高效表达范文

高效表达范文（精选9篇）

高效表达 第1篇

一、巧设舒适环境, 激发表达意愿

幼儿是活动的主体, 语言课堂教学中, 教师应充分利用现有条件, 努力为幼儿营造民主自由、舒适宽松, 并且充满互动气息的语言环境, 使幼儿在无拘无束的交往氛围中学习, 让幼儿想说、敢说、会说, 充分激发他们的语言表达意愿。 由于幼儿的语言都是在实践运用过程中不断积累起来的, 因此巧设一些富有运用价值的语言环境很有必要。 如在班级背景环境的布置中, 采用绚丽多彩的墙纸鼓励幼儿多说话、交流。 儿童节到了, 教师可以在墙面布置欢庆气氛的景象, 如缤纷的气球、鲜艳的花朵、美味的零食、可爱的笑脸、玩耍的小孩、起舞的孩童等, 让幼儿一一述说出来。

教师还可以在班级里组织幼儿举行讲故事比赛, 在语气、神情、感情、普通话是否流利等方面要求幼儿, 讲得好的奖励小礼品。 幼儿会模仿平时教师讲故事的语气, 有模有样, 从而培养幼儿的语言表达能力。

二、抓住语言规律, 完善语言表达

加强语言教学, 掌握语言规律是有目的、有计划地发展幼儿语言的重要手段, 在培养幼儿语言能力的过程中, 教师应注重改善教学内容设计, 使这一内容符合幼儿语言发展规律。 在幼儿语言教学课程中, 正确选择教材, 精心设计教学方案, 采用生动形象的教学方法, 充分调动幼儿语言积极性, 指导幼儿正确认识事物, 生动描述客观事物, 促进思维与语言发展。

无论是在家庭还是在幼儿园, 家长和教师的行为都很容易被孩子模仿和学习。 因此, 老师和家长都应注意自己的语言表达规范, 与幼儿多沟通和交流, 使孩子在良好的环境中提高语言表达能力。 平时课余时间, 组织小小故事会, 不要只停留在单纯复述上, 鼓励孩子根据自己的喜好编出有创意的故事, 不仅培养孩子们的语言创造性, 还提高他们的逻辑思维能力。从对成人的模仿中, 幼儿可以从一种能力中获得的技能与知识迁移到另一种语言能力的发展中, 进而促进另一种语言能力发展。 这种迁移发展往往起始于幼儿对成人良好行为的模仿。 因此在日常生活中, 无论家长还是教师, 都应该注重培养孩子的阅读习惯, 并且在幼儿面前表现出这一习惯, 在这样的氛围下成长的幼儿更容易对阅读书籍产生兴趣。

三、训练倾听能力, 增加彼此信任

倾听能力是幼儿的一项重要语言技能。 幼儿教师在教学中组织倾听能力训练时, 一方面, 要为幼儿营造温馨和谐的倾听教学环境。 可以给他们听感兴趣的儿歌, 慢慢训练他们的倾听能力。 此外, 还可以给幼儿多讲故事, 训练他们的倾听能力。另一方面, 幼儿教师应在幼儿倾听能力训练过程中促进其语言能力提高, 使教学活动获得更为有效的教育效果。 比如, 进行活动训练时, 应注重锻炼幼儿倾听能力与语言表达能力相结合。 幼儿教师讲完故事后, 可以让学生说出这个故事表达什么意思。 通过这种活动体验, 一定程度上改善孩子的语言表达及思维方式。

教师应培养孩子向老师倾诉的好习惯, 注意平时发展与孩子密切友好、互相信任的关系, 必要时向孩子透露自己的情绪和想法, 让孩子知道原来老师的“心里话”都会对自己说, 自己有话也应该与教师倾诉。

四、树立幼儿信心, 鼓励大胆发言

幼儿的自信心直接影响学习态度及喜好程度。 自信心的树立不但与以往成功和失败体验相关, 还与成人评价和期盼有关。 因此, 日常生活中, 无论是家长还是幼儿教师, 都要善于营造轻松愉快、幽默和谐的说话环境, 以信任及接受的态度鼓励孩子大胆表达自己的想法、情感和欲望。 对于那些语言表达能力较强的孩子, 努力为他们创造表现自己的机会。 对于那些不愿和别人交流, 性格内向、胆小自卑, 害怕说错话的孩子, 教师要主动接近并耐心听完幼儿的每一句话, 有原则性地鼓励他们根据自己的理解大胆表达, 从他们的讲话中挑亮点, 时刻保护孩子的自尊心。 有些幼儿口齿不清, 不能准确发音, 但又很有表达欲望, 要多给予耐心和包容, 及时指导和纠正他们的错误表达和不良发音。 时间一久, 幼儿因为多次得到教师及家长的激励性评价, 看到同伴赞许的眼光, 感受到成功的喜悦, 自然有了大胆说话的信心和勇气。

总之, 幼儿的语言表达能力培养对孩子一生有着举足轻重的作用, 这不是短时间内能完成的。 幼儿教师要根据幼儿的个性特点、身心发展特征培养他们的语言表达方式, 让幼儿多说、会说, 这样才能有效培养幼儿的语言表达能力。

摘要：作为人们交际的首要工具, 语言已经足够被用来交流和沟通人与人之间的生活经历、人生体验及思想感情, 增进相互理解。现实生活中, 每个人都离不开语言。所以, 孩童期间就应该充分培养孩子的语言才能, 对他们以后人生发展有着长远意义。因此, 提高幼儿的语言表达能力对其素质的全面发展有着至关重要的影响。本文针对幼儿语言表达能力培养进行探讨。

关键词：幼儿,语言表达能力,培养策略

参考文献

[1]兰琴香.幼儿语言表达能力培养的有效策略[J].中国科技教育-理论版, 2011 (1) :19-21.

高效表达 第2篇

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我凭着坚定的对发展前景看好的信念，一股热情，从事无限极第九个月就月入过万，第十个月业绩达27万/月。我很独立，我在江西做事业，业务指导远在珠海，我就自己看书看光碟，思索问题，继续前进。当我做到业绩40万一个月时，我感觉带不动我的团队了。怎么办？我分析：直销的魅力就是倍增，做市场要涌现大量独立业务员。为此，讲法要简单，当然要有效。如何让人一看就看见无限极的未来？如何吸引人来做？经过反复摸索总结，现在讲吸引人的奖金制度，成了我的强项。每次讲完之后，总会有3-5个人办卡。另外，我注意到，讲制度的时候，要用生活化的语言，要善于打比方。讲述时，我分几个步骤，第一步骤：1.问：你愿不愿意了解一些小常识？然后就做两款产品示范。做示范不宜做太多项。不然人家不耐烦。我一般做牙膏示范，洗发水或沐浴露。然后问：①产品质量好不好？ ②价格实惠不实惠？（作一下价格对比）③向人介绍产品行不行？ 三问。我的专卖店天天来听的人有100多人。记住，一定要板书。人少的话，也要拿一张白纸来板书。我会在白板上写出售牙膏的途径，传统的方法： 产品——代理——批发——超市或商店——顾客。中间商赚钱，应不应该？应该，因人家付出资金、时间、服务。但我们作为顾客，只是一个花钱的角色，只是消费者。但在直销行业，是： 产品——工厂——经销商（同时也是消费者）——顾客，我们换了一个角色，我们不仅仅花钱，我们还可以赚钱。我们不仅仅是消费者，我们还是生产消费者。无限极公司把中间利润合理分配给我们。这样好不好？太好了！

那么，听的朋友就会问：怎样才能成为业务员？经销商？我就讲第二步骤：

2．498元，就买到产品，公司免费送卡。我的手提包里随时袋着优惠卡，随时办卡。办卡有5大好处：

①在全国可享受八折购货。

②享有全球代理权。经销商的身份可复制。一个新人经销商，他有了业绩，那么他有利润，你也有利润，因为是你告诉他这个消息的。他带动香港、台湾、马来西亚的人做无限极，利润跟他有关，跟你也有关。

③锁住客户、倍增客户，你是没有围墙的公司。

④能继承。百年后，顾客、生产消费者还要洗头，中间利润还存在，你的卡号还存在，只是卡号转成你的小孩了，利润也不变，产生在你的小孩身上。

⑤你用这个卡，做到一万一个月的业绩，你就拿到公司分红，你就是公司股东了。

这样简单不简单？你每天同一个人讲，估计多少人相信你？跟你买？跟你做？如果你一个月讲30天，有2个人跟你做，这两个人又有两个人跟他们做，以此类推，第一个月2人，第二个月4人，第三个月8人，第四个月16人，第五个月32人，第六个月64人，第七个月128人，第八个月256人，第九个月512人，第十个月1024人，第十一个月2048人，第十二个月4096人。注意，中间不要点点点地省略，要全部写出来，以示倍增多么重要，多么不可思议，多么厉害！

