内皮细胞生长因子

内皮细胞生长因子（精选10篇）

内皮细胞生长因子 第1篇

1 冠心病的中医理论基础

中医认为“气血互根、脉为血之府”,“脉”可理解成解剖学中较大的血管,脉络则与中小血管、微循环基本相同。冠心病的发生为心之络脉瘀阻亦或心之络脉绌急所致[2],心气虚乏,络脉瘀阻可致心络瘀塞引起真心痛发作,即急性心肌梗死(AMI)。冠心病为本虚标实之证,气虚血瘀贯穿疾病的不同病理阶段[3],因此,益气活血、去瘀生新是中药治疗冠心病的方法。“生新”代表新的血液,同时也可以解释为血管的再生[4]。血管新生是指在缺血心肌已有的血管床上,促进内皮细胞发芽长出新支,形成血管网[5]。血管新生与中医学“生脉”理论相关联,中医“生脉”理论包括三层含义:一是血管管腔增粗,血流量增加;二是处于关闭状态的血管出现再通现象;三是生成新的血管[6]。医学文献中关于“生脉”、“生血”、“生肌”等方面的论述,为中药促进血管新生奠定了理论基础。

2 中药与血管新生

目前在中药促血管新生作用研究中,中药及中药单体包括丹参、白藜芦醇、人参皂苷、西洋参茎叶总皂苷、葛根素、川芎嗪等,方剂与中成药包括当归补血汤、保心汤、温养益心方、芪参益气浸膏、芪丹通脉片等。血管新生是一个较为复杂的、程序化的级联事件[7],包括活化内皮细胞,使内皮细胞释放蛋白酶,蛋白酶溶解血管基底膜,从而使内皮细胞侵入周围组织,形成血管萌芽,萌芽增殖与内皮细胞分化形成管腔,而在此过程中细胞因子起到了重要的作用,目前证实血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、转化生长因子(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)等20多种细胞因子参与了血管新生的调控。

3 细胞因子在血管新生中的作用

有实验证实中药能够通过调控VEGF、b FGF水平而影响血管新生,另有学者发现PDGF-B能通过诱导血管周细胞聚集,促进血管成熟,对维持有功能的血管有重要的意义[8]。在体外研究中发现TGF-β1具有促血管生成的作用,同时还可调节内皮细胞基因表达,增加纤维蛋白等细胞外基质形成,是体内血管生成的重要因素之一[9]。目前研究认为VEGF和b FGF是体内发现的最为有效的促血管因子[10]。

4 中药治疗与VEGF

4.1 VEGF

VEGF又称血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)或血管调理素(vasculotropin),是一组功能强大且能产生多种效应的细胞因子[11]。VEGF活性为组胺的5 000倍[7],能够增强血管的通透性从而诱导新血管的形成。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及胎盘生长因子(PIGF)等,具有调解大量血管内皮细胞的增殖、迁移、存活、分化和细胞间通讯等作用。有文献报道,缺氧是刺激VEGF过度表达的作用因素之一[7]。

4.2 中药对VEGF的影响

人参皂苷Rg1(Ginsenoside-Rg1)作为人参提取物中的一种重要皂苷成分,在体内能够诱导血管新生[12]。尹慧秋等[12]通过建立大鼠心肌梗死模型及模拟人脐静脉内皮细胞低氧状态方法,证实人参皂苷Rg1诱导血管新生与较高的VEGF表达水平有关,并且是通过激活PI3K/AKT和抑制p38MAP途径发挥作用的。

丹酚酸B(Bsalvianolic acid B)为丹参有效成分之一,He等[13]证实丹酚酸B能够增加梗死周边区以及左心室非梗死区VEGF相对高表达,从而促进血管新生实现心肌保护作用。

动物实验提示川芎嗪(Tetramethylpyrazine)注射液可提高大鼠梗死心肌VEGF、PDGF-β等细胞因子水平,梗死周边区毛细血管数(MVC)及毛细血管密度(MVD)较对照组出现明显增加趋势,推测其促进或诱导缺血心肌血管新生作用可能通过促进VEGF等相关细胞因子而发挥效用[14]。

巴戟天糖链(MOO)是巴戟天醇的主要有效成分,杨景柯等[15]研究发现MOO具有促进AMI后大鼠缺血心肌血管新生作用,机制可能是通过增加梗死周边区VEGF表达实现的。

葛根素(puerarin)为传统中药葛根中的主要有效成分,张淑娟等[16]证实其能够促进缺血心肌血管新生,且血管的新生程度与VEGF m RNA表达水平大体上保持一致,提示其促进血管新生的作用与增加VEGF m RNA表达相关。

舒脉汤含由黄芪、三七、水蛭、丹参等七种组成成分,是治疗缺血性心肌病传统中药之一,已证实该药能使AMI大鼠梗死周边区MVD增加,心肌VEGF蛋白表达量增高,并证实该药促进血管新生作用是通过PI3K/AKT信号通路产生作用的[17]。

5 中药治疗与b FGF

5.1 b FGF

b FGF是目前研究最多、生物效应最强、作用最广泛的成纤维细胞生长因子(FGF)之一[18],在体内和体外均能明显促进新生血管形成[19]。b FGF与FGF受体(FGFR)结合发挥效应,激活信号转导途径蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、Ras/Raf/MEK/ERK、蛋白酪氨酸激酶(Janus kinase,JAK)/信号转导子及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)等通路[19]。b FGF能够趋化血管内膜的各类细胞[19],促进血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖迁移[20],促进外溶酶原激活物和胶原酶分泌,加速损伤部位的细胞外基质部分溶解,使毛细血管长入细胞外基质,拮抗心肌损伤,并且可促进一氧化氮(NO)产生。NO能促进内皮细胞增殖、迁移、抑制凋亡,为血管新生早期一种重要的血管生成介质[13]。

5.2 中药对b FGF的影响

芪丹液由黄芪、丹参等六味益气活血药物组成,已证实丹参能促进一些器官黏膜的细胞再生和组织修复,同时可以消除陈旧性的瘢痕疙瘩,对缺氧所致的心肌损伤也具有一定的保护作用[21]。殷惠军等[22]发现芪丹液能够上调心肌梗死大鼠促血管新生因子VEGF、b FGF基因及蛋白的表达,14 d MVD较7 d时显著增高,表明芪丹液可以将VEGF、b FGF水平维持较长时间,有易于侧支循环形成。

西洋参茎叶总皂苷(PQS)由西洋参茎叶中提取,王承龙等[23]通过观察不同PQS剂量组VEGF和b FGF表达的情况得出结论:PQS可促进大鼠AMI后缺血心肌内源性VEGF和b FGF合成和分泌,从而促进心肌血管新生,血管密度增加,改善心肌微循环。

双龙丸为蜈蚣和全蝎等虫类按比例组成的中药配方,具有破瘀散结的作用。杨祖福等[24]观察到大剂量和小剂量组较同时期心肌梗死组新生血管数显著增加,表明双龙丸具有促进血管新生的作用,并推测大剂量双龙丸对VEGF、b FGF的分泌及其基因转录水平都有一定的上调作用。

侯仙明等[25]通过给予AMI大鼠和血生络方3周治疗,发现该药物能够使血清及心肌组织中b FGF和b FGF m R-NA表达增加,有利于大鼠心肌缺血区血管新生。

6 展望

心肌梗死后心肌缺血,损伤的心肌细胞结构与功能发生改变,随时间推移导致心室重塑,加重心肌纤维化,促血管新生治疗可以在不同程度上减小梗死面积,从而改善心功能。细胞因子在中药促血管新生过程中具有重要的调控作用,尤其中药对VEGF、b FGF表达可产生一定的影响,已知某些中药能够激活PI3K/AKT通路,但中药对VEGF、b FGF与相应受体结合后,下游转导途径机制的影响研究仍在进行中,已有学者证实可能存在其他信号通路和下游介质参与纤维化损伤[13]。

中药方剂与中成药的成分较为复杂,主要为大分子化合物的混合物,其促进细胞因子表达的确切成分研究仍处在探索阶段,如何将有效成分进行提纯并深入研究中药单体作用及其机制尚在进一步的探索中。

摘要：中药对缺血心肌血管新生的促进作用已成为心肌梗死治疗的又一途径。血管新生为多种细胞因子共同作用的结果,通过对其机制的探讨,发现在促进缺血心肌血管新生过程中血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)起到了重要的作用。

内皮细胞生长因子 第2篇

体外培养小鼠卵母细胞及其生长分化因子-9基因表达

体外培养小鼠的窦前卵泡以得到第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞, 比较体外发育卵母细胞与体内生长的卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量, 探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的.影响. 选择体外培养第2天(D2)、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞作为体外发育组; 同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组; 半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组MⅠ卵母细胞GDF-9基因表达量. 结果体外培养小鼠窦前卵泡可以得到MⅡ期卵母细胞, 卵泡成活率、窦腔形成率、卵母细胞成熟率分别达到89.5%、51.8%和56.6%. 小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变而发生变化, 而体外发育D8-12卵母细胞GDF-9表达量显著低于同期体内发育卵母细胞(P<0.05). 体外发育D8-12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞的原因之一可能是其发育潜能较低.

