气道上皮细胞范文

气道上皮细胞范文（精选8篇）

气道上皮细胞 第1篇

肺炎支原体 (Mycoplasma pneumonia, Mp) 是机体非典型性肺炎的重要病原微生物, 并与支气管哮喘也存在一定关系[4]。大环内酯类抗生素是治疗Mp感染的首选药物[5]。越来越多的研究证实, 某些大环内酯抗生素类不仅具有抗菌活性, 还可发挥一定的免疫调控效应[6]。如有研究显示大环内酯类可提高DPB患者的存活率, 并能减少慢性下气道疾病患者的痰液产生[7]。此外, 哮喘患者气道中往往具有过多的黏蛋白, 但Mp是否能影响气道上皮细胞中黏蛋白的产生目前仍不清楚。本研究旨在探讨克拉霉素能否抑制Mp诱导气道上皮产生MUC5AC黏蛋白, 以及该效应是否与核因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB) 的激活有关。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鼠抗人MUC5AC单克隆抗体购自Neomarkers。辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 标记羊抗鼠多克隆抗体购自Santa Cruz。NF-κB转录因子活性检测试剂盒购自Millipore;核/胞浆蛋白分离试剂盒购自Bio Vision。Mp (ATCC15531) 和NCI-H292细胞株购自ATCC。PPLO培养基为Difico产品;马血清、胎牛血清、RPMI1640为Gibco公司产品;酵母提取物购自Oxoid。

1.2 试验方法

1.2.1 Mp培养

Mp接种于含马血清的PPLO培养基中于37℃、5%二氧化碳环境下培养, 当培养基由红色转变为橙黄色 (已生长至对数生长期) 后, 14 000 r/min离心15 min, 并用Hanks’平衡盐液洗涤2次。随后置于超声仪中 (Sonifier 250, Branson Ultrasonic) 超声10次, 每次1 min。14 000 r/min离心5 min后, 上清即为粗抗原, 并采用蛋白测定试剂盒 (Bio-Rad) 测定其浓度。

1.2.2 细胞培养

人气道上皮细胞系NCI-H292细胞用含10%FBS、100 u/m L青霉素及100μg/m L链霉素的RPMI-1640培养基中于5%二氧化碳37℃的环境下生长。当细胞生长成片生长时, 置于无血清条件下培养24 h, 然后加入支原体抗原刺激。在研究克拉霉素对MUC5AC的抑制效应时, NCI-H292细胞于Mp抗原刺激前, 用不同浓度的克拉霉素预处理30 min。阴性对照组仅加入培养基。

1.2.3 MUC5AC检测

采用利用酶联免疫分析 (ELISA) 测量MUC5AC蛋白的含量。细胞处理结束后, 弃上清, 随后用4℃PBS洗涤细胞。并加入裂解缓冲液 (20 m M Tris-HCl, 133 m M Na Cl, 1%NP-40及10%甘油) 裂解细胞。离心获取裂解上清液并测定其浓度后置于-80℃。检测MUC5AC时, 取裂解上清液置于96孔板中, 40℃下烘干。加入2%胎牛血清于37℃封闭1 h, 随后加入含0.05%Tween-20的MUC5AC抗体 (PBS稀释) 孵育1 h, 结束后加入HRP标记的羊抗鼠抗体, 37℃1 h。TMB法显色后, 再加入2N H2SO4终止反应。酶标仪下读取450 nm下的吸光度。

1.2.4 MUC5AC的m RNA表达检测

细胞处理结束后, 根据Quick Gene-Mini80及Quick Gene培养细胞RNA提取试剂盒 (FUJIFILM) 操作要求获取总RNA。利用oligo (d T) 引物及Super Script III逆转录酶将1μg RNA逆转录为c DNA后用RNA酶进行处理产物。设计特异性引物及Tap Man探针用于MUC5AC表达的定量。其正向引物为:5'-CAGCCAC GTCCCCTTCAATA-3';反向引物:5'-ACCGCATTTG GGCATCC-3';Taqman探针:5'-6-FAM-CCACCTCC GAGCCCGTCACTGAG-TAMRA-3') 。利用LightCycler PCR仪对MUC5AC进行扩增:95℃15 s;60℃30 s, 共40个循环。同时采用人卟胆原脱氨基酶 (porphobilino gendeaminase, PBGD) 为内参。数据以比值表示。

1.2.5 NF-κB转录因子分析

根据Bio Vision公司的胞核/胞质提取试剂盒获取细胞核提取物后, 用转录因子NF-κB活性试剂盒检测其p65活性。操作按照说明书提供的方法进行, 主要步骤包括:10μg待测样本和、俘获探针、双链生物素标记的含结合NF-κB结合序列的寡核苷酸共同加入链酶亲和素包被的96孔板中。37℃孵育后, 分别加入p65抗体和二抗。加入显色底物后, 全自动酶标仪获取每个样本的吸光度。

1.3 统计学分析

所有数据用 表示。NF-κB抑制剂处理实验采用t检验。组间比较采用单向方差分析后行Dunnet t检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 Mp抗原诱导NCI-H292细胞分泌MUC5AC蛋白和m RNA表达

ELISA结果显示, Mp抗原刺激24 h后, 能以剂量依赖性方式诱导NCI-H292细胞产生MUC5AC (图1A) 。实时定量RT-PCR结果显示, 10μg/m L Mp抗原刺激8 h之后, 能明显上调MUC5AC m R-NA的表达 (图1B) 。因此, 在随后的实验中, 我们以10μg/m L Mp抗原作为刺激浓度。

2.2 Mp抗原刺激对NF-κB活性的影响

p65是NF-κB的主要活性亚单位, 细胞核内p65的水平可以间接反映NF-κB的活性。Mp刺激20 min后, p65的含量显著性增加。随着刺激时间的延长, 活性逐渐增高, 60 min后达到峰值 (图2) 。

2.3 NF-κB激活与MUC5AC产生的关系

为了探讨Mp抗原诱导MUC5AC产生是否与NF-κB的激活有关, NCI-H292细胞在Mp抗原刺激前用10μM NF-κB特异性抑制剂咖啡酸苯乙酯 (Caffeic acid phenethyl ester, CAPE) 处理30min。如图3所示, CAPE处理后MUC5AC的生成显著下降。

2.4 克拉霉素对Mp抗原诱导MUC5AC表达产生的影响

细胞用不同浓度的克拉霉素预处理30 min后, 在用Mp抗原刺激6 h, 实时RT-PCR结果显示克拉霉素MUC5AC m RNA水平可有效减少MUC5AC的产生 (图4A) 。24 h后, 当克拉霉素浓度在50μg/m L时, MUC5AC蛋白产生的量仅增高了18% (图4B) 。

2.5 克拉霉素对Mp诱导NF-κB活化的影响

NCI-H292细胞处理前预先用克拉霉素处理30min, 随后用10μg/m L Mp抗原作用60 min, 结果显示, 不同浓度克拉霉素均能抑制p65的转位 (图5) 。