然后讲第三步骤，这是要讲得慢：

3.大家想一想，4096人，要不要刷牙？

要不要洗澡，要不要洗头，要不要护肤？

要不要保健？肯定要，那么4096人一个月的消费是：

刷牙：36元X4096=147456元（约15万元）

洗澡：30元X4096=122880元（约12万元）

洗头：33元X4096=135168元（约13万元）

护肤：174元X4096=712704元（约71万元）

保健：268元X4096=1097728元（约110万元）

4096人消费：

15万+12万+13万+71万+110万=221万

假如公司回报奖金给你1.5%，这样做一年后，你的收入是：

221万X1.5%=3.315万/月

这样好不好？

我们的产品不贵，纯天然，我们可以在用的同时，顺便做起来，简单不简单？

还有，每月用完了牙膏，还需要不需要继续用？用完了洗发水，还要不要继续用？继续用，是不是就能建立永恒的消费群？这样宣讲引导，是不是就会有新人产生？在生意中，你是不是选择销售重复消费的日常用品？护肤品？保健品？这样的生意大不大？

第四步骤：用公司的精美画册促成，一页一页翻看讲解，最后促成办卡。

用我的这个简单易复制的方法（小学文化的伙伴以个月后也能讲得很好），我在2008年到2009年一年间，业绩增长了300万，我六个市场全线上扬，有的市场由12万/月一年间长到60万/月。

这样做轻松，简单。

参加早会，配合体系，大家轻松。很简单，大家都来专卖店，天天都是爆满的，我的流失率很低。

提包里一定要有产品，随时做示范。要有卡，表格，随时办卡。搞宽度，建50万/月的市场我的经验是花2-3年。

高效表达 第3篇

体验性学习是指在教学过程中，教师以一定的理论为指导，根据学生发展和教学需要，深度开发文本资源，巧设问题情境，激发学生深入思考体验，从而形成和发展正确的认识和情感，达到促进学生自主发展，培养“完整的人”的目的的教学活动。

教学案例

一位教师教学《天鹅的故事》一文的第二课时，紧扣文本内容，设计了三步学习预案，引导学生学习并交流：（1）找出文中的“三次叫声”，并发表看法；（2）找出文中老天鹅撞击冰面的特写镜头，抓住关键词语，体会老天鹅是“破冰勇士”这一称号；（3）对斯杰潘老人放下猎枪的理解和质疑。在写作手法的学习方面，掌握故事的三种写法，理解作者运用场面描写、点面结合、故事套故事等写作形式的目的和意义，尝试建构文本意义与形式之间的内在联系。

且看第二步学习预案的完成情况：

1.指名朗读第五自然段。

2.画出“像石头似的”、“腾空而起”、“撞击”、“颤动”等关键词语并理解。

3.想象体验：你在冰面上看到了什么？从中体会到什么？

生1：看到了一道缝裂开了。

生2：看到了又一道缝裂开。

生3：还看到了冰面上的羽毛和鲜血。

……

4.实践体验：让学生用自己的右手象征那只老天鹅，随着课文的内容，高高地举起，重重地落下。说出自己的感受。

生：痛呀！

师：再来一次！

生：更痛了！

师：继续不停！

生：太痛了！

（学生体验老天鹅第二次、第三次，无数次撞击冰面的情景，深化对其勇敢顽强以及“破冰勇士”这一称号的理解。）

5.老天鹅这一壮举不仅感动了我们，也感动了其他的天鹅。它们纷纷加入了撞击冰面的行列，而且鼓舞着，叫喊着，同时还感动了另一个人——斯杰潘老人。（顺势过渡引入到第三步预案的学习）

案例评析

江苏教育科学研究院杨九俊院长曾说过：“课堂教学要十分关注学生有效思维的时间长度，尽可能让学生形成有效思维……”《义务教育语文课程标准》明确提出：“语文教师应高度重视课程资源的开发与利用……创造性地理解和使用教材，积极开发课程资源，灵活运用多种教学策略，引导学生在实践中学会学习。”在平时的阅读课堂教学中，我们应在充分挖掘、领悟教材的基础上，创造性地处理与整合教材，对教材进行二次开发，对教学进行系统设计，在课文重难点处、关键处发现问题，提出问题，引导学生发现文本内容之间的内在联系，实现深度思考与体验学习的结合。本课教学中，学生的体验学习不可谓不深入，体验学习的磁力不可谓不强劲。此外，在作业设计方面，还设计了《老天鹅，我想对你说》的随文练笔以及环保实践活动。如此教学设计，充分考虑到文本教学内容的深度与延展度，在深度体验学习中，使课程改革的三维目标、思维拓展的具体要求得到充分体现，夯实了有效课堂教学的基础。

高效是我们课堂教学的目标，务实是课堂教学的手段。体验是学生获得知识，形成技能的重要途径。开展体验性教学，实现课堂教学的高效发展，我们还应注意一些问题。

1.突出主体，发挥主导。在体验性学习的课堂中，学生作为学习的主体必须真实参与言语活动。因此，我们应强调学生的“学”而非教师的“教”，应突出学生主体作用的发挥，而教者所要做的是精心创设体验情境，精心设计体验活动，对学习过程进行有效引领。

2.注重深度，避免浅表化。阅读教学呼唤深度的体验学习。然而，由于教者对体验学习的理解和实践局限于认识论的视阈，往往引导学生进行浅层性的体验学习。以角色表演体验为例，许多教师总会在课堂教学中创设一定的情境，让课堂“热闹非凡”。要知道，进行角色表演需要考虑文本的属性、人物的角色地位以及学生的身份实际；需要教者巧妙设计教学环节。否则，体验就会肤浅的，甚至是不伦不类，得不偿失。

3.尊重差异，鼓励表达。由于学生在认知水平、兴趣爱好、对事物的理解深度等方面存在差异，形成了学生体验深浅、快慢的个体差异。教者应正视这种差异性，留给学生各自不同的体验空间和时间，积极鼓励学生大胆地表达自己的体验感受。即使这些感受是片面的、零散的，也要给予尊重、肯定和赞赏。

著名学者王一川在《审美体验论》中写道：“体验，就是以身‘体之，以心‘验之，即身体力行，亲身实践。”体验性学习给语文课堂教学，给学生的语文学习带来诸多变化。在体验性学习中，学生与文本、教者、教科书编者进行着有效的体验互动，知识结构、情感积累、素养体系得以建构，彰显了高效语文课堂的应然表达。

高效表达 第4篇

关键词：pfuDNA聚合酶,高效表达,大肠杆菌,活性

pfu DNA聚合酶基因编码一个775个氨基酸的多肽,分子量 90 109 Da[1]。Pfu DNA聚合酶具有 3′5′外切酶活性,这使它在 PCR扩增过程中具有校正功能,具有高保真度,特别适用于需要高保真度的 PCR扩增[2,3],在分子生物学中应用广泛。本研究通过将pfu基因克隆至pET28a载体,并在大肠杆菌DH5α中高效表达,表达产物纯化后,PCR证实了Pfu酶具有较高的活性,表达的Pfu酶完全胜任商用Pfu酶活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌DH5α,BL21;pET-28a质粒,puc19-pfu(含有pfu基因的质粒)。

1.1.2 试剂

pfu DNA聚合酶,T4连接酶,BspHⅠ和XhoⅠ购自(宝生物(大连)有限公司);DNA回收试剂盒,DNA maker和蛋白质maker(北京天根公司)。

1.1.3 培养基

实验中所设计Lb培养基和凝胶均按照《分子克隆实验指南》的说明配置[4]。

1.2 方法

1.2.1 pfu基因的克隆

在PCR 50 μL反应体系中,以puc19-pfu 为模板(1 μL),加入保真DNA聚合酶1 μL,其Buffer(5)10 μL,正反向引物(P1 5’-AGATCAATGATTTTAGATGTGGATTA-3’和P2 5’- ATACTCGAGGGATTTTTTAATGTTAAG-3’)各1 μL(20 mmol/L),dNTP 2 μL(200 mmol/L),纯水31 μL。PCR程序:98 ℃预变性30 s;进入循环:98 ℃变性10 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃保温10 min。

1.2.2 重组pET28a-pfu质粒的构建

20 μL体系中分别加入pfu基因片段和pET-28a,BspHⅠ 和Xho Ⅰ 各1 μL。反应物混匀后,在37 ℃双酶切过夜。试剂盒回收双酶切后的pfu基因片段和pET28a,检测正确后,在10 μL体系中添加T4连接酶1μL,pfu基因片段(6.5μL),pET28a(1.5 μL),在16 ℃下连接3～4h。将连接产物加入50 μL DH5α感受态中,冰上放置30 min,42 ℃水浴热击60～80 s,然后迅速在冰上放置2 min。继续加入100 μL液体LB培养基,37 ℃温浴30 min活化,最后取菌液涂板(卡那霉素抗性),于37 ℃培养12 h。挑阳性克隆菌落PCR初步鉴定后,提取重组质粒酶切、质粒PCR鉴定和测序验证。

1.2.3 酶的诱导表达

取-20 ℃保存的DH5α(pET28a-pfu)菌种1:100加入2 mL液体LB培养基中,37 ℃、180～200 r/min培养过夜。将过夜菌1:50接入5 mL液体LB培养基中活化1～2 h,待细菌生长至OD600值为0.2左右时,加入IPTG(终浓度为1 mmol/L)诱导过夜(10～12 h)。

1.2.4 酶的纯化

将诱导10-12 h后的重组菌株,离心并重悬于10 mL PBS(50 mmol/L,pH 7.4)、500 mmol/L NaCl缓冲液中,冰浴超声波破壁,将细菌裂解液在80 ℃水浴30 min后,8 000 r/min离心5 min,取上清液用Ni柱纯化后透析,用SDS-PAGE检验纯度。

1.2.5 酶的活性检测

取不同浓度纯化后的pfu酶扩增目的基因DNA片段,商用pfu酶(1U)作对照,通过比较扩增的目的基因条带的亮度比较重组Pfu酶的活性。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET28a-pfu 的鉴定

目的片段回收后,与载体pET28a连接,连接产物转化DH5α感受态细胞。用菌落PCR初步筛选阳性菌落,提取质粒进行酶切,验证了重组质粒pET28a-pfu成功构建(图1)。

M,DNA marker;1,p ET-28a-pfu/Bsp HⅠ+XhoⅠ.

