PVS、PVX、PLRV和PVA)分离物的CP基因保守序列设计引物(表1),由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.4 总RNA提取

采用RNA提取试剂盒提取总RNA:称取马铃薯叶片100 mg,加液氮研磨后,置入预冷的1.5 m L离心管中,加入2-巯基乙醇,再加入RL裂解液500μL,振荡5 min后转移至过滤柱CS上,12 000 r/min离心5 min,取上清液至RNasefree离心管中,缓慢加入无水乙醇(体积为上清0.5倍),混匀后再转入吸附柱CR中,12 000 r/min离心1 min,弃废液。向吸附柱CR中加入去蛋白液RW1,用量为700μL,以12 000 r/min离心1 min,弃废液后,加入去漂洗液RW 500μL,以12 000 r/min离心1 min,弃废液,将吸附柱放回收集管中重复漂洗1次。将吸附柱在12 000 r/min离心2 min,在室温下放置片刻后,放入1个新的RNase-free离心管中,向膜中央加入RNase-free水80μL,室温放置2 min,以12 000 r/min离心2 min,得到RNA溶液,保存于-20℃备用。

1.5 c DNA的合成

20μL反转录体系:20 pmo L/L病毒下游引物各0.5μL,病毒总RNA2.5μL,5MMLV buffer(MBI)4μL,10 mmo L/L d NTPs 1μL,200 U/μL MMLV反转录酶(MMLVRT,MBI)0.3μL,20 U/μL RNA抑制剂(Rnasin,MBI)0.2μL,DEPC处理水补足20μL。反转录条件:42℃30 min,94℃5 min,4℃保存。在进行双重和多重RT-PCR的反转录反应时,RNA抑制剂的用量增加到0.5μL,反转录酶的用量分别提高到0.5、1.0μL,d NTPs的用量增加到2μL。在PCR扩增仪中进行扩增反应eppendorf。

1.6 PCR扩增

RCR体系(25μL体系):以c DNA 4μL作为反应模板,加入10 mmo L/L d NTP 0.5μL,10PCR buffer(Bio BRK)2.5μL,25 mmo L/L Mg Cl21.5μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶(Bio BRK)0.3μL,分别加入20 pmo L/L病毒上游引物和下游引物0.5μL,加水补足25μL。在进行双重和多重PCR扩增时,Mg Cl2的用量分别提高到2.0μL和2.5μL,病毒上游引物和下游引物各1μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环,最后在72℃下延伸10 min;反应结束后,取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 RT-PCR产物的克隆和测序

RT-PCR产物的克隆和测序由上海英俊生物技术有限公司进行。切胶回收RT-PCR产物后,PGM-T克隆按标准方法进行,阳性菌落筛选采用PCR法,提取质粒DNA,酶切验证后分别测序。

2 结果与分析

2.1 病毒总RNA提取质量

病毒总RNA的提取质量决定了病毒RNA的反转录和PCR扩增。图1为病毒总RNA提取电泳图片,从图1可以看出,电泳图片中5、18、28 s条带清晰,基本无降解发生,28 s是18 s亮度的2倍。因此,采用该试验方法对马铃薯病毒总RNA的提取效果较好,保证了后续试验的准确性。

2.2 引物对适用性检测

用筛选的4种马铃薯病毒(PVS、PVX、PLRV和PVA)引物分别进行单重RT-PCR扩增,其分别扩增出435、625、222、300 bp特异性单一条带,各病毒的预期值一致。分别以2、3、4种病毒的c DNA作模板,在同一个反应体系中混合4对引物,扩增结果表明,可以同时扩增出不同病毒的特异条带,未出现杂带(图2~图5)。

注:1、2均代表马铃薯病毒总RNA。

注:1为DNA marker;2为PLRV;3为PVA;4为PVS;5为PVX。

注:1为DNA Marker;2为PVX;3为PVA和PLRV;4为PVS和PVA;5为PVX和PVA;6为PVS和PLRV;7为PVX和PVS;8为PVX和PLRV。

因此,说明试验选取的4对引物适合进行多重检测,无交叉和相互干扰现象,特异性好。用RT-PCR方法检测马铃薯病毒,对存在的目标片断能准确检测出来,且重复性好,特异性强。

2.3 RT-PCR产物的克隆及测序

切取4种病毒的RT-PCR产物凝胶,进行扩增片段回收,克隆至PGM-T载体中,培养后,进行PCR检测,去除假阳性,得到分别含有以上几种病毒的c DNA的白色菌落,进行测序。测序结果进行BLAST分析,表明PLRV的RT-PCR扩增序列其相应病毒的序列同源性达到100%;PVA的RT-PCR扩增序列与NCBI数据库中的PVA病毒的序列同源性达到99%;PVS的RT-PCR扩增序列与NCBI数据库中的的PVS病毒的序列同源性达到98%;PVX的RT-PCR扩增序列与NCBI数据库中的PVX病毒的序列同源性达到96%。

注:1为DNA Marker;2为PVX、PVS、PLRV;3为PVX、PVS、PVA;4为PVX、PVA、PLRV;5为PVS、PVA、PLRV。

注:1为DNA Marker;2为PVX、PVS、PVA、PLRV;3为阴性对照。

2.4 供试马铃薯样品的病毒检测结果

利用本研究的检测技术,对样品提取总RNA进行RT-PCR检测。结果显示有2个样品同时检出4种病毒,16个样品检出了3种病毒,其中6个样品检出PVX、PVS、PLRV,3个样品检出了PVS、PVX、PVA,4个样品检出了PVS、PVA、PLRV,3个样品检出了PVX、PVA、PLRV,16个样品检出了PVX、PVS,13个样品检出了PVX、PLRV,2个样品检出了PVX、PVA,6个样品检出了PVS、PVA,2个样品检出了PVA、PLRV,28个样品检出了PVS、PLRV,41个样品只检出了1种病毒,即21个样品检出PVS,7个样品检出PVX,3个检出PVA,10个检出PLRV,8个有症状样未检出病毒,有可能为其他病毒侵染。该检验结果表明,本研究建立的体系可以高效准确的检测马铃薯样品是否带毒,带的是何种病毒,该方法可靠性、稳定性良好。