作 者：彭宇洪 庄广伦 周灿权 谢守珍 程冀平PENG Yu-hong ZHUANG Guang-lun ZHOU Can-quan XIE Shou-zhen CHENG Ji-ping 作者单位：广州军区武汉总医院,妇产科,湖北,武汉,430070刊 名：动物学研究 ISTIC PKU英文刊名：ZOOLOGICAL RESEARCH年，卷(期)：27(5)分类号：Q95关键词：小鼠 培养 卵母细胞 生长分化因子9 Mice Culture Oocyte Growth differention factor-9

内皮细胞生长因子 第3篇

[关键词] 血管内皮生长因子；急性心肌梗死；单个核细胞

[中图分类号] R542.22   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2012）01-22-03

Study of the expression of vascular endothelial growth factor by peripheral blood mononuclear cells in patients with acute myocardial infarction

HONG Canghao  TANG Guofa  LIU Xiaohong

Department of Cardiology,E'gang Hospital,Wu Iron and Steel Group,E'zhou 463002,China

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of VEGF levels in the supernation of cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in AMI.We also explored the relationship between VEGF and left ventricular systolic function in AMI. Methods 28 patients with AMI and 12 controls were used for this study.PBMCs were isolated from perispheral blood on days 1,5,10 and 15 after the onset of AMI.PBMCs were cultured for 24h.VEGF levels in the culture media were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results (1)VEGF levels in the cultured medium of PBMCs after incubation of 24 h (PBMC-VEGF) were elevated gradually and reached a peak on day 5, which was significantly higher than that of control (343.2±82.5pg/mL vs 143.3±24.2pg/mL,P＜0.05).(2)Peak PBMC- VEGF levels showed no correlation with peak creatine phosphokinase (CK) levels.(3)Improvement of left ventricular systolic function during the course of AMI showed significantly higher PBMC-VEGF levels than patients without improvements (P＜0.05). Conclusion PBMC-VEGF played an important role in the improvement of left ventricular systolic function by promoting angiogenesis and reendothelialization after AMI.

[Key words] Vascular endothelial growth factor;Acute myocardial infarction;Peripheral blood mononuclear cells

血管内皮生长因子在缺血性心脏病发病机制中起着重要作用，动脉粥样硬化的形成，冠状动脉成形术后再狭窄都与生长因子参与的细胞增殖、迁移、分化与凋亡有密切关系。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种特异作用于血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）强有力的有丝分裂原，在缺血、缺氧及血管损伤时能促进VEC增殖、迁移及诱导血管生成，是迄今所发现最强的一种血管内皮生长因子。由于冠心病是以心肌缺血为主要特征，外源性VEGF已成为目前促血管生成、重建冠状动脉侧枝循环的研究热点。目前，在应用外源性VEGF基因转染治疗心肌缺血方面研究很多，而对不同来源的内源性VEGF在心肌缺血时所起的作用研究甚少。本研究通过观察AMI患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分泌的VEGF水平的动态变化来探讨不同来源的内源性VEGF在AMI患者中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

患者为2010年1月～2011年6月笔者所在医院心血管内科住院确诊的急性心肌梗死患者28例，其中男20例，女8例，平均年龄（58.7±7.9）岁。12例正常体检者作对照，其中男9例，女3例，平均年龄（55.6±6.3）岁。28例AMI患者均进行了冠脉造影（coronary angiography，CAG），并实施经皮腔内冠状动脉球囊扩张和支架植入术（percutaneous transluminal coronary angioplasty and stent，PTCA+stent），所有患者均常规服用阿司匹林和氯吡格雷，并根据医生建议服用β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等药。28例患者CAG检查结果：单支血管病变11例，2支血管病变9例，3支血管病变8例。合并高血压病的有15例（54%），高脂血症23例（82%），糖尿病7例（25%），18例患者有吸烟史（64%），8例有冠心病家族史（28%）。

1.2 急性心肌梗死的诊断

根据WHO标准持续典型的胸痛30 min以上；典型心电图动态变化；心肌酶（肌酸磷酸激酶及其同工酶MB或肌钙蛋白）动态变化。具有以上中任何2项即可确诊。

1.3 正常对照者入选条件

对照组与AMI组进行性别、年龄配对，经病史询问无心血管疾病史，体格检查无阳性体征，胸片、心电图、肝肾功能、生化常规检查无异常者。合并严重心衰、肝、肾功能衰竭、感染性疾病、肿瘤、外周血管病、脑卒中者予以剔除。

所有患者在发病2 d内进行床旁心脏彩色多普勒超声检测左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），半月后（出院时）复查LVEF（由心脏彩超室专人质控检测）。

1.4 主要仪器和试剂

CO2培养箱：美国Formal Scientific公司；Lympus倒置显微镜：日本；酶联免疫检测仪：美国EL312eVEGF酶联免疫检测试剂盒：北京晶美生物工程有限公司（进口分装），检测灵敏度为30 pg/mL，批内、批间误差均＜9.5%；淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypaque液，中科院血液研究所；PBS液：新鲜配制；RPMI-1640：GIBCO，美国；小牛血清：笔者所在医院中心实验室制备；双抗：青霉素100 IU/mL，链霉素100μg/mL。

1.5 研究方法

1.5.1 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离和培养及标本的提取

1.5.1.1 PBMCs的分离  （1）在AMI患者发病的第1、5、10、15天分别抽取20 mL静脉血放入肝素抗凝离心管内，摇匀，用PBS液稀释血液1倍，对照组仅抽1次静脉血。（2）取淋巴分离液4 mL，放入15 mL离心管中。（3）将稀释全血沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于淋巴分离液上，稀释血液与分离液体积之比约为2∶1。（4）用水平离心机以2 000 rpm离心20 min，离心后，单个核细胞位于血浆和淋巴分离液界面层。（5）吸取界面单个核细胞层，用PBS洗涤3次，每次1 500 rpm离心10 min，吸弃上清，加入1 mL RPMI 1640，混匀，细胞计数，用苔盼蓝染色，计算活细胞数，均＞95%。

1.5.1.2 PBMCs的培养 （1）用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液重悬单个核细胞，并将细胞浓度调节至5×106/mL。（2）取1 mL浓度为5×106/mL PBMCs悬液放入24孔培养板中，在37℃，5%CO2条件下于培养箱中进行细胞培养。

1.5.1.3 标本的提取 分别于6、12、24 h收取PBMCs培养的上清液，置-70℃冰箱保存待测。

1.5.2 血清肌酸磷酸激酶（CK）最大值的测定 AMI患者发病后每4 小时测1次CK直到最大值（由检验科专人质控检验）。

1.5.3 VEGF的测定 外周血单个核细胞培养分泌的VEGF量均采用双抗夹心酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定，浓度单位为pg/mL。按试剂盒说明进行操作。

1.6 统计学处理

应用SPSS17.0软件包进行统计分析，主要统计指标均进行正态性检验，对于偏态分布的计量资料，对数转换达到近似正态分布后，再进行比较。各统计指标均以（）表示。采用直线相关分析法分析相关指标间相关性，计量资料的组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMCs产生的VEGF水平的动态变化