2.2 Pfu 酶在大肠杆菌重组菌株中的表达、纯化及鉴定

将单菌落重组大肠杆菌DH5α菌株过夜培养,次日1:50扩大培养,至对数期(OD600值为0.2)后,加入IPTG(终浓度为1 mmol/L)诱导表达10～12 h,Pfu酶的粗提液80 ℃处理30 min后,离心,过镍柱进一步纯化,纯化的结果如图2所示。

咪唑洗脱后的Pfu酶洗脱液通过透析并浓缩后,PCR检测纯化后的Pfu酶活性。纯化后的Pfu酶取0.04 μL与商用Pfu酶 1 U的活性相当(大连宝生)。PCR结果如图3所示: PCR产物中酶用量为0.04 μL条带与商用酶1 U条带亮度相当,表明本研究pfu酶不仅高效表达了,而且具有很高的生物活性。100 mL菌体诱导培养后,10 mL酶粗提液,经80 ℃热处理和镍离子亲和层析进一步纯化并浓缩后获得10 mL酶液,浓缩后酶液0.04 μl与商用Pfu酶1U活性相当,本研究表达后纯化的Pfu酶比活为62 500U/mg,明显高于孙章辉等[4,5,6]表达Pfu酶的比活。本研究工作为Pfu酶的实际应用奠定了的基础。

1,protein marker;2,E.coli DH5α(PET-28a)全蛋白电泳;3,重组菌株(p ET-28a-pfu)全蛋白电泳;4,纯化的重组Pfu酶。

Lane 1,protein maker;Lane 2,E.coli DH5αharbouring p ET28a;Lane 3,E.coli harbouring p ET-28a-pfu;Lane 5,purified pfu DNA polymerase.

1,商用Pfu酶(1 U)PCR产物;2～5,重组pfu酶PCR产物,用量分别为0.02、0.04、0.8、0.12μL;6,阴性对照。

Lane 1 PCR product amplified by pfu DNA polymerase from TAKARA(1U);Lane 2-5,PCR product amplified by recombinant pfu DNA polymerase(0.042,0.04,0.08,0.12μL);Lane 6,negative control.

3 讨论

Pfu DNA聚合酶拥有 3′5′外切酶活性,具有高保真性,在分子生物学和基因工程中的应用广泛,目前已商业化。许多研究者在大肠杆菌中表达了Pfu DNA聚合酶,但大部分表达的问题存在于表达量偏低,表达的Pfu DNA聚合酶活性不强[5,6,7]。本研究成功构建的重组大肠杆菌在IPTG的诱导下,高效表达了重组Pfu 酶,粗酶液经Ni离子亲和层析进一步纯化,获得了高纯度的重组Pfu 酶,PCR检测证明了纯化的Pfu酶具有较高的酶活性,高于其他研究者表达的Pfu酶的比活。本研究的Pfu 酶表达条件的进一步优化工作,以及纯化的过程中酶的活性的保持工作的研究还在开展之中。

参考文献

[1]Uemori T,Ishino Y,Toh H,Asada F,Kato I.Organization and nucleo-tide sequence of the DNA polymerase gene from the archaeon Pyrococcusfuorious[J].Nucleic Acids Research,1993,21(2):259-265.

[2]Cline J.,Braman J.C.,Hogrefe H.H.PCR fidelity of pfu DNA poly-merase and other thermostable DNA polymerase[J].Nucleic Acids Re-search,1996,4:3546-3551.

[3]Dabrowski S.,Kur J.Cloning and expression in Escherichia coli of therecombinant his tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pro-coccus woesei[J].Protein Expression and Purification,1998,14:131-138.

[4](美)F,M奥斯伯,等.马学军,等译.精编分子生物学实验指南[M].4版.北京:科学出版社,2005:785-890.

[5]唐雪明,方惠英,等.pfu DNA聚合酶的克隆及初步表达[J].无锡轻工大学学报,2001,20(1):29-31.

[6]孙章辉.重组大肠杆菌DNA聚合酶的提取及纯化研究[J].浙江大学学报,2006,25(1):19-21.

高效表达 第5篇

在秋风送爽的9月，黑马学堂迎来了任天行老师的《管理者高效演讲与表达技巧》课程，任老师专业干练的气质，谦谦有礼的举止首先就吸引了大家的眼球。他通过将自己多年独特、专业的演讲经验与课堂实际演练相结合，让大家领略到了演讲的真正魅力。

两天课程的学习让人受益匪浅、体会颇多，将其总结为三“金”。第一“津”，是“津津有味”，两天的学习让所有学员都集中精神，上课几乎没有走思的，没有犯困的，有的只是同学们一双双期待的眼神和一阵阵愉悦的实践练习声，大家都感觉时间过得飞快，甚至会觉得意犹未尽，还想再听。

第二“经”是取得真经的意思。在西游记中唐僧师徒经历九九八十一难才取得真经，而我们就利用短短两天就掌握了演讲的实质性技巧，可以说是取得了“演讲的真经”。演讲的一个中心，三个适合，万能公式“赞美+回顾+愿景”，条理化训练公式数量词+提炼词、拆词法，让复杂紧张的演讲过程变得简单愉快，逻辑清晰，大家都恍然大悟，仿佛已经掌握了秘诀，都有了想得心应手展示一番的冲动。

第三“今”是今非昔比的意思。过去我一直自信自己还算是比较擅长上台讲话的人，可是学习专业的演讲课程后我才知道，原来自己多年来所谓的上台经验与老师讲的相比就是业余与专业的`差距，只能算是入了门儿，并没有掌握其精髓。经过两天的学习，在场所有学员的精神面貌都焕然一新，过去不爱讲话的、害怕上台的学员，也都能主动上台即兴演讲，每个人都激情高昂、自信满满，克服了自己对上台讲话的恐惧，而且演讲内容结构合理，表达清晰。

老师讲到的那些看似简单的公式，仅仅两天时间就解决了所有学员多年对于自己口才不好和胆怯的困扰，这也是任老师教学的高明之处。在课堂上，老师一再强调知识要活学活用，任何学问不使用就等于白学，当然不会变通、不能与时俱进也是没有出路的。

我觉得，黑马学堂的课程越来越精彩了，也越来越能引起大家的积极性和学习的激情了。每节课都能给我们不一样的惊喜，让大家收获多多，受益多多。

此次课程让我们这些演讲小丑离专业的演讲者更近了一步，掌握了知识，最重要的是实践，是进一步去钻研、探索和尝试。期待黑马学堂的每一位学员能够学以致用，今后的工作中有更好地表现，能在进一步提高工作效率的同时，大大降低沟通成本，实现自我素质的综合提升。

高效表达 第6篇

研究发现, 变形链球菌 (Streptococcus mutans) 种内密度感应系统在调控感受态的诱导、生物膜的形成、变链素的合成以及耐酸反应方面发挥重要的作用[3,4,5,6,7]。与这些方面密切相关的一组基因统称为com 基因, 其中comD基因和comE 基因的编码产物组成了一个双组分的信号转导系统。其中一个组分是组氨酸激酶 (histidine kinase, HK) , 它由comD 基因编码, 作为胞膜蛋白感知外界信号, 并将信号传递给胞内的另一组分反应调节因子 (response regulator, RR) 。RR 由comE 基因编码, 它被激活后, 自身构象发生改变, 作为转录调节因子进入核内, 调控自身和其他com基因以及一系列密度感应相关基因的表达[8,9,10]。有研究表明, 敲除变形链球菌 (以下简称变链) comE 基因后, 细菌的转化效率大大降低, 耐酸能力下降, 不能合成变链素, 并且形成异常的生物膜[3,4,5,6]。因此ComE 蛋白是密度感应系统信号通路上的一个关键成份, 研究ComE 蛋白调控的下游基因及其相关的信号通路, 有助于揭示com基因家族信号转导通路的组成及了解变链密度感应系统信号网络的概况。

本研究将comE 基因克隆到pET28a (+) 表达载体中, 构建了pET28a (+) - comE 重组质粒, 并诱导其在大肠杆菌中高效表达, 最后获得高纯度的ComE 融合蛋白, 为后续进行变形链球菌密度感应系统调控机制的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

E. coli DH5α、BL21 (DE3) 由北京大学口腔医学院生物实验室保存, 原核表达载体pET28a (+) 由北京大学生命科学院结构生物学实验室惠赠。引物由上海英骏公司合成。高保真DNA 聚合酶ACCUpol (美莱博公司) , 限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ 及T4 连接酶 (NEB 公司) , IPTG (Sigma 公司) , Western blot中所用的抗体 (中杉金桥公司) 。DNA 胶回收试剂盒 (德国Qiagen 公司) , 细菌基因组提取试剂盒与质粒小量抽提试剂盒 (百泰克公司) 。镍金属螯合层析柱、Sephadex 75层析柱及ÄKTA Xplorer100 3D 自动纯化蛋白系统 (GE 公司) , 其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 comE 基因片段的获取