3 讨论

气道黏液分泌异常是各种阻塞性肺疾病 (包括哮喘) 最常见的病理特征之一。MUC5AC为黏蛋白的主要成分, 多种因素, 如大气污染物、炎症介质、细胞因子及某些细菌成分均可引起其表达上调[8]。如有研究发现, Mp能诱导哮喘患者体内分离的上皮细胞产生MUC5AC[9]。此外, 鼻病毒感染也可增加MUC5AC及总黏蛋白的产生从而加重哮喘的发作[10]。本研究表明Mp在m RNA和蛋白质水平上均能以剂量依赖性地增加MUC5AC的产生, 这意味着Mp通过产生气道黏蛋白可能会导致哮喘恶化。同时本研究也证实, Mp可促进NF-κB活化。尽管CAPE可减少Mp诱导的MUC5AC产生, 但也不能完全抑制它。这表明Mp感染后之后, NF-κB可能不是唯一可上调MUC5AC基因表达的转录因子[11]。因为MUC5AC基因的上游也存在AP-1转录因子结合位点。因此, AP-1也可能参与Mp刺激后MUC5AC的基因表达[12,13]。

最近, 大环内酯类趋向于各种阻塞性肺疾病的治疗。尤其是在严重的支气管哮喘病人的治疗中, 克拉霉素的复制治疗能明显提高患者生活质量评分[14], 并能减少气道中IL-8的浓度和嗜中性粒细胞的数量[15,16]。在某些呼吸功能恶化的患者中, 大环内酯类提高了症状评分及肺部功能[15]。但以上这些临床效益的原因仍不完全清楚。尽管大环内酯类抗菌药具有抗Mp的抗菌活性, 但在本研究当中克拉霉素对MUCAC的影响是免疫调制效应的结果, 因为笔者采用的是无感染性的Mp抗原。此外, 本研究中克拉霉素使用的浓度为50μg/m L。事实上在口服药物之后, 克拉霉素在肺泡巨噬细胞中的平均稳态浓度能超过300μg/m L, 而在黏膜上皮分泌液中也能超过3μg/m L。因此, 该研究中使用的抗生素浓度在临床病例中是可行的。

气道上皮细胞 第2篇

为了探讨山羊子宫内膜腺上皮细胞的`分离、生长条件以及纯度鉴定,通过2 g/L的Ⅰ型胶原酶置于水浴消化4 h,200目的滤网过滤后进行低速离心,收集沉淀物,沉降洗涤3～5次,将细胞移至24孔培养板置37℃细胞培养箱中进行培养.12 h后开始贴壁生长,腺团开始向外部扩散,生长2～3 d,细胞扩散并出现明显的铺路石状,4～5 d腺团基本扩散开来并呈一定走向继续生长.经免疫组织化学方法进行细胞染色,细胞表达角蛋白的阳性率达90%以上.

作 者：丰艳妮 吴庆侠 吴瑞 楚元奎 靳亚平FENG Yan-ni WU Qing-xia WU Rui CHU Yuan-kui JIN Ya-ping  作者单位：农业部家畜生殖内分泌与胚胎工程重点开放实验室,西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌,712100 刊 名：西北农业学报  ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRICULTURAE BOREALI-OCCIDENTALIS SINICA 年，卷(期)：2006 15(6) 分类号：S827 关键词：子宫内膜   腺上皮细胞   免疫组织化学   鉴定  

牛乳腺上皮细胞研究进展 第3篇

1 乳腺上皮细胞培养方法的研究进展

1957年,Lasfargues利用胶原酶消化法将乳腺细胞从乳腺组织中分离出来,第一次实现了乳腺细胞的直接培养。1961年,Ebmer等首先利用胶原酶消化法长期培养了牛乳腺细胞,但随传代的不断进行,上皮细胞逐渐被生长较快的成纤维细胞取代,并失去了原来所具有的组织能力。1980年,Medina在培养液中加入胰岛素、转铁蛋白、纤粘连蛋白、表皮生长因子、内皮生长因子等促进上皮细胞生长,抑制基质细胞的增殖,来纯化上皮细胞。1984年,Danielson[1]利用胰酶/EDTA轻微消化法,去除成纤维细胞。1987年,McGrath[2]利用密度梯度离心法,去除成纤维细胞、脂肪颗粒、细胞碎片、DNA纤维等成分,可以得到较为纯化的乳腺上皮细胞。1989年,Chaslam等试图通过细胞克隆得到纯净的乳腺上皮细胞,但正常乳腺上皮细胞的克隆率极低,要获得上皮细胞的单细胞克隆非常困难,即使有克隆出现,这些克隆极易老化,失去增殖能力。1994年,Frdshney利用细胞刮刀或放射性射线照射的方法去除成纤维细胞,用小片铅板挡住需保留的上皮细胞片,以射线照射上皮细胞片外的区域,这样未受到射线照射的细胞便存活下来,照射过的细胞便失去增殖能力,逐渐衰退、死亡。1995年Ahn等[3]采用低浓度(0.05%) 的胶原酶Ⅰ长时间(14 h) 的消化后,再用蛋白酶消化的方法分离了牛的乳腺上皮细胞,得到了50～100个细胞组成的牛乳腺上皮细胞团。2003年Novaro等[4]应用较高浓度(0.2%)的胶原酶A短时间(3 h)消化结合高速短时间离心的方法分离纯化了小鼠的乳腺上皮细胞。2006年多曙光等[5]应用较高浓度(0.5%)的胶原酶Ⅰ消化3 h 后,再应用蛋白酶处理并结合反复6次高速(1 500 g)短时间(15 s)离心的方法分离并初步纯化了乳腺上皮细胞,得到了较为理想的结果;经过初步纯化的细胞培养后,再采用贴壁培养的上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感性的差异进一步去除污染的成纤维细胞,得到了较为纯净的乳腺上皮细胞。

2 牛乳腺上皮细胞系的研究进展

细胞系有有限细胞系及无限细胞系两种。有限细胞系多属二倍体细胞系,正常情况下具有有限生命期,是由正常组织的细胞分离培养传代后得到的[6]。无限细胞系过去多是由癌细胞建立而成,多为类上皮型细胞,可无限传代,并具有不死性和异体接种致癌性[7,8]。近年来,随着分子生物学的发展,可以通过基因转移等分子生物学技术,将外源基因转入原代细胞中,从而获得无限的转化细胞系[9]。经过多年的实验探索,人们发现猿猴病毒获取早期基因转染的细胞系不仅可以获得永生性,还在不同程度上保持了原组织细胞的分化特点与功能。

最先建立牛乳腺细胞系是Schmid等,1983年他们利用传代乳腺细胞单克隆的方法得到的,这些细胞系被命名为BMGE+HM,BMGE+H及BMGEH(BMGE代表Bovine Mammary Gland Epithelium;+H,-H代表在细胞传代过程中加激素或不加激素)。细胞系BMGE+HM 没有上皮细胞多角形的典型形态特点,而是具有较长突起的瘦长形。由于这个细胞系能够合成细胞角蛋白及桥粒蛋白,证明这一细胞系是上皮型的。BMGE+H及BMGEH均具有典型的上皮细胞的形态特点,都能合成细胞角蛋白,但都不形成圆顶或泡状结构[10]。