3 结论与讨论

本研究以Genbank查询的马铃薯4种病毒(PVS、PVX、PLRV和PVA)的CP基因高度保守序列设计的4对引物,扩增靶带大小适中,GC百分含量、Tm值相近,相互之间及与其他病毒之间均无同源性,凝胶电泳图像目标条带清晰,无杂带和引物二聚体产生,从而保证了引物的特异性。PCR技术用于植物病毒的检测有特异性强、灵敏度高、快速简便及所需样品量少等特点,据报道PCR的灵敏度可达30 pg,比ELLSA方法高很多[4],是检测植物病毒的一个重要手段。与单一PCR相比,多重RT-PCR能同时扩增多个目的片段,其是在一个反应体系中加入多对引物,因此多重PCR在植物病毒检测中优势突出,具有高产率、高效、试验成本较低等优点[5]。在复杂性上,与单重RT-PCR方法相比,建立一个多重RT-PCR方法由于受到许多因素的影响,其构建复杂得多。引物设计上,其灵敏度要达到或接近单重RT-PCR的水平[6,7],要求多重RT-PCR避免各目的片段之间的非特异性扩增和各个引物对之间的相互干扰,使各目的片段有相近的扩增效率,设计的备选引物退火温度相近,另外需不断优化对体系中各种参数。因此,保证引物的特异性是多重RT-PCR方法检测的关键。

本试验所建立的PT-PCR体系,能有效地同时检测出PVX、PVS、PVA和PLRV等4种病毒,扩增目的条带清楚,无非特异性扩增,重复性好,可极大的简化病毒检测的工作步骤,进而进一步降低检测成本,便于马铃薯病毒的检测,对指导马铃薯抗病毒育种具有重要意义。

摘要：依据马铃薯病毒PVS、PVX、PLRV、PVA的CP保守序列设计特异性引物,从马铃薯病叶组织中提取出病毒总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到了与预期片段长度一致的PCR特异扩增产物,建立了能够同步检测PVS、PVX、PLRV、PVA的RT-PCR多重检测体系。该方法对PVS、PVX、PLRV、PVA扩增出的靶带大小分别为435、625、222、300 bp,凝胶电泳易辨别区分。研究结果表明,该方法特异性好、灵敏度高、快速简便,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。

关键词：马铃薯病毒,RT-PCR,检测体系,建立

参考文献

[1]唐艳玲,贾忠峰,余庆善.马铃薯脱毒方法研究进展[J].科技向导,2011(17):357.

[2]姚文国,崔茂森.马铃薯有害生物及其检疫[M].北京:中国农业出版社,2004:6-7.

[3]阎文昭,蒲志刚,钟婷婷.四川马铃薯病毒RT-PCR检测体系的建立[J].西南农业学报,2010,23(6):2171-2173.

[4]WAN Y F W C,SYMONS R H.A high sensitivity RT-PCR assay for thediagnosis of grapevine viroids in field and tissu cluture samples[J].J VirolMethods,1997(63):123-131.

[5]郑耘,陈枝楠,陈富华,等.侵染唐菖蒲和百合3种病毒的多重RT-PCR检测方法[J].植物检疫,2010,24(3):19-22.

[6]侯义宏,林祥梅,张晓臣,等.禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2007,35(8):29-33.

RT-PCR检测 第2篇

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法.方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验.结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的`检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)<10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好.结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术.

作 者：尹惠琼 刘松婷 史利军 杨姝 章金刚 YIN Hui-Qiong LIU Song-Ting SHI Li-Jun YANG Shu ZHANG Jin-Gang 作者单位：军事医学科学院,野战输血研究所,北京,100850刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：21(2)分类号：Q502 Q78关键词：甲型H1N1流感病毒 大流行 荧光定量RT-PCR 诊断

RT-PCR检测 第3篇

1 材料与方法

1.1 植物材料

待检测的四季草莓品种是蒙特瑞保存于组培实验室继代培养的组培瓶中, 通过微茎尖培养共获得20个株系, 阳性对照草莓为温室大棚中未经处理的蒙特瑞。

1.2 试剂

Taq DNA聚合酶、DNAMarker、d NTPs和反转录试剂盒为上海生物工程公司产品;CTAB提取液为实验室自配。

1.3 引物

引物D1/D3、C1/C2、Y1/Y2序列见表1。

1.4 核酸提取

利用改进的CTAB法提取草莓叶片总核酸[3]。取少许幼嫩的叶片, 放入1.5m L离心管中, 加入石英砂用研磨杵研磨均匀, 直至全部研磨至粉末, 加入500u L65℃预热的CTAB溶液 (用前加入2%的巯基乙醇) , 将装有CTAB和样品的EP管放入65℃水浴, 约20'。冷却后加入500u L的酚、氯仿、异戊醇 (25:24:1=300:288:12) , 混匀, 12000r/min, 离心15min, 吸上清, 装入一新的EP管。加入500u L氯仿、异戊醇 (24:1=576:24) , 12000r/min。离心15min吸上清, 转入一新的离心管中。加入1/10体积的Na Ac (3mol/L) , 1m L-20℃预冷的无水乙醇, 反复颠倒数次, 混匀后置于-20℃ (-80℃, 30min) 3~4h, 12000r/min, 10min弃上清。向离心管中加入75%的乙醇洗涤2~3次, 置于吸水纸上倒置晾干。加入DEPC H2O (30u L) 溶解。

1.5 多重PCR体系的建立

SMo V、SMYEV引物参考 (Thompson et al., 2003) , SVBV引物参考 (常琳琳等2009) 。

1.5.1 反转录步骤

取5u L总核酸+1u L随机引物+6u L Rnase-free dd H2O, 将混合物置于70℃水浴5min后立即冰浴10sec, 短暂离心。再将混合物置于冰上, 依次加入下列组分:

轻轻混匀后置37℃水浴5min。加入1ul Reverase Transciptase, 使终体积为20u L。将混合物置于37℃水浴60min。70℃孵育10min终止反应。