提取变链UA159基因组, 根据Genebank 公布的变链UA159 comE 基因序列设计1 对引物, 上游:5'- gcggatccatgatttctatttttgtattggaagat- 3', 划线部分为BamH Ⅰ 酶切位点, 下游:5'- gcctcgagctatcattttgctctcctttgatcag- 3', 划线部分为Xho Ⅰ 酶切位点。PCR扩增获取comE基因的全长序列。

1.2.2 comE 基因表达载体的构建与鉴定

质粒pET28a (+) 和PCR 产物分别进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ 双酶切及切胶回收, 连接后转化E. coli DH5α。经卡那霉素抗性筛选后, 挑单克隆提取质粒做PCR 和双酶切鉴定, 然后送上海英骏公司测序。

1.2.3 ComE 融合蛋白的诱导表达及表达鉴定

将测序鉴定后的重组质粒转化E. coli BL21 (DE3) , 挑取单克隆过夜培养。1∶50 扩培后增菌至A600 约为0.6, 加入IPTG 至终浓度1 mmol/L, 37 ℃继续振摇培养3 h。取1 ml 菌液, 离心后重悬在100 μl buffer A (20 mmol/L Tris- Cl, 500 mmol/L NaCl, pH 7.4) 中, 加入等体积的2SDS 上样缓冲液, 100 ℃, 10 min后离心取上清8 μl上样, 12% SDS- PAGE 分析。进一步用His- tag 的抗体和变链的全菌抗体分别进行Western blot 鉴定表达产物。

1.2.4 ComE 融合蛋白的可溶性鉴定

收集诱导后菌液1 ml, 冰水浴中超声处理, 之后4 ℃离心分别收集上清和沉淀, 12% SDS- PAGE分析。

1.2.5 ComE 融合蛋白诱导表达条件的优化

设置A600约为0.4、0.6、0.8和1.2 4 个梯度, 诱导温度37 ℃、30 ℃和18 ℃ 3 个梯度, 诱导时间2、4、6、8、10、12、15 h 7 个梯度以及IPTG的浓度 0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00 mmol/L 7 个梯度, 采用同样的方法处理样本后, 12% SDS- PAGE 分析。

1.2.6 ComE 融合蛋白的大量纯化及定量

增菌1 L, 用优化的条件大量诱导目的蛋白的表达, 收菌后重悬在40 ml的buffer A 中, 加入PMSF (0.1 mol/L) 400 μl, 冰水浴中超声处理。4 ℃离心后收集上清, 在ÄKTA Xplorer100 3D 自动纯化蛋白系统监测下, 过镍金属螯合层析柱后收集到目的蛋白峰约30 ml, 超滤管浓缩后用Sephadex 75 层析柱除盐并更换蛋白溶解缓冲液为PBS。BCA法测蛋白浓度, -80 ℃冻存。

2 结果

2.1 PCR 产物和质粒的双酶切

PCR 产物双酶切后条带位于相对分子质量标准的750 bp 条带稍上方, 与comE 基因753 bp大小相符, 且无非特异性扩增条带;质粒双酶切后条带位于5 kb条带稍上方, 与pET28a (+) 5.3 kb 大小相符。

2.2 重组质粒的构建及鉴定

双酶切后的目的片段和载体连接后转化E. coli DH5α, 经卡那霉素抗性筛选后, 挑取2 个阳性克隆进行PCR 及双酶切鉴定。结果显示, PCR 均扩增出单一条带, 大小与目的基因相符;双酶切后均产生一大一小2 个片段, 小片段与PCR 产物双酶切后位置相同, 大片段与质粒pET28a (+) 的双酶切产物位置一致 (图 1) 。测序表明重组质粒中的插入序列为comE 基因的全长片段, 无碱基的突变与读码框架的偏移, 将此重组质粒命名为pET28a (+) - comE。

1: D2 000 DNA ladder; 2:变链UA159基因组为模板的PCR 产物的双酶切产物; 3:1号单克隆中提取的质粒的双酶切产物; 4:2号单克隆中提取的质粒的双酶切产物; 5:质粒pET28a (+) 的双酶切产物; 6:1 kb DNA ladder

2.3 ComE 融合蛋白的诱导表达及Western blot 鉴定

将pET28a (+) - comE 转化入E. coli BL21 (DE3) 中, 诱导表达融合蛋白。预计目的蛋白相对分子质量为33 000, 12% SDS- PAGE 分析显示, 诱导后样本和诱导前样本在此位置均有蛋白条带可见, 但同样的上样量, 诱导后样本的条带明显粗于诱导前样本, 因此推测诱导前样本中的蛋白条带为菌体蛋白带 (图 2) 。His- tag抗体的Western blot 鉴定结果显示, 仅诱导后携带重组质粒的样本中出现了特异性条带, 未诱导的携带空载体和重组质粒的样本在同样的位置均无条带可见;变链全菌抗体的Western blot鉴定结果显示, 诱导后重组质粒样本中相对分子质量33 000位置出现了条带, 而同样位置2 个阴性对照无条带可见。因为变链的全菌抗体不是ComE 融合蛋白的特异性抗体, 所以可见非特异性条带 (图 3～5) 。

2.4 ComE 融合蛋白表达的可溶性鉴定

可溶性鉴定结果表明融合蛋白在上清和沉淀中均有表达 (图 6) 。

2.5 ComE 融合蛋白诱导表达条件的优化

经12% SDS- PAGE 分析, 各组表达条件优化的结

1:非预染的蛋白Maker; 2:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 3、4:含pET28a (+) -comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前和诱导后样本

1:非预染的蛋白Maker;2:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本;3、4:含pET28a (+) -comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前和诱导后样本

果表明, 增菌至A600 约为0.4, 加入IPTG 至终浓度0.10 mmol/L, 37 ℃振摇诱导4 h可获得最大目的蛋白表达量 (图 7～10) 。

2.6 ComE 融合蛋白的大量纯化及浓度测定

两步法纯化后得到了ComE 融合蛋白, 12% SDS- PAGE 分析显示, 纯化后蛋白条带与诱导后样本中的蛋白表达带位置一致, 相对分子质量约为33 000, 且无杂带可见 (图 11) 。BCA 法测得蛋白的浓度约为0.2 mg/ml。

1:非预染的蛋白Maker;2:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本;3、4:含pET28a (+) - comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前和诱导后样本

箭头所指处为目的条带, 其他条带为杂带; 1:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 2、3:含pET28a (+) - comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前和诱导后样本

3 讨论

龋病是危害人类口腔健康的常见病及多发病之一, 主要的致病因素是龈上菌斑的形成和持续存在。龈上菌斑是位于牙表面的生物膜, 为口腔细菌的定植、生长和繁殖提供了一个微生态环境。在此环境中, 变链通过密度感应系统来感知群体的密度, 相互交流, 及时调控某些基因的表达, 改变行为方式, 更好地适应外界环境, 因此这种密度感应相关的交流对变链的生存至关重要。研究密度感应系统信号转导通路有助于揭示变链主要毒力因子的分子调控机制, 发现通路上关键的成份如ComE 蛋白及其相关的信号传导途径, 阻断主要信号分子的识别及传导, 干扰密度感应系统, 最终影响密度感应系统所调控的生理功能及毒力基因的表达, 为龋病的防治提供新的切入点[11]。

本文以ComE 蛋 白 为 研 究 中 心, 构 建 了pET28a (+) - comE 原核表达载体, 然后在E. coli BL21 (DE3) 中诱导表达了6His- ComE 融合蛋白。12% SDS- PAGE

1:非预染的蛋白Maker;2:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本;3～6:含pET28a (+) - comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本、诱导后全菌样本、诱导后上清样本、诱导后沉淀样本

1:非预染的蛋白Maker; 2:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 3:含pET28a (+) - comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 4: A600约为0.4时开始诱导的样本; 5:A600约为0.6时开始诱导的样本; 6:A600约为0.8时开始诱导的样本; 7:A600约为1.0时开始诱导的样本;

1:非预染的蛋白Maker; 2:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 3:含pET28a (+) - comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 4～10:诱导后2、4、6、8、10、12、15 h样本

1:非预染的蛋白Maker; 2:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 3:含pET28a (+) - comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 4: 37 ℃诱导4 h样本;5:30 ℃诱导8 h样本; 6:18 ℃诱导24 h样本

分析显示, 在预计的目的蛋白相对分子质量33 000的位置, 诱导后样本出现较其他菌体蛋白浓粗的蛋白条带, 但是在同样的位置, 未诱导的样本也出现了较细弱的条带。为进一步证实融合蛋白的表达, 分别用His- tag的抗体和变链的全菌抗体做Western blot 验证。在预计的位置, 2 种抗体的Western blot均在诱导后样本中出现了反应条带, 而未诱导样本在同样 位 置无条 带 可