1991年,Gibson等[11]采用无血清培养基原代培养,用密度梯度离心法富集上皮细胞,同时用胰酶消化去除成纤维细胞,然后用流式细胞计数器分离细胞,将细胞分成单个的或一组10个进行培养,等到第3代再进行细胞其他特性检验,建立了牛PS-BME-CI乳腺细胞克隆及PS-BME-L6和PS-BME-L7两个细胞系。这些细胞系或克隆都有上皮细胞的典型特征,并能表达乳脂球膜蛋白(PAS-11),用塑料瓶培养可形成圆顶型。用胶原作基质时则形成腺泡样聚集体(acinilike aggregates),这些都是乳腺上皮细胞的典型特征。不仅如此,该细胞系在胰岛素、催乳素、皮质醇的诱导下还可合成和分泌α-乳白蛋白和αS2-酪蛋白。将这种细胞注入雌鼠乳腺的脂肪垫中,8周内可形成非侵袭性的有波动感的细胞团,说明这几个细胞系或克隆是未癌化的正常细胞。

1991年,Shay等通过SV40LTA稳定整合诱导的永久细胞系包括ET-C、BME-UV、MAC-T三个牛乳腺上皮细胞系。同年,Huynh等[12]利用SV40病毒温度敏感突变株的T抗原基因转染牛原代乳腺腺泡样细胞建立了MAC-T细胞系,该细胞系外形亦呈现上皮细胞的典型特征,而且在催乳素的诱导下可以产生β-酪蛋白。

1995年,Huynh等建立了永生化牛乳腺细胞系HH2A,该细胞系可产生来源乳腺的生长抑制剂。1996年,zavizion等通过SV40LTA转染法建立了牛乳腺上皮细胞系BME-UV,该细胞系在IGF及EGF的作用下增殖加快,而且可表达低水平的特殊泌乳蛋白。由于外源基因在宿主细胞染色体上整合的位点不同,所以该细胞系的两个亚系对不同的生长因子反应有所不同,并且具有不同核型。

3 激素等调节因子对乳腺上皮细胞分化及增殖的调控

乳腺组织在动物体内的增殖、分化、组织结构的重塑、泌乳的启动和维持受许多因素的影响和作用,这些因素也同样影响体外培养乳腺细胞的增殖、分化、泌乳等功能的表现[13]。由于乳腺细胞的增殖和分化始终贯穿于乳腺发育及泌乳过程的两个重要方面,因此,在细胞水平上进行了大量的乳腺上皮细胞增殖及分化的调控研究。

3.1 激素等调节因子对乳腺上皮细胞生长的影响

在体内,多种激素成份共同作用于乳腺组织,促进上皮细胞的生长及分化,缺乏任何一种因子或激素,其它激素也会部分或全部地失去作用[14]。为此人们利用体外培养的乳腺细胞研究各种激素及其它调控因子的调节作用。雌激素对乳腺合成酪蛋白及乳糖是必需的,但体外培养的乳腺组织乳糖的合成不依赖于雌激素[15]。E2 对山羊乳腺上皮细胞有一定增殖作用,但须与 T3(三碘甲腺原氨酸)结合使用;孕酮或 T3单独或结合对该细胞均无效[16]。催乳素和胰岛素是两种主要的生乳激素,这两种激素在诱导乳腺细胞分化及维持这些细胞功能方面的作用己得到公认。但不同动物得到的结果不一致。Feldman等报道妊娠期小鼠的乳腺细胞在胰岛素存在情况下可合成少量酪蛋白,但酪蛋白的产生量并不依赖添加考的松、催乳素、雌激素及孕酮的量,它们只会使小鼠乳腺细胞合成特定蛋白的能力出现暂时性加强。Devinoy等实验证明兔和人的酪蛋白生成就不一定需要胰岛素的存在。Wamer等证明原代培养的小鼠乳腺组织,乳白蛋白的产生不依赖催乳素的作用。Atwood等[17]报道孕酮单独可以诱导青春期小鼠乳腺三级腺小管分支的形成,而除了E2和孕酮外其它因子可以诱导初级或次级管的发育。林桂娟等[18]报道孕酮可以促进乳腺上皮细胞生长,抑制成纤维细胞生长。Katigar等报道,生长激素可以代替催乳素在细胞分化上的作用,而Akers等认为牛乳腺上皮细胞缺乏生长激素的受体,同时,Romagnofo等也认为生长激素对牛乳腺上皮细胞无促进增殖的作用。Woodward等[19]报道,EGF和IGF-I对小鼠乳腺上皮细胞有协同增殖作用,但孕酮及E2和孕酮减少了体外EGF和IGF-I对小鼠乳腺上皮细胞的增殖反应,同时表明,孕酮可能对体外IGF-I诱导的细胞增殖具有抑制作用。

3.2 细胞外基质对乳腺上皮细胞生长的影响

上皮细胞和细胞外基质之间的关系十分密切,其生长和分化的因子主要来源于细胞外基质[20]。在动物机体内,上皮细胞位于基膜表面,基膜含有大量的胶原蛋白、附着蛋白和氨基多糖;在体外培养时,上皮细胞和细胞外基质之间的依存关系仍然存在[21]。 Emerman等于1977年首先利用从鼠尾制备的悬浮胶原作为基质,培养怀孕中期的小鼠乳腺上皮细胞。在鼠尾悬浮胶原作为基质的培养基中细胞可维持分化状态或被诱导进入分化状态;同时证明悬浮胶原使细胞处于极化状态,顶端微绒毛出现,基板形成,葡萄糖代谢类型发生变化,腔形成,大部分乳蛋白合成及分泌增加等上皮细胞功能的特点[22,23]。由此,人们开始重视胶原等细胞外基质的作用。实际上,胶原只是细胞外基质的一种,通常胶原蛋白或弹性蛋白以纤维形式发挥作用,蛋白多糖则在纤维与细胞或组织之间介导他们相互粘连[24]。目前,细胞外基质对细胞功能调节的重要性己得到公认,但其作用机理还不十分清楚[25]。

悬浮胶原的使用是细胞培养方法的一大进步,但生长在胶原上的乳腺细胞其分化状态并未完全恢复;增殖能力及分化程度均有限,而且不能合成乳糖[26]。Yang等[27]把细胞培养在基质胶之中时,细胞增殖能力加强,但其分化程度未改善。为了更好地模拟细胞生存的内环境,wicha等[28]利用基膜胶原(IV型胶原)做乳腺细胞培养的基质,细胞在这种基质上容易贴壁、增殖,其作用比I型和IV型胶原效果都好。但这种胶原对细胞维持分化状态并不比其他类型的胶原更有效,细胞的寿命也不能因此而延长。乳腺上皮细胞培养成功说明了乳腺细胞生物学功能的分化取决于细胞与底物的相互作用,在泌乳激素存在的条件下也是如此。胶原底物的应用,特别是悬浮胶原凝胶的应用,己经成为一种普遍采用的方法用于牛乳腺上皮细胞原代培养的研究。