1.5.2 PCR体系

反应程序:预变性94℃2min;94℃30s;50~58℃40s;65~72℃1min, 25~35个循环;72℃延伸5min。

1.6 PCR产物的电泳分析

用含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2 结果与分析

2.1 总核酸分离和电泳检测

采用改进CTAB法提取总核酸, 包括总DNA和总RNA。从琼脂糖凝胶电泳结果可以看出 (如图1) , DNA条带及RNA的28S和18S条带均能看到, 这说明总RNA没有发生降解, 完整性较好。

2.2 多重RT-PCR同时检测3种病毒

本研究中, 作者利用引物D1/D3、C1/C2和Y1/Y2做了大量预实验来同时检测SMo V、SMYEV和SVBV, 研究中对多重RT-PCR体系中主要的影响因素, 如PCR缓冲液浓度、d NTP、Mg2+浓度、DNA聚合酶浓度、引物浓度及循环数进行了优化。在优化过程中, 根据产物中目标片段的长短, 适当调节PCR缓冲液浓度, 将10PCR Buffer分别调至终浓度为2.5, 2, 1.5, 1, 0.5几个梯度。本研究中, 3个目标片段均属于小片段, 而高盐浓度会使长片段扩增逐渐减弱, 而短片段扩增逐渐增强, 因此对比试验中, 2的效果最佳。此外, 调节引物浓度也是影响多重PCR的主要因素, 本研究中对引物浓度进行了梯度对比, 扩增结果发现, 对引物浓度进行的调整引起扩增产物的显著变化, 且一种引物浓度过高时容易出现弥散现象, 只有在诸多因素最佳条件下, 再调节引物浓度才可以起到较好的效果。

最终的优化结果为:加入2PCR Buffer, 引物浓度分别为D1/D30.17umol/L、C1/C20.25umol/L、Y1/Y20.15umol/L。PCR反应程序为94℃2min;94℃30s, 55℃30s, 72℃1min, 35个循环;最后72℃延伸10 min。

利用建立的多重PCR体系对温室草莓样品和试管苗茎尖脱毒样品进行了检测, 在对蒙特瑞试管苗茎尖脱毒样品检测中 (如图2) , 有11个样品脱除了3种病毒, 9个样品未能脱除SVBV。本研究首次利用多重PCR同草莓茎尖脱毒相结合, 可以快速、高效地鉴定脱毒效果。

3 讨论

3.1 多重PCR反应条件的影响

多重PCR技术具有高效性、降低实验成本、缩短实验时间、结果一目了然等特点。它要求不同引物能在同一体系中进行特异性扩增, 因而影响其扩增效果的因素也很多, 主要有反应体系中的各种成分浓度、反应体积、循环数、引物之间的碱基配对 (主要是引物间形成错配) 等因素。PCR引物是PCR扩增结果好坏的主要参数, 好的引物可以在一定程度上避免形成引物二聚体及发夹结构, 引物间的配对、引物间的竞争性扩增均能影响结果。但单一调整引物浓度, 不能达到最佳效果, 因而同时调整反应循环数、PCR缓冲液浓度及其他反应成分的浓度, 选择合适的反应条件和反应程序, 则可以提高扩增效果。此外, 核酸提取质量也可以影响PCR扩增效果, 若总核酸提取过程中蛋白抽提不干净或氯仿:异戊醇被吸上, 则可以导致不能提取到总核酸或是扩增结果不整齐。

3.2 总核酸的提取方法

SVBV属于DNA病毒[5], 而其他两个病毒属于RNA病毒, 分别提取核酸检测, 增加了检测程序, 因此能够在提取步骤上同时进行无疑就缩短了检测时间, 本研究通过改进的CTAB法提取总核酸, 效果比较理想, 减少了工作量, 而且不需花费昂贵的费用购买试剂盒, 只需实验室购买简单化学试剂自己配制, 降低了成本。

参考文献

[1]肖君泽, 黄益鸿, 姜放军, 等.草莓病毒病及其脱毒与检测技术研究进展[J].江西农业学报, 2010, 22 (8) :88-90.

[2]常琳琳, 张志宏.草莓病毒的简单、快速PCR检测[J].草莓研究进展 (三) , 2009, 83-88.

RT-PCR检测 第4篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂:

RTPCR试验试剂:0.1%DEPC水 (购自上海生物工程公司的DEPC 1 mL溶于1 000 mL去离子水中, 混匀, 过夜后灭菌备用) 、琼脂糖凝胶 (Agarose琼脂糖0.500 g, 加TBE (0.5X) 50 mL, 加热至溶解, 稍待冷却后加荧光涂料 (Glodview) 3μL) 、裂解液 (澳兰百特诊断中心实验室配制) 、氯仿、异丙醇、75%冷酒精、DNA Marker DL 2 000、RT-PCR试剂盒。

1.1.2 仪器:

20～200μL单道移液器、PCR仪、电热恒温水浴锅、电泳仪器、电子天平、SK-1型快速混匀器等。

1.2 方法

1.2.1 样品处理:

分别取9头病死猪的组织 (肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结等) , 加入组织体积3～5倍的生理盐水匀浆, 反复冻融3次。

1.2.2 核酸的提取:

首先, 取样品上清液400μL, 加600μL的裂解液, 加400μL氯仿, 振荡, -20℃沉淀10 min。然后, 12 000 r10 min离心, 取上清600μL, 加800μL异丙醇, -20℃沉淀30 min。最后, 12 000 r10 min离心, 弃上清, 用75%的冷乙醇冲洗1次, 冷风将核酸吹干。

1.2.3 反转录 (20μL体系) :见表1。

μL

以上混合体系溶解吹干的核酸, 42℃反转录1 h。

1.2.4 PCR扩增 (30μL体系) :见表2。

放入PCR仪进行扩增, 扩增35个循环, 反应程序为:预变性94℃5 min, 变性94℃30 s, 退火55℃30 s, 延伸72℃1 min, 终延伸72℃6 min。

1.2.5 电泳:

将琼脂糖凝胶倒入电泳槽中, 凝固后点样电泳, 紫外灯下观察结果。

2 结果与分析

本试验中的引物是根据Genband已公布的猪蓝耳病序列设计的, 其电泳后的目的条带大小为605 bp左右。

注:图中1、2、3、4、5、6、7、8、9待检病死猪, M为DL2 000 marker

由图1可以看出, 9头待检病死猪中, 有5头猪呈阳性 (即图中的1、2、3、4、5) , 由此可以看出该批待检病死猪猪繁殖与呼吸综合征发病率较高。

3讨论

试验结果表明, 该批待检病死猪发病率为56%, 由于该病的致死率高, 给养猪业造成很大经济损失, 因此做好此病的综合防治至关重要。可以采用以下防治措施:猪群应加强饲养管理, 供给充足营养, 以增强猪群抗病力。合理免疫, 科学预防。一般情况下, 未免母猪所产仔猪可用猪繁殖与呼吸道综合征乳油剂灭活苗在12日龄时首免1/2头份, 30日龄二免1头份;已免母猪所产仔猪25～35日龄接种灭活苗1头份;后备母猪和哺乳母猪均在配种前半月至1个月免疫1头份[5]。另外, 已发现感染蓝耳病猪只的猪场, 猪只接种疫苗时, 应选用弱毒疫苗[6]。猪舍随时清扫, 定期进行消毒。外买猪应严格检疫, 并隔离饲养。

参考文献

[1]Z.Q.Gao, X Guo and H.C.Yang.Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Vet Immunol Immunopathol, 2004, 149:1341～1351

[2]陈爱珍.猪蓝耳病的诊断与防治.福建农业, 2008 (1) :24

[3]赵以云.猪蓝耳病的诊断与防治.现代农业科技, 2008 (1) :24.

[4]孙艳明, 赵德明.猪蓝耳病的诊断与防治.中国畜牧兽医, 2007, 34:130～131

[5]鲍顺梅, 张吉平.猪蓝耳病的防治.畜禽业, 2007 (7) :35～35

RT-PCR检测 第5篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 参考毒株

犬瘟热CDV-3弱毒株。

1.1.2 试剂

DNAzol Regent、TRIzol LS?Reagent、RNA提取试剂盒;r Taq DNA ploymerase、d NTPs、AMV Reverse Transcriptase、Rnase-Inhibitor、DNA Marker (DL2000) ;Agarose琼脂糖;异丙醇、无水乙醇、DEPC水、氯仿、琼脂粉等。

1.1.3 仪器设备

超净工作台、台式高速冷冻离心机、PCR扩增仪 (Alpha Unit Black Assembly PCR、PTC-200) 、42℃可调恒温水浴锅、高速离心机、微波炉、电子天平、DYY-Ⅲ-7型、DYY-Ⅲ-8B核酸电泳仪、紫外凝胶成像系统[2]。

1.1.4 检测的组织病料来源及病料采集方法

某新建貂场饲养水貂1600只, 其中44日龄断奶幼貂1100只, 2016年4月23日突然发病176只, 死亡114只。

无菌操作剪取1.0~2.0g病料, 加少量灭菌PBS (含青霉素、链霉素) , 注意边研磨边加液氮, 防止RNA被降解。用PBS按1∶4稀释成悬液, -20℃反复冻融3次, 4℃10000r/min离心10min, 取上清, -70℃保存。

1.2 方法步骤

1.2.1 引物设计与合成

根据Gen Bank中CDV-3N蛋白基因序列, 用Primer软件设计了特异性引物, 扩增引物:CDV-3-P1 (5′TAGGT-TAGGGCTGTGGCCTT3′) ;CDV-3-P2 (5′CCGCACCTTCG-GATATACTG3′) 。

1.2.2 CDV的RNA提取

1.5ml离心管中加入250μl组织液;加TRIzol LSRReagent750μl, 颠倒6~8次, 4℃静止5min;加200μl氯仿充分震荡, 在4℃冰箱, 静止10min;4℃离心12000转15min;取上清液500μl, 转入新EP管, 加等量的异丙醇, 颠倒6~8次 (-70℃冰箱中静置45min) , 充分沉淀核酸;4℃离心12000转15min, 弃上清液;加入75%冷乙醇 (DEPC配置) 1000μl, 离心5min, 弃上清液, 干燥核酸;加20μl DEPC水溶解-20℃保存, 备用。

1.2.3 CDV RNA的反转录

CDV反转录反应 (RT-PCR) 总体积为20μl:5×Buffer4μl, M-MLV (反转录酶) 0.5μl, RNase inhibitor 0.5μl, RT引物1μl, 2.5m M d NTP2.5μl, DEPC灭菌水8.5μl, 病毒RNA模板3μl, 混匀42℃水浴1h, 70℃5min灭活反转录酶。得到c DNA模板, -20℃保存备用。

1.2.4 CDV PCR的反应条件的优化及体系的建立

最适模板量确定:分别以2、3、4、5、6、7和8μl反转录的c DNA为模板, 对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察, 保持其他试剂浓度及反应条件不变, 确立最佳模板浓度。最适引物浓度确定:在PCR反应体系中分别加入上、下游引物 (20μmol/μl) 0.1、0.3、0.5、0.7、1.0μl, 通过琼脂糖凝胶电泳进行对扩增产物观察, 确立最佳引物浓度。最佳退火温度确定:分别以47、49、51、53、55和57℃退火温度进行PCR反应, 通过琼脂糖凝胶电泳进行对扩增产物的观察, 确立最佳退火温度。CDV最佳反应体系:总体积25μl, 10×Buffer2.5μl, d NTP Mixture (2.5mmol/L) 2μl, P1+P2 0.5μl+0.5μl, Taq0.5μl, 灭菌双蒸水17μl, DNA模板2μl。最佳扩增条件:95℃预变性5min, 94℃变性30s, 51℃退火40s, 72℃延伸2min, 共30个循环, 72℃终延伸10min。

在PCR仪中进行扩增:95℃预变性5min;94℃变性30s, 51℃退火40s, 72℃延伸2min, 循环数30次;72℃终延伸10min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳:用TAE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶, 琼脂糖加热溶化后加入溴化乙锭 (EB, 10mg/ml) 至终浓度0.5μg/μl, 混匀, 制成电泳凝胶板待用。取3μl扩增产物加3μl6×Loading Buffer (上样缓冲液) 混匀, 加入上样孔, 同时以标准DNA分子量 (DL-2000 Marker) 为对照, 100V电泳30min, 紫外凝胶成像系统观察分析结果。