PBMCs培养产生的VEGF水平在不同培养时间段呈动态变化，用“PBMC-VEGF”表示PBMCs培养产生的VEGF水平。为了便于观察，首先对AMI发病第1天分离的PBMCs培养产生的VEGF进行统计分析。见表1。从表中可见PBMC-VEGF水平随着培养时间的延长而逐渐增加，在12 h和24 h时均显著高于对照组（P＜0.05）。取培养24 h的PBMCs产生的VEGF量作为观察PBMCs分泌VEGF能力的统计指标。AMI患者从发病第1～15天，PBMC-VEGF水平呈动态变化。见表2。从表中可见，AMI组PBMC-VEGF水平从发病第1天开始升高，在第5天达峰值为（343.2±82.5）pg/mL，显著高于对照组的（143.3±24.2）pg/mL（P＜0.05）。随后呈下降趋势，但仍显著高于对照组，到发病第15天PBMC-VEGF水平仍显著高于对照组（P＜0.05）。

2.2 VEGF与心肌酶CK的相关性

AMI患者心肌酶峰值CK为929.8～3 827.2 IU/L，平均（2 185.9±320.3）IU/L。为了探讨VEGF水平与急性心肌梗死时心肌酶升高的关系，对外周血单个核细胞PBMC-VEGF水平与CK峰值进行线性相关分析，PBMC-VEGF峰值与CK无显著相关性。

2.3 VEGF水平与左室收缩功能的关系

为了探讨VEGF水平与左室收缩功能（LVEF）的关系，将入院时LVEF水平（52.3±2.6）%与半月后（出院时）复查的LVEF水平（52.7±2.8）%进行比较，结果两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。将LVEF水平分成两组，A组为AMI患者半月后复查时LVEF水平不低于入院时LVEF水平，有12例，B组为AMI患者半月后复查时LVEF水平低于入院时LVEF水平，有16例，然后分别比较A、B两组PBMC-VEGF水平之间的关系。见表3。

3 讨论

VEGF是现今发现的众多血管生长因子中最有力的血管生成因子，VEGF通过与细胞表面的特异受体结合而发挥作用，目前发现有3种特异受体分别为flt-1、flk-1/KDR和flt-4，属酪氨酸激酶受体家族第三亚型[1]，其中flt-1和flt-1/KDR主要在血管内皮细胞表达，在人的冠状动脉内皮细胞和心肌细胞中均有高水平表达，提示VEGF在心血管系统的功能主要以旁分泌和自分泌的形式实现[2]。

本研究发现，从AMI患者外周静脉血中分离出的单个核细胞能分泌VEGF，PBMCs分泌的VEGF在AMI后即呈上升趋势，于心梗后第5天上升到最高峰，随后10 d内仍维持高值状态，且显著高于对照组，但PBMCs分泌VEGF的高峰值与心肌酶CK高峰值无显著相关性。从以上结果可见，AMI后，由PBMCs产生的VEGF水平迅速上升，目前，鲜有此类报道，其发生机制尚不清楚，可能与AMI发生后，产生VEGF的PBMCs的种类发生改变和（或）其分泌VEGF的功能得以加强有关，其发生机制有待进一步研究。Zhao等[3]发现，心肌梗死处VEGF mRNA基因表达在AMI后2 h就迅速增高，12 h达高峰。引起VEGF表达增加的原因是多方面的。以上结果显示，心肌缺血、缺氧可能是刺激心肌细胞VEGF迅速高表达并在特定时间内持续的主要始动因素，AMI后分泌的生物活性物质可能是AMI亚急性期VEGF持续高表达，并维持一定时间的原因之一[4]。

在研究VEGF水平与AMI患者左室收缩功能关系时发现，左室收缩功能有改善的AMI患者，其PBMC-VEGF水平显著高于左室收缩功能下降的AMI患者。推测AMI患者左室收缩功能的改善可能与PBMCs产生的内源性VEGF在参与修复损伤血管内皮和促进血管生成方面有密切关系。VEGF是迄今所发现最强的一种血管内皮生长因子，能特异地作用于靶细胞－VEC，促进其有丝分裂及血管形成。Zhao等[3]发现，梗死区有VEGF mRNA的表达，同时伴有血管密度高水平表达可持续7 d以上，提示VEGF可能参与心肌梗死的血管重建。Wu等[5]研究发现重组VEGF基因能改善AMI患者的左室收缩功能，局部梗死区心肌室壁异常运动也明显改善。以上结果显示，通过有效方法使特定部位的内源性VEGF基因和蛋白表达升高到一定程度，就能充分发挥其促血管生成，增加缺血心肌灌注，改善AMI患者左室收缩功能。

单个核细胞不但能分泌VEGF，且能介导VEGF对炎性细胞的趋化反应，与炎性细胞在血管生成中的作用有关[6]。Ripa等[7]发现，冠心病患者建立侧支循环以改善进行性冠脉狭窄的能力与单核细胞缺氧时产生的VEGF mRNA的能力有关，建立侧支循环的患者与没有建立侧支循环的患者相比，单核细胞缺氧时VEGF mRNA表达水平有显著差异。以上结果提示，急性心肌梗死时，单个核细胞趋化、粘附在损伤的血管内皮部位，促使内源性VEGFm RNA高表达及VEGF蛋白大量生成，发挥VEGF促内皮细胞分裂、增殖、修复血管内皮和促进缺血区侧枝循环的建立等作用，增加缺血区血流灌注，抑制缺血、梗死范围的进一步扩大，达到改善心脏收缩功能的作用。推测在AMI发生时，通过促进粘附在冠状动脉内皮损伤处PBMCs产生的VEG FmRNA高表达，可达到改善AMI患者心功能目的，详细的机制有待更深入的研究。

在AMI患者急性期，由PBMCs产生的VEGF在改善左室收缩功能方面可能起重要作用。

[参考文献]

[1] Miura S，Matsuo Y，Saku K.Transactivation of KDR/Flk-1 by the B2 receptor induces tube formation in human coronary endothelial cells[J].Hypertension，2003，41（5）：1118-1123.

[2] Korpisalo P，Yl-Herttuala S.Stimulation of functional vessel growth by gene therapy[J].Integr Biol （Camb），2010，2（2）：102-112.

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[4] Dremina NN，Shurygina IA，Lushnikova EL，et al.Effect of endothelial growth factor on postinfarction remodeling of rat myocardium[J].Bull Exp Biol Med，2009，148（3）：441-446.

[5] Wu G，Rana JS，Wykrzykowska J，et al. Exercise-induced expression of VEGF and salvation of myocardium in the early stage of myocardial infarction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296（2）：H389-H395.

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[7] Ripa RS，Jrgensen E，Baldazzi F，et al.The influence of genotype on vascular endothelialgrowth factor and regulation of myocardial collateral blood flow in patients with acute and chronic coronary heart disease[J]. Scand J Clin Lab Invest，2009，69（6）：722-728.

内皮细胞生长因子 第4篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

(1) 药品:葛根素注射液 (郑州羚锐制药股份有限公司) ;噻唑蓝 (MTT) , 以PBS溶解成5 mg/ml备用。 (2) 免疫细胞化学试剂:一抗, 鼠抗人细胞内皮生长因子 (VEGF) 单克隆抗体, 4℃保存;二抗, 单克隆羊抗鼠;ECL显色液;人脐静脉内皮细胞 (HUVECs, 北京裕恒丰科技有限公司) 。

1.2 方法

(1) 细胞培养:将HUVECs在含有10%胎牛血清、青霉素100U/ml及链霉素100U/ml的DMEM培养基中, 以0.25%胰酶消化, 在37℃、5%CO2条件下培养, 每周换液传代3次。取生长良好的HUVECs (调整细胞浓度为2×105/ml) 接种于96孔培养板, 每孔200μl, 设3个平行孔;用葡萄糖、葛根素及葛根素联合葡萄糖作用HUVECs 24h。 (2) 分组:根据以上实验方法, 分为正常组 (5.5mmol/L) 、高糖组 (35mmol/L) 、葛根素组 (200 mg/L) 、联合组 (葛根素联合高糖35 mmol/L) 及用DMEM培养基和二甲基亚砜 (各2μl) 培养的细胞为对照组。在Genebank检索基因cDNA序列, 自行设计PCR引物, 由上海生物工程公司合成。

1.3 检测指标

(1) 细胞增殖情况:倒置显微镜下观察细胞生长情况;MTT检测细胞增殖情况, 细胞增殖率= (实验组平衡A值-对照组平衡A值) /对照组平衡A值×100%, 计算细胞A值及标准率。 (2) VEGF mRNA表达;用RT-PCR检测。 (3) VEGF蛋白表达:采用蛋白质免疫印迹实验法进行, X线曝光显影, 软件扫描定量, 每个浓度组重复3次, 取均值。