1:非预染的蛋白Maker; 2:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 3:含pET28a (+) - comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 4: 0.10 mmol/L IPTG诱导的样本; 5: 0.25 mmol/L IPTG诱导的样本; 6: 0.50 mmol/L IPTG诱导的样本; 7: 0.75 mmol/L IPTG诱导的样本; 8: 1.00 mmol/L IPTG诱导的样本; 9: 1.50 mmol/L IPTG诱导的样本; 10: 2.00 mmol/L IPTG诱导的样本

1:非预染的蛋白Maker; 2:含pET28a (+) 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本; 3、4:含pET28a (+) - comE 的E. coli BL21 (DE3) 的诱导前样本和诱导后样本; 5:纯化后得到的ComE 融合蛋白

见。由此推断, 未诱导样本中的蛋白条带应为菌体蛋白, 恰好与目的蛋白大小相近, 故跑胶出现在同一位置, 并非泄露表达。

为获得最大的蛋白表达量, 分别优化了诱导时菌液的A600 值、IPTG浓度、诱导时间和温度4 个表达条件[12,13], 发现培养细菌的A600值至0.4 时开始诱导, 可获得最大的蛋白表达量, 分析原因可能是A600 达0.4时, 细菌刚开始进入对数生长期, 此时细胞内各种合成反应及生命活动都处于上升期, 蛋白的合成也渐达峰值, 继续培养达平台期后, 细菌活力下降, 蛋白表达量也随之下降。蛋白表达量也不与诱导时间成正比, 4 h时表达量达到峰值, 之后随着诱导时间的延长, 蛋白表达量反而有所下降。不同的IPTG 浓度对蛋白表达量的影响不是很大, 各浓度梯度目的蛋白均有表达, 以0.10 mmol/L IPTG诱导时, 蛋白的表达量最大。

蛋白分离纯化的方法有多种, 如凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析和亲和层析, 每种方法有其不同的原理和优势。金属螯合层析是亲和层析的一种, 它利用蛋白与金属离子间的特异性吸附作用来分离蛋白。蛋白表面的一些氨基酸如组氨酸可以与某些金属离子如Ni2+结合, 而Ni2+离子又能够以亚胺络合物的形式耦合到固定相上, 从而形成了亚胺金属-蛋白螯合物。因此含有组氨酸的蛋白就能够特异性地吸附在螯合了镍金属离子的固定相上, 而不含组氨酸的杂蛋白就会随着结合液流出[14]。凝胶排阻层析又称大小排阻层析, 是一种根据蛋白质分子的大小和形状来分离蛋白的方法, 不同大小和形状的蛋白质分子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而得以分离。本文采用镍金属螯合层析与凝胶排阻层析相结合的两步法进行纯化, 蛋白裂解液过镍柱后, 得到了含组氨酸的蛋白, 这些蛋白以含6His 标签的目的蛋白为主, 但也存在含组氨酸的大肠杆菌的菌体蛋白。取上述蛋白液再过分子筛, 大分子的蛋白先洗脱出来, 小分子的蛋白后洗脱出来, 几乎所有含组氨酸的蛋白因分子大小不同而得以分离, 收集目的蛋白峰即可获得高纯度的目的蛋白。

综上, 本研究获得了高纯度的ComE 融合蛋白, 为后续进行变形链球菌密度感应系统调控机制的研究奠定了基础。

摘要：目的:构建变形链球菌comE基因原核表达载体, 诱导ComE融合蛋白高效表达, 获取高质量的ComE融合蛋白。方法:提取变形链球菌基因组, PCR扩增得到变形链球菌comE基因片段, BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后定向克隆到pET28a (+) 表达载体中, 并转化入E.coli BL21 (DE3) 。IPTG诱导融合蛋白表达, Western blot鉴定表达产物。进行蛋白表达的可溶性鉴定, 并优化诱导时菌液的A600值、IPTG浓度、诱导时间和温度4个表达条件。然后用优化的条件大量诱导表达ComE融合蛋白, 采用镍柱和分子筛两步法进行纯化。结果:经PCR、双酶切反应以及测序鉴定, 重组质粒中的插入序列为comE基因的全长片段 (753bp) , 无碱基的突变与读码框架的偏移。Western blot证实表达产物确为6×His-ComE融合蛋白, 相对分子质量约为33000。目的蛋白在上清和沉淀中均有表达, 且当A600为0.4时, 加入IPTG至终浓度0.10mmol/L, 37℃诱导4h后表达量最大。结论:成功构建pET28a (+) -comE原核表达载体, 用优化后的6×His-ComE融合蛋白在E.coli BL21 (DE3) 中的表达条件, 获得纯化的变形链球菌ComE融合蛋白。

高效表达 第7篇

聚乙二醇(PEG)修饰是使用最广泛的提高蛋白药物半衰期的方法。但是GLP-1由于分子量太小,不适于直接使用PEG修饰。有研究发现通过替换GLP-1个别位点的氨基酸或是对某个氨基酸进行化学修饰,也可明显地延长GLP-1在体内的半衰期,提高其生理活性[9,10,11,12,13]。现在,长效GLP-1的研究主要集中在对其氨基酸进行化学修饰[14,15,16]或构建复合体以增加其半衰期[17]。

很多研究已证明,重组蛋白与人IgG抗体Fc段融合表达,形成融合蛋白即Fc-融合蛋白,可以明显地提高重组蛋白的稳定性,增加其半衰期。作者结合两种方法,首先将GLP-1的第二位氨基酸由Ala变为Gly,消除DPP-Ⅳ位点,然后将其与人IgG Fc分子偶联构建一个IgG样的嵌合分子,并利用毕赤氏酵母(Pichia pastoris GS115)进行高效表达获得长效的GLP-1-IgG Fc融合蛋白,为下一步的活性测定和产业化开发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

Escherichia coli DH5α由作者实验室保存;毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)、质粒pPIC9K为Invitrogen公司产品;人IgG Fc 基因由山东大学医学院免疫学研究所张利宁教授惠赠。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、DNA marker、Protein Marker购自Fermentas公司;T4 DNA 连接酶、DNA聚合酶TransTaq Hifi、质粒pEASY-T1 Simple购自北京全式金生物技术有限公司;G418 购自上海生工生物技术有限公司;酵母提取物和蛋白胨购自OXOID公司;HRP标记羊抗人IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其余试剂均为购自国药的分析纯试剂。

1.1.3 仪器

PCR仪、凝胶成像仪、电转化仪购自Bio-Rad公司;DNA电泳槽、SDS-PAGE电泳槽购自北京六一仪器厂。

1.1.4 培养基

LB培养基(1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1% NaCl,pH 7.0);BMGY(1%酵母提取粉,2%蛋白胨,1.34% YNB,100mmol/L磷酸缓冲液pH 6.0,410-5%生物素,1%甘油);BMMY(1%酵母提取粉,2%蛋白胨,1.34%YNB,100mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0,410-5%生物素,0.5%甲醇);MD(1.34%YNB,410-5%生物素,2%葡萄糖)。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

根据GeneBank公布的基因序列设计上游和下游引物各3条:G1(GLP序前):5’-TCTGAATTCGAGAAAAGACATGGTGAAGGTACTTTTACTTCTGATGTTTCCTCTTACTTGGAAGGACAAGCTGCTA-3’;G2(GLP序后):5’-TCCTCTTCCTTTAACCAACCATGCAA TGAACTCCTTAGCAGCTTGTCCTTCCAAGTAAGA-3’。C1(IgG前):5’-GAGTCCAAATCTT GTGACAAAACTCACAC-3’;C2(IgG后):5’-TATGCGGCCGC TCATTTACCCGGAG ACAGGGAG-3’。L1(延伸前):5’-TTGTCACAAGATTTGGACTCTCCTCTTCCTTTAACCAACC-3’;L2(延伸后):5’-GGTTGGTTAAAGGAAGAGGAGAGTCCAAATCTTGTGACAA-3’。其中 G1、G2为扩增GLP-1的引物序列,在G1中引入EcoRⅠ 酶切位点,并将GLP-1的第二位氨基酸由Ala变为Gly;以C1和C2为引物扩增得到人IgG Fc基因序列,同时在C2中引入终止密码子和NotⅠ酶切位点;引物L1和L2为正反互补的两条链,是GLP-1基因的C端和IgG Fc基因的N端组成的拼接序列,用于连接GLP-1基因和IgG Fc基因。以上所有引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 GLP-1基因的获得及扩增

使用 G1、G2分别互为引物和模板,进行PCR扩增得到GLP-1基因。PCR反应条件为:94℃ 45s,54℃ 45s,72℃ 45s,共30个循环,72℃ 延伸10min。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后,用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。

1.2.3 融合基因及表达载体的构建

以 C1为上游引物,C2为下游引物,并以含IgG Fc基因的质粒为模板,PCR反应扩增人IgG Fc基因。分别以引物G1和L1为上下游引物进行PCR,得到在C端含有IgG Fc基因的N端部分序列的GLP-1基因;同样利用L2和C2为引物PCR得到N端含有GLP-1基因C端部分序列的IgG Fc基因;然后将以上得到的两个基因片段使用重叠延伸PCR的方法进行体外拼接,获得嵌合体基因。将得到的嵌合体基因使用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切,并将酶切后的纯化产物插入到经过同样双酶切处理的pPIC9K质粒中,构建巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K-GLP-1-IgG Fc(简称为 pPIC9K-GF)。使用PCR及EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的方法对表达载体进行鉴定。鉴定后的阳性克隆作进一步测序鉴定。