1.3 CDV PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验

1.3.1 RT-PCR特异性试验

分别取犬瘟热病毒 (CDV) 、犬冠状病毒 (CCV) 反转录产物及犬细小病毒 (CPV) 抽提的DNA, 用已建立的方法进行扩增, 验证本方法的特异性。

1.3.2 RT-PCR敏感性试验

从疫苗中抽提CDV-3的RNA, 用DEPC水将RNA依次进行10-1~10-7倍稀释, 分别进行RT-PCR检测, 确定其敏感性。

1.3.3 RT-PCR重复性性试验

用已建立的RT-PCR检测方法对用免疫胶体金试纸跟RT-PCR同检测为水貂犬瘟热病毒为阳性的病料进行重复检测3次, 验证本方法的重复性和稳定性。

1.4 RT-PCR的临床应用

从储存水貂病料中随机取2份病料, 分别用胶体金和RT-PCR方法检测。

2 结果

2.1 RT-PCR检测方法反应条件的确定

以CDV-3株为模板, 利用设计的特异性引物进行RT-PCR反应。显示扩增得到与预期目的条带大小相符的特异性片段。经过不同条件, 优化PCR反应体系, 确定采用2μl的模板量, 上、下游引物各0.5μl, 退火温度为51℃进行扩增。以优化的PCR反应的最佳条件进行PCR扩增并进行凝胶电泳, 在287bp处得到清晰可见的目的条带。

2.2 CDV PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验结果

2.2.1 特异性试验结果

RT-PCR能从提取的核酸中扩增出287bp特异条带, 其他泳道的病毒:犬细小病毒 (CPV) 、犬冠状病毒 (CCV) 扩增结果为阴性, 说明本引物特异性好 (见图1) 。

2.2.2 敏感性试验结果

对不同浓度CDV-3RNA进行RT-PCR扩增, 显示该RT-PCR方法最低能检出约稀释浓度10~5倍的病毒RNA (见图2) 。

2.2.3 重复性试验结果

3次重复操作RT-PCR方法检测结果一致, 表明方法稳定可靠 (见图3) 。

2.3临床收集样品检测结果

本试验RT-PCR检测方法比免疫胶体金法敏感度高, 结果准。

参考文献

[1]高娃, 杨敬, 陈振文, 等.犬瘟热病毒分子生物学研究进展[J].中国比较医学杂志, 2004, 14 (4) :241-244.

RT-PCR检测 第6篇

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择我院感染性疾病科2014年5月—8月收治的手足口病患儿86例, 其中男45例, 女41例;年龄0月~5岁, 平均 (2.50±1.52) 岁, 诊断均符合卫生部《手足口病诊疗指南 (2008年版) 》。

1.2 检测方法

手足口病毒RNA检测采用实时荧光定量PCR法, 试剂盒由广州中山大学达安基因股份有限公司提供。采集患者发病3 d内的咽拭子样本, 用盐水浸湿无菌咽拭子, 适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位, 应避免触及舌部;迅速将咽拭子放入装有1~2 m L生理盐水 (需提前把1~2 m L盐水预先加入到咽拭子管中) 的咽拭子样本采样管中, 以防干燥, 贴上条码送检。经上述处理的样本可4℃暂存并在12 h内送达实验室, -20℃以下低温冷冻保藏, 需长期保存的标本存于-70℃冰箱, 标本应避免反复冻融。标本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

2 结果

2.1 RT-PCR法检测患儿肠道病毒类型结果

本研究采用RT-PCR对86例手足口病患儿咽拭子肠道病毒进行检测, 结果显示, 肠道病毒通用型阳性38例, 阳性率为44.2% (38/86) ;肠道病毒EV71型阳性18例, 阳性率为20.9% (18/86) ;肠道病毒CA16型阳性3例, 阳性率为3.5% (3/86) 。

2.2 不同性别患儿手足口病肠道病毒的检测结果

检测45例男性患儿手足口病EV、EV71、CA16感染情况, EV阳性男20例, 女18例, 男女患儿EV阳性率分别为44.4% (20/45) 和43.9% (18/41) ;男EV71阳性有8例, 女10例, 男女患儿EV71阳性率分别为17.8% (8/45) 和24.4% (10/42) ;男性患儿CA16阳性有1例, 女性患儿2例, 男女患儿CA16阳性率分别为2.2% (1/45) 和4.9% (2/41) 。

2.3 不同年龄阶段患儿手足口病肠道病毒检出情况

有13例<1岁手足口病患儿接受检查, EV阳性有6例, EV71阳性1例, CA16阳性0例, 阳性率分别为46.2% (6/13) 、7.7% (1/13) 、0% (0/13) ;43例1岁~2岁患儿, EV阳性有16例, EV71阳性9例, CA16例阳性1例, 阳性率分别为37.2% (16/43) 、20.9% (9/43) 、2.3% (1/43) ;30例≥2岁患儿, EV阳性有16例, EV71阳性8例, CA16例阳性2例, 阳性率分别为53.3% (16/30) 、26.7% (8/30) 、6.7% (2/30) 。见表1。