2 结果

高糖为35 mmol/L时, 其A值与对照组比较明显下降 (P<0.05) , 葛根素组于葛根素200 mg/L时其A值与对照组比较明显升高 (P<0.05) , 联合组与对照组比较, 葛根素联合高糖时对细胞则出现明显的增殖作用 (P<0.05, 表1) 。作用HUVECs 24 h VEGF mRNA表达A值为, 对照组 (0.704±0.03) , 高糖组在35mmol/L时 (0.45±0.02) , 联合组在葛根素200 mg/L联合高糖35mmol/L时 (0.59±0.01) ;其VEGF mRNA吸光度A值, 高糖组与对照组比较明显下降 (P<0.05) , 联合组与对联合组与对照组比较差异无显著性意义。作用HUVECs 24h VEGF蛋白的表达为, 与对照组比较, 高糖组35mmol/L时VEGF蛋白表达下调 (P<0.05) 。葛根素组 (200mg/L) 及联合组 (葛根素200 mg/L、高糖35 mmol/L) 相近。

3 讨论

糖尿病是心肌梗塞的危险因素之一, 本文研究结果表明:高糖作用人体HUVECs有明显抑制作用[2]。高糖和葛根素同时作用HU-VECs后, 则能修复高糖对细胞的损伤。高糖抑制血管增殖可能与血管内皮细胞的凋亡有密切关系[1,2], 加剧血管病变的发生。VEGF与受体结合, 激活酪氨酸蛋白激酶, 从而催化自身及底物蛋白质的酪氨酸残基磷酸化、使信息传递并发生生物效应。还有资料表明血管损伤后VEGF使新内膜显著增厚。葛根素是含有多种药理活性的物质及营养元素, 能抑制血小板聚集, 降低血浆纤维蛋白原浓度, 增加细胞表面电荷而降低血粘度。对抗血栓素A2 (TXA2) 样物质的生物活性, 增加PGI2的活性, 使血栓形成时间延长, 血栓长度及重量减少, 凝血酶原时间延长, 优球蛋白溶解时间缩短, 还可拮抗内皮素, 直接降低血管外周阻力, 增加器官血流量。

本文结果表明, 高糖能使血管内皮细胞VEGF mRNA和蛋白表达下调;而葛根素和高糖同时作用能抑制其下调。虽然葛根素不能使VEGF mRNA和蛋白表达明显上调, 但能使其表达正常, 从而保护高浓度高糖对血管内皮的损伤, 这可能是葛根素治疗糖尿病并发组织缺血性疾病的机制之一。

参考文献

[1]娄金荣.胰岛素抵抗与内皮功能障碍[J].心血管病学进展, 2005, 26:117-119.

细胞生长因子美容化妆品引人注目 第5篇

然而,细胞生长因子作为一种有生物活性的蛋白质或多肽,如何解决它在美容化妆品或护肤品生产过程中遇到的各种问题,特别是加热对它的影响和破坏,以及大分子量物质能否透皮吸收、发挥最佳生物学效应等。这些问题的解决也是细胞生长因子美容化妆品是否有应用前景和生命力的关键。

最近,国内有些科学家和研究人员,在对人胎盘组织提取液进行成分鉴定和分析中发现,人胎盤组织中至少含有55种生物活性物质,他们还成功地从这些生物活性成分中分离出多种细胞生长因子,其中一种耐热、分子量较小、对多细胞生长增殖有促进作用的人胎盘源促细胞生长因子(HPGF-Ⅰ)倍受人们关注。

为了清楚地证实人胎盘源促细胞生长因子(HPGF-Ⅰ)对热有较强的稳定性,研究人员收集了一批正常妊娠分娩的新鲜人胎盘,经过特殊的工艺过程,将其洗净后用组织捣碎机制成匀浆,再放到90℃的恒温水浴箱中,经过连续保温两个半小时,将这种经过高热作用的人胎盘组织匀浆液迅速冷却、过滤、离心、分离出上清液,并将这种上清液在40℃条件下用旋转蒸发器浓缩,得到蛋黄色粘稠物后即可进行实验。正常情况下,这种其化学本质为蛋白质或多肽的细胞生长因子,经过在90℃高热持续处理,又在40℃条件下进行浓缩,一般都会部分或完全被破坏,其生物学活性也会自然消失。然而,奇怪的是在这种不利的条件下,人胎盘源促细胞生长因子(HPGF-Ⅰ)不仅没有被破坏,而且还表现出良好的生物学效应,保持它特有的对细胞生长增殖的促进作用。为了充分说明这一点,研究人员分别以人羊膜细胞和动物的成纤维细胞为人胎盘源促细胞生长因子的作用对象,观察它对这些细胞生长增殖的影响。结果表明,人胎盘源促细胞生长因子对上述细胞具有良好的刺激生长活性,被作用的细胞其生长增殖速度明显加快。

为了进一步研究人胎盘源促细胞生长因子,科学家又通过在90℃恒温下用酸性物质提取、乙醇沉淀、DE-52阴离子交换层析、高效液相色谱分析等方法对人胎盘源促细胞生长因子进行提纯,并对提纯以后的样品采用质谱快原子轰击法测得其分子量为1900道尔顿,这证实了人胎盘源促细胞生长因子为小分子量的活性肽,而且很可能是一种糖肽。同时,用等电热聚胶电泳法还测得其等电点为6.8,接近中性,为其应用提供了科学依据。

内皮细胞生长因子 第6篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年9月~2011年4月我院确诊的初发急性白血病患者36例,男20例,女16例;年龄8~57岁,中位年龄38岁。急性髓细胞白血病25例,其中M211例,M34例,M46例,M54例;急性淋巴细胞白血病11例,其中,L12例,L28例,L31例。所有患者均经临床表现、骨髓细胞学检查、免疫分型及染色体、融合基因等检查明确诊断。诊断均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》(第3版)[2]。健康组对象为我院门诊健康体检者15名,男8名,女7名,年龄9~56岁,并确定无引起VEGF分泌的病理因素。三组患者的年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

实验组患者在确诊后即开始口服沙利度胺(常州制药厂,50 mg/片),起始剂量为50 mg/d,1周后加量至100 mg/d并长期维持治疗,同时予以化疗。急性髓细胞白血病患者化疗用DA方案(柔红霉素+阿糖胞苷),急性淋巴细胞白血病患者化疗用VTC/LP方案(长春新碱+吡柔比星+环磷酰胺/左旋门冬酰胺酶+泼尼松),M3患者予以全反式维甲酸/三氧化二砷治疗。对照组患者化疗方案同实验组,但未口服沙利度胺。各组患者均根据病情予以抗感染、输注血液制品及对症支持治疗。

1.3 标本采集及疗效判定

所有患者治疗前及健康组采集清晨空腹外周血5 ml,肝素抗凝,以2 000 r/min速度离心10 min,吸取上层血浆置于-20℃冰箱内冻存。所有患者化疗后8周再次采集清晨外周血5 ml,分离血浆-20℃冰箱内冻存(步骤同前)。血浆VEGF、b FGF检测采用双抗体夹心ELISA法,试剂盒购自美国R&D公司,具体操作步骤按试剂盒说明书进行。疗效判定根据《血液病诊断及疗效标准》,分为完全缓解、部分缓解、未缓解。有效=完全缓解+部分缓解。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。计量资料数据以(x±s)表示,两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较采用方差分析,两指标间关系采用直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床疗效比较

36例患者均于治疗后8周评价疗效,实验组有效患者继续口服沙利度胺。实验组完全缓解15例,部分缓解1例,未缓解2例,有效率为88.9%。对照组完全缓解12例,部分缓解2例,未缓解4例,有效率为77.8%。两组有效率比较,差异有统计学意义(χ2=4.10,P<0.05),提示沙利度胺联合化疗可以提高急性白血病的缓解率。

2.2 两组治疗前后血浆VEGF、b FGF水平检测结果

见表1。由表1可见两组患者治疗前血浆VEGF水平差异无统计学意义(t=1.38,P>0.05),但均明显高于健康组(t=3.14、3.02,P<0.01)。治疗后较治疗前均降低(t=2.41、2.32,均P<0.05),但仍高于健康组(t=8.14、7.36,均P<0.05),其中,实验组血浆VEGF水平明显低于对照组(t=2.79,P<0.05)。