鸡肠上皮细胞原代培养与鉴定 第4篇

体外培养细胞技术是现代分子生物学的一项重要技术,该技术与多种现代生物学技术相结合在生命科学的各个领域有重要价值。目前,对于人或者鼠的肠上皮细胞体外培养研究较多,尚未见关于鸡肠上皮细胞系培养的报道。体外培养肠上皮细胞是进行本试验研究的基础和前提。笔者进行了鸡肠上皮细胞原代体外培养,以期构建鸡肠上皮细胞c DNA文库并利用纯化的Ipa C蛋白对文库进行生物筛选,验证鸡肠上皮细胞是否存在与人肠上皮细胞相似的Ipa C蛋白受体分子。

1 材料

1. 1 试验动物

14,16,18 日龄SPF鸡胚,购自郑州市生物制药厂。

1. 2 主要试剂

Ⅺ型胶原酶、Ⅰ型中性蛋白酶、肝素钠、表皮生长因子( EGF) 、L谷氨酰胺( Gln) 、青霉素、链霉素,均为Sigma公司产品; DMEM / F12 细胞培养基,Hyclone公司产品; 胎牛血清( FBS) ,杭州四季青公司产品。

1. 3 培养用液

磷酸盐缓冲液( PBS) ,自制; 10% FBS - DMEM/F12 细胞生长液( p H值为7. 0) ,在DMEM / F12 细胞培养基中加入10% FBS、20 μg /L表皮生长因子、110 mg / L丙酮酸钠、200 mmol / L谷氨酰胺、100 IU / L青霉素、100 μg /L链霉素配成; 2. 5% FBS - DMEM/F12 细胞生长液( p H值为7. 0) ,在DMEM / F12 细胞培养基中加入2. 5% FBS、20 μg /L表皮生长因子、110 mg / L丙酮酸钠、200 mmol / L谷氨酰胺、100 IU / L青霉素、100 μg /L链霉素配成。

2 方法

2. 1 鸡肠上皮细胞的分离

参照参考文献[7 - 8]中的方法制备鸡肠上皮原代细胞: 分别取14,16,18 日龄鸡胚,用70% 乙醇擦其外壳,晾干后无菌取鸡胚肠组织于无菌玻璃平皿中,PBS反复洗涤5 次直至液体基本清亮。将肠系膜小心剥离,用无菌剪刀将肠组织剪碎( 小于1 mm3) ,用吸管吸入三角瓶中,用少量DMEM/F12 细胞培养基悬浮,室温静置3 min; 除去上清液,加入300 U/m LⅪ型胶原酶和0. 1 mg /m L Ⅰ型中性蛋白酶混合液,37 ℃ 水浴,80 r / min联合消化25 min; 待消化完成后1 000 r / min离心10 min; 弃去酶消化液,向沉淀中加入少量DMEM/F12 细胞培养基悬浮,静置5 min; 用吸管小心吸出细胞上清液,再在沉淀中加入少量DMEM / F12 细胞培养基悬浮,用吸管吸出细胞上清液,将两次悬浮吸出的细胞上清液收集于同一支离心管中,1 000 r/min离心10 min; 弃去上清液,在细胞沉淀中加入含10% FBS - DMEM/F12 细胞生长液,小心吹打,种植到细胞培养瓶中,放于37 ℃、5% CO2培养箱中培养,3 h后把细胞培养液连同未贴壁的细胞收集到离心管中,1 000 r/min离心10 min; 弃去上清液,向细胞沉淀中加入含2. 5% FBS - DMEM/F12 细胞生长液悬浮,分别种植于提前24 h用20% FBS包被过的一次性塑料细胞培养瓶和没有包被过的一次性塑料细胞培养瓶中,在37 ℃、5% CO2培养箱中培养,24 h后观察并首次换液。

2. 2 培养细胞的鉴定

在倒置显微镜下观察生长24 h细胞的形态和生长状态。

将培养24 h的原代鸡肠上皮细胞消化并离心,制成细胞团,用2. 5% 戊二醛磷酸缓冲液固定,制作超薄切片,用醋酸铀和柠檬酸铅染色,通过透射电镜观察分离培养的鸡肠上皮细胞微形态和结构。

3 结果

3. 1 酶消化法分离的肠隐窝单位观察结果

在分别选用3 种不同日龄的鸡胚分离培养鸡肠上皮细胞时,发现14 日龄鸡胚肠组织分离的肠隐窝单位少,后期贴壁效果差; 18 日龄鸡胚分离的细胞中成纤维细胞等杂细胞多,影响肠隐窝单位贴壁; 采用16 日龄鸡胚分离的肠隐窝单位多,杂细胞少,且后期培养的鸡肠上皮细胞生长状态好。采用300 U/m LⅪ型胶原酶和0. 1 mg /m L Ⅰ型中性蛋白酶联合消化25 min分离的肠隐窝单位较多,见284 页彩图1。

3. 2 鸡肠上皮细胞生长基质效果观察结果

经贴壁时间差纯化肠上皮细胞后,肠隐窝单位种植于未包被的一次性塑料细胞培养瓶中贴壁效果差,培养24 h后成纤维细胞等杂细胞多,见284 页彩图2。将肠隐窝单位种植于提前24 h用20% FBS包被过的一次性塑料细胞培养瓶中贴壁效果满意,见284页彩图3。

3. 3 倒置显微镜下细胞生长状态观察结果

在倒置显微镜下观察培养24 h的鸡肠上皮细胞形态,原代培养的鸡肠上皮细胞呈单层生长,互不重叠,生长状态良好,见284 页彩图4。

3. 4 透射电镜观察结果

在透射电镜下观察生长48 h后的鸡肠上皮细胞,可见肠上皮细胞的微绒毛单位,见284 页彩图5。

4 讨论

4. 1 鸡胚日龄的选择

马玉龙等［8］采用18 日龄鸡胚也成功分离培养出鸡肠上皮细胞。杨文平等［9］选择的是1 月龄鸡,由此可见,不同研究者在鸡胚日龄的选择上不尽相同,这可能与所用研究方法不同所致。本试验材料选用不同日龄的鸡胚分离培养鸡肠上皮细胞,发现16 日龄的鸡胚分离的肠隐窝单位多,培养的肠上皮细胞纯度高,增殖速度快,生长状态好。选用鸡胚避免了源头污染,在16 日龄时已经形成了十二指肠、空肠、回肠、盲肠等,而且在胚胎期肠上皮细胞生长迅速,增殖能力强,有利于鸡肠上皮细胞体外培养。本研究结果与参考文献[10]的报道是一致的。

4. 2 鸡肠上皮细胞体外培养方法

目前,体外分离培养肠上皮细胞的方法主要有组织块法、非酶消化法和酶消化法。组织块法是鸡肠上皮细胞原代培养最简单的一种方法,细胞分离培养速度较慢,成纤维细胞杂细胞多,纯化过程较为复杂。付文卓等［11］用组织块法成功分离出鸡肠上皮细胞。