3 讨论

手足口病 (HFMD) 是由肠道病毒引起的传染病, 有20多种 (型) 肠道病毒可引发手足口病, 其中以肠道病毒71型 (EV71) 和柯萨奇病毒A16型 (CA16) 最为常见, 春夏是HFMD高发季节, 患者常为儿童, 男性多见[4]。该病临床表现主要有口痛, 厌食, 低热, 手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡, 大多数患儿大约1周后自愈, 少数患儿病情发展, 可有心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症, 个别患儿病情进展快, 甚至导致死亡。HFMD病例数2010、2011年连续两年居我国法定传染病之首, 病死例数在我国法定传染病也居于前列。由于目前临床上尚无特效的手足口病毒疫苗, 也缺乏针对此病毒特异性的治疗药物。因此, 严密监控本地区HFMD病原体流行状况、病毒感染构成比、年龄分布, 对于HFMD的预防治疗均具有重要意义。随着实时荧光定量PCR检测技术的不断成熟, 各医院临床实验室均开展了手足口肠道病毒的定量检测, 肠道病毒RNA的定量检测有快速、简便、特异性强的特点, 且PCR技术可以高效扩增, 具有高敏感性、高特异性、和高精确性的优点;同时应用实时荧光定量PCR技术检测儿童手足口肠道病毒的感染类型载量, 还可以根据病毒载量的多少反映患儿体内的病毒复制水平, 可以帮助临床医师迅速确诊肠道病毒感染的患儿, 及时进行抗病毒治疗, 对于儿童手足口肠道病毒感染的诊断和疗效观察都具有指导意义。本研究中HFMD患儿就诊时间为5月~8月, 且男性45例, 多于女性的41例, 符合HFMD流行病学特征。本研究采用RT-PCR对86例手足口病患儿咽拭子肠道病毒进行检测, 结果显示, 肠道病毒通用型阳性率为44.2%, 肠道病毒EV71型阳性率为20.9%, 肠道病毒CA16型阳性率为3.5%, 提示运城市手足口病毒感染以EV71型为主。男女患儿EV阳性率分别为44.4%和43.9%;男女患儿EV71阳性率分别为17.8%和24.4%;男女患儿CA16阳性率分别为2.2%和4.9%, 可见女患儿EV71感染阳性率高于男患儿。<1岁手足口病患儿, EV、EV71、CA16阳性率分别为46.2%, 7.7%, 0%;1岁~2岁患儿, EV、EV71、CA16阳性率分别为37.2%, 20.9%, 2.3%;≥2岁患儿, EV、EV71、CA16阳性率分别为53.3%, 26.7%, 6.7%, 可见≥2岁患儿病毒检出阳性率最高。

总之, 手足口病传染性强, 无特异性疫苗预防, 也无针对病毒的特效治疗方法, 对0岁~5岁儿童危害严重。为遏制疫情蔓延, 要不断检测本地区儿童手足口病肠道病毒感染情况, 我市手足口病病原以EV71型为主, 女患儿EV71感染阳性率高于男患儿, ≥2岁患儿病毒检出阳性率最高, 应根据检测结果做到早预防、早发现、早诊断、早治疗, 采取果断措施, 遏制疫情蔓延。

参考文献

[1]杨海英, 王冯彬, 王江蓉, 等.98例手足口病流行特征与临床分析[J].微生物与感染, 2009, 4 (1) :22-25.

[2]马亦林, 李兰娟.传染病学[M].第5版.上海:上海科学技术出版社, 2011:137-144.

[3]郭雪, 郑焕英, 莫艳玲, 等.2008年广东省儿童手足口病病原学监测[J].中华疾病控制杂志, 2009, 13 (3) :270-272.

RT-PCR检测 第7篇

1 材料与方法

1.1 病毒

鹅副粘病毒株、鹅副伤寒、新城疫病毒株和曲霉菌均由本实验室保存。

1.2 主要试剂

pMD18-T Simple Vector、胶回收试剂盒均购自大连宝生物公司;DH5α感受态细胞购自北京全实金有限公司;RNA提取试剂、质粒提取试剂盒、高纯质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物与探针的设计与合成

根据GenBank公布的GPMV基因的保守序列应用Primer Express Software软件设计一对特异性引物,用于克隆并检测部分为F基因,目的基因长度为1 700 bp。引物与探针由宝生物有限公司合成,序列如下:

MeqForward:5'-ACCTGTACCTAACC-GAATTGACTAC-3'

Meq Reverse:5'-ACCGATTAATGAGCT-GAGTTGATTG-3'

Meq probe:5'FAM-TCGGACCACAAAT-CACTTCACCTGCCT-TAMRA3'

1.4 病毒核酸提取

对鸭胚尿囊液病毒RNA提取按照RNA提取试剂盒使用说明书操作。

1.5 目的基因的扩增与鉴定

反应体系为10PCR buffer 2.5μL;dNTP(10 mmol/μL)2μL;上下游引物1μL(均为10μM);模板病毒5μL;超纯13μL。

PCR反应程序:94℃变性5 min,94℃变性45 s;52℃退火45 s;72℃延伸90 s,共30个循环,最后72℃延伸10 min。

取10μL PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳。PCR产物经电泳、胶回收纯化后,与PMD18-T Simple Vector连接,转化DH5а,接种于含有AMP的LB平板,37℃过夜,挑取单菌落接种含AMP的LB培养液,37℃振荡过夜。碱裂解法小量提取质粒。采用质粒PCR的方法来鉴定是否有插入片段。将阳性菌液交由天根生化科技有限公司进行测序。

1.6 标准曲线建立

经过优化筛选,确定反应体系为:各成分终浓度及含量为(1)上游引物(0.2μmol/L)0.5μL;下游引物(0.2μmol/L)0.5μL;探针(0.1μmol/L)0.25μL;(2)10buffer,2.5μL;(3)MgCl2(2.5μmol/L)2.5μL;(4)dNTP(0.25μmol/L)0.25μL;(5)Taq酶0.25μL;(6)DNA摸板2μL;(7)反应水23μL。总反应体系25μL。

反应条件:92℃预变性3 min,然后进行40个循环(92℃变性5 s,60℃退火30 s),40℃延伸10 s。

以10倍梯度稀释已知拷贝数的质粒为模板,经荧光定量PCR仪上检测,得到动力学曲线。

1.7 重复性试验

采用Taqman探针法,同一样品在相同条件下重复8次试验,以验证试验结果的稳定性。

1.8 敏感性试验

将已计算出拷贝数的含目的基因的质粒作10倍梯度稀释,稀释至用荧光定量PCR仪不能检出,以此计算出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数。

1.9 实时定量PCR的特异性试验

利用所建立的荧光RT-PCR检测方法,分别对已知的鹅副粘病毒(GPV)、新城疫(NDV)、鹅副伤寒、曲霉菌等进行检测。

2 结果与分析

2.1 GPMV的F基因的鉴定、测序

RT-PCR扩增后,取10μL PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳,出现一条约为1 700 bp左右的扩增条带,与预期片大小一致。如图1。将阳性目的片段切胶回收,回收的PCR产物连接至p MD18-T载体上,涂布平板过夜培养菌体。挑取阳性菌落提取质粒使用EcoR I/HindⅢ进行双酶切鉴定,将酶切鉴定为阳性的重组质粒送往大连宝生物公司测序。