两组患者治疗前血浆b FGF水平均高于健康组(t=4.98、4.17,P<0.05),治疗前两组间血浆b FGF水平差异无统计学意义(t=0.95,P>0.05)。治疗后两组患者血浆b FGF水平均下降,但仍高于健康组(t=3.01,2.77,均P<0.05),治疗后两组患者间血浆b FGF水平差异无统计学意义(t=1.28,P>0.05)。

2.3 不良反应

所有患者均出现不同程度的骨髓受抑、恶心、呕吐、脱发等化疗副反应,实验组患者有嗜睡、腹胀、便秘等不良反应,但恶心、呕吐程度轻于对照组,未发现顽固性便秘。两组均无深静脉血栓及末梢神经炎。

2.4 急性白血病患者血浆VEGF及b FGF水平与临床疗效间的关系

采用直线相关分析发现急性白血病患者血浆VEGF水平与临床疗效间存在相关性(r=0.613,P<0.05)。血浆b FGF水平与临床疗效间无相关性(r=0.342,P>0.05)。

3 讨论

针对实体瘤血管新生的靶向治疗已证实可以改善其预后并成为肿瘤治疗的新策略[3]。近年研究表明,血管生成及其调控因子与血液系统恶性疾病的发生、演变及预后密切相关[4,5]。沙利度胺用于治疗多发性骨髓瘤、淋巴瘤已取得肯定疗效。有研究表明白血病细胞表达血管生长因子并刺激骨髓新生血管形成,血管生成参与了白血病的病理生理过程,抗血管新生成为治疗的一个靶点[6]。本研究显示实验组及对照组急性白血病患者治疗后8周临床有效率分别为88.9%和77.8%,差异有统计学意义(P<0.05),提示沙利度胺联合化疗可提高急性白血病患者的缓解率。

本研究发现治疗前急性白血病患者血浆VEGF水平较健康组均明显升高,治疗后8周实验组血浆VEGF水平下降程度明显高于对照组,但两组患者治疗后血浆VEGF水平仍均高于健康组。推测原因可能是化疗损伤的炎症刺激、化疗后患者持续的贫血状态导致机体缺氧从而诱导机体组织细胞分泌VEGF[7],因而化疗缓解后VEGF水平何时能降至正常水平尚需进一步延长观察时间。治疗前两组急性白血病患者血浆b FGF水平均高于健康组,治疗后8周两组患者血浆b FGF水平均有不同程度下降,但两组间差异无统计学意义(P>0.05),推测沙利度胺对b FGF的抑制作用不明显。

研究证实急性白血病患者血浆高水平VEGF可通过旁分泌与自分泌途径促进白血病细胞增殖活性及抗药性增高[8]。本研究相关性分析发现,急性白血病患者治疗后血浆VEGF水平下降越明显,其缓解率越高,而血浆b FGF水平与临床疗效间无相关性,提示急性白血病患者血浆VEGF水平可能与其预后密切相关,这与在实体瘤中的研究结果类似[9]。

病联合化疗的治疗中有望代替中枢止吐剂,减轻化疗药物所致的恶心、呕吐副反应。本研究显示两组急性白血病患者治疗后均有不同程度的骨髓受抑、恶心、呕吐等副反应,实验组患者尚有嗜睡、腹胀、便秘的不良反应,但实验组急性白血病患者其治疗期间恶心、呕吐的消化道反应程度较对照组明显减轻,同时并未增加患者骨髓受抑的程度,因沙利度胺最终以100 mg/d的小剂量长期维持治疗,并未发现顽固性便秘、严重的末梢神经炎等不能耐受的不良反应,无一例深静脉血栓发生,且其嗜睡的不良反应更有利于保证患者化疗期间的休息,增加了患者坚持化疗的信心及治疗的依从性。

注:与本组治疗前比较,*P<0.05,与B组治疗后比较,△P<0.05

本研究表明沙利度胺联合化疗治疗急性白血病的可能机制是通过降低VEGF水平抑制急性白血病患者血管新生,是否存在其他的作用机制尚需进一步深入研究。

参考文献

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[8]Lee CY,Tien HF,Hu CY,et al.Marrow angiogenesis-associated factorsas prognostic biomarkers in patients with acute myelogenous leukaemia[J].Br J Cancer,2007,97(7):877-882.

内皮细胞生长因子 第7篇

众所周知, 由于肾小球特殊的毛细血管丛结构, 血管内皮细胞的结构、功能及其调节在肾脏疾病中具有重要意义。如糖尿病肾病患者, 其肾小管周围的毛细血管减少, 并伴有血管内皮细胞损伤。血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 是一种促进内皮细胞的增殖、迁移、增强血管通透性的细胞因子。VEGF通过促进肾周血管的新生不仅能减轻对肾脏的损害, 甚至还能恢复肾脏功能[1]。因此VEGF及其受体的表达在肾脏疾病中发挥着重要的作用。现就综述如下。

1 VEGF的结构、来源、种类及生物学作用

1.1 VEGF膜受体的结构及来源

VEGF是分子量为46 k Da的二聚体糖蛋白化合物, 是一种促进血管生成的内源性调节因子, 能够维持内皮细胞的完整性并增强内皮细胞的通透性。肾脏VEGF主要在肾小球脏层上皮细胞表达与合成。病理条件下, 也可由系膜细胞、内皮细胞及肾小管细胞合成[2]。迄今为止, 已发现的VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及PIGF (胎盘生长因子) , 其中VEGF-A是这些因子中最为关键的调节因子。足细胞VEGF-A的缺失能导致小鼠足细胞的凋亡, 最终导致肾小球硬化。

1.2 VEGF膜受体的种类及生物学作用

根据VEGF受体存在的形式不同, 可分为膜受体以及可溶性受体。下面分别就膜受体以及可溶性受体的结构、来源、种类与生物学作用做简要介绍:

1.2.1 VEGF膜受体的结构、来源、种类及生物学作用

VEGF的膜受体包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Neuropilin-1及Neuropilin-2。其中, 前三种属于细胞表面的酪氨酸激酶家族;而后两种则为非酪氨酸激酶受体, 主要是作为VEGFR的共受体存在于细胞表面。

1.2.1. 1 酪氨酸激酶受体

尽管VEGFR-1 (又称Flt-1) 、VEGFR-2 (又称Flk-1) 和VEGFR-3的结构相似, 但其分布及来源却有明显的差异。VEGFR-1主要由单核细胞和巨噬细胞表达, VEGFR-2则主要由肿瘤细胞和血管内皮细胞表达。作为VEGF的正调控受体, VEGFR-1和VEGFR-2通过与VEGF结合能够激活信号通路, 起到促进血管内皮细胞迁移、增生及血管生成的作用。值得注意的是, 尽管VEGFR-1对于VEGF的亲和力比VEGFR-2高, 但由于它的酪氨酸激酶活性很弱, 只有VEGFR-2的1/10[3], 所以VEGF的生物学活性更多是由VEGFR-2介导。

1.2.1. 2 Nrp-1受体以及Nrp-2受体

作为非酪氨酸激酶受体, 目前对于Nrp-1的了解显著多于Nrp-2。神经菌毛素 (neuropilin, NRP) 是一种分子量为130 k Da的跨膜糖蛋白, 但缺乏酪氨酸激酶结构域。NRP-1的结构高度保守, 由胞内区、跨膜区以及胞外区构成, 其中胞外区包括a1/a2 (又称CUB结构域) 、b1/b2及c区 (MAN结构域) (图1) 。Nrp-1能够在多种细胞中表达, 包括内皮细胞、干细胞、成骨细胞以及肿瘤组织。Nrp-1的主要生物学作用是作为共受体通过b1/b2区与VEGF-A结合, 可增强VEGFR-2结合VEGF-A的能力, 从而更好的促进VEGF发挥生物学作用, 介导血管生成与肿瘤的发展。

1.2.2 VEGF可溶性受体的结构、来源、种类及生物学作用

VEGF的可溶性受体主要包括s Flt-1与s NRP-1, 而s Flt-1与s NRP-1在一定的程度上所表现的生物学效应相同, 如VEGF-B186诱导的血管生成效应被s NRP-1降低69%, 被s Flt-1降低47%[4]。