1.2.4 分泌表达载体转化毕赤酵母菌GS115及其鉴定

将经过测序验证正确的pPIC9K-GF载体用SacⅠ内切酶进行线性化处理,然后采用Bio-Rad电转化仪提供的电转化方法转化至感受态毕赤酵母菌中,涂布MD平板进行筛选。将阳性菌株提取基因组后使用5-AOXI和C2为引物,进行PCR验证。将经过验证的重组菌株分别划线培养于添加浓度梯度G418(1.0mmol/L,1.75mmol/L,2.0mmol/L,3.0mmol/L,4.0mmol/L)的筛选平板上,培养3～5d后将阳性转化子再次进行PCR验证。阳性菌株进行发酵检测并菌种保藏。

1.2.5 融合蛋白在毕赤酵母菌GS115中的表达及鉴定

挑取经过验证的高拷贝重组质粒转化子的单菌落,接种于25mL BMGY中,30°C、280r/min培养至OD600达到2～6。3 000r/min离心5min收集细胞,弃去上清,用BMMY培养基重悬细胞,转入50mL BMMY中,25°C、280r/min诱导蛋白表达。每24h取样1mL,并补加一次甲醇至甲醇浓度0.5%,120h结束诱导。同样条件培养GS115菌株作为阴性对照。将所取样品离心取上清,用TCA处理,将沉淀进行SDS-PAGE并使用HRP标记的羊抗人IgG抗体进行Western Blot检测。

2 结果与分析

2.1 融合基因GLP-1-IgG Fc的构建

使用G1和G2分别为引物和模板进行扩增得到GLP-1基因,经过电泳检测,大小为100 bp左右,结果如图1a,与理论值相一致。将GLP-1与IgG Fc在体外以重叠延伸 PCR 的方法进行拼接,将GLP-1的3′端融合到IgG Fc基因的5′ ,最终获得嵌合体基因,所得片段进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1b。从图中可以看出,得到的融合片段大小约为800bp,比IgG Fc基因大了大约100bp,与理论值的807bp相一致,将其命名为GLP-1-IgG Fc。

2.2 毕赤酵母表达载体的构建及鉴定

将GLP-1-IgG Fc基因回收产物与pPIC9K质粒分别进行EcoRⅠ/NotⅠ双酶切、回收、连接并转化E.coli DH5α。提取质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定筛选阳性克隆(图2)。所得到的阳性转化子经过测序检测,结果证实IgG Fc基因和GLP-1基因的序列与Genebank公布的序列完全一致,嵌合体基因的连接方式与设计完全相符。将阳性转化子命名为pPIC9K-GLP-1-IgG Fc (简称为 pPIC9K-GF)。

2.3 毕赤酵母高拷贝菌株的筛选与鉴定

将构建正确的表达载体pPIC9K-GF经线性化后使用电转化法转化入巴斯德毕赤酵母菌 GS115菌株中,在MD平板上选取40个单菌落,提取基因组,以5’AOX1(pPIC9K质粒特有序列)及C2(基因后引物)为引物进行PCR验证。PCR扩增结果显示,重组菌株以特异引物扩增时在1 300 bp左右有明显条带,与预期结果一致,而阴性对照无相应的条带(图3)。PCR结果表明,pPIC9K-GF成功整合到毕赤酵母基因组DNA中,重组酵母命名P.pastoris GS115/ GF。将验证正确的单菌落,用牙签点种于含有不同Geneticin®(G418)浓度的YPD平板上,筛选到能在含4.0 mg/mL G418平板生长的菌落,进行发酵检测。

2.4 融合蛋白的表达及鉴定

挑取鉴定正确的多拷贝重组菌株,在25°C、280r/min条件下使用甲醇诱导菌株表达,每24h取样1mL,并补加一次甲醇至甲醇浓度0.5%,120 h结束诱导。同样条件培养GS115菌株做为对照。样品离心取上清TCA处理后,使用12%的SDS-PAGE电泳检测(图4),在40 kDa大小附近有一条外源蛋白条带,该条带在72 h时达到最大表达量,经过初步测算,表达量大约为5mg/L。将72 h诱导浓缩产物进行Western Blot检测,结果显示表达产物为GLP-1-IgG Fc的融合蛋白(图5)。

3 讨论

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)能有效刺激 β-细胞葡萄糖依赖的胰岛素分泌,促进胰岛素基因转录、胰岛细胞增殖及 β-细胞增殖和再生,具有不依赖于胰岛素的独立降糖作用,从而延缓糖尿病进展。同时GLP-1还可抑制胃肠运动和胃液分泌,抑制细胞凋亡、降低食欲,在不会引起显著的临床低血糖反应的条件下减轻体重[2,3,9,10,11,12,13],从而保证了使用 GLP-1治疗糖尿病的安全性和有效性。

天然 GLP-1在体内很快被DPP-Ⅳ(二肽酶Ⅳ)降解[8],使其体内半衰期很短,这极大地限制了其生理作用的发挥。随着研究的不断深入,多种增加 GLP-1的半衰期的策略被提出,如氨基酸替换、氨基酸修饰、N-末端封闭、末端化学修饰和组成复合物等,其中两种修饰后的 GLP-1的类似物已经进入市场[14,18]。但是这些修饰后的GLP-1的类似物在半衰期增加的同时,活性均受到不同程度的影响[19]。

一种备受关注的获得长效重组蛋白制剂的策略是将重组蛋白与人IgG抗体Fc段融合表达,形成融合蛋白即Fc-重组蛋白(Fc-fusion proteins)。融合蛋白增加了蛋白制剂的分子量,从而降低肾脏清除重组蛋白分子的速率,达到延长重组蛋白血浆半衰期的目的[20];另一方面,还可以通过Fc的再循环受体(recycling receptors,FcRn),促进重组蛋白的再循环利用,进一步延长重组蛋白的血浆半衰期[21]。将GLP-1与人IgG抗体Fc段融合组成融合蛋白已经有了初步研究,文献报道,GLP-1-IgG Fc融合蛋白明显增加了GLP-1的半衰期,同时还提高了GLP-1的降血糖效率[22]。但是抗体蛋白在细菌中的表达一直是蛋白表达的一个难点,所以GLP-1-IgG Fc融合蛋白是作为基因治疗的手段[22]或是在哺乳动物细胞中进行表达[23],这极大的限制了其应用于产业化开发。

本实验在制备长效GLP-1时,结合两种方式,首先进行氨基酸突变以消除DPP-Ⅳ酶切位点,然后再将突变后的GLP-1与人IgG Fc组成融合蛋白GLP-1-IgG Fc,以期更好的提高GLP-1的半衰期。融合蛋白GLP-1-IgG Fc克隆到毕赤酵母菌中并成功地实现了表达,初步测算其表达量约为5mg/L,高于抗体蛋白在毕赤酵母中的一般表达量。发酵液上清经过浓缩后,SDS-PAGE分析有一条明显的外源蛋白条带。融合蛋白的分子量理论值Mr为30kDa,SDS-PAGE结果显示融合蛋白的分子量与理论值相比较有明显的差异,进一步经过Western Blot分析结果表明,其可以被抗人IgG抗体所识别。可见该蛋白即是GLP-1-IgG Fc融合蛋白,分子量的差异是由于毕赤酵母菌对融合蛋白在翻译后进行了糖基化修饰造成的,并且糖基化程度比较高。

我们在毕赤酵母菌中成功地表达了人GLP-1-IgG Fc的融合蛋白,为了进一步研究GLP-1-IgG Fc长效融合蛋白的活性和半衰期测定及下一步的开发奠定了基础,并为在毕赤酵母菌中表达其他的Fc融合蛋白和抗体提供了参考。而毕赤酵母表达蛋白的糖基化对Fc融合蛋白的活性、免疫原性的影响及应对策略需要进一步的研究解决。

摘要：目的:构建GLP-1-IgG Fc融合蛋白分子并在毕赤酵母中实现高效表达。方法:使用蛋白质工程技术改造GLP-1,去除其蛋白酶降解位点,然后利用重叠延伸PCR方法得到改造后的GLP-1与人IgG-Fc片断的嵌合体基因并将其插入pPIC9K载体中。以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行表达。采用SDS-PAGE和Western Blot方法检测重组蛋白的表达。结果:成功的构建了GLP-1-IgG Fc嵌合体基因并使其在重组毕赤酵母中高效分泌表达。在25℃条件下,摇瓶培养添加0.5%甲醇诱导72h后融合蛋白的表达量最大,为5mg/L。SDS-PAGE和Western-Blot结果表明表达产物为GLP-1-IgG Fc融合蛋白。结论:获得了高效表达GLP-1-IgG Fc融合蛋白的毕赤酵母菌株,为GLP-1-IgG Fc的活性和半衰期测定及下一步的开发奠定了基础,并为在毕赤酵母菌中表达其他Fc融合蛋白和抗体提供了参考。