非酶消化法较酶消化法温和,主要利用乙二胺四乙酸( EDTA) 的螯合作用,EDTA可以螯合溶液中的Ca2 +、Mg2 +,破坏细胞间的紧密连接,同时会产生一定的细胞毒性作用,不利于细胞在体外培养［12］。M.C. Aldhous等［13］利用EDTA的螯合作用成功分离到成年人肠上皮细胞。酶消化法是利用化学的方法去掉组织中的细胞间质,使其分散成单个细胞制成细胞悬液进行培养,细胞本身不受伤害。分离完整的肠隐窝单位是体外分离培养原代鸡肠上皮细胞的关键。另外,肠上皮细胞在离体后会快速凋亡,因此应尽可能缩短上皮细胞的离体时间,故选择合适的消化酶和确定适宜的消化时间至关重要。常用的消化酶有胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原蛋白酶和中性蛋白酶。胰蛋白酶是最常见的消化酶,是肽链内切酶,由于其消化能力太强,容易损害鸡肠上皮细胞,使其贴壁能力降低［14］。廖贤平等［15］用胰蛋白酶成功分离培养人肠上皮细胞。嗜热菌蛋白酶作用于肠黏膜基底膜特定分子,分离的细胞产量高,活力强［14］。古少鹏等［16］用噬热菌蛋白酶用较短的消化时间分离培养出活力强的鸡肠上皮细胞。胶原酶主要对细胞间质有消化作用,消化的是细胞间质而非细胞本身; 因此不会损害细胞膜而影响细胞贴壁［14］。本研究分离鸡肠上皮细胞采用300 U/m L Ⅺ型胶原酶和0. 1 mg /m LⅠ型中性蛋白酶混合消化,肠隐窝细胞团产率高,消化温和,既能有效减小消化酶细胞毒性,又能在短时间内有效地分离培养出高纯度的原代鸡肠上皮细胞。

4. 3 肠上皮细胞生长基质

肠上皮细胞是贴壁生长细胞,在离体培养中,支持物的表面性状也至关重要。血清中的蛋白质和纤维可有效改善培养支持物表面性状,提前24 h用20% FBS包被一次性细胞培养瓶可促进细胞贴壁生长。在细胞培养瓶中用胶原酶涂膜后,也可有效促进细胞贴壁［17］。

4. 4 培养条件

虽然,在细胞培养液中加入胎牛血清可有效促进肠上皮细胞生长增殖; 但是,如果胎牛血清浓度过高,会对细胞产生毒性,影响细胞生长。采用10% FBS的细胞生长液培养肠上皮细胞会使成纤维细胞等杂细胞逐渐成为优势细胞,降低肠上皮细胞纯度。采用2. 5% FBS - DMEM / F12 细胞生长液既可促进肠上皮细胞增殖,又可抑制成纤维细胞和平滑肌细胞等杂细胞的生长。

4. 5 促生长因子

细胞在体内生长有许多生长因子相互调节,在体外培养中加入促细胞生长因子可有效促进上皮细胞增殖分化。生长因子对于维持分化和未分化的细胞功能、保持细胞状态具有十分重要的作用。谷氨酰胺是肠上皮细胞分裂增殖所必需的营养物质,可促进人和动物肠上皮细胞蛋白质和核酸合成,调节细胞周期对维持肠黏膜的健康和正常功能是必需的,是肠上皮细胞增殖所必需的氨基酸［17］。表皮生长因子具有促进细胞的增殖和上皮再生的DNA、RNA合成作用。表皮生长因子通过与细胞膜受体结合,在细胞内传递中构成一个复杂的代谢网络,启动、催化、维持与细胞生长、增殖有关的一系列生化过程［18］。另外,胰岛素可促进K+、Mg2 +穿过细胞膜进入细胞内,可促进脱氧核糖核酸( DNA) 、核糖核酸( RNA) 及三磷酸腺苷( ATP) 的合成,在细胞生长液中加入胰岛素也可促进细胞增殖生长［19］。

4. 6 肠上皮细胞鉴定

目前,肠上皮细胞鉴定常用方法有碱性磷酸酶染色法、免疫细胞化学法及电镜法等。仅在倒置显微镜下观察不能确定为肠上皮细胞。肠上皮细胞上的碱性磷酸酶是肠上皮细胞微绒毛的标志性酶,利用碱性磷酸酶染色法可准确鉴定肠上皮细胞,刚分离的上皮细胞碱性磷酸酶活性强,随着培养时间的延长,其活性逐渐降低。免疫细胞化学法是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。采用细胞角蛋白结合上皮细胞表面的特异性抗原,可准确鉴定肠上皮细胞。肠上皮细胞微绒毛是肠上皮细胞的典型特征,用戊二醛固定后通过透射电镜观察微绒毛是鉴定肠上皮细胞有效的方法。

注: 箭头所示为肠上皮细胞微绒毛单位。

摘要：为了探讨鸡肠上皮细胞体外分离培养方法,进一步研究鸡源志贺菌Ipa C毒力蛋白在鸡肠上皮细胞上的受体蛋白分子,试验分别无菌取14,16,18日龄鸡胚肠组织,用300 U/m LⅪ型胶原酶和0.1 mg/m LⅠ型中性蛋白酶混合搅拌消化25 min,用壁差法纯化鸡肠上皮细胞,贴壁时间差为3 h,分别种植于20%FBS包被过的和未包被过的一次性塑料细胞培养瓶中,在倒置显微镜下观察细胞生长状态,透射电镜下对培养细胞进行鉴定。结果表明:采用16日龄鸡胚肠组织用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶联合消化25 min,可获得较多的肠隐窝单位,肠上皮细胞在20%FBS包被过的一次性细胞培养瓶中贴壁效果良好,细胞生长状态良好;透射电镜下可见鸡肠上皮细胞的微绒毛,鉴定为鸡肠上皮细胞。

气道上皮细胞 第5篇

细胞移行 (cell migration) 是一种十分重要的生物学现象, 比如说, 在创伤修复过程中。aPKC-Par3与PATJ是2种重要的极性蛋白, 参与调控上皮细胞的移行行为。但是2种极性蛋白是如何聚集到需移行的细胞周围的, 却一直不清楚。

研究人员鉴别了一种特殊的蛋白, 在外界刺激环境下具有吸引aPKC-Par3与PATJ蛋白聚集在上皮细胞周围的功能。 Occludin是一种存在于细胞连接处的细胞膜蛋白。最近的研究发现, Occludin还有鲜为人知的一种新功能。这种功能体现在创伤愈合过程中的肾上皮细胞中。研究人员发现, Occludin在17h内能促进90%的细胞完成创口愈合过程。而对Occludin进行功能性缺失研究发现, 只有28.6%的细胞能完成创口愈合过程。Occludin被发现存在于细胞连接处, 促进细胞移行。

气道上皮细胞 第6篇

关键词：羊膜上皮细胞,移植,脑卒中,护理

羊膜上皮细胞具有多潜能干细胞特性, 并可合成和分泌多种神经递质及神经营养因子, 在神经发育的过程中扮演重要的角色。近年来, 应用羊膜上皮细胞治疗帕金森病、脑和脊髓损伤以及中枢神经系统退行性疾病取得了一定的进展。我院自2002 年5 月至2009 年12 月间采用羊膜上皮细胞移植手术治疗脑卒中后遗症19 例, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2002 年5 月至2009 年12 月期间, 应用人羊膜上皮细胞移植治疗脑卒中后遗症患者19 例, 男11 例, 女8 例;年龄12~68 岁, 平均49 岁。病因:高血压14 例, 脑动静脉畸形2 例, 颅脑外伤3 例。GCS 5~6 分5 例, 7~8 分14 例, 平均住院31 d。