1.2.2. 1 s Flt-1受体

s Flt-1 (又称s VEGFR-1) 是VEGF的可溶性受体, 其分子量为110 k Da, 相比于VEGFR-1, 该受体缺乏跨膜和细胞内激酶结构域, 因而不具有酪氨酸激酶活性。主要由内皮细胞、单核细胞及胎盘产生。作为VEGF的可溶性受体, s Flt-1能够负性调节VEGF的生物活性, 调节机制主要为: (1) s Flt-1能够结合并抑制循环中的VEGF (2) s Flt-1能够与VEGFR-1或VEGFR-2的细胞外区域形成二聚体, 因此抑制下游信号的活化[5]。研究表明, s Flt-1能够引起内皮细胞损伤, 降低血管生成活性, 损伤血管的修复机制, 增加蛋白尿的排出[6]。此外, s Flt-1还是子痫早期的危险因子, 是怀孕时导致肾病发生的主要危险因素。

1.2.2. 2 s NRP-1受体

可溶性NRP-1 (s NRP-1) 相比于NRP-1主要缺失胞内区、跨膜区以及c区, 其分子量大小为90k Da。s NRP-1可以与NRP-1的配体结合以抑制膜受体NRP-1的生物学作用, 即抑制VEGF与内皮细胞和肿瘤细胞的结合;抑制VEGF诱导的内皮细胞中VEGFR-2酪氨酸的磷酸化。研究显示, NRP-1与s NRP-1在基因表达上并不重叠, s NRP-1的m RNA表达在肝细胞、近端肾小管以及远端肾小管, 而NRP-1主要表达在皮肤的上皮细胞和血管中[7]。有报道表明, s NRP-1与NRP-1一样, 都具有血管生成效应, 但s NRP-1的血管生成效应要弱得多[8], 因此, s NRP-1可以拮抗膜受体NRP-1的生物学活性。

2 VEGF可溶性受体在肾脏疾病中的意义

VEGF可溶性受体的表达参与了肾脏诸多疾病, 其中包括慢性肾脏疾病 (CKD) 如Ig A肾病、糖尿病肾病, 急进性肾炎综合征及其他与肾脏相关的疾病如肾血管性高血压、子痫前期等[9,10,11,12]。

2.1 s Flt-1在肾脏疾病中的意义

研究证明, CKD患者的单核细胞能够促使s Flt-1的含量升高[9]。Hagmann H等研究发现在Ig A肾病中, 患者血浆中s Flt-1的含量明显升高[10], 并且在糖尿病肾病、原发性高血压及子痫前期, s Flt-1的含量亦明显升高[9,11]。但在家猪单侧肾动脉狭窄导致的肾血管性高血压 (RVH) 模型中[12], s Flt-1的含量先降低, 在第3周后重新升高并在第12周恢复到初始水平, 这可能是由于AngⅡ诱导肾脏保护因子血红素加氧酶1 (HO-1) 表达增加的结果[13], 因为HO-1能够负性调节s Flt-1的活性。

在肾脏疾病患者中, s Flt-1与多种因素相关。首先, s Flt-1的含量与蛋白尿具有明显的相关性[9], 在绝大多数肾脏疾病中, 有轻度蛋白尿的患者, s Flt-1的含量显著低于中度与重度的蛋白尿患者[14]。研究显示, 在正常的小鼠中, s Flt-1的过多表达会导致小鼠蛋白尿情况恶化。这表明s Flt-1含量越高, 蛋白尿的情况越严重。但是, 在糖尿病小鼠中, s Flt-1的治疗却能够有效缓解糖尿病小鼠蛋白尿的症状[15]。

在新月体肾小球肾炎小鼠中, 使用s Flt-1来抑制VEGF不仅会导致大量的蛋白尿, 同时伴随着能够防止足细胞凋亡的肾病蛋白 (nephrin) 的表达下调[16], 并加速肾小球硬化和肾间质纤维化的进程[17]。大量研究证实, VEGF信号转导能够维持肾小球滤过膜的完整性[18], 而下调足细胞VEGF的表达会导致肾小球内皮损伤以及肾小球功能严重损伤。而在肾炎小鼠中使用s Flt-1进行治疗, 上皮细胞足突会发生严重的融合, 难以辨认[15]。另外, 在Ig A肾病中, v WF作为内皮细胞损伤的标志物, 其含量也与s Flt-1含量呈正相关[14]。以上研究表明, VEGF在维持足细胞的功能中起重要作用, 作为VEGF拮抗剂的s Flt-1, 其含量越高, 表明患者的肾小球内皮损伤越严重。此外, 有研究发现, 内皮损伤还能够增加CKD患者患心血管疾病的风险。CKD患者更容易患动脉粥样硬化、缺血性心脏病以及血管硬化等, 许多研究表明内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化的关键因素[19]。据Framingham风险评分显示患者s Flt-1含量越高, 表明患者患心血管疾病的风险越高[9]。

2.2 s NRP-1在肾脏疾病中的意义

相比于s Flt-1, 关于s NRP-1在肾脏疾病中研究较少。VEGF是内皮细胞存活的一个关键因素, s NRP-1作为一个新型的VEGF拮抗剂, 能够与膜受体竞争性结合VEGF, 进而抑制内皮细胞的增殖。研究表明, 注射了s NRP-1的患肿瘤的小鼠与对照组比较, 显示出更少和体积更小的毛细血管[20]。目前已知, NRP1能促进足细胞黏附力的分化, 抑制NRP-1能降低足细胞迁移[21]。应用糖基化终产物 (AGE) 或s NRP-1能够降低小鼠肾脏足细胞对于胶原蛋白IV、层黏蛋白以及纤维蛋白连接素的黏附力, 但不影响对胶原蛋白I的黏附[21]。足细胞凋亡引起的损伤, 是糖尿病肾病以及肾小球硬化的早期特征。有研究显示, s NRP-1以及AGE能够抑制NRP1, 导致足细胞迁移减少, 从而促使肾小球硬化的发生。同时, 糖尿病小鼠较非糖尿病小鼠的足细胞显示出明显的NRP1蛋白染色降低, 足以证明糖尿病小鼠的NRP1表达降低[21,22]。总的来说, s NRP-1能够抑制NRP-1的表达, 从而抑制足细胞的迁移、分化, 引起肾脏损伤。

内皮细胞生长因子 第8篇

1 资料与方法

1.1 实验对象

1.1.1 入组条件。

(1)肝癌单发结节,结节最大径小于5cm;(2)影像学检查未发现肝外转移和血管侵袭;(3)无明显临床症状的肝癌患者,首发病灶,入选本研究前未接受过任何治疗;(4)超声造影检查同期(1周内)有病理组织学检查结果,病理证实结节为肝细胞肝癌,周围为肝硬化改变;(5)临床资料完整。

1.1.2 临床一般资料。

2006年3月～2007年1月在301医院就诊患者中符合上述入组条件者23例。上述23名患者签署知情同意书后入选本研究。本研究获得伦理委员会准许。

上述23名患者肿瘤数目与大小均根据超声、CT/MRI综合判定,肿瘤最大径1.5～4.4cm,平均2.52±0.77cm。男21例,女2例,年龄39～71岁,平均(54.44±9.14)岁。23例患者均无明确肝区疼痛、体重减轻等症状,入选本研究前未接受过任何治疗。HBsAg(+)抗HCV(-)21例,HBsAg(-)抗HCV(+)1例,HBsAg(+)抗HCV(+)1例。肝功能均为Child A级。

1.2 仪器与材料

超声仪为Sequoia 512超声仪,4V1探头,造影软件采用随机配备的对比脉冲序列(CPS,contrast pulse sequence)。造影剂采用声诺维(SonoVue®),使用前以5mL生理盐水混匀。

1.3 方法

对23例患者进行常规超声及超声造影检查。超声造影检查过程中保持机械指数、深度及增益不变。记录病灶的增强过程,结束后回放影像资料绘制时间-强度曲线,分析并记录各增强时间参数。选取肿瘤区域作为感兴趣区1(ROI 1),尽量选择相同深度水平的周围肝实质作为感兴趣区2(ROI 2)。ROI2距肿瘤边缘在1～2cm之间。分别绘制ROI 1和ROI 2的时间-强度曲线(图1)。由时间-强度曲线及CEUS动态图像得出增强时间各参数,详见表1。