高效表达 第8篇

关键词：酿酒酵母,脂肪酶,基因克隆,毕赤酵母,表达

生物柴油是新兴的“绿色能源”,大力发展生物柴油对经济可持续发展,推进能源替代,减轻环境压力,控制城市大气污染具有重要的战略意义。由于用化学方法生产生物柴油过程中的废碱(酸)液排放容易对环境造成二次污染等[5],人们开始研究用生物酶法合成生物柴油。酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、无污染排放、环境友好性等优点,并且酶催化转化的产物纯度高,易与副产物甘油分离,所以用酶法转化生物柴油越来越受到关注[6],对脂肪酶的研究也越来越广泛。

脂肪酶基因TGL3是酿酒酵母体内起主要作用的脂肪酶[7],本实验意在通过克隆表达提高其活力,并且是国内首次对酿酒酵母脂肪酶基因的克隆和重组表达进行研究。重组表达的脂肪酶单位酶活力是原菌株的10倍,该酶不受众金属离子的影响,研究初步表明该酶具有一定的应用潜力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

Saccharomyces cerevisiae、E.coli JM109、Pichia pastoris GS115和表达载体p PIC9K均为作者实验室保存。

1.1.2 试剂

LA Taq DNA聚合酶,限制性内切酶,T4DNA连接酶均购自MBI,p-NPP购自Sigma公司,其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

LB、YPD培养基参见《分子克隆》,MD、MM、BMGY、BM-MY培养基参考Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册。

1.2 方法

1.2.1 酿酒酵母TGL3基因的克隆

以酿酒酵母总DNA为模板,P1、P2为引物进行PCR,上下游引物中分别加入AvrⅡ和NotⅠ限制性内切酶酶切位点:

PCR反应条件为:95℃5min,94℃45s,53℃45s,72℃2min,30个循环后72℃延伸10min。

1.2.2 重组表达载体的构建、转化、筛选和验证

PCR产物和p PIC9K分别进行双酶切后连接转化E.coli JM109,菌体电泳筛选阳性克隆。质粒酶切验证后,用SacⅠ单酶切重组质粒使其线性化,后电转化至Pichia pastoris GS115,涂布到MD平板上,30℃培养2~3d,把MD平板上的菌落用灭菌牙签分别点种到MD和MM平板上,筛选Mut+表型,2~3d后,把在MM平板上生长良好的菌落分别点种到含有不同浓度G418的YPD平板上,筛选多拷贝重组子并进行PCR验证。

1.2.3 重组菌的诱导表达和表达产物的SDS-PAGE分析

对在较高浓度的G418平板上生长良好验证正确的重组子进行摇瓶发酵,筛选表达量高的菌株。先用BMGY培养基培养至OD600=2~6,4℃、3 000g离心5min收集菌体,再用BMMY培养基悬浮菌体使OD600值约为1,30℃、250r/min摇床培养,每24h取样测定酶活并补加终浓度为0.5%的甲醇。将发酵后的发酵液离心收集上清,进行SDS-PAGE凝胶电泳,分析目的蛋白的大小和表达情况。

1.2.4 酶学性质的测定

1.2.4. 1 最适p H和p H稳定性的测定

在p H为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的条件下测定酶活性,确定其最适p H值。将酶液按1∶1比例分别在p H为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液中30℃保温30min,测剩余酶活,确定该酶的p H稳定性。

1.2.4. 2 最适温度和热稳定性的测定

分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的条件下测定酶活,以确定其最适作用温度。分别把相同浓度的酶液在15℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃下放置30min,测定剩余酶活,以确定其热稳定性。

1.2.4. 3 金属离子对酶的影响

向相同体积的酶液中分别加入不同的金属盐离子(Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Al3+、Ni+、Sr2+),使盐最终浓度为5mmol/L,同时以不加金属离子的酶液作为对照,测定各金属离子对酶的影响。

2 结果和分析

2.1 酿酒酵母脂肪酶基因的克隆

以酿酒酵母的DNA为模板,PCR扩增得到大小约2kb的目的片段,测序结果表明:序列与Gen Bank中TGL3基因(登录号为NC_001145)的序列同源性高达99.8%,氨基酸序列同源性达99.7%。该脂肪酶片段长1 929bp,是一个完整的读码框,编码643个氨基酸,编码的氨基酸中有脂肪酶的保守序列GXSXG,位于235~239位。

2.2 毕赤酵母表达载体的构建

载体p PIC9K和PCR产物分别双酶切后连接转化E.coli JM109,菌体电泳筛选阳性克隆,提取质粒,用AvrⅡ和NotⅠ进行双酶切验证,酶切结果显示,两条带分别与载体和目的片段大小相符,表明载体p PIC9K-TGL3构建成功。

2.3 重组毕赤酵母的筛选和验证

经过MD、MM和不同浓度G418平板的筛选及PCR验证,最终得到9个高拷贝的阳性转化子。分别对这9个重组子进行摇瓶发酵,得到1株表达量最高的重组子G6。PCR验证结果如图1所示。

M:DNA Marker DL2000;1:PCR product of p PIC9K;2:PCR product of recombinant.

2.4 重组毕赤酵母的诱导表达和SDS-PAGE电泳

以终浓度为0.5%的甲醇诱导表达G6重组子,每24h取样用p-NPP法测定发酵液中分泌表达的脂肪酶活力。发现脂肪酶的活力在诱导发酵120h后达到高峰,最高酶活力达60U/m L。SDS-PAGE电泳结果表明目的蛋白的大小约为70kDa(图2),与预测值相符。

2.5 酶学性质的测定结果

2.5.1 重组脂肪酶最适p H和p H稳定性

在不同p H的缓冲液体系中37℃测定重组脂肪酶的活性,发现在p H8.5的缓冲液中酶活最大。

将酶液与p H6.0~10.0的不同p H的缓冲液1∶1混合30℃保温30min后,在p H6.5~9.0之间酶液能保持50%以上的酶活力。

2.5.2 重组脂肪酶最适温度和热稳定性

在最适p H的缓冲液体系下,将酶与底物在不同温度下反应测定其作用的最适温度,测得该重组脂肪酶的最适作用温度为40℃,在25℃~40℃之间都可保持较高的活性。

将酶液在不同的温度下保温30min后在最适p H、最适温度下测其活性,结果显示该重组脂肪酶在40℃下保温30min后仍可保持60%以上的酶活力。

M:Unstained Protein Moleclar Marker;1:GS115 cells harboring p PIC9Konly;2:GS115 transformants harboring G6.

2.5.3 金属离子对重组酶的影响

除Al3+和Fe2+对酶有明显抑制作用,Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Ni+、Sr2+等金属离子对该重组酶均无明显抑制作用,该重组酶有很广的金属耐受性。

3 讨论

对酿酒酵母脂肪酶的研究,国外曾通过基因敲除的手段证实了在酿酒酵母中脂肪酶的存在[7,8,9],最近两年的研究则集中在酿酒酵母中脂类合成、储存、分解的途径和调控及对整个细胞代谢的作用,以及在这个过程中起关键作用的脂肪酶的作用和作用机制,研究方向偏向于机体健康和医药应用方面。Tibor Czabany等[10]通过TM(triple mutants)方法研究酿酒酵母体中脂质体的结构,为解释脂肪酶的作用机制提供了依据;Christoph F.Kurat等[11]也利用基因敲除的方法研究证明了Tgl3和Tgl4是酵母细胞生长初期水解TG的主要用酶,对细胞的生长有很大的影响。国内对产脂肪酶的酵母菌的研究目前主要集中在南极假丝酵母和粗壮假丝酵母,对酿酒酵母脂肪酶基因的研究尚未见报道。朱艳飞等[12]通过将人工合成的由毕赤酵母偏爱密码子组成的南极假丝酵母脂肪酶基因在Pichia pastoris GS115中表达,最高酶活力为14.5U/m L;熊杰等[13]对产脂肪酶的粗壮假丝酵母进行发酵条件优化,优化后酶活力可达6.2U/m L,可见酵母菌类产脂肪酶酶活力普遍较低。本实验的结果不仅为国内脂肪酶的研究增添了新的内容,也为以后对酿酒酵母脂肪酶更深入的研究做了铺垫。在以后的工作中,可以通过条件优化和分子改造等方法进一步对提高该酶的表达量,优化其酶学性质进行研究,力求使其适用于生物柴油的工业催化。

高效表达 第9篇

基于重组牛干扰素在治疗牛病毒性疾病和寄生虫病方面广阔的应用前景, 试验在已建立的新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统的基础上构建了表达牛α干扰素 (BoIFNα) 基因的全基因组克隆, 实现了牛α干扰素在SPF鸡胚内的高效、稳定表达, 并对其表达产物进行了抗病毒活性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

表达增强型绿色荧光蛋白的重组水疱性口炎病毒VSV-EGFP, 哈尔滨兽医研究所人畜共患病实验室构建、滴定并保存[1];BHK-21细胞、牛肾细胞 (MDBK细胞) , 由哈尔滨兽医研究所人畜共患病实验室传代培养, 培养基为含10%胎牛血清的DMEM;表达T7聚合酶的痘病毒vTF7-3、新城疫病毒LaSota克隆株rLa Sota, 由哈尔滨兽医研究所人畜共患病实验室保存;pBS-BoIFNα、rLaSota反向遗传操作系统基因组转录模板质粒pBRN-FL-PmeⅠ、大聚合酶、核蛋白及磷酸蛋白表达辅助质粒pBSL、pBSNP、pBSP, 均由哈尔滨兽医研究所人畜共患病实验室克隆并保存[2]。