1.2 移植方法

采用椎管内蛛网膜下腔植入或脑室穿刺脑室内植入;采用脑卒中局部脑实质内移植, 共移植2~3 次, 间隔1 个月。

2 移植前护理

2.1 心理护理

由于患者缺乏神经干细胞移植方面的知识, 且对疾病预防后缺乏信心, 存在焦虑与恐惧, 故在移植前向患者提供有关方面的知识, 耐心细致地做好心理疏导与解释工作, 使其增强信心以最佳心理状态接受治疗。

2.2 完善好移植前各项准备工作

进行颅脑CT、脑核磁共振、血尿常规、血生化、肝肾功能、心电图等检查。

2.3 评估

(1) 肢体功能评估。以简式Fugl2 Meyer运动功能评定量表 (Fugl2 Meyer assessment, FMA) 评定肢体运动功能[1], 以改良巴氏指数 (modified Bart hel index, MBI) 评定日常生活活动能力 (activities of daily living, ADL) [2]。 (2) 语言功能评估。患者虽然失语, 但仍需与患者进行语言或非语言交流, 通过交谈和观察, 全面评价语言障碍的程度, 评价标准采用汉语失语症的流利性特征评分进行评定, 9~13 分为非流利性, 14~20 分为中间性, 21~27 分为流利性。

3 移植后护理

3.1 移植后72 h内严密观察

(1) 神志、瞳孔、T、P、R、BP变化, 并做好详细记录。 (2) 有无中枢神经系统感染、发热、头痛、腰脊部疾病, 并做好详细的记录。 (3) 术后免疫排斥反应等造成局部、神经系统或其他组织或器官的炎性反应, 甚至重要脏器功能障碍。 (4) 术后应用相关药物的过敏反应或不适应而导致肌体功能或器质性病变。一旦出现病情变化, 应及时报告医师。

3.2 切口的护理

由于头部脂性分泌物较多, 容易污染切口。因此, 每1~2 天更换切口敷料1 次, 定时给予75% 乙醇湿敷。适时剃除切口周围的头发, 以便于消毒切口、粘贴胶布。术后注意观察敷料是否干燥、清洁。如敷料有血性液体渗出或异常潮湿, 应及时予以更换。

3.3 心理护理

对患者移植后出现的每一点进步给予肯定, 并及时与床位医师进行沟通;鼓励患者主动体会移植后感觉功能和运动功能的变化, 并让患者共同参与移植后的训练计划, 从而增强患者战胜疾病的信心。向患者详细解释恢复过程中可能出现的问题, 以及所要采取的应对措施。加强护患沟通, 融洽护患关系, 取得患者及家属的信任和配合。

4 康复护理

4.1 偏瘫肢体功能锻炼

鼓励患者从简单的运动开始, 练习翻身及向上下、左右移动身躯, 手抓床栏练习起坐。每次起坐时间从5 min开始逐步增加至30 min, 直至1 h为止。训练10 d后, 再增加坐起时间及次数, 随着病情好转, 适时进行站立、行走训练;根据肢体功能恢复情况, 循序渐进, 制定一系列的锻炼计划, 逐步增加训练难度。如解衣扣、用筷、写字、洗脸、刷牙、梳头、穿衣服等, 利用各种形式进行肢体功能训练。

4.2 语言训练

根据患者的临床表现, 科学地评估失语的类型和程度, 采取灵活多样的训练方法, 充分调动患者语言训练的积极性、主动性, 坚持不懈、持之以恒地进行语言训练。为取得好的训练效果, 在训练过程中要教会家属语言训练的方法, 使家属能够主动协助医护人员对患者实施康复训练。实践证明, 亲人的支持帮助是患者语言功能恢复的重要保证。

4.3 出院指导

嘱患者继续进行肢体、语言康复训练, 并定时进行跟踪随访, 及时了解患者康复情况, 指导患者的下一步训练计划。通过对患者的慰问, 体现人文关怀, 树立患者康复的信心, 让患者用良好的心态面对自己的病情, 以利其顺利回归社会。

5 结果

移植前与移植后2 周进行比较, 多数病例 (14 例, 73.7%) 在肢体功能及言语能力在有所改善, 移植后2 年随访 (其中15 例获得随访) , 11 例 (57.9%) 功能上有较大改善, 多数言语较前流利, 可以说出完整句子, 行走不再需要支具, 部分患者步态恢复正常。

6 讨论

通过临床护理观察和出院随访表明, 大多数脑卒中患者在接受羊膜上皮细胞移植护理后, 在肢体运动、语言等方面都有不同程度的改善, 而且随着患者恢复期的延长症状改善越明显。脑卒中后的中枢神经系统在结构或功能上具有重组能力或可塑性, 康复护理训练促进了代偿和重组的产生[3]。我们从临床护理中体会到, 移植后的患者及早进行功能锻炼尤为重要。要想恢复到最佳的状态, 就必须积极制定一套正规系统的康复训练及全面细致的健康教育。在此过程中应不断地进行观察和测试, 进而来调整护理计划。同时建立和谐的护患关系, 发挥患者的主观能动性, 得到患者家属的密切配合也是及其重要的。总之, 脑卒中患者的康复是一个比较慢长的过程, 不可能一蹴而就。因此, 在训练期间患者要保持良好的心理状态, 不要急于求成。积极配合训练, 才能取得最佳疗效。

参考文献

[1]缪鸿石.脑卒中康复评定和治疗[M].北京:华夏出版社, 1996:9-12.

[2]王玉龙.康复评定[M].北京:人民卫生出版社, 2000:292-293.

气道上皮细胞 第7篇

1 细胞因子的影响

1.1 血管内皮细胞生长因子

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)是一种分子量为40～45 kD的分泌性糖蛋白,编码人类VEGF的基因位于染色体6p21.3上,该基因全长24 kb。体外实验发现其对血管内皮的增殖,血管构建的作用较强,且特异性高,VEGF还可以增加血管内皮细胞的通透性[2]。VEGF发挥作用主要依赖其受体的存在。其中VEGFR1和VEGFR2是血管内皮细胞的特异性酪氨酸激酶蛋白受体,而VEGFR3主要在淋巴管内皮细胞中表达[3]。由此可见,VEGF在干细胞向食管上皮诱导分化过程中有一定的意义。首先,VEGF可以促进组织工程食管中微血管的生成,并增加其通透性;其次,促进淋巴管的形成。以上两者的作用,创造出更接近于人体食管的微环境,有利于食管上皮细胞的增殖分化。