所测序列在NCBI上进行比对,比对结果同源性达到99%,说明目的基因已克隆入载体中。

2.2 标准曲线建立

对RNA模板作1.0100、1.010-1、1.010-2、1.010-3、1.010-4、1.010-5、1.010-6、1.010-7、1.010-8共有9个稀释浓度的标准RNA模板进行荧光RT-PCR检测。随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,在最大稀释度1.010-8仍有典型S型曲线。如图2所示。在稀释的线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,两者之间线性相关系数达0.998。如图3所示。

2.3 重复性试验结果

重复性试验结果如图4所示。从图中可以看到,该检测体系稳定,具有良好的稳定性。

2.4 特异性试验结果

利用所建立的荧光RT-PCR检测方法,分别对鹅副粘病毒、新城疫、小鹅瘟病、鹅副伤寒、曲霉菌等进行荧光RT-PCR方法检测。结果显示只有鹅副粘病毒毒株呈阳性反应,其他病原均呈阴性,如图5所示。

从左至右稀释度依次为1.0100、1.010-1、1.010-2、.010-3、1.010-4、1.010-5、1.010-6、1.010-7、1.010-8

表明该检测方法具有良好的特异性。

3 讨论

3.1 本研究采用Taqman探针法,以GPMV F基因序列为靶基因,建立了一种特异性的荧光RT-PCR检测方法。该方法可检出1.010-8稀释度的病毒含量,同时重复8次试验,结果差异不显著,经对1份鹅副粘病毒、1份新城疫、1份小鹅瘟病、1份鹅副伤寒、1份曲霉菌同时检测,只有鹅副粘病毒出现典型S形曲线,因此,该方法具有较高的灵敏性、较好的重复性和较强的特异性。

3.2 本研究建立的荧光定量PCR方法可直接对临床样本进行检测,且在短时间内完成检测工作。因此,此方法可用于GPMV的检测及流行病学调查,从而为GPMV感染的早期快速诊断及确证提供有效的检测方法。

摘要：根据GenBank所载鹅副粘病毒(GPMV)的F基因保守区序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增F基因片段,克隆、测序后,采取Taqman探针法建立了检测鹅副粘病毒的荧光RT-PCR方法。结果表明,该方法特异性强,敏感性高,可以用于鹅副粘病毒的检测。

RT-PCR检测 第8篇

1 常规RT-PCR

RT-PCR技术是在反转录酶的作用下以mRNA为模板加入反转录引物合成互补的cDNA,然后在TaqDNA聚合酶作用下以cDNA为模板经多次“变性、退火、延伸”等基本步骤,实现目标cDNA片段的数百万倍扩增,再通过琼脂糖凝胶电泳、探针杂交或序列分析对扩增产物进行检测[1]。与传统方法比较,RT-PCR技术具有特异性好、敏感性高、快速、简便等优点,甚至能检测到变异株基因的变异位点,但是必须控制好环境污染,否则很容易造成假阳性结果。有人通过扩增禽流感病毒HA基因来分析致病株与非致病株的序列差异,结果表明致病株的C末端比非致病株多3个氨基酸。闫玉河等[2]根据禽流感病毒H9N2基因核蛋白(NP)的核酸序列设计1对引物,得到来源于标准沉淀抗原和病毒分离株的RT-PCR产物。H.Noroozian等[3]应用RT-PCR方法在试验感染鸡粪便中检测到H9亚型禽流感病毒,表明RT-PCR技术可以快速、准确地检测禽类粪便样品是否有H9亚型禽流感病毒。

2 巢式RT-PCR

巢式(套式)RT-PCR是在PCR过程中使用2对引物:1对引物扩增片段稍长,以cDNA为模板进行第1轮扩增;第2对引物稍短,以第1对引物的产物为模版进行第2轮扩增,这样扩增不受平台效应的限制,灵敏度很高,但是也有人认为,这种方法过于灵敏,在环境控制不好的情况下非常容易造成高的假阳性率。B.Herrmann等[4]对 215 份流感疑似病料进行检测,用巢式RT-PCR检出 83 份,病毒分离鉴定检出 66 份,免疫荧光检出 68 份阳性结果。另用巢式RT-PCR从 98 份病毒分离和免疫荧光阴性样品中检出16份阳性结果,灵敏度很高。 E.Starick等[5]设计了H7亚型特异性的巢式RT-PCR,扩增片段包括了血凝素裂解位点,可以依据裂解位点变化确定强弱毒株,他认为该方法与病毒的分离鉴定具有同样的灵敏性。有学者建立了用半巢式RT-PCR方法区分新城疫病毒的强弱毒株[6]。蔡锐等[7]建立了适合鸭圆环病毒(DuCV)快速检测的巢式PCR方法,对从安徽省望江县采集的发病鸭肝脏、胸腺、法氏囊、肾脏和脾脏等内脏病料进行了检测。结果表明,巢式PCR对所有内脏病料均能扩增出 340 bp的条带,而正常鸭胚、鸭瘟病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸡传染性贫血病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里氏杆菌等的扩增结果均为阴性,该方法第1次扩增的敏感性是1 ng,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高106。