1.2 表达牛α干扰素基因的全基因组克隆的构建

以质粒pBS-BoIFNα为模板, 通过PCR引物在干扰素基因ORF的5′端引入PmeⅠ限制酶识别序列和新城疫病毒自身聚合酶L识别的转录终止序列GE (TTAAGAAAAAA) 、转录起始序列GS (ACGGG-TAGAA) 及增强基因表达的Kozak序列 (GCCACC) , 在干扰素基因ORF的3′端引入PmeⅠ限制酶识别序列。为了确保重组基因组cDNA全长总碱基数仍保持为6的倍数, 在引物GS和Kozak序列之间加入适当数量的碱基进行调整。PCR末端经PmeⅠ酶切插入同样经PmeⅠ处理的pBRN-FL-PmeⅠ载体内, 表达牛α干扰素的重组基因组全长cDNA克隆命名为pBRN-FL-BoIFNα。利用PmeⅠ酶切位点鉴定阳性克隆;利用引物NDV-3#PF:5′-gtccgtgcattgatcatg-3′和牛α干扰素基因PCR所用下游引物鉴定外源基因插入大小及方向。

1.3 重组病毒的拯救

BHK-21细胞接种于6孔细胞培养板内生长达50%～80%单层时, 转录质粒pBRN-FL-BoIFNα与辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL共转染BHK-21细胞。转染上清液经0.22μm孔径滤器过滤后接种9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔;接种后的SPF鸡胚继续培养3～5d, 取鸡胚尿囊液50μL按常规进行新城疫病毒的血凝 (HA) 试验和血凝抑制 (HI) 试验, 详细操作方法参见参考文献[2]。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液, -70℃冻存, 并按常规方法分别于9～10日龄鸡胚尿囊腔接种进行传代, 测定EID50[2]。

1.4 rL-BoIFNα抗病毒活性检测

分别取rL-BoIFNα和rLaSota接种的SPF鸡胚尿囊液2mL放入平皿中, 置于紫外灯下照射2h, 每隔20min摇动1次, 以灭活新城疫病毒。取经紫外线灭活的尿囊液接种3枚SPF鸡胚 (每胚100μL) 以检测病毒灭活是否彻底, 接种后的鸡胚置37℃孵化器内孵化, 3d后检测鸡胚尿囊液是否为HA阳性。取HA阴性样品分装, -70℃保存, 备用。

用VSV-EGFP-MDBK细胞系统测定rL-BoIFNα的抗病毒活性, 具体方法为取灭活后的重组病毒rL-BoIFNα鸡胚尿囊液 (每个样品100μL) , 用含5%胎牛血清的DMEM进行10倍系列稀释, 在生长于96孔细胞培养板上的牛肾细胞上加入稀释度为210～2108的尿囊液, 同时取相同稀释度的灭活rLaSota鸡胚尿囊液作为对照组, 于37℃作用24h;吸出上清液后接种VSV-EGFP, 剂量为200PFU/孔, 感作1h后换完全培养液继续培养, 同时设空白对照组, 24h后于荧光显微镜下观察结果。以空白对照组为对照, 将减少50%VSV-EGFP感染率的样品的最高稀释度定为1个病毒抑制单位 (IU) 。

1.5 重组病毒尿囊液抗病毒稳定性检测

取灭活后的重组病毒rL-BoIFNα鸡胚尿囊液分装, 100μL/管, 一部分放入4℃冰箱内长期保存, 每隔1周取出1份进行抗病毒活性检测;另一部分放入-70℃冰箱中, 取冻融1次、2次、3次的样品检测抗病毒活性单位的变化, 以检测反复冻融对抗病毒活性的影响。

2 结果

2.1 表达牛α干扰素基因的全基因组克隆的构建及鉴定结果

通过PCR引物在牛α干扰素基因的ORF 5′端和3′端引入PmeⅠ限制酶识别序列 (所用引物见表1) 。由于插入的外源基因为PmeⅠ单酶切连入pBRN-FL-PmeⅠ载体, 因此克隆质粒经PmeⅠ酶切的产物应有2条:一条为载体, 长约18kb;另一条为外源基因及其所携带的GE/GS, 长约610bp (图1A) 。引物进行PCR扩增, 应得到比相应外源基因大150bp左右的条带, 产物长约760bp, 电泳结果显示与预期相符 (图1B) 。证明表达牛α干扰素的重组基因组全长cDNA克隆构建成功。

注:基因起始信号和基因结束信号用小写字符表示, 酶切位点用边框表示, 用黑体字符调整碱基数以适应6的倍数规则, Kozak序列用斜体表示, 下划线部分为病毒特异序列。

2.2 重组病毒的拯救及鉴定结果

全基因组转录质粒pBRN-FL-BoIFNα分别与辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL共转染BHK-21细胞, 取转染上清液接种SPF鸡胚后继续培养3～5d, 取鸡胚尿囊液50μL按常规方法进行新城疫病毒的血凝 (HA) 试验和血凝抑制 (HI) 试验。收获HA试验及HI试验结果阳性的尿囊液, -70℃冻存。同时进行RT-PCR鉴定, PCR产物测序结果证明重组病毒基因组内含有相应的外源基因片段, 至此成功拯救出表达牛α干扰素的重组新城疫病毒, 并命名为rL-BoIFNα。

2.3 rL-BoIFNα抗病毒活性检测结果

收获的重组病毒尿囊液经紫外线灭活后进行10倍系列稀释, 用稀释后的样品处理细胞24h, 然后按每孔200PFU的接种量感染VSV-EGFP, 24h后经荧光显微镜观察结果。结果表明:稀释度为2104的rL-BoIFNα可以完全抑制VSV-EGFP的复制, 无荧光出现 (图2A) ;稀释度为2105和2106的rL-BoIFNα可部分抑制VSV-EGFP的复制;稀释度为2106稀释孔的荧光亮度约为对照组的一半 (图2C) ;稀释度为2107的稀释孔与对照组无差别 (图2D) ;未加干扰素样品的对照孔出现大量荧光 (图2G) , 说明VSV-EGFP在牛肾细胞中大量复制;稀释度为210的rLaSota病毒接种SPF鸡胚尿囊液可以非特异性地部分抑制VSV-EGFP在牛肾细胞中的复制 (图2E) ;稀释度为2102的rLaSota病毒接种SPF鸡胚尿囊液组出现大量荧光 (图2F) , 不能抑制VSV-EGFP的复制。由此可知rL-BoIFNα抗病毒活性为2107IU/mL。

2.4 重组病毒尿囊液抗病毒稳定性检测结果

4℃冰箱保存重组病毒rL-BoIFNα鸡胚尿囊液3周时检测抗病毒活性仍然没有明显下降, 即4℃冰箱保存干扰素样品可以保持至少3周的抗病毒活性;反复冻融样品在冻融1次、2次、3次后样品的抗病毒活性单位没有明显下降, 说明反复冻融对干扰素样品实验抗病毒活性的影响不大, 经鸡胚尿囊液生产的干扰素可以长时间保持稳定、高效的抗病毒活性。

3讨论

试验构建了表达牛α干扰素的重组新城疫病毒rL-BoIFNα, 收获的SPF鸡胚尿囊液经紫外线灭活新城疫病毒后, 具有2107IU/mL的高滴度抗病毒活性, 与杆状病毒表达系统、酵母表达系统具有相近甚至更高的抗病毒滴度, 但成本相对较低, 具有产业化应用潜力。本研究克隆的牛α干扰素基因为进一步利用基因工程技术生产重组牛干扰素及其生物学功能的研究奠定了基础, 期望通过进一步开展深入研究, 使重组干扰素成为具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的主要药物。

此外, 表达牛α干扰素的重组新城疫病毒接种的鸡胚尿囊液可以长时间稳定保存, 反复冻融对其抗病毒活性影响很小, 便于保存和长途运输, 有利于进一步的现地推广应用, 而且可以进一步探索干扰素样品冻干保护工艺, 实现常温运输和保存, 为将来的推广应用奠定基础。

摘要：研究在已有的新城疫病毒La Sota株反向遗传系统的基础上, 利用新城疫病毒La Sota株作为表达载体, 构建表达牛α干扰素 (bovine interferonα) 完整开放阅读框的全基因组质粒pFL-BoIFNα, 转染BHK-21细胞获得表达牛α干扰素重组新城疫病毒。采用RT-PCR方法检测, 证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因。将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒, 利用表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒 (VSV-EGFP) 在牛肾细胞 (MDBK) 上测定rL-BoIFNα抗病毒活性, 证实表达牛干扰素的重组新城疫病毒尿囊液能有效抑制VSV-EGFP在牛肾细胞上的复制, rL-BoIFNα接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性高达2×107IU/mL。结果表明:牛α干扰素在重组新城疫病毒rL-BoIFNα接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达, 并具有高效而稳定的抗病毒活性。

关键词：干扰素,牛,重组新城疫病毒,抗病毒活性

参考文献

[1]温志远, 葛金英, 胡森, 等.表达增强绿色荧光蛋白重组水泡性口炎病毒印地安纳株的构建[J].预防兽医学报, 2007, 29 (12) :905-910.