1.2 表皮生长因子

表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)是一种广泛存在于各种组织体液中的53个氨基酸组成的促有丝分裂的多肽,可促进多种细胞增殖,包括上皮细胞、间质细胞及神经干细胞等[4]。ECF在体外可刺激角化细胞分裂,在体内可促进上皮的再生[5]。许多文献报道,干细胞向食管上皮分化中出现分化消失现象,原因可能与培养基血清中的转移生长因子β(TGF-β)等因子抑制上皮细胞生长,但刺激成纤维细胞生长有关[6]。成纤维细胞的大量产生有有利的一面,也可以消耗培养基中大量营养物质,从而抑制上皮细胞生长。刘洪清等[7]采用添加EGF等细胞因子的方法,有效地促进食管上皮细胞增殖和传代,有效抑制成纤维细胞生长。EGF与靶细胞表面的EGF受体结合后,能刺激受体自身磷酸化及细胞内其它蛋白质的酪氨酸磷酸化,进而激活蛋白激酶C和磷脂酶C,通过第二信使CAMP、Ca2+激活CAMP依赖的蛋白酶,使细胞核内组蛋白对DNA的阻遏作用解除,促使有丝分裂信号向细胞内传递,从而引起DNA合成细胞增殖[8]。但不同浓度的EGF对BMSC促分化和促增殖的影响作用不同,其机理有待进一步研究。

1.3 转移生长因子β

转移生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一类多功能的细胞因子,参与多种细胞功能的调节,包括细胞增殖、分化、迁移,细胞外基质生成等。在干细胞向食管上皮分的过程中,TGF-β1的突出作用是促使各种细胞外基质(extra cellular matrixc,ECM),如胶原蛋白、连接蛋白(fibronectin,FN)、层黏蛋白(laminin,LN)和蛋白多糖的合成,抑制这些蛋白的降解,从而增加ECM的沉积[9]。TGF-β通过与细胞跨膜蛋白受体结合发挥其生物作用,其跨膜蛋白受体有三种亚型TGF-βRAⅠ、RⅡ、RⅢ。RⅠ、RⅡ有丝氨酸-苏氨酸激酶活性,RⅢ可促进TGF-β与RⅠ、RⅡ结合[10]。TGF-β1另一重要作用是刺激成纤维上皮细胞的生长,但其机制说法尚不统一。被TGF-β1刺激增生的成纤维细胞能促进食管上皮细胞增殖分化,有报道证实食管上皮细胞分层程度与加入成纤维细胞密度成正比[11]。

1.4 胰岛素样生长因子-1

胰岛素样生长因子-1 (Insulin-like growth factor1,IGF-1)是一个重要的细胞增殖因子。在细胞周期中,一旦细胞进入G1期,在其他生长因子缺乏的情况下,IGF-1可促进C增殖周期的完成[12]。IGF-1的活性主要是由胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)介导的,即IGF-1R很大程度上与细胞增殖状况有关[13]。它的这种作用,在组织工程食管上皮细胞分化增殖中十分重要。组织工程食管上皮在体外培养时,必然存在与体内微环境的不同之处,缺乏某些细胞因子,IGF-1上述特点正好弥补了此种不足,值得关注的是IGF-1刺激细胞增生抑制凋亡,又是致食管癌的发生的重要因素。IGF-1活性主要由胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)来调控,故对IGFBPs的研究也值得进一步深入研究。

1.5 碱性成纤维细胞生长因子

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,BFGF),有研究表明,体积大于1 mm3的组织就需要血液供应。组织工程中食管上皮细胞体积巨大,需要充足的血供,BFGF表达与食管中微血管密度有关。BFGF是一种碱性多肽,在体内广泛分布,是血管内皮细胞的有丝分裂素,它在体内可趋化血管内膜的各类细胞,并诱导这些细胞表达组织重建所需的血浆酶原激活剂等,通过刺激内膜各类细胞的增殖和迁移,诱导血管内皮细胞长入胶原基质中形成管腔,并促进神经元与新生血管的生长[14]。BFGF在促进神经元生成的作用,为研究组织工程食管神经的重建提供了新的思路与着手点。

2 细胞外基质的影响

在组织工程食管中,高分了聚合材料结构和成分单一,不能同时提供食管上皮细胞生长的ECM。而种子细胞与ECM的黏附及相互作用是细胞分化增殖的基础。故对ECM的研究,对组织工程食管上皮细胞分化增殖有重要意义。

2.1 胶原蛋白

研究发现I型胶原主要存在于食管的黏膜下层及肌层内,Ⅲ型胶原主要存在于食管的外膜弹力纤维层和黏膜下[15]。具有良好的生物相容性,极低的免疫原性,极强的促组织再生性[16]。鲍春荣等[10]用Ⅳ型胶原预涂材料表面,可有效地促进食管上皮细胞与支架的吸附和均匀分布。但在食管中各型胶原蛋白的比例关系及各型胶原如何特异性作用于食管的特定部位,还有待研究。

2.2 纤维连接蛋白

纤维连接蛋白(FN)是一组结构上类似、免疫源性相同的高分子糖蛋白,是体内重要的细胞外基质成份。它具有维持细胞正常形态参与细胞与细胞,细胞与基质间的粘连,促细胞生长,分化和增殖,调节细胞运动等功能,在正常食管上皮有表达[17]。在组织上工程食管上皮细胞诱导过程中,利用其具有细胞间或细胞与其他细胞外基质间的桥蛋白作用,促进食管上皮细胞的粘附,构成其它增殖,分化的基础。梁志刚等成功应用转染Ad.FnCBD64的食管上皮细胞体外构建组织工程食管。证明了FN具有增强种子细胞黏附力的效果。但FN分子量大,在实际的使用中存在转染种子细胞的困难,有待于寻找促进FN表达的实用性方法。

2.3缝隙连接蛋白(Cx43)

缝隙连接蛋白(Connexins,Cx)的缝隙连接普遍存在于上皮细胞间,缝隙连接蛋白CX43表达与胚胎发育,细胞诱导,分化,生长调控有关[18]。刘学红等[19]通过实验证实,2～4个月CX43蛋白呈阳性或强阳性表达,4个月后呈弱阳性表达,推测在食管神经系统及微循环系统未完善时期,Cx43通过参与细胞间缝隙连接调控信息转导及细胞的分化、增殖。在组织工程食管上皮细胞的培养中,诱导种子细胞向食管上皮细胞分化,利用Cx43特性促进分化增殖国内外尚无报道。笔者认为有待从实验中得到求证。

3 性激素

从食管癌发生的性别差异,不难发现性激素可能参与了上皮细胞的增殖分化,但不论雌雄激素,发挥生理作用均与其受体密切相关,雌激素(ER)在胎儿食管→正常食管上皮两者间出现到消失的规律。有学者认为最好的解释是ER参与了食管上皮细胞的增殖分化。ER的作用机制为雌激素弥漫入细胞后,先与靶细胞浆中特异性受体结合,形成激素受体复合物,复合物进入细胞核内,加上共激活因子的作用与核内受体形成单二聚体,影响DNA转录生成新的mRNA,从而生成新的蛋白质,影响细胞生理功能,雄激素(AR)作用机制与ER相似。但在性激素影响下产生了何种蛋白质影响了生物学功能尚不清楚,且人体内雌雄激素间存在复杂的相互影响,不同性别个体间雌、雄激素迥然不同,所以性激素对组织工程食管上细胞的分化影响还有待进一步研究。