穿刺活检或手术取得肿瘤组织标本,行常规HE染色及VEGF免疫组化染色。显微镜下观察,细胞胞质中出现黄色、棕黄色、棕褐色颗粒者为VEGF阳性细胞。参考Weidner[9]方法,先在低倍镜下全面观察肿瘤区域,选出5个棕黄色较集中的“热点”区域,在高倍镜下对每个“热点”区域计数VEGF阳性细胞及阴性细胞,计算每高倍视野下阳性细胞占总细胞数的百分率,以5个区域阳性细胞占总细胞数的百分率的平均值作为VEGF阳性细胞表达率。根据每个标本VEGF阳性细胞表达率n进行分级,0n15%为1级,15%

对CEUS增强时间各参数与VEGF分级进行相关分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS12.0统计软件。正态分布的定量资料采用均数±标准差描述,非正态分布的资料采用中位数、四分位距描述。用Spearman相关分析CEUS增强时间参数(如t wash-in time,p wash-in time,t TTP,p TTP,p-t TTP)与VEGF的相关性。P<0.05有统计学意义,P<0.01有显著的统计学意义。

2 结果

2.1 CEUS增强时间参数

由CEUS时间-强度曲线及动态图像中可得到各参数。t TTP平均(21.9±3.8)s;p TTP平均(39.7±13.9)s;p-t TTP中位数16.0s,四分位距14.0s。各参数详见表2。

2.2 免疫组化染色结果

免疫组化染色结果显示,23例标本中HCC肿瘤区域均有程度不一的VEGF阳性表达(图2)。按前述方法分级,有1例为1级,2例为2级,7例为3级,8例为4级,5例为5级。

23例肿瘤周围肝实质均存在肝硬化,肝实质区域VEGF染色均呈阴性。

2.3 HCC超声造影特征参数与瘤内VEGF表达水平的相关性检验

经Spearman等级相关检验,肿瘤达峰早于肝实质的时间(p-t TTP)与VEGF表达水平之间呈负相关,有显著的统计学意义,r=-0.600,P=0.002;肿瘤达峰时间(t TTP)与VEGF表达之间在统计学上无相关性,r=-0.318,P=0.140。p TTP与VEGF表达水平之间呈负相关,r=-0.539,P=0.008。

3 讨论

VEGF是目前已知最重要的肿瘤血管生成因子[10,11],常用于评价肿瘤血供及血管形成,是肿瘤转移、复发和预后的相关因子[1]。用免疫组化染色计数肿瘤组织的VEGF表达是反映肿瘤血管形成的主要方法,但这是一个有创的途径。许多研究试图寻找一种无创、安全以及更为便捷的方法来评估肿瘤的VEGF表达。近年有学者对HCC的增强CT/MRI表现及参数与VEGF表达之间的关系进行了研究,结果显示某些CT/MRI表现及参数(包括MR信号强度、肝动脉血供、HCC强化的不均一性等)与VEGF表达具有相关性[2,3,4,5]。

有学者应用能量多普勒和脉冲谐波成像对肿瘤血管形成进行了评价[6,7,8]。Forsberg等[6]研究结果表明,VEGF免疫组化染色阳性面积百分比与能量多普勒和脉冲谐波成像结果显著相关。然而,应用低机械指数实时超声造影技术估计VEGF表达和评价HCC血管生成的报道不多。与高机械指数谐波成像相比,低机械指数实时超声造影技术能够更敏感地探测血流信号及观察实时灌注,更能够反映出肿瘤组织内血管分布状况及组织灌注状态。与增强CT/MRI相比,低机械指数超声造影具有动态实时、无放射等优势。

本研究结果显示,未发现肿瘤自身达峰时间(t TTP)与VEGF表达水平有相关性,发现肿瘤肝实质达峰时间的差值(p-t TTP)与肿瘤VEGF表达水平有相关性(r=-0.600,P=0.002)。肝实质达峰时间(p TTP)与肿瘤VEGF表达程度也有相关性(r=-0.539,P=0.008),但其相关系数小于p-t TTP与VEGF的相关系数。推测可能有以下病理基础和原因:

(1)p TTP与肿瘤VEGF表达水平相关p TTP反映了瘤周肝实质的血供来源组成比例。肝脏接受门脉及肝动脉系统双重血供,动脉血供比例越大,p TTP越提前。本组HCC病例发生肝硬化基础上,随着肝硬化的发展,门脉和动脉血供的比例已经发生了不同程度的变化。p TTP越提前,说明动脉血供比例越大,肝实质血流动力学改变越明显,该“土壤”也越适合肿瘤生长。该环境下肿瘤生长更加旺盛,对氧的需求量更大,肿瘤血管形成愈发活跃,相应地VEGF表达愈强。

(2)t TTP与肿瘤VEGF表达水平无明显相关肿瘤本身大部分或几乎全部为动脉供血[12],CEUS在动脉早期就迅速地达到了峰值,各个肿瘤的t TTP相差并不显著。因此t TTP无法明显而敏感地反映出肿瘤及瘤周的病理和血供差异。VEGF表达的差异并不易由t TTP明显反映出来。

(3)p-t TTP与肿瘤VEGF表达水平相关肿瘤达峰早于肝实质的时间(p-t TTP)为肝实质达峰时间(p TTP)和肿瘤达峰时间(t TTP)二者差值。VEGF表达程度高,p TTP值减小,t TTP变化不显著,总体上表现出肿瘤周围肝实质达峰时间的差值减小。相比p TTP,p-t TTP是一个更为客观的指标,因为p TTP与t TTP相减排除了心血管因素等其他干扰因素。p-t TTP与VEGF相关系数高于p TTP也说明了这一点。

本研究结果提示,p TTP提前得越明显,说明肝脏血流动力学改变越明显,肝脏正常结构破坏、改建及异常增生越显著。在对肿瘤与肝实质达峰时间差值(t-p TTP)的影响程度上,p TTP提前的影响可能比t TTP更敏感,可见肝实质微环境这一“土壤”的作用不可小觑。本研究结果的病理基础和机制可能比初步的理解更为复杂,但这一结果提示CEUS的半定量参数可以反映出一定的功能信息。

综上所述,HCC超声造影参数肿瘤达峰早于肝实质的时间(p-t TTP)、肝实质达峰时间(p TTP)与肿瘤组织VEGF表达水平有相关性,有助于推测肿瘤VEGF表达。超声造影检查有望成为评估肝癌血供及血管生成的方法。

摘要：目的探讨肝细胞癌超声造影增强时间参数与血管内皮生长因子表达水平之间的关系,寻求可能无创、有效评价肿瘤血管形成的超声造影增强时间参数。资料与方法对23例具有单发结节(且最大径小于5cm)、无门静脉侵袭及肝外转移的肝细胞癌患者行超声造影检查,绘制时间-强度曲线取得各增强时间参数。穿刺活检取得23个癌灶组织标本并行VEGF免疫组化染色,对VEGF表达水平进行分级。分析增强时间参数与VEGF表达分级的相关性。结果肿瘤达峰早于肝实质的时间(p-tTTP)与VEGF表达水平之间呈负相关(r=-0.600,P=0.002);肿瘤达峰时间(tTTP)与VEGF表达之间在统计学上无相关性(r=-0.318,P=0.140);pTTP与VEGF表达水平之间呈负相关(r=-0.539,P=0.008)。结论p-tTTP对评估肝细胞癌VEGF表达水平有价值,超声造影有助于评价肝细胞癌血管形成,有望成为无创评价肿瘤血管形成的方法。l

关键词：超声造影,血管内皮生长因子,肝细胞癌

参考文献

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[11]Mise M,Arii S,Higashituji H,et al.Clinical significance of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor gene expression in liver tumor[J].Hepatology,1996,23(3):455-464.