3 实时定量RT-PCR

实时定量RT-PCR方法原理是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定性和定量分析,该技术近年来发展迅速,主要有探针法和染料法。核酸探针技术一般用人工合成及重组质粒的方法获得所需要的探针,通过重组质粒来获取有关的基因片段或从已知病毒基因序列中筛选一段序列,并以人工方法合成与其互补的一段寡核苷酸作为探针,再采用不同的标记方法(如标记荧光)以构成核酸探针。探针法具有特异性强、灵敏度高等优点,但如果探针区域发生变异就会导致假阴性结果。目前,可行的是采用多个探针来避免这一缺陷,然而探针设计、标记及纯化成本较为昂贵。染料法是将荧光染料与DNA结合利用荧光分光光度计采集结合后增强的荧光信号,通过DNA标准样品计算得出样品DNA的初始浓度,最常使用的荧光染料是SYBR Green I,相比于核酸探针定量RT-PCR,SYBR Green I荧光定量RT-PCR技术操作更为简单,成本也更低廉,只需要设计出扩增序列特异性引物。有人建立了H5亚型禽流感病毒的TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR,该方法在快速检测病毒的同时还具有很高敏感性和特异性[8]。严进等[9]建立了番鸭呼肠孤病毒(DRV)的TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测方法,用已知浓度的重组质粒为标准品,构建标准曲线的相关系数达到99%。该方法可以检测到1.0102拷贝/L的标准品,比普通PCR至少高100倍,对于人工感染的呼肠孤病毒番鸭肝脏组织其检出率达到 100%。万春和等[10]针对H9亚型禽流感HA基因保守序列设计引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ检测模式的荧光定量RT-PCR,最低检测限为8.33102拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出100倍。S.M.Ben等[11]采用TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR方法检测H9N2亚型禽流感病毒的结果表明,该方法比普通PCR灵敏1.5～2.5个数量级,检测鸡胚尿囊液时,实时定量荧光PCR灵敏度高出普通PCR 2～3个数量级。

4 一步法多重RT-PCR

一步法多重RT-PCR是在一个PCR反应体系中同时加入2对或2对以上引物,用于扩增不同的目的片段,可在1次试验中检出不同病毒或同种病毒的不同亚型。多重RT-PCR技术适合多种禽病毒混合感染的诊断,节省时间、材料及费用,不过由于多对引物之间容易出现相互干扰现象,导致检验的特异性和敏感性降低,提高检验的特异性和敏感性对临床应用非常关键。近年来,一步法多重RT-PCR技术发展迅速,不断有针对各种禽病的多重RT-PCR方法建立。张应国等[12]建立了可用于检测和鉴别混合感染的多重RT-PCR检测技术,该方法从核酸提取、基因扩增到产物分析,可在3～4 h内完成,经过对36株禽流感病毒及相关病毒分离物进行检测,与病毒分离鉴定的结果完全一致,且与相关病毒或其他亚型无交叉反应。有人建立了针对A型流感和H5、H7、H9亚型禽流感病毒的多重RT-PCR检测方法[13],该方法对H5、H7、H9亚型禽流感病毒敏感性为100 pg,对A型流感病毒的敏感性为10 pg,多重检测时无杂带出现。韩雪清等[14]建立了针对禽流感H1、H3,H5、N2 4种亚型的一步法多重RT-PCR检测方法。黄溢泓等[15]建立了针对禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡毒支原体(MG)5种禽呼吸道病病原的多重RT-PCR检测方法,在临床诊断方面有重要作用。

5 不对称RT-PCR标记技术

不对称RT-PCR是用不等量的1对引物,经PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA),这对引物分别称为非限制引物与限制性引物,其比例一般为10∶1～100∶1,在PCR反应最初的10～15个循环中,扩增产物主要是双链DNA,当限制性引物消耗完后,非限制性引物引导的PCR产生大量单链DNA。单链DNA探针与双链DNA探针相比,杂交效率更高,具有更强的敏感性。陶启蒙等[16]结合非对称RT-PCR和基因芯片2种技术,构建可同时区分禽流感病毒的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型,以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片,对样品检测结果与RT-PCR鸡胚接种具有较高的一致性,符合率分别为100%和96%。

6 其他

自20世纪80年代发明PCR技术以来,该技术和PCR仪都在不断地更新改进,其中很多新方法已经在实验室广为使用。

6.1 降落PCR

降落PCR是在扩增过程中选定35～50 ℃,每个温度2个循环,然后在35 ℃循环15次,其原理是随着退火温度的降低,特异性也逐步降低,但特异性条带在温度较高时已经扩增出来,其浓度远远超过非特异性条带,退火温度降低时特异性条带优先被扩增,这种方法的退火温度范围较大,在不知道最佳退火温度时比较适合。

6.2 竞争引物PCR

竞争引物PCR原理是用有一个碱基变化的2种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板,其中只有完全互补的引物才能大量配对,该方法可用于测定DNA片段上是否存在某个已知碱基的置换。

6.3 锚定PCR

锚定PCR是在未知DNA或cDNA片段的1个末端人工接上已知序列片段,利用基因特异性引物与人工序列引物(锚定引物)进行扩增,这是一种半特异性扩增。

7 结语

禽类病毒性疾病种类众多,一些病毒亚型复杂难以准确诊断,且传播速度很快,给疫病的防控造成很大困难。传统的病毒分离需要接种鸡胚或进行细胞培养,时间太长,血清学方法多用于检测血清中抗体反应,然而在高致病性病毒病发生时,往往还未出现阳性抗体鸡群已经遭受毁灭性打击,这些方法很难满足禽类急性、烈性传染病紧急疫情防制工作的需要。PCR技术操作简便,能够对多种传染性疾病作出快速准确地诊断,已经成为检测各种禽类病毒性疾病的重要手段;同时,PCR技术在其他动植物病毒、细菌的检验检疫,螺旋体、支原体和真菌等病原体的检测鉴定中也得到广泛的应用。但PCR方法也存在着各种不足,如常规RT-PCR、巢式RT-PCR因其敏感性高易出现假阳性反应,荧光探针RT-PCR的变异出会出现假阴性,多重RT-PCR敏感性、特异性降低等等。相信随着现代分子生物学和免疫学的发展,PCR技术与其他现代生物技术的结合, 一定能够克服这些不足,建立起更快速、简单、准确、经济、灵敏、特异的方法,为养殖业的健康发展保驾护航。

摘要：传染性疾病已成为危害家禽业安全生产的主要因素,病毒性传染病变异性强、容易传播、难以控制;因此,建立快速、准确的检测方法对于病毒性传染病的防控非常重要。利用聚合酶链式反应(PCR)技术对病毒基因组进行诊断鉴定,与传统病毒检测方法相比具有快速、简便、特异性强的优势。目前,在常规PCR基础上已发展出套式PCR、实时荧光定量PCR、一步法多重PCR等,笔者对PCR技术在家禽病毒性传染病检测中的应用进行了分析与归纳,希望能对实验室研究和临床诊断提供帮助。