4 Ca2+浓度及O2浓度的影响

4.1 Ca2+浓度与食管上皮细胞的增殖、分化密切相关

Ca2+浓度低于0.05 mmol/L时食管上皮细胞缺少桥粒,当Ca2+浓度大于等于0.05 mmol/L时角蛋白丝增加,桥粒出现。其机制可能为Ca2+充当第二信使激活CAMP依赖的蛋白激酶使细胞核内组蛋白对DNA的组合解除,促使有丝分裂信号向细胞内传递引起DNA合成,细胞增殖,并且整合素等粘附分子发挥作用也需要Ca2+的存在。

4.2 O2浓度的影响

O2浓度为微环境对组织工程食管上皮细胞分化的影响报道不一,有学者用CoCl2诱导缺氧条件,发现随缺氧时间延长,处于G0/G1期的细胞明显增加,S期减少,由此认为,缺氧对细胞周期进行负调控[20]。另一部分学者认为供氧不足,缺氧信号迅速传至细胞核内启动相关基因表达,以维持细胞和机体氧平衡,在这一过程中引起细胞的增殖分化,其中缺氧诱导因子-1 (HIF-1)是影响调控的最主要因子。组织工程食管种子细胞在体外诱导分化过程中,O2浓度必然高于正常处于体内的细胞,高O2浓度的影响是有利于细胞增殖分化,还是不利于细胞增殖分化,有待于进一步研究。

今后,组织工程食管的研究,应深入研究微环境如何影响种子细胞向食管上皮细胞增生、分化,如何在体外模拟体内的微环境。在不久的未来,组织工程食管必将应用于临床,给更多的患者减少病痛。

姜黄素对肠上皮细胞屏障的保护作用 第8篇

肠黏膜是机体最重要的防御屏障。其选择性吸收氨基酸、维生素、离子等营养物质,阻止肠腔内有害物质如细菌或毒素等穿过肠黏膜进入血液循环和其它组织器官。各种病理情况均能导致肠黏膜屏障功能受损,致使有害物质入血循环引发严重脓毒症、败血症,甚至多脏器功能衰竭[1]。笔者现就姜黄素(Cur)对乙醇诱导的肠上皮屏障损伤的保护作用进行探讨,报道如下。

1材料与方法

1.1材料Caco-2细胞株购于中科院上海细胞所;姜黄素、乙醇、荧光素钠购自美国Sigma公司;电阻仪购自美国Millipore公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养:Caco-2细胞在DMEM培养液中,37℃、5%CO2条件下培养。隔日换液,监测跨上皮细胞电阻(TEER)。细胞培养约21~28d后TEER明显升高,证明体外肠上皮屏障模型形成。

1.2.2分组:待Caco-2细胞肠上皮屏障模型形成后,分为空白对照组,不予特殊处理,乙醇组予终体积为10%乙醇共同孵育[1],姜黄素组予不同浓度(5、20、80μmol/L)姜黄素及乙醇,姜黄素较乙醇提前30min加入,共同孵育6h[2]。每项实验均选取至少3组非同代细胞进行。

1.2.3 TEER测定:TEER应用Millcell电阻仪测定:将电阻仪的两电极分别插入小室顶侧和基底侧浸没在液体中测量细胞单层电阻,整个过程在恒温37℃下进行,每个transwell均取不同方向的3个点,重复测定3次。电阻值用ohm/cm2(Ω/cm2)表示。

1.2.4荧光素钠透过率测定:于transwell小室顶端加入终浓度为67mg/ml的荧光素钠,基底侧加入0.6ml空白的HBSS,37℃,孵育6h后收集基底侧液体,应用荧光分光光度计测定荧光强度(激发波长490nm,发射波长520nm),根据荧光素钠的标准曲线计算荧光素钠的浓度。荧光黄钠透过率(%·h-1·cm-2)=(基底侧荧光素钠荧光量/最初加入顶侧的荧光素钠荧光量)·1h-1·0.33cm-2×100%[3]。

1.3统计学方法采用SPSS 12.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示,多组间均数差异性比较采用方差分析,组间比较采用LDS检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 TEER变化情况培养Caco-2细胞21~28d时,单层上皮细胞TEER平均值达到(288.85±26.11)Ω·cm-2,乙醇组TEER明显低于空白对照组(P<0.05),姜黄素治疗组TEER均较乙醇组增高(P<0.05),20μmol/L姜黄素治疗组最佳(P<0.05),5μmol/L与80μmol/L姜黄素治疗组TEER比较(P>0.05),差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2荧光素钠变化情况培养Caco-2细胞21~28d时,荧光素钠的透过率平均值约(6.48±1.85)%·h-1·cm-2。乙醇组荧光素钠透过率高于空白对照组(P<0.05),5μmol/L,20μmol/L,80μmol/L姜黄素治疗组荧光素钠透过率较乙醇组降低(P<0.05),20μmol/L姜黄素治疗组最佳(P<0.05),5μmol/L与80μmol/L姜黄素治疗组荧光素钠透过率比较(P>0.05),差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3讨论

肠黏膜屏障功能受损在一系列肠道疾病的发病机制中起着重要的作用。各种病理状态如严重脓毒症、败血症、急性胰腺炎、急性坏死性小肠炎、轮状病毒肠炎等均可导致肠黏膜屏障功能受损,致使细菌、毒素等有害物质透过肠黏膜进入组织器官及血液循环,形成恶性循环[3]。由于小儿肠黏膜屏障功能差,通透性高等特点,保护肠黏膜屏障功能非常关键。

Caco-2细胞培养后可融合形成肠单层上皮细胞,是国际上公认的研究肠黏膜屏障的体外模型。TEER是由于离子通过细胞间隙的流动形成,荧光素钠透过率体现的是肠单层上皮对小分子的通透性,这2个指标为反映细胞通透性的常用指标,本研究中空白组TEER高,荧光素钠透过率低,反映Caco-2细胞单层通透性低,证实体外肠单层上皮模型制作成功。乙醇可通过多种途径破坏肠黏膜,但确切机制尚不明确[4,5]。在本研究中终浓度为10%的乙醇明显降低肠单层上皮的TEER,同时造成荧光素钠透过率明显升高。与上述研究结果一致[4]。

姜黄素是从姜科植物姜黄、莪术中提取的有效成份,其药理作用广泛,包括抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗病毒等[6,7,8],本研究结果显示姜黄素可在一定程度上改善乙醇诱导的肠单层上皮屏障通透性增高,其中20μmol/L姜黄素治疗组的疗效最为明显。

综上所述,姜黄素能够有效的改善乙醇诱导的肠黏膜屏障功能破坏,为临床用药提供理论依据。

参考文献

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[2]Wang N,Wang G,Hao J,et al.Curcumin ameliorates hydrogen peroxide-induced epithelial barrier disruption by upregulating heme oxygenase-1 expression in human intestinal epithelial cells[J].Dig Dis Sci,2012,57(7):1792-1801.

[3]闫勇,尹致良,田伏洲,等.肠黏膜屏障损害致肠源性内毒素血症[J].中华胃肠外科杂志,1999,2(4):246-247.

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[5]Mitzscherling K,Volynets V,Parlesak A.Phosphatidylcholine reverses ethanol-induced increase in transepithelial endotoxin permeability and abolishes transepithelial leukocyte activation[J].Alcohol Clin Exp Res,2009,33(3):557-562.

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