内皮细胞生长因子 第9篇

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2007～2008年在我院因子宫肌瘤而行子宫切除的40例住院患者，年龄32～56岁，平均46岁。所有研究对象术前3个月未使用过类固醇激素。以患者的正常子宫肌组织作为对照组。标本经10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，切片厚4μm，分别做HE染色及免疫组化染色。

1.2 主要试剂

鼠抗人单克隆VEGF、PCNA及免疫组织化学（SP）法试剂盒均购自北京中杉生物技术公司。

1.3 实验方法

免疫组织化学SP法，Ⅰ抗工作浓度均为1∶50。所有标本均经10%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm厚连续切片，分别用HE染色及免疫组织化学染色。以高温、高压、枸橼酸盐行抗原修复，DAB显色，其他步骤按说明书操作。

1.4 结果判定

VEGF蛋白主要分布于细胞胞质内，PCNA蛋白主要定位于细胞核，也有一部分出现于胞质。凡出现明显的棕色或棕黄色颗粒者为阳性细胞。按阳性细胞所占比例分为：阳性细胞≤5%或细胞无棕色颗粒与背景一致为阴性，记为（-）；阳性细胞占5%～30%为弱阳性，记为（+），阳性细胞占31%～60%为阳性，记为（++），>60%为强阳性，记为（+++）。本实验以阳性强度在（+）以上者列为阳性表达。

1.5 统计学处理

所得数据应用SPSS 10.0软件进行分析，检验水准α=0.05，计数资料用χ2检验分析。

2 结果

VEGF及PCNA在子宫肌瘤与正常肌组织中的表达见表1、2。

（例）

两组阳性率比较，有显著性差异（χ2=25.26,P<0.01)4035230

（例）

两组阳性率比较，有显著性差异（χ2=15.43,P<0.01)

3 讨论

子宫肌瘤是女性生殖系统最常见的良性肿瘤，子宫肌瘤多见于30～50岁妇女。30岁以下少见，70岁以上极少见，以35～50岁发生率最高[3,4]，约有50%的患者有症状，每年因为此病手术的患者约有60万人次，给患者带来很大的痛苦和经济负担[5]。子宫肌瘤的病因尚不明确，目前认为其发生、发展可能与遗传，卵巢内分泌功能，雌、孕激素及肌瘤组织中雌、孕激素受体、生长因子，细胞凋亡，癌基因与抑癌基因，细胞免疫等有关。

血管形成在肿瘤的发生、发展及转归过程中起着重要作用。肿瘤血管新生理论认为，实体肿瘤内血管新生刺激因子和血管新生抑制因子间的平衡发生改变，使肿瘤内的血管新生处于失控的病理状态，促进了实体肿瘤的生长。血管内皮生长因子是一种能特异性作用于血管内皮细胞，对血管生长有极强诱导作用的生长因子，被认为是最强、特异性最高的调控因子。VEGF在促进肿瘤血管发生和人类肿瘤的发病中的作用已确定[6]。VEGF主要作用于血管内皮细胞，与内皮细胞上的受体高亲和力结合后可作为内皮细胞特异性有丝分裂原，诱导内皮细胞增生毛细血管袢形成[7]，同时还可增加微血管通透性。通过诱导间质产生，促进体内新生血管的生成[8]。本研究显示，在子宫肌瘤组织中，VEGF有较高水平的表达，阳性率达77.5%，与正常肌组织阳性率（12.5%）比较，有显著性差异（P<0.01），表明肿瘤血管生长在子宫肌瘤的发生及发展过程中可能起到至关重要的作用。

PCNA是DNA聚合酶-6的附属蛋白，仅在增殖细胞中合成和表达，其表达在细胞周期G1期逐渐增加，S期达到高峰，而G/M期减少[9,10]，其含量反映了肿瘤细胞的增殖活性，被认为是反映细胞增殖的可靠指标[11,12]。本研究显示，在子宫肌瘤组织中，PCNA呈高表达，阳性率达92.5%，与正常肌组织阳性率（47.5%）比较，有显著性差异（P<0.01），提示肌瘤中的细胞增殖活性远远高于正常肌层，致使肌瘤不断增大，说明子宫肌瘤的生长与瘤细胞的增殖速度有关。

内皮细胞生长因子 第10篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年5月-2013年10月在本院就诊的胃癌患者36例, 其中男20例, 女16例, 年龄23~76岁, 平均 (56.50±3.15) 岁;伴有淋巴结转移患者15例, 无淋巴结转移患者21例;高分化16例, 低分化20例。

1.2 方法

对36例患者手术切除的胃癌组织用10%的福尔马林固定, 用石蜡包埋, 然后做4μm厚切片。采用免疫组化SP法检测患者胃癌组织中血管内皮抑素和碱性成纤维细胞生长因子的表达水平。具体步骤如下: (1) 将切边脱蜡水化:将切片置于60℃烤箱中烤片60 min, 用二甲苯及梯度酒精逐级脱蜡, 然后置于双蒸水中中分水化5 min, 用PBS冲洗切片3次, 5 min/次。 (2) 每张切片滴加过氧化氢溶液50μL, 室温孵育10 min, 用PBS冲洗切片3次, 3 min/次。 (3) 将切片浸于柠檬酸缓冲溶液中, 置于微波炉中, 加热至沸腾后, 关闭微波炉, 10 min后, 再次置于微波炉中加热至沸腾。然后取出, 待冷却至室温后, 用PBS冲洗切片3次, 3 min/次。 (4) 甩弃切片上的PBS溶液, 每张切片滴加羊血清50μL, 室温孵育15 min。 (5) 弃去多余血清, 每张切片加相应一抗50μL, 4℃孵育过夜。 (6) 弃去一抗, 用PBS冲洗切片3次, 5 min/次。甩弃PBS, 每张切片加相应二抗50μL, 室温孵育30 min。用PBS冲洗切片3次, 3 min/次。 (7) 甩弃PBS溶液, 每张切片加链霉菌-亲和素50μL, 室温孵育30 min。用PBS冲洗切片3次, 3 min/次。 (8) DAB显色, 水洗终止。 (9) 苏木精复染90 s~2 min。 (10) 梯度酒精脱水后, 二甲苯透明, 然后用中性树胶进行封片。

1.3 观察指标

对于血管内皮抑素及碱性成纤维细胞生长因子采用半定量标准进行阳性判断, 即依据细胞染色强度以及染色细胞所占的面积之和进行判断[12]。血管内皮抑素蛋白阳性判定:血管内皮抑素蛋白为胞浆着色。阳性细胞染色评分:无着色为0分, 淡黄色为1分, 棕褐色为3分。血管内皮抑素染色细胞面积评定:阴性为0分, <25%细胞着色为1分, 25%~50%细胞着色为2分, >50%细胞着色为3分。碱性成纤维细胞生长因子染色细胞面积评定:阴性为0分, 10%细胞着色为1分, 11%~50%细胞着色为2分, >50%细胞着色为3分。若细胞染色强度以及染色细胞所占的面积之和>2, 则为阳性表达, ≤2则为阴性表达[13]。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析, 计数资料采用x2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

经免疫组化染色发现, 不同分化程度的胃癌组织中血管内皮抑素及碱性成纤维细胞生长因子的表达均无显著性差异。发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移胃癌患者其胃癌组织中的血管内皮抑素阳性表达率分别为46.7%、81.0%。碱性成纤维细胞生长因子阳性表达率分别为93.3%、61.9%, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

3 讨论

血管内皮抑素及碱性成纤维细胞生长因子是胃癌血管生成过程中的两个重要的调节因子[12,13]。本研究中发现, 伴有淋巴结转移和未发生淋巴结转移胃癌患者其胃癌组织中的血管内皮抑素阳性表达率分别为46.7%、81.0%。碱性成纤维细胞生长因子阳性表达率分别为93.3%、61.9%, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。伴淋巴结转移的胃癌组织中, 血管内皮抑素的阳性表达率低 (46.7%) , 而碱性成纤维细胞生长因子的阳性表达率高 (93.9%) ;无淋巴结转移的胃癌组织中血管内皮抑素的阳性表达率高 (81.0%) , 而碱性成纤维细胞生长因子的阳性表达率低 (61.9%) , 这表明, 两者的消长关系可能与胃癌的发生发展等生物学行为相关。

摘要：目的:分析探讨血管内皮抑素及碱性成纤维细胞生长因子在人胃癌组织中的表达情况。方法:选取来本院就诊的36例胃癌患者, 采用免疫组化SP法检测患者胃癌组织中血管内皮抑素和碱性成纤维细胞生长因子的表达水平。结果:发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移胃癌患者其胃癌组织中的血管内皮抑素阳性表达率分别为46.7%、81.0%。碱性成纤维细胞生长因子阳性表达率分别为93.3%、61.9%, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:血管内皮抑素及碱性成纤维细胞生长因子是人胃癌组织肿瘤血管的生成过程中的重要调节因子, 两者的消长关系可能与胃癌的发生发展等生物学行为